DE69724218T2

DE69724218T2 - Universale feste träger und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69724218T2
Application number: DE69724218T
Authority: DE
Inventors: Parameswara M. Reddy; A. Maged MICHAEL; Firdous Farooqui
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-21
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2017-04-22
Also published as: JP2000500158A; EP0843684A2; US5869696A; WO1997040458A3; EP0843684B1; WO1997040458A2; DE69724218D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Chemie und Biologie. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung in der Synthese von Oligonukleotiden (zum Beispiel DNA- und RNA-Sequenzen)-Es wurde eine Vielfalt von Synthesemethoden zur Herstellung von Oligunukleotidsequenzen entwickelt. Oligonukleotide werden typischerweise unter Verwendung einer Blockaufbaumethode synthetisiert, die die sequentielle Addition von Nukleotiden auf eine auf einem festen Träger immobilisierte wachsende Oligonukleotidkette betrifft. Da jedes DNA-Oligonukleotid eines von 4 verschiedenen Anfangsnukleotiden aufweisen kann, ist es notwendig, ein Angebot von 4 verschiedenen auf festen Trägern aufgebrachten Nukleosiden (A, C, G und T) bereitzuhalten, um in der Lage zu sein, jede gegebene DNA-Sequenz zu synthetisieren. Im Falle einer DNA-Synthese wird das erste Nukleosid von dem 3'-Ende der DNA-Sequenz typischerweise durch eine Esterverknüpfung auf den festen Träger vorher aufgebracht. Enthält zum Beispiel die zu synthetisierende Sequenz ein T-Nukleosid an dem 3'-Ende, so wird ein T-Träger angewandt und der Rest der Nukleotide in der DNA-Sequenz daran addiert (zum Beispiel unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung). Am Ende der gesamten DNA-Synthese wird das Oligonukleotid von dem festen Träger durch Hydrolyse der Esterverknüpfung gespalten. Bei Berücksichtigung von RNA-Syntheseverfahren, müssen feste Träger mit zusätzlichen aufgebrachten 4 verschiedenen Nukleosiden dem Benutzer zur Verfügung stehen. Ähnliche Erwägungen treffen zu, wenn ein beliebiges speziell am 3'-Ende modifiziertes Nukleosid erwünscht ist.
Die Bereithaltung eines Angebots von mindestens 8 verschiedenen vorher derivatisierten festen Trägern ist lästig und teuer: Eine weitere Erwägung ist die relativ kurze Lagerbeständigkeit von Nukleosid-derivatisierten festen Trägern. Solche feste Träger sind typischerweise nach einem Jahr Lagerung nicht mehr verwendbar. Es ist ebenfalls die Möglichkeit vorhanden, dass synthetische Verfahren mit dem falschen Träger falsch eingeleitet werden können, was bei der Endanwendung der Oligonukleotide zu verheerenden Folgen führt.
Zur Milderung dieser Probleme haben manche Forscher die Entwicklung einer gewissen Art eines universalen Trägers verfolgt. Zum Beispiel derivatisierte deBear et al. Glasträger mit 2'(3')-O-Benzoyluridin-5'-O-succinyl, so dass die Uridineinheit an das Glas über eine Ester- (Succinct) Brücke gebunden ist. [de Bear et al., Nucleosides and Nucleotides 6, 821–830 (1987)]. Die Oligonukleotidsynthese findet durch Addition von Nukleotidmonomeren an die 2'- oder 3'-Position des Uridins statt. Nach der Synthese können die neuen Oligonukleotide in einer Reaktion von dem Glas freigesetzt, entschützt und von dem Uridinylylende gespalten werden. Da in dieser Spaltungsreaktion die Uridinylfunktionalität von dem festen Träger gespalten wird, ist der Träger für nachfolgende Oligonukleotidsynthesen nicht mehr verfügbar.
Crea und Horn schlugen eine ähnliche Methode vor, die die Herstellung der Dimers 5'-O-p-Chlorphenylphospho-2'(3')-O-acetyluridilyl-[2'(3')-3']-5'-Odimethoxytritylthymidin-p-chlorphenylester und Bindung des Dlmers an Zellulose über eines Phosphatbindung betraf. Die 5'-Position des Thymidins ist für die Oligonukleotidbindung und-synthese verfügbar. [R. Crea & T. Horn, Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980)]. Die anschließende Verwendung von wässrigem konzentriertem Ammoniak resultierte in der Freisetzung des synthetisierten Oligonucleotids von der Zellulose, wobei der Uridinteil des Dimers an der Zellulose gebunden blieb. Obwohl Crea und Horn benachbarte reaktive Gruppen auf dem Uridin als Freisetzungsstelle für das Oligonukleotid von dem Uridin verwendeten, war der in dieser Veröffentlichung vorgeschlagene feste Träger kein universeller fester Träger, da das Anfangsnukleotid in das feste Trägerreagenz eingebaut ist und ein unterschiedlicher fester Träger für Oligonukleotide, die unterschiedliche erste Nukleoside enthalten, erforderlich ist.
Kürzlich befestigten Schwartz et al. einen Adapter 2'(3')-O-Dimethoxytrityl-3'(2')-Obenzoyluridin-5'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit an ein Thymidinderivatisiertes Polystyrol und synthetisierten von der O-Dimethoxytritylposition des Uridins ausgehend ein Oligonukleotid. [M. E. Schwartz, R. R. Breaker, G. T. Asteriadis und G. R. Gough, Tetrahedron Letters, Bd. 36, Nr. 1 Seiten 27–30, 1995] Während diese Methode einen universellen festen Träger für die Oligonukleotidsynthese zur Verfügung stellt, setzt der Spaltungsschritt den Adapter und das Thymidin von dem festen Träger frei und spaltet dann das synthetisierte Oligonukleotid von dem Uridin. Somit erfordert das Reinigungsverfahren die Entfernung des Thymidinlinkers und die Spaltungsverfahren hinterlassen den festen Träger unbrauchbar für nachfolgende Verwendungen.
Die vorher erwähnten festen Träger und Verfahren zu deren Verwendung leiden unter Nachteilen bezüglich der Zweckmäßigkeit und Leistungsfähigkeit der anschließenden Oligonukleotidspaltungsschritte. Bei der Verwendung von Ammoniak, das nach der Lehre von deBear et al. weitgehend als sicheres Reagenz für die Spaltung bei der DNA-Synthese verwendet wird, beträgt die Zeit zur Spaltung schon 24 Stunden bei 65°C. In Hinblick auf den wachsenden Trend, Oligonukleotide so schnell wie möglich herzustellen, ist dies eine nicht annehmbare lange Zeitdauer. Zur Verringerung der Zeit, die zur Spaltung des Uridylyls von dem Oligonukleotid an der Uridin-3'-Position erforderlich ist, wird typischerweise ein Blei(II)-lonenkatalysatorsystem oder die Wirkung starker Alkalihydroxide verwendet. Diese Verfahren erfordern notwendigerweise einen gesonderten Isolationsschritt zur Entfernung des Bleiions. Zusätzlich finden bei Verwendung starker Alkalibasen in diesen Spaltungsverfahren beträchtliche Nebenreaktionen in Form von Cytosindeaminierung statt.
Jüngste Verbesserungen in der Automatisierung der gleichzeitigen mehrfachen Oligonukleotidsynthese (wobei mehrere Oligonukleotide gleichzeitig synthetisiert werden) verdeutlichen weiterhin den Wunsch, einen einzigen universellen festen Träger für die Synthese von Oligonukleotiden zu verwenden. Jegliche Erfordernis mehrere vorher mit verschiedenen Nukleosiden beladene feste Träger auf einer DNA-Synthesevorrichtung auszugeben macht die Syntheseautomation deutlich komplizierter. Es wäre daher äußerst wünschenswert einen universellen festen Träger zur Synthese einer beliebigen Nukleinsäure zu haben.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung in der Synthese von Oligonukleotiden zur Verfügung zu stellen, die einige der Probleme verbessern, auf die man bei den Verfahren und Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik stößt.
In der WO 93/20091 wird ein Träger für die Oligonukleotidsynthese beschrieben, der einen homolytischen oder heterolytischen Ring trägt, der ein erstes und zweites Kohlenstoffatom enthält, wobei: (i) das erste Kohlenstoffatom durch eine nukleophile Gruppe oder eine durch Behandlung mit einer Base dazu umwandelbare Gruppe substituiert ist, (ii) das zweite Kohlenstoffatom durch eine Hydroxygruppe substituiert ist, eine durch eine säureempfindliche Schutzgruppe geschützte Hydroxygruppe ist oder eine durch ein Oligonukleotid substituierte Phosphatgruppe ist und (iii) das erste und zweite Kohlenstoffatom direkt durch eine kovalente Bindung miteinander verbunden sind und wobei dieser Träger zur Verwendung in der Oligonukleotidsynthese geeignet ist.
Reagenzien und Verfahren zur Spaltung und Entschützung unlöslich gemachter und geschützter synthetischer Oligonukleotide sind in der US 5 348 868 beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, dass ein Methylamin und t-Butylamin umfassendes Reagenz zur Unterdrückung von Transaminierungsvorgängen brauchbar ist.
In der WO 85/01051 wird ein Oligonukleotid-Polymerträgersystem beschrieben, das sich durch einen universellen Primer auszeichnet, der eine Kettenverlängerung entweder in der 3'- oder 5'-Richtung gestattet und in der Lage ist, milden basischen und sauren Bedingungen standzuhalten und der selektiv oxidierbare Substituenten besitzt, wobei das erwünschte Olignukleotid von dem Polymerträger freisetzbar ist.
Ein Verfahren zur Nukleinsäuresynthese mit festem Träger und dafür als feste Träger verwendbare Verbindungen sind in der WO 95/01987 beschrieben. Als fester Träger wird ein Mineral oder ein organisches Polymer verwendet, das durch ein zweiwertiges Kohlenwasserstoffradikal an eine Epoxy- oder glykolartige Gruppe gebunden ist, wobei die Gruppe zwei benachbarte gesättigte Kohlenstoffatome umfaßt, auf denen eine -OH und eine nukleophile Gruppe substituiert sind.
Insbesondere ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, wiederverwendbare Oligonukleotidsynthesereagenzien zur Verfügung zu stellen, die zur Synthese einer Vielfalt von Oligonukleotiden, unabhängig von dem Anfangsnukleosid verwendet werden können. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Spaltungsreagenzien und Spaltungs verfahren zur Verfügung zu stellen, die die zur Spaltung der Oligonukleotide nach der Synthese erforderliche Zeit wesentlich verringern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung, die die mit der Oligonukleotidsynthese mit festem Träger zusammenhängenden Probleme aus dem Stand der Technik überwindet. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen einen einzigen wiederverwendbaren universellen festen Träger zur Verfügung, der für die schrittweise Oligonukleotidsynthese und die anschließende Spaltung und Entschützung des synthetisierten Oligonukleotids in einem Schritt geeignet ist. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Spaltungsreagenzien zur Verfügung, die zur Entfernung der Oligonukleotide von dem festen Träger, an den sie synthetisiert wurden, geeignet sind. Die Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung sind flüchtig und erfordern daher keine Zeitverschwendung bei anschließenden Reagenzentfernungsverfahren. Überdies entfernen die Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung die synthetisierten Oligonukleotide in einer wesentlich verringerten Zeitdauer.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Oligonukleotidsynthesereagenz mit der folgenden allgemeinen Formel zur Verfügung: SS-R⁶-O-R³ wobei SS ein fester Träger ist, R⁶
ist, wobei R⁵ Wasserstoff oder Alkyl ist und R⁴ eine Phosphatschutzgruppe ist, und R³ eine Ringeinheit mit den benachbarten Gruppen -XR¹ und -YR² ist, wobei jedes X und Y unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus O, S und NH ausgewählt sind und eines von R¹ und R² eine Blockierungseinheit ist und das andere Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe ist. R³ ist vorzugsweise eine Zuckereinheit, wobei -XR¹ und -YR² die zweite und dritte Kohlenstoffposition auf dem Zuckerring einnehmen. R³ weist besonders bevorzugt die Struktur
auf, wobei B eine Purin oder Pyrimidinbase ist, jedes X und Y und R¹ und R² wie vorstehend beschrieben sind. Die Blockierungseinheiten R¹ und R² sind vorzugsweise Alkylcarbonyl oder Arylcarbonyl, die durch Bildung einer Esterschutzgruppe an einem der zwei nachbarständigen Hydroxyfunktionalitäten hergestellt werden können. Bevorzugte Ausführungsformen von R⁶ sind die Phosrphoramiditverknüpfungen und die oxidierte Form, Phosphoramidatverknüpfungen, die dadurch charakterisiert sind, dass R⁶
ist und die Phosphatschutzgruppe R⁴ eine Cyanoethyleinheit ist. Diese Reagenzien sind vorteilhafterweise als universelle feste Träger in der Synthese von Oligonukleotiden verwendbar, wobei die Synthese an der nachbarständigen R¹- oder R²-Position mit der Hydroxyschutzgruppe stattfindet und wobei die andere R¹- oder R²-Position mit der Arylcarbonyl- oder Alkylcarbonylblockierungseinheit blockiert ist. Es wurde überraschend festgestellt, dass die Freisetzung nach der Synthese der unter Verwendung des Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung synthetisierten Oligonukleotide wesentlich schneller ist, als die Freisetzung der unter Verwendung von Reagenzien aus dem Stand der Technik synthetisierten Oligonukleotide. Überdies werden die Oligonukleotide an der nachbarständigen Gruppenposition der Ringeinheit freigesetzt. Ist die Verknüpfung zwischen der Ringeinheit und dem festen Träger ein Phosphoramidat oder Phosphoramidit, so wirkt sich die Freisetzung nicht auf die Bindung an den festen Träger aus und das Oligonukleotidreagenz ist für wiederholte Syntheseverfahren geeignet.
Entsprechend einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Spaltungsverfahren und Spaltungsreagenzien zur Freisetzung von Oligonukleotiden von einem festen Träger zur Verfügung gestellt. Die hier beschriebenen Spaltungsreagenzien und Freisetzungsverfahren sind auf an vielfältige feste Träger gebundene Oligo nukleotide, einschließlich Ester-verknüpfte Oligonukleotide, Phosphat-verknüpfte Oligonukleotide und Phosphoramidat- oder Phosphoramidit-verknüpfte Oligonukleotide anwendbar. Die Spaltungsverfahren der vorliegenden Erfindung betreffen das Kontaktieren eines ein Oligonukleotid-tragenden festen Trägers mit einem Spaltungsreagenz der vorliegenden Erfindung, das eine Mischung aus einer ersten Verbindung, die Methylamin und/oder Ammoniumhydroxid umfaßt, und einer zweiten Verbindung umfaßt, die ein sekundäres Amin und/oder ein tertiäres Amin sein kann. Das Spaltungsreagenz weist eine Zusammensetzung auf, die vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 : 9 (v/v) mit 40 Gew.-% wässrigem Methylamin: 23–25 Gew.-% wässrigem Trimethylamin bis ungefähr 9 : 1 (v/v) mit 40 Gew.-% wässrigem Methylamin: 23–25 Gew.-% wässrigem Trimethylamin liegt.
Diese und andere Vorteile werden dem Fachmann nach eingehendem Verständnis der vorliegenden Erfindung offensichtlich, wie sie in der nachfolgenden Beschreibung genauer beschrieben ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verbesserungen in den Zusammensetzungen und Verfahren für die auf einem festen Träger basierende Oligonukleotidsynthese zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Oligonukleotidsynthesereagenzien zur Verfügung, in denen eine Ringeinheit an einen festen Träger über eine Phosphoramidatverknüpfung gebunden ist. Die Ringeinheit weist nachbarständig positionierte Funktionalitäten auf, von denen eine die Stelle zur schrittweisen Synthese von Oligonukleotiden ist und die andere während der Synthese blockiert ist, jedoch während der Spaltungsverfahrens nicht blockiert ist, um aktiv zu werden. Das Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung ist ein universeller fester Träger, wobei ein einziges Oligonukleotidreagenz zur Synthese eines beliebigen Oligonukleotids mit einem beliebigen Anfangsnukleosid verwendbar ist, wodurch vermieden wird, daß eine Vielfalt von verschiedenen geeignet derivatisierten festen Trägern bereitgehalten werden muß. Da überdies während der typischen Spaltungsprozesse die Phosphoramiditverknüpfung des vorliegenden Oligonukleotidreagenz stabil bleibt, können die Synthesereagenzien der vorliegenden Erfindung für nachfolgende Oligonukleotidsynthesen verwendet werden.
In solchen Systemen werden zwei Hydroxylgruppen (oder dazu gleichwertige Gruppen, wie nachfolgend definiert wird) an angrenzende Kohlenstoffatome, vorzugsweise in cis-Orientierung gebunden. Für die Oligonukleotidsynthese wird eine der zwei Hydroxylgruppen oder zu Hydroxyl gleichwertigen Gruppen blockiert, wobei Hydroxyl vorzugsweise in Form eines Esterderivats der Hydroxylgruppe oder zu Hydroxyl gleichwertigen Gruppe blockiert wird. Es können Zusammensetzungen, in den entweder eine der Hydroxylgruppen oder gleichwertige Gruppen oder eine Mischung von sowohl Hydroxylgruppen oder gleichwertige Gruppen in geeigneter Weise angewandt werden. Die übrige nicht blockierte nachbarständige Stelle wird zum Wachsen der Oligonukleotidkette verwendet. Diese Stelle wird typischerweise mit einer geeigneten Schutzgruppe, zum Beispiel DMT (Dimethoxytrityl) geschützt und dann gerade vor dem Zugeben des Anfangsnukleotids in der Synthese entschützt.
Am Ende der Synthese wird die blockierte nachbarständige Stelle entschützt oder hydrolysiert, um die Hydroxylgruppe oder gleichwertige Gruppe freizusetzen. Die Hydroxylgruppe oder gleichwertige Gruppe greift dann intramolekular an der benachbarten Phosphatgruppe des ersten Nukleotids der Oligonukleotidkette unter Bildung eines cyclischen Phosphats an. Dies führt zur Freisetzung des Oligonukleotidmoleküls von dem festen Träger. Unabhängig von dem zu dem festen Träger zuerst zugegebenen Nukleosid wird dieses während der Oligonukleotidsynthese das terminale Nukleosid am 3'-Ende des synthetisierten Moleküls (bei einer Oligonukleotidsynthese in der üblichen 3' nach 5' Richtung).
Entsprechend einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Oligonukleotidsynthesereagenzien mit der allgemeinen Formel I SS-R⁶-O-R³ zur Verfügung gestellt wobei SS ein fester Träger ist, R⁶
ist, wobei R⁵ Wasserstoff oder Alkyl ist und R⁴ eine Phosphatschutzgruppe ist, und R³
ist, wobei B eine Purin oder Pyrimidinbase ist, jedes X und Y unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus O, S und NH ausgewählt sind und eines von R¹ und R² eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppe ist und die andere von R¹ und R² Wasserstoff oder eine zum Schutz von -O, -S oder-NH geeignete Schutzgruppe ist. Aufgrund seiner Verfügbarkeit und Einfachheit in der Verwendung ist B vorzugsweise Uridin.
Unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S und NH und eines von R¹ und R² ist eine Blockierungseinheit und die andere Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe, die zum Schutz von -OH, -SH oder -NH₂ geeignet ist. Ist R⁶ ein Phosphoramidit oder dessen oxidierte Form, Phosphoramidat, so ist dem Fachmann klar, dass R⁵ vorzugsweise Wasserstoff ist. Dies ist der Fall, weil diese Oligonukleotidsynthesereagenzien im allgemeinen unter Verwendung eines primären Amins hergestellt werden. Dem Fachmann ist jedoch klar, dass R⁵ Alkyl sein kann, weil Phosphoramidat unter Verwendung sekundärer Amine hergestellt werden kann.
Die Phosphatschutzgruppe R⁴ ist geeigneterweise jede Gruppe, die in der Lage ist, den Phosphor des Phosphoramidats oder Phosphoramidits vor Spaltung oder Reaktion während der Oligonukleotidsynthese zu schützen. Der Fachmann wird erkennen, dass Cyanoethyleinheiten bevorzugte Phosphatschutzgruppen sind, aufgrund ihrer Stabilität unter den Oligonukleotidsynthesebedingungen und ihrer einfachen Entfernung mit Ammoniak oder Methylamin. Es ist jedoch verständlich, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendete Phosphoramidat- oder Phosphoramiditverknüpfung nicht entschützt zu werden braucht. Daher sind im allgemeinen Alkyleinheiten oder Aryl-enthaltende Einheiten ebenfalls als Phosphatschutzgruppen R⁴ geeignet.
Aufgrund der nachstehend beschriebenen Gründe sind die nachbarständigen Gruppen -XR¹ und-YR² am wirksamsten, wenn sie zueinander in cis-Position sind. Da an Ringeinheiten gebundene benachbarte Funktionalitäten in einer cis-Konfiguration vorhanden sein können, ist R³ vorzugsweise eine Ringeinheit und -XR¹ und -YR² sind räumlich zueinander in einer festen cis-Position orientiert. Da viele Zucker Ringsysteme sind, die in Nachbarstellung positionierte Hydroxyfunktionalitäten aufweisen, ist R³ vorzugsweise ein Zucker, bei dem -XR¹ und -YR² die zweite und dritte Kohlenstoffposition des Zuckerrings einnehmen. Aus den nachstehend beschriebenen Gründen sind Nukleoside oder Zucker, die eine gebundene Purin- oder Pyrimidinbase aufweisen besonders bevorzugte Ringeinheiten. Dem Fachmann ist klar, dass X und Y vorzugsweise O (Sauerstoff sind), da Zucker und glycerolartige Diole verfügbar sind und die zu ihrem Schutz geeigneten Schutzgruppen bekannt sind. Jedoch ist dem Fachmann auch klar, dass die Verwendung von NH und S in diesen Positionen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt.
Eine der nachbarständigen Positionen muß vor der Teilnahme an der Oligonukleotidsynthese durch eine geeignete Blockierungsgruppe R¹ oder R² blockiert werden. Da das nicht blockierte X oder Y in dem letzten Oligonukelotidspaltungsschritt aktiv ist, entsprechend der nachstehenden Beschreibung, muß die Blockierungsgruppe unter Spaltungsbedingungen leicht entfernt werden können, jedoch muß sie unter den für die Oligonukleotidsynthese typischen Bedingungen stabil sein. Aus diesem Grund ist eines von R¹ oder R² vorzugsweise eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppe. Eine Alkylcarbonyleinheit ist eine aliphatische Gruppe mit einem C=O Ende, wobei die aliphatische Komponente eines (das heißt Acetyl) bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen umfaßt. Mit einer Arylcarbonylgruppe wird ein Rest bezeichnet, der mindestens einen homoaromatischen oder heteroaromatischen Ring mit einem C=O Ende aufweist (zum Beispiel C₆H₅CO).
Die mit R¹ oder R² in Zusammenhang stehende Hydroxylschutzgruppe, die keine Blockierungsgruppe ist, ist jede geeignete Schutzgruppe, die leicht entfernt werden kann, so dass die geschützte Gruppe als die Stelle zur Einführung eines ersten Nukleosids während der Einleitung der Oligonukleotidsynthese verfügbar ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Dimethoxytrityl- (DMT) Gruppe beson ders bevorzugt. Andere geeignete Gruppen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf folgende: 4,4',4''-Tris-(benzyloxy)trityl (TBTr); 4,4',4''-Tris-(4,5-dichlorphthalimido)trityl (CPTr), 4,4',4''-Tris(levulinyloxy)trityl (TLTr), 3-(Imidazolylmethyl)-4,4'-dimethoxytrityl (IDTr), Pixyl-(9-phenylxanthen-9-yl), 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl (Mox), 4-Decyloxytrityl (C₁₀Tr), 4-Hexadecyloxytrityl (C₁₆Tr), 9-(4-Octadecyloxyphenyl)xanthen-9-yl (C₁₈Px), 1,1-Bis-(4-methoxyphenyl)-1'-pyrenylmethyl (MBPM), p-Phenylazophenyloxycarbonyl (PAPoc), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 2,4-Dinitrophenylethoxycarbonyl (DNPEoc), 4-(Methylthiomethoxy)butyryl (MTMB), 2-(Methylthiomethoxymethyl)benzoyl (MTMT), (2-(Isopropylthiomethoxymethyl)benzoyl (PTMT), 2-(2,4-Dinitrobenzolsulfphenyloxymethyl)benzoyl (DNBSB) und Levulinylgruppen. Diese und andere geeignete Schutzgruppen sind in genau in Beaucage, S. L. und lyer, R. P. Tetrahedron 48, 2223–2311 (1992) beschrieben, wobei auf die gesamte Offenbarung vollumfänglich Bezug genommen wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung stellt B eine Pyrimidin- oder Purinbase dar. Zur erfindungsgemäßen Verwendung werden Basen. die für Guanin, Adenin, Thymin und Cytosin charakteristisch sind, bevorzugt, jedoch können alternativ dazu in der Synthese von Nukleotidanaloga andere Purin- oder Pyrimidinbasen als Gruppe B verwendet werden.
Wie aus den hier beschriebenen Beispielen offensichtlich ist, weisen bevorzugte Oligonukleotidsynthesereagenzien der vorliegenden Erfindung die folgenden Strukturen auf:
Wie dem Fachmann sofort klar ist, kann eine große Vielfalt an in der Oligonukleotidsynthese üblichen festen Trägern verwendet werden. Ein fester Träger kann aus Glas mit kontrollierbarer Porosität, Copolymeren aus Ethylen und Acrylat, Copolymeren aus Ethylen und Methacrylat, Polystyrol und Mylar ausgewählt werden. Der feste Träger umfaßt eine funktionelle Gruppe zum Binden eines geeigneten Phosphoramidits unter Bildung einer Phosphoramidatverknüpfung, substituierten Phosphoramiditverknüpfung oder geeigneten Esterverknüpfung daran durch Routineverfahren, allgemeine funktionelle Gruppen umfassen Hydroxyl, Sulfhydryl und Amino. Es wurden die folgenden beispielhaften Träger verwendett: CPG [Pon, R. T. et al., Biotechniques 6, 768 (1988), Adams, S. P. et al., J. Amer. Chem. Soc. 105, 661 (1993)], Fractogel [vertrieben von E. Merck, Darmstadt, Deutschland unter dem Namen „Fractogel" und von TosoHaas, Philadelphia, Pennsylvania unter dem Namen „Toyopearl", Reddy, M. P. et al., Tetrahedron Letters 35, 5771–5774 (1994)] und Tentagel [beziehbar von Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland, Andrus et al., Tetrahedron Letters 34, 3373–3376 (1993)]. Für den Fachmann ist es verständlich, dass der feste Träger mit einer Abstandshalterverknüpfung derivatisiert sein kann, die eine zur Bildung der Bindung an die benachbarten reaktiven Gruppen geeignete funktionelle Gruppe aufweist. Solche Abstandshalterverknüpfungen werden von machen bevorzugt, weil sie als Leine wirken können, um den festen Träger räumlich entfernt zu halten.
Andere üblicherweise in der DNA-Synthese verwendeten Träger [wie zum Beispiel in Gait, M. J., Oligonucleotid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1984) und in dem U.S. Patent Nr. 4,923,901 beschrieben ist] könnten ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sein. Geeignete feste Träger sind in harziger oder partikulärer Form, in anderen vorgebildeten Formen von beliebiger Größe, Fasern, Filmen usw. verwendbar.
Das Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise in jedem Oliognukleotidsyntheseverfahren verwendet werden, das in der Lage ist, eine ungeschützte oder geschützte -OH-, -SH-, -NH₂-Gruppe zu verwenden und umfaßt Phosphoramiditreagenzien verwendende Verfahren, mit der am meisten verwendeten Kopplungschemie zur Synthese von Oligonukleotiden. Andere Arten der Kopplungschemie sind jedoch gleichwertig zur Verwendung geeignet, wie zum Beispiel die H-Phosphonatchemie [U.S. Patent Nr. 4,959,463, Froehler, B. C. et al., Nucleic Acids Research 14, 5399 (1986)] und die Triesterchemie [Stec, W. J. et al. Tetrahedron Letters 26, 2191 (1985), Gallo, K. O. et al., Nucleic Acids Research 14, 7406 (1986), Gait, M. J., Oligonucleotid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1984)]. Es können daher verschiedene Arten von Nukleinsäuren in der Synthese von Oligonukleotiden angewandt werden. Die Produkte, die synthetisiert werden können, umfassen DNA, RNA, Oligonukleoside, Methylphosphonate [Agarwal, S. & Goodchild, J. Tetrahedron Letters 28, 3539 (1987)], Oliogonukleosidphosphorthioate [Beaucage, S. L. et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)], Oligonukleosidphosphordithioate [Dahl, O. & Bjergade, K., Nucleic Acids Research 19, 5843 (1991)], kreisförmige Oligonukleotide, E. T. & Wang, S., Nucleic Acids Research 22, 2326 (1994), Kool E. T. et al., J. Amer. Chem. Soc. 115, 360 (1993)], 2'-OMe RNA [Sproat, B. S. et al., Nucleic Acids Research 18, 41 (1989)] und Peptidnukleinsäuren enthaltende Produkte [Nielsen, P. E. et al., Bioconjugate Chem. 5, 3 (1994)] oder mit einem morpholinartigen Gerüst modifizierte Nukleinsäuren [Stirchak et al., Nucleic Acids Research 17 6129 (1989), U.S. Patent Nr. 5,034,506].
Die Synthese auf einem festen Träger auf die hier beschriebene Art lässt ebenfalls die Wahl zu, ein an einen festen Träger gebundenes Oligonukleotid zu erzeugen. Das an den Träger gebundene Oligonukleotid kann in einer Vielfalt von Anwendungen, wie zum Beispiel DNA-Affinitätsextraktionen und umgekehrte Blothybridiserung verwendet werden. In einer Methode wird am Ende der Oligonukleotidsynthese der feste Träger bei Raumtemperatur mit Methylamin während ungefähr 1 Stunde behandelt, um die Schutzgruppen von den heterocyclischen Aminogruppen der in den Nukleosiden enthaltenen Purin- und Pyrimidinbasen zu entfernen. Diese Behandlung setzt nur eine geringe Menge des Oligonukleotids von dem festen Träger frei, während der größere Teil des Oligonukleotids intakt auf dem festen Träger bleibt. Dies liefert ein biologisch aktives Oligonukleotid, das noch an den festen Träger gebunden ist.
In einer anderen Methode wird die benachbarte Hydroxylgruppe durch eine Gruppe wie zum Beispiel Silyl geschützt. In solchen Systemen bleiben die Oligonukleotide an den Träger nach der Behandlung mit beispielsweise CH₃NH₂ gebunden. Die Silylgruppe kann jedoch zum Beispiel durch Tetrabutylammoniumfluorid entfernt werden, wodurch die Hydroxylgruppe freigegeben wird, unter basischen Bedingungen greift die freigegebene Hydroxylgruppe das benachbarte Phosphat unter Freisetzung der DNA von dem festen Träger an.
Entsprechend einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Spaltung eines Oligonukleotids von einem festen Träger und die zur Spaltung von Oligonukleotiden von einem festen Träger, an den sie synthetisiert worden sind, verwendbare Reagenzien zur Verfügung gestellt. Die Spaltungsreagenzien und Spaltungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in Oligonukleotidsynthesesystemen angewandt, wobei das Oligonukleotid durch die schrittweise Addition eines Nukleosids von einer Hydroxyl- oder dazu gleichwertigen Gruppe eines nachbarständigen Diolpaars oder eines dazu funktionell gleichwertigen Paars synthetisiert wird. Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotidreagenz zur Spaltung von Oligonukleotiden verwendbar, die unter Verwendung des Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung synthetisiert worden sind. Die Verfahren und Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung sind jedoch genauso zur Spaltung von Oligonukleotiden verwendbar, die an feste Träger durch Esterverknüpfungen und Phosphatverknüpfungen gebunden sind.
Insbesondere betreffen die Spaltungsverfahren der vorliegenden Erfindung das Kontaktieren des ein Oligonukleotid-tragenden festen Trägers mit einem Spaltungsreagenz der vorliegenden Erfindung, das eine Mischung aus einem Amin, das aus der Gruppe, bestehend aus tertiären Aminen und sekundären Aminen ausgewählt ist, und eine Base umfaßt, die aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumhydroxid und einem primären Amin ausgewählt ist. Ein besonders bevorzugtes Spaltungsreagenz ist eine Lösung aus Trimethylamin und Methylamin. Zusätzliche für die praktische Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignete sekundäre und tertiäre Amine umfassen eine Vielfalt von Aminen (Basen mit höheren pKa-Werten), wie zum Beispiel Triethylamin, n-Propylamin, Diisopropylamin, Diisopropylethylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Piperidin, N-Methylpiperidin und N-Methylpyrrolidin. Bevorzugte tertiäre Amine umfassen Trimethylamin, Triethylamin, N-Methylpyrrolidin und Diisopropylethylamin. Wie nachstehend gezeigt wird, kann die Menge an Ammoniumhydroxid oder primärem Amin und die Menge an sekundärem Amin oder tertiärem Amin in dem Spaltungsreagenz beträchtlich variieren. Zum Beispiel liegt in bevorzugten Spaltungsreagenzien das Verhältnis von Methylamin oder Ammoniumhydroxid zu sekundärem Amin oder tertiärem Amin innerhalb des Bereichs von ungefähr 1 : 100 bis ungefähr 100 : 1, Bevorzugte Verhältnisse von Konzentrationen und Bestandteilen liegen mindestens bei 9 Teilen einer wässrigen Methylaminlösung zu einem Teil organischer Base mit einer Basizität, die größer als Ammoniak ist. Das besonders bevorzugte Spaltungsreagenz ist 1 Teil wässriges Methylamin mit 40 Gew.-% zu 1 Teil Trimethylamin mit 3 bis 25 Gew.-%. (Der Fachmann wird erkennen, dass Methylamin und Trimethylamin Gase bei Standardtemperatur und -Druck sind und sie typischerweise in Form einer wässrigen Lösung verfügbar sind. Typisches wässriges Methylamin ist Methylamin mit 40 Gew.-% und typische Trimethylaminkonzentrationen liegen im Bereich von 23–25 Gew.-%. Entsprechend der Verwendung im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Hinweis auf eine Lösung mit 1 : 1 v/v Methylamin und Trimethylamin auf eine Lösung mit 1 : 1 v/v von 40 Gew.-% Methylamin und ungefähr 24 Gew.-% Trimethylamin.) Im Umfang der vorliegenden Erfindung wird weiterhin beabsichtigt, anorganische Salze in die Reaktionsmischungen zur Erhöhung der Spaltungskinetik einzubeziehen. Solche Salze sind typischerweise Li- oder Na-Salze, jedoch sind auch andere Kationen einschließlich Mn und Mg geeignet. Es wurde entdeckt, dass bei Verwendung von 0,5 M LiCl in einem Spaltungsreagenz mit Methylamin : Triethylamin von 1 : 1 die nach 15 Minuten bei 65°C gespaltene Oligonukleotidmenge von ungefähr 45 (in Abwesenheit von LiCl) auf ungefähr 65 Minuten zunimmt.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird die Spaltungsgeschwindigkeit des Oligonukleotids von dem festen Träger durch die Art der Bindung zwischen dem festen Träger und der Oligonukleotidsynthesestelle beeinflusst. Insbesondere erfordern Spaltungsreaktionen, die Oligonukleotide betreffen, die an benachbarte Stellen synthetisiert worden sind, die an einen festen durch Esterbindungen gebunden sind, zuerst die Hydrolyse der Esterbindung und anschließend die Spaltung des Oligonukleotids von der nachbarständigen Stelle. In Bezug auf die Verwendung einer aliphathi schen Esterverknüpfung zur Anbindung der Bindungsgruppe, die eine nachbarständige Diolgruppe an dem festen Träger umfaßt, erleichtert die Verwendung von Phosphoramidatverknüpfungen eine schnellere Spaltungskinetik.
Im Falle einer Esterverknüpfung (entsprechend der Beschreibung in deBear et al.) wird der Ester zuerst in ungefähr 5 Minuten hydrolysiert. Dieses setzt das Oligonukleotid und die Bindungsgruppe von dem festen Träger frei. Die Abspaltung der Bindungsgruppe von dem Oligonukleotid erfordert dann zusätzlich Inkubation während ungefähr 4 Stunden bei 65°C.
Im Falle der Verwendung der Oligonukleotidsynthesereagenzien mit einer Phosphoramidatverknüpfung, entsprechend der vorliegenden Erfindung, wird das Oligonukleotid von der nachbarständigen reaktiven Stelle freigesetzt und die Phosphoramidatbindung bleibt intakt und noch an dem Träger gebunden. Diese Spaltungsreaktion kann unter Verwendung eines Spaltungsreagenz mit Methylamin/Trimethylamin von 1 : 1 v/v (wie vorstehend beschrieben) in näherungsweise 90 Minuten bei 65°C ausgeführt werden. Von der Verknüpfung werden signifikante Oligonukleotidmengen in einer wesentlich kürzeren Zeitdauer freigesetzt. Das heißt, dass ungefähr 60% des Oligonukleotids nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten freigesetzt werden. Dies weist darauf hin, dass die Phosphoramidatgruppe der Verknüpfungsgruppe die Spaltung des nachbarständigen Diolsystems von der Nukleinsäure beschleunigt.
Bei der Untersuchung der Spaltung eines Oligonukleotids von nachbarständigen Diolsystemen, die an einen festen Träger durch eine Esterverknüpfung gebundenen sind, wurde bemerkt, dass die Verwendung von konzentriertem Ammoniak bei 65°C eine Inkubationszeit von 24 Stunden erforderte, was eine kommerziell unerwünschte Zeitdauer ist. Bei der Verwendung von Methylamin/Ammoniak wurde die Spaltungsdauer auf 12 Stunden verkürzt, jedoch war die Verkürzung in der Zeitdauer nicht so groß, als gestützt auf die Reaktivität von Methylamin zu erwarten war. Es wurde berichtet [Reddy, M. P. et al., Tetrahedron Letters 35, 4311 (1994), U.S. Patent Nr. 5,348,868], dass Methylamin ungefähr 10 mal reaktiver als Ammoniak bei der Bewirkung der Esterhydrolyse aufgrund dessen höherer Nukleophilie ist. Da Methylamin nur die ungefähr 2-fache Kinetik zeigte, wurde vermutet, dass Methylamin bloß als eine stärkere Base als Ammoniak und nicht als ein stärkeres Nukleophil wirken könn te. Dies weist darauf hin, dass eine stärkere Base zur Aktivierung eines Hydroxyls des nachbarständigen Diolsystems gebraucht werden könnte, um einen Angriff auf das benachbarte Hydroxyl zu machen.
Dementsprechend wurde eine Vielfalt an starken organischen Basen (Basen mit höheren pKa-Werten), wie zum Beispiel Trimethylamin, Triethylamin, n-Propylamin, Diisopropylamin, Diisopropylethylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Piperidin, N-Methylpiperidin und N-Methylpyrrolidin in einer 1 : 1 Mischung mit Methylamin angewandt. Methylamin wurde zur Entfernung der Schutzgruppen von den heterocyclischen Aminogruppen des Oligonukleotids und zur Entfernung der Phosphatschutzgruppe der Nukleoside in dem zu synthetisierenden Oligonukleotid verwendet. Unter Verwendung dieser beispielhaften Zusammensetzungen wurde die Spaltungszeit auf einen Wert zwischen 3 Stunden und 7 Stunden verkürzt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Spaltung von Oligonukleotiden von praktisch jeder Art nachbarständigen Diols oder gleichwertigen für die Oligonukleotidsynthese verwendeten Systems geeignet. Solche Systeme können durch die allgemeine Formel
beschrieben werden, wobei S ein fester Träger ist, A eine Verknüpfungsgruppe ist, X und Y unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -SH und -NH₂ ausgewählt sind und R⁹, R¹⁰ und R¹¹ Substituenten sind, die nicht die Oligonukleotidsynthesereaktion stören. Der Fachmann erkennt, dass Amino- oder Thiolgruppen unter bestimmten Bedingungen Vorteile in Bezug auf die Verleihung von mehr Stabilität und/oder Bereitstellung schnellerer Kinetik bezüglich der Freisetzung von Nukleinsäuren von dem festen Träger liefern. In bevorzugten Systemen umfassen zwei von R⁹, R¹⁰ und R¹¹ zusammen eine einzige Einheit, die (in Kombination mit den die X- und Y-Substituenten tragenden Kohlenstoffatomen) ein Ringsystem bildet. Zum Beispiel ist die Spaltungskinetik mit einem Uridinsystem schneller als im Vergleich zu einem Glycerolsystem, wahrscheinlich aufgrund der freien Rotation um die Glycerol C-C-Bindung, was weniger zur Bildung des cyclischen Phosphats förderlich ist. Im Falle der bevorzugten Systeme (wie zum Beispiel diejenigen, die Uridin umfassen) sind die Hydroxylgruppen in einer cis-Konfiguration arretiert, die der Bildung des cyclischen Phosphats förderlich ist. Eine große Vielfalt an anderen nachbarständigen Diolsystemen (wie zum Beispiel Dihydroxylcyclopentan, Dihydroxycyclohexan und Anhydroerythritol) wären ebenfalls geeignet.
Der Fachmann erkennt, dass die Blockierungseinheit an einer nachbarständigen Position des Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung oder eines anderen relevanten festen Trägersystems sich nicht auf die Gesamtspaltungszeit unter Verwendung der Reagenzien der vorliegenden Erfindung auswirkt. Das heißt, dass die Spaltungszeitdauer sich nicht darauf bezieht, ob die Gruppe zum Beispiel durch eine Acetylgruppe oder eine Benzoylgruppe geschützt war. Dies bestätigt weiterhin, dass die Esterhydrolyse (das heißt die Entfernung der Schutzgruppe von dem Hydroxyl) kein geschwindigkeitsbestimmender schneller Schritt ist, wohingegen der Angriff auf die freigegebene Hydroxylgruppe auf dem benachbarten Phosphor des synthetisierten Oligonukleotids ein geschwindigkeitsbestimmender langsamerer Schritt ist.
Die Erfindung kann besser unter Bezugnahme auf die begleitenden Beispiele verstanden werden, die nur für erläuternde Zwecke zur Verfügung gestellt werden und in keiner Weise dahingehend anzusehen sind, dass sie den Umfang der Erfindung, entsprechend der Definition der beigefügten Ansprüchen einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Synthese von 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-5'-O-(N,Ndiisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramidit
Das folgende Beispiel beschreibt die Synthese eines Phosphoramiditreagenz, das für die Herstellung eines Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin (0,65 g, 1,1 mmol) wurde durch aufeinanderfolgende Eindampfung zusammen mit Pyridin, Toluol und THF getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde in trockenem THF (5 ml) gelöst, N,N-Diisopropylethylamin (0,85 ml, 4 mmol) wurde zugegeben und anschließend wurde tropfweise β-Cyano-ethylmonochlor-N,N-diisopropylphosphoramidit (0,5 ml, 2 mmol) unter Verwendung einer Spritze unter fortwährendem Rühren unter Argon bei Raumtemperatur während 5 Minuten zugegeben. Nach 60 Minuten zusätzlichem Rühren wurde die Reaktionsmischung zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat (50 ml) gelöst, mit 10% NaHCO₃-Lösung (2 × 50 ml) gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Ethylacetats unter verringertem Druck wurde der Rückstand unter Verwendung von Silicagel- (vorgeheizt bei 100–120°C) Säulenchromatographie gereinigt. Die Säule wurde mit dem vorgeheiztem Silicagel in Ethylacetat/Diisopropylamin 95/5 v/v gepackt und mit Ethylacetat eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, unter verringertem Druck eingedampft und unter Verwendung von Hochvakuum getrocknet, um die Titelverbindung als einen weißen Festkörper zu liefern (0,6 g, 69% Ausbeute).
Das ¹H-NMR in CDCl₃ war wie folgt: δ 1,19 (m, 12H, 2CH(CH ₃)₂, 1,97 (d, 3H, COCH ₃), 2,46 (m, 4H, CH ₂CH₂CN), 3,63 (m, 4H, C_5'CH ₂ und 2 × CH(CH ₃)₂), 3,77 (d, 6H, 2 × OCH ₃), 4,13 (m, 1H, C_4'H), 4,29 (m, 1H, C_3'H), 5,0 (m, 1H, C_2'H), 5,69 (m, 1H, C_1'H), 6,50 (m, 1H, C₅H) und 6,75–7,72 (m, 14H, C₆H und aromatische Protonen von DMT).
Die ³¹P-NMR-Daten in CDCl₃ waren folgende: δ 147,98 und 148,56 ppm.
Beispiel 2
Synthese von 2'-Trifluoracetamindo-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-succinat (Hydroxyl/Amino analog)
Im folgenden wird die Synthese eines für die Herstellung eines festen Trägers geeigneten Succinats beschrieben, das wiederum zur Herstellung eines Oligonukleotids verwendet werden kann, das in der Lage ist, unter Verwendung eines Spaltungsreagenz der vorliegenden Erfindung gespalten zu werden. 2'-Amino-2'-Desoxyuridin, das entsprechend Verfahren aus der Literatur hergestellt wurde [J. Moffat et al., J. Org. Chem. 36, 250 (1971), F. Eckstein et al., J. Org. Chem. 42, 714 (1977)] (3,1 g, 12,76 mmol) wurde in trockenem Methanol (260 ml) suspendiert und S-Ethyltrifluoracetat (2,5 ml, 19,67 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt und dann bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehengelassen, um eine homogene und klare Lösung zu erhalten. Durch diese Lösung ließ man 1 Stunde Stickstoff hindurchperlen. Die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt, woraus sich 4 g des 2'-Trifluoracetamido-2'-desoxyuridinzwischenprodukts ergaben, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Dieses Zwischenprodukt (1,5 g, 4,62 mmol) wurde durch Eindampfung zusammen mit trockenem Pyridin ( 2 × 50 ml) getrocknet und in Imidazol (0,35 g, 5 mmol) enthaltendem trockenen Pyridin (50 ml) gelöst. tert-Butyldimethylsilylchlorid (0,75 g, 5 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst, mit 5% Natriumbicarbonatlösung (2 × 50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab ein Rohprodukt, das auf Silicagel (60 g) gereinigt wurde. Die Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (98/2, v/v) ergab 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-trifluoracetamido-2'desoxyuridin (1,63 g, 78% Ausbeute).
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-trifluoracetamido-2'desoxyuridin (1,5 g, 3,3 mmol) wurde durch Eindampfung zusammen mit trockenem Pyridin (2 × 50 ml) getrocknet und in trockenem Pyridin (50 ml) gelöst. Dimethoxytritylchlorid (1,725 g, 5,1 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde über Nacht (16 Stunden) gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Methanol verdünnt und die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst, mit 5% Natriumbicarbonatlösung (1 × 100 ml), Kochsalzlösung (1 × 100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das auf Silicagel unter Verwendung des Eluierungslösungsmittels CH₂Cl₂-MeOH (99 : 1, v/v) gereinigt wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft, woraus sich 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-5'-O-(tertbutyldimethylsilyl)-2'-desoxyuridin (1,8 g, 72,29%) ergab.
2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2'-desoxyuridin (1,5 g, 1,98 mmol) wurde mit (20 ml) 1,0 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF bei Raumtemperatur während 15 Stunden behandelt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, der Rückstand in CH₂Cl₂ gelöst und auf eine Silicagelsäule gegeben, die mit 400 ml Portionen von 0–3% Methanol in CH₂Cl₂ eluiert wurde. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, zur Trockene eingedampft und unter Vakuum getrocknet, woraus sich 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin (0,9 g, 71% Ausbeute) ergab.
2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin (0,64 g, 1 mmol), Succinsäureanhydrid (0,32 g, 2,55 mmol) und DMAP (0,7 g, 2,5 mmol) wurden in wasserfreiem Pyridin (15 ml) gelöst und bei Raumtemperatur während 24 Stunden gerührt. Das Pyridin wurde unter verringertem Druck verdampft und der Rückstand wurde zusammen mit trockenem Toluol (2 × 10 ml) eingedampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst und bei Raumtemperatur unter schnellem Rühren in Hexan (100 ml) gefällt. Das Produkt wurde filtriert und unter Vakuum getrocknet, woraus sich 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'succinat ergab.
Beispiel 3
Synthese von 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-O(N,N'-diisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramidit
Im folgenden wird die Synthese eines Phosphoramiditreagenz beschrieben, das zur Herstellung eines Oligonukleotidreagenz der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin (0,64 g, 1 mmol) wurde durch aufeinanderfolgende Eindampfung zusammen mit Pyridin, Toluol getrocknet und in trockenem THF (5 ml) gelöst, das N,N-Diisopropylethylamin (0,85 ml, 4 mmol) enthielt. Zu dieser Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze tropfweise β-Cyanoethylmonochlor-N,N-diisopropylphosphoramidit (0,5 ml, 2 mmol) unter fortwährendem Rühren unter Argonatmosphäre bei Raumtemperatur während 5 Minuten zugegeben. Nach 90 Minuten Rühren wurde die Reaktionsmischung zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) gelöst, mit 10% NaH-CO₃-Lösung (2 × 50 ml) gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Verdampfung des Ethylacetats unter verringertem Druck wurde der Rückstand unter Verwendung einer Silicagel- (vorgeheizt bei 100–120°C) Säule gereinigt, woraus sich 2'-Trifluoracetamido-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-O-(N,N'-diisopropyl)β-cyanoethylphosphoramidit ergab.
Beispiel 4
Synthese von 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-succinat (Hydroxyl/Thiol analog)
Im folgenden wird die Synthese eines geeigneten Succinatreagenz beschrieben, das zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet wird, die unter Verwendung der Spaltungsreagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, anschließend gespalten zu werden. 2'-Desoxy-2'-mercaptouridin, das entsprechend dem Verfahren aus der Literatur [B. Reese et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 969 (1990)] (2,6 g, 10 mmol) hergestellt wurde, wurde in trockenem Pyridin (50 ml) mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (3,13 ml, 10 mmol) unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur behandelt. TLC zeigte nach 4 Stunden eine vollständige Reaktion an, das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der übrige Sirup in Ethylacetat (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 5% wässriger Natriumbicarbonatlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das rohe 3',5'-O(Tetraisopropyldisioloxan-1,3-diyl)-2'-desoxy-2'-mercaptouridin wurde auf eine Sllicagelsäule unter Verwendung von CH₂Cl₂ als Eluierungslösungsmittel gereinigt.
3',5'-O-(Tetraisopropyldisioloxan-1,3-diyl)-2'-desoxy-2'-mercaptouridin (5 mmol) wurde in trockenem Pyridin (20 ml) gelöst, das DMAP (250 g, 2 mmol) enthielt. Benzoylchlorid (10 mmol) wurden zugegeben und die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand in CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst, mit 5% wässriger Natriumbicarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohprodukt 3',5'-O-(Tetraisopropyldisioloxan-1,3-diyl)-2'-desoxy-2'-(benzoylthio)uridin wurde mit (Tetraisopropyldisioloxan-1,3-diyl)-2'-desoxy-2'-(benzoylthio)uridin wurde mit Silicagelsäulenchromatographie gereinigt.
3',5'-O-(Tetraisopropyldisioloxan-1,3-diyl)-2'-desoxy-2'-(benzoylthio)uridin (3,25 mmol) wurde in 25 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran gelöst. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand in CH₂Cl₂ (10 ml) aufgenommen und mit Silicagelsäulenchromatographie gereinigt, um 2'-Desoxy-2'-(bezoylthio)uridin zu liefern.
2'-Desoxy-2'-(benzoylthio)uridin (2,75 mmol) wurde durch Eindampfung zusammen mit trockenem Pyridin (2 × 20 ml) getrocknet und in trockenem Pyridin (50 ml) gelöst, das Imidazol(5 mmol) enthielt, tert-Butyldimethylsilylchlorid (5 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 16 STunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst, mit 5% Natriumbicarbonatlösung (2 × 50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohproukt 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxy-2'(benzoylthio)uridin, das mit Silicagelsäulenchromatographie gereinigt wurde.
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxy-2'-(benzoylthio)uridin (2,09 mmol) wurden durch Eindampfung zusammen mit trockenem Pyridin (2 × 10 ml) getrocknet und in trockenem Pyridin (25 ml) gelöst. Dimethoxytritylchlorid (3 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (16 Stunden) gerührt und dann mit Methanol (10 ml) verdünnt. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt, der Rückstand in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst, mit 5% Natriumbicarbonatlösung (2 × 50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-2'(benzoylthio)uridin, das mit Silicagelsäulenchromatographie gereinigt wurde.
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-2'(benzoylthio)uridin (1,4 mmol) wurden mit 20 ml 1,0 M Tetrabutylamoniumfluorid in THF bei Raumtemperatur während 16 Stunden behandelt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde mit Silicagelsäulenchromatographie gereinigt, um 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin zu liefern.
2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin (1 mmol), Succinsäureanhydrid (2,55 mmol) und DMAP (2,5 mmol) wurden in wasserfreiem Pyridin (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur während 24 Stunden gerührt. Das Pyridin wurde unter verringertem Druck verdampft und der Rückstand wurde zusammen mit trockenem Toluol (2 × 100 ml) eingedampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (15 ml) gelöst und bei Raumtemperatur in Hexan (100 ml) unter schnellem Rühren gefällt. Das Produkt wurde filtriert und unter Vakuum getrocknet, woraus sich 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'.desoxyuridin-5'-succinct ergaben.
Beispiel 5
Synthese von 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-O-(N,N'-diisopropyl)-β-cyanoethylghosphoramidit
Im folgenden wird die Synthese eines Phosphoramiditreagenz beschrieben, das zur Herstellung eines Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin (1 mmol) wurde durch aufeinandertolgende Eindampfung zusammen mit Pyridin und Toluol getrocknet und in trockenem THF (5 ml) gelöst, das N,N-Diisopropylethylamin (4 mmol) enthielt. Zu dieser Lösung wurde β-Cyanoethylmonochlordiisopropylphosphoramidit (2 mmol) tropfweise unter Verwendung einer Spritze unter fortwährendem Rühren unter Argon bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 5 Minuten gegeben. Nach 60 Minuten Rühren wurde die Reaktionsmischung zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat (50 ml) gelöst und mit 10% NaHCO₃-Lösung (2 × 50 ml) gewaschen und die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Verdampfung des Ethylacetats unter verringertem Druck wurde der Rückstand durch Silicagel- (vorgeheizt bei 100–120°C) Säulenchromatographie gereinigt, um 2'-(Benzoylthio)-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-5'-O-(N,N'-diisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramidit zu liefern.
Beispiel 6
Synthese von 2'(3')-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'(3')-O-acetyluridin-5'-succinat
Uridin (10 g, 41 mmol), Toluol-p-sulfonsäuremonohydrat (2 g, 0,5 mmol) und Trimethylorthoacetat wurden zusammen bei 20°C während 20 Stunden gerührt. TLC zeigte zwei Produkte im Verhältnis 4 : 1, es wurde kein Uridin gefunden. Die Reaktionsmischung wurde mit methanolischem MeONa leicht basisch gemacht, zu einem Öl eingeengt, in CH₂Cl₂ gelöst und durch Aluminasäulenchromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit (CH₂Cl₂ : MeOH, 96 : 4, v/v) eluiert, die gewünschten Fraktionen gesammelt und unter reduziertem Druck eingedampft, woraus sich 2',3'-O-Methoxyethylidenuridin (8,8 g, 71,8% Ausbeute) als eine farbloses Glas ergaben.
IR (KBr): u 1670 cm^–1 (s, C=O des Ringamids), 2900–3600 cm^–1 (NH, OH).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,51 und 1,58 (2s, 3H, -CH ₃), 3,14 und 3,29 (2s, 3H, OCH ₃), 3,58 (m, 2H, C_5'CH ₂), 4,06 (m, 1H, C_4'-H), 4,89–5,10 (m, 2H, C_2'-H und C_3'-H), 5,63 (d, 1H, C₅-H), 5,80 und 5,95 (2d, 1H, C_1'-H), 7,77 (d, 1H, C₆-H) und 11,42 (s, 1H, -NH).
Zu 5,2 g (18 mmol) 2',3'-O-Methoxyethylidenuridin in THF (100 ml) wurde Imidazol (4,9 g, 4 Äquivalente) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von tert-Butyldimethylsilylchlorid (5,4 g, 2 Äquivalente). Die resultierende Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (16 Stunden) gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in CH₂Cl₂ (200 ml) aufgenommen, mit gesättigter NaCl-Lösung (200 ml) und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, woraus sich beinahe reines halbfestes 2',3'-O-Methoxyethyliden-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)uridin (7,2 g, 99 Ausbeute) ergab, diese Verbindung wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
IR (rein): 1650 cm^–1 (C=O des Ringamids) und 3400–3600 cm^–1 (NH, OH).
¹H-NMR (CDCl₃): δ -0,005 (s, 6H-Si(CH ₃)₂), 0,82 (s, 9H, Si-((CH ₃)₃), 1,55 und 1,6 (2s, 3H, -CH ₃), 2,79 und 2,87 (2s, 3H, OCH ₃), 3,82 (m, 2H, C_5'-CH ₂), 4,22 (m, 1H, C_4'H), 4,65 (m, 2H, C_'2H und C_3'H), 5,64 (d, 1H, C₅-H), 6,0 (2d, 1H, C_1'-H), 7,50 (d, 1H, C₆-H) und 9,35 (br, 1H, NH).
Zu 8,0 g (27,58 mmol) 2',3'-O-Methoxyethyliden-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)uridin wurde 80% wässrige Essigsäure (20 ml) gegeben und die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min gerührt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde der rohe Rückstand durch Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (97/3, v/v) als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthielten, wurden gesammelt, eingedampft und unter Vakuum getrocknet, woraus sich halbfestes 2'(3')-O-Acetyl-5'-O(tert-butyldimethylsilyl)uridin (7,6 g, 68% Ausbeute) ergab.
IR (rein): u 1701 cm^–1 (s, br, C=O der Acetylgruppe und des Ringamids).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 0,07 (s, 6H, -Si(CH ₃)₂), 0,87 (s, 9H, -Si(CH ₃)₃), 2,03 und 2,10 (2s, 3H, COCH ₃), 3,87 (m, 2H, C_5'-CH ₂), 4,33 (2m, 2H, C_3'H und C_4'H), 4,7 (m, 1H, C_2'H), 5,65 (d, 1H, C₅H), 6,06 (2d, 1H, C_1'-H), 7,85 (d, 1H, C₆H) und 10,18 (br, s 1H, NH).
2'(3')-O-Acetyl-5'-O-(tert butyldimethylsilyl)uridin (4 g, 10 mmol) wurden in trockenem CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst. Nach Zugabe von Collidin (4 ml) wurde Tetrabutylammoniumperchlorat (5,13 g, 1,5 Äquivalente) und Dimethoxytritylchlorid (5,07 g, 1,5 Äquivalente) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht (16 Stunden) gerührt, hintereinander mit 2 × 50 ml 5% wässriger NaHCO₃-Lösung und 2 × 50 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt, die Säule wurde mit Silicagel in 1% TEA/CH₂Cl₂ gepackt und das Produkt mit CH₂Cl₂ eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft, woraus sich 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)uridin (4,8 g, 66% Ausbeute) ergab.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 0,6 (m, 6H, Si(CH ₃)₂), 0,88 (2s, 9H, Si(CH ₃)₃), 2,22 (2s, 3H, COCN₃), 3,52 (m, 2H, C_5'-CH ₂), 3,85 (2s, 6H, 2 × OCH ₃), 4,07 (m, 1H, C_4'H), 4,26 (m, 1H, C_3'H), 5,08 (m, 1H, C_2'H), 5,71 (2d, 1H, C_1'H), 6,59 (2d, 1H, C₅H), 6,80–7,83 (m, 13H, aromatische H) und 8,74 (d, 1H, C₆ H).
2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)uridin (1,5 g, 2,14 mmol) wurde in (15 ml) 1,0 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF gelöst und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 15 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (10 ml) aufgenommen und auf eine Silicagelsäule gegeben, die mit 400 ml Portionen von 0–3% Methanol in CH₂Cl₂ eluiert wurde. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, zur Trockene eingedampft und unter Vakuum getrocknet, woraus sich 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin (1 g, 79,4% Ausbeute ergab.
¹H-NMR (CDCl₃): d 2,07 (d, 3H, -COCH ₃), 3,61 (m, 2H, C_5'-CH ₂), 3,83 (d, 6H, 2 × OCH ₃), 3,89 (m, 1H, C_4'H), 4,44 (m, 1H, C_3'H), 4,91 (m, 1H, C_2'H), 5,66 (m, C_1'H), 6,03 (m, 1H, C₅H), 6,75–7,43 (m, 13H, aromatische H), 7,49 (m, 1H, C₆H).
2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin (0,59 g, 1 mmol), Succinsäureanhydrid (0,32 g, 2,55 mmol) und DMAP (0,7 g, 2,5 mmol) wurden in wasserfreiem Pyridin (10 ml) gelöst und bei Raumtemperatur während 24 Stunden gerührt. Das Pyridin wurde unter verringertem Druck verdampft und der Rückstand zusammen mit trockenem Toluol (2 × 10 ml) eingedampft. Der klebrige Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst und mit gesättigter NaCl-Lösung (2 × 40 ml) und Wasser (40 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und dann eingedampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst und bei Raumtemperatur unter schnellem Rühren in Hexan (100 ml) gefällt. Das Produkt wurde filtriert und unter Vakuum getrocknet, woraus sich 2'(3')-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'(3')-Oacetyluridin-5'succinat (0,4 g, 60% Ausbeute) ergab.
Schmelzpunkt: 100–115°C (dec.).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,07 (d, 3H, COCH ₃), 2,50 (m, 4H, COCH ₂CH ₂CO), 2,96 (m, 2H, C_'5CH ₂), 3,75 (d, 6H, 2 × OCH ₃), 4,10 (m, 2H, C_4'H und C_3'H), 4,23 (m, 1H, C_2'H), 5,66 (d, 1H, C_1'H), 6,23 (d, 1H, C₅H), 6,74–7,41 (m, 14H, DMT-Gruppe und C₆H) und 9,50 (s, 1H, COOH).
Beispiel 7
Herstellung des Hydroxy-derivatisierten festen Trägers
Im folgenden wird die Herstellung eines festen Trägers für seine anschließende Reaktion mit einem zur Bildung eine Oligonukleotidsynthesereagenz geeigneten Reagenz beschrieben. Zu einer Suspension von Toyopearl AF-Amino Harz (1 g, Amino = 300 μmol/g, TosoHaas, Philadelphia, PA) in 4 ml trockenem DMF wurde eine Lösung aus p-Nitrophenol-4-[di-(p-methoxyphenyl)phenylmethyloxy]butyrat (2,0 g, 0,4 M), hergestellt entsprechend dem Verfahren aus dem Literatur [J. Haralambidis et al, Nucleic Acid Research 18, 493 (1989)] in 4 ml Dioxan, gegeben, danach wurde TEA (2 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (16 Stunden) geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit DMF (5 ml), CH₃CN (2 × 5 ml), CH₂Cl₂ (2 × 5 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und unter Vakuum während 3 Stunden getrocknet. Das Harz wurde in 10 ml trockenem Pyridin suspendiert, nach Zugabe von DMAP (250 mg, 0,2 M) wurde Ac2O (2,5 ml, 2,5 M) zum Kappen von nicht umgesetzten Aminogruppen zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden geschüttelt. Das Harz wurde filtriert, mit trockenem Pyridin (10 ml), CH₃CN (10 ml) und Diethylether (10 ml) gewaschen und im Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Hydroxygruppenbeladung auf dem festen Träger im Bereich von 200–250 μmol/g lag, wie durch Messung (bei A₅₀₀ nm) zur Berechnung der Menge an freigesetztem Dimethoxytritylkation bestimmt wurde.
Ein ähnliches Verfahren wurde zur Funktionalisierung von CPG-LCAA und AMinopropyl-CPG [H. Seliger und Groger, Nukleosides and Nucleotides 7, 773 (1988)] Harzen mit Hydroxygruppen verwendet.
Beispiel 8
Derivatisierung des festen CPG-Trägers mit einer Uridineinheit über Phosphatverknüpfung
Im folgenden wird die Herstellung eines festen CPG-Trägers beschrieben, der zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden kann, die von dem festen Träger erfindungsgemäß abgespalten werden. Der feste CPG-OH Träger (500 mg, freie OH = 27 mmol/g) von Beispiel 7 wurde in trockenem Acetronitril (3 ml) suspendiert. Nach Zugabe von 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-5'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (39,4 mg, 0,05 mmol) wurde 2 ml eine 0,5 m Lösung von Tetrazol in CH₃CN zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit trockenem CH₃CN (2 × 3 ml) gewaschen und dann in 3 ml einer I₂-Lösung (0,3% I₂ in THF/Pyridin/Wasser – 93 : 5 : 2) suspendiert und man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur während 30 Min schütteln. Der feste Träger wurde filtriert, mit THF (2 × 5 ml) und CH₃CH (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum während 1–2 Stunden getrocknet. Nach Zugabe von 3 ml 17% N-Methylimidazol in THF zu dem festen Träger wurden 3 ml 10% Ac₂O, 10% Lutidin, 80% THF v/v zugegeben und man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur während 30 Minuten schütteln. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₃CN (2 × 5 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Beladung der Uridineinheit 20,2 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch Messung (bei A₅₀₀ nm) der Menge des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 9
Derivatisierung von Toyogearl (Fractogel 65 M) Harz mit einer Uridineinheit über Phosphatverknüpfung
Toyopearl (Fractogel 65 M) Harz (1 g, freie OH = 200 mmol/g) von Beispiel 7 wurde in trockenem CH₃CN (6 ml) suspendiert. Nach Zugabe von 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-5'-O-(β-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphoramidit (39,4 mg, 0,05 mmol) wurde 2 ml einer 0,5 M Lösung von Tetrazol in CH₃CN zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit trockenem CH₃CN (2 × 6 ml) gewaschen und dann in 6 ml einer I₂-Lösung (0,3% I₂ in THF/Pyridin/Wasser – 93 : 5 : 2) suspendiert und man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur während 30 Min schütteln. Der feste Träger wurde filtriert, mit THF (2 × 6 ml) und CH₃CH (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Nach Zugabe von 5 ml (17% N-Methylimidazol in THF) zu dem festen Träger wurden 5 ml (10% Ac₂O, 10% Lutidin, 80% THF v/v) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₃CN (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Beladung der Uridineinheit im Bereich von 45–55 μmol/g lag, entsprechend der Bestimmung durch Messung (bei A₅₀₀ nm) der Menge des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 10
Derivatisierung von Tentagel-Harz mit einer Uridineinheit über Phosphatverknüpfung
Tentagel-Hydroxyharz (500 mg, freie OH = 200 mmol/g) wurde mit einer Uridineinheit nach dem in den Beispielen 8 und 9 beschriebenen Verfahren derivatisiert. Es wurde festgestellt, dass die Beladung der Uridineinheit 17,6 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch Messung (bei A₅₀₀ nm) der Menge des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 11
Derivatisierung von Toyopearl (Fractogel AF-Amino 65 M) Harz mit Uridin über einen Phosphoramidatlinker
Toyopearl-AF-Amino-65-Harz (1 g, 300 mmol/g Aminogruppen, TosoHaas, Phildelphia, PA) wurde in trockenem CH₃CN (6 ml) suspendiert. Nach Zugabe von 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-5'-O-(β-cyanoethyl-N,Ndiisopropyl)phosphoramidit (39,4 mg, 0,05 mmol) wurde 2 ml einer 0,5 M Lösung von Tetrazol in CH₃CN zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit trockenem CH₃CN (2 × 6 ml) gewaschen und in 6 ml einer I₂-Lösung (0,3% I₂ in THF/Pyridin/Wasser – 93 : 5 : 2) suspendiert und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit THF (2 × 6 ml) und CH₃CH (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Nach Zugabe von 5 ml 17% N-Methylimidazol in THF zu dem festen Träger wurden 5 ml einer Lösung aus 10% Ac₂O, 10% Lutidin und 80% THF v/v zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₃CN (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Beladung der Uridineinheit auf dem Harz wurde durch Messung der Tritylabgabe eines kleinen Aliquots in 2,5% Dichloressigsäure in Dichlormethan bei 500 nm in einem Spektrophotometer bestimmt.
Die Beladung betrug in diesem Beispiel 45 μmol/g.
Beispiel 12
Derivatisierung von CPG-LCAA-Harz mit einer Uridineinheit über einen Phosphoramidatlinker
CPG-LCAA-Harz (Sigma, 500 mg, ~60 μmol/g Aminogruppen) wurde in trockenem CH₃CN (3 ml) suspendiert. Nach Zugabe von 2'(3')-O-Acetyl-2'(3')-O-(4,4'dimethoxytrityl)uridin-5'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (39,4 mg, 0,05 mmol) wurde 2 ml einer 0,5 M Lösung von Tetrazol in CH₃CN zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit trockenem CH₃CN (2 × 3 ml) gewaschen und dann in 5 ml einer I₂-Lösung (0,3% I₂ in THF/Pyridin/Wasser – 93 : 5 : 2) suspendiert und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit THF (2 × 5 ml) und CH₃CH (2 × 5 ml) gewaschen und unter Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Nach Zugabe von 3 ml 17% N-Methylimidazol in THF zu dem festen Träger wurden 3 ml einer Lösung aus 10% Ac₂O, 10% Lutidin und 80% THF v/v zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₃CN (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Uridinbeladung auf dem Träger betrug 8,1 μmol/g, entsprechend der Bestimmung des freigesetzten Dimethyltritylkations bei A₅₀₀ nm.
Beispiel 13
Derivatisierung von Toyopearl (Fractogel) AF-Amino 65 M Harz mit einer Uridineinheit über eine Succinatesterverknüpfung
1 g Toyopearl (Fractogel) AF-Amino-650M (Aminogruppen = 300 μmol/g) wurde in 10 ml trockenem Pyridin suspendiert, das Succinsäureanhydrid (1 g, 1 M) und N-Methylimidazol (1 ml) enthielt. Man ließ die Mischung bei Raumtemperatur während 16 Stunden stehen. Nach Filtration wurde der Träger mit wässrigem Pyridin, trockenem Pyridin (10 ml) und Diethylether (10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ein Ninhydrintest bezüglich freier Aminogruppen war negativ.
Der succinylierte Träger (1 g) wurde in trockenem Pyridin (10 ml) suspendiert, das 2',3'-O-Methoxyethylidinuridin (0,9 g, 3,12 mmol), DMAP (0,3 g, 2,46 mmol) und DCC (2,14 g, 10,37 mmol) enthielt, und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 48 Stunden geschüttelt. Zu dieser Lösung wurde p-Nitrophenol (1,8 g, 12,186 mmol) zugegeben und das Schütteln wurde während weiteren 20 Stunden fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Morpholin (1 ml) gequencht und das Schütteln wurde während weiteren 2 Stunden fortgesetzt, dieser Schritt ist zum Kappen der nicht umgesetzten Carbonsäuregruppen notwendig. Der feste Träger wurde filtriert, mit Pyridin (10 ml), MeOH (2 × 10 ml) und Diethylether (10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das 2',3'-Orthoesterzwischenprodukt wurde hydrolysiert, woraus sich eine Mischung aus 2',3'-Acetaten durch Behandlung mit 80% wässriger Essigsäure (10 ml) bei Raumtemperatur während 4 Stunden ergab. Nach Filtration wurde der feste Träger mit MeOH (2 × 10 ml) gewaschen, Diethylether (10 ml) wurden zugegeben und im Vakuum während 3 Stunden getrocknet.
Der feste Träger (1 g) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert, nach Zugabe von Collidin (0,66 ml, 0,5 M) wurde Tetrabutylammoniumperchlorat (0,17 g, 0,05 M) und Dimethoxytritylchlorid (0,169 g, 0,05 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₂Cl₂ (2 × 10 ml), MeOH (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 10 ml) gewaschen und unter Vakuum während 3 Stunden getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Beladung des festen Trägers mit der Uridineinheit 22,35 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch A₅₀₀ nm des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 14
Derivatisierung von Tentagel-Amino-Harz mit einer Uridineinheit über einen Succinatesterlinker
2'(3')-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'(3')-O-acetyluridin-5'-succinat (68,8 mg, 0,1 mmol) von Beispiel 6 wurde in trockenem Dioxan (4 ml) gelöst, das trockenes Pyridin (0,4 ml) und p-Nitrophenol (14 mg, 0,1 mmol) enthielt. Dann wurde 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (52 mg, 0,25 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 3 Stunden geschüttelt. Dann wurde der Dicyclohexylharnstoff durch Fitration entfernt und nach Zugabe des Überstands zu dem Tentagel-Amino-Harz (1 g, NH₂-Gruppen = 220 mmol/g, RAPP Polymer Company, Deutschland), das in trockenem DMF (4 ml) suspendiert war, wurde Triethylamin (2 ml) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 6 Stunden geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, gründlich mit DMF (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 5 ml) gewaschen und unter Vakuum während 1 Stunde getrocknet. Der feste Träger wurde in trockenem Pyridin (10 ml) resuspendiert, nach Zugabe von DMAP (250 mg, 0,2 M) wurde Essigsäureanhydrid (2,5 ml, 2,5 M) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 16 Stunden geschüttelt. Das Harz wurde filtriert, mit CH₃CN (2 × 10 ml) und Diethy lether (2 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Beladung des Harzes mit der Uridineinheit 48,8 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch A₅₀₀ nm des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 15
Derivatisierung von CPG-LCAA mit einer Uridineinheit über einen Succinatesterlinker
CPG (1 g, LCAA, Sigma, Aminogruppen = 60 mmol/g) wurde mit einer Uridineinheit durch einen Succinatesterlinker derivatisiert nach dem in den Beispielen 13 und 14 beschriebenen Verfahren. Es wurde festgestellt, dass die Beladung des festen Trägers mit Uridin 20,23 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch A₅₀₀ nm des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 16
Derivatisierung von Toyopearl (Fractogel) 65F-Harz mit einer Uridineinheit über einen Succinatesterlinker
Fractogel 65F-Harz (5 g Trockengewicht, TosoHaas, Philadelphia, PA) wurde in trockenem CH₃CN (50 ml) suspendiert, 1,1'-Carbonyldiimidazol (8,1 g zur Herstellung einer 1 M Lösung) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden geschüttelt. Der feste Träger wurde mit einem gesinterten Glastrichter filtriert, mit trockenem CH₃CH (2 × 50 ml) gewaschen und dann in trockenem CH₂Cl₂ (50 ml) resuspendiert. 1,12-Diamindodecan (10 g, zur Herstellung einer 1 M Lösung) wurden zugegeben und die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (16–20 Stunden) geschüttelt. N-Propylamin (4,1 ml, zur Herstellung einer 1 M Lösung) wurden der vorstehenden Mischung zugegeben und die Lösung wurde während einer weiteren Stunde geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und hintereinander mit trockenem CH₂Cl₂ (5 × 50 ml), Aceton (5 × 50 ml) und CH₃CN (5 × 20 ml) gewaschen, wobei das letzte Filtrat einen negativen Ninhydrintest zeigte, dann wurde das Harz mit Diethylether (2 × 20 ml) gewaschen und unter Vakuum während ungefähr 3 Stunden getrocknet. Es wurde festgestellt, dass der Gehalt an Aminogruppen auf dem festen Träger im Bereich von 300–400 μmol/g lag, entsprechend der Bestimmung durch einen Pikrinsäureassay. [J. M. Stewart & J. D.
Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, 107 (1984)]. Dann wurde der feste Träger wiederum mit Succinsäureanhydrid nach dem in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren umgesetzt. Das succinylierte Harz (1 g) wurde dann mit dem Uridinderivat nach dem Verfahren von Beispiel 13 funktionalisiert. Der feste Träger wurde nach dem Verfahren von Beispiel 13 mit Dimethoxytritylchlorid umgesetzt. Es wurde festgestellt, dass die Beladung des festen Trägers mit der Uridineinheit 20–25 mmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch A₅₀₀ nm des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 17
Derivatisierung von Toyopearl (Fractogel) 65F-Harz mit einer Uridineinheit durch einen Carbamat- (Urethan) Linker
Die Funktionalisierung von Fractogel 65F-Harz (5 g, Trockengewicht) mit 1,12-Diaminododecan wurde nach dem Verfahren von Beispiel 16 ausgeführt. Es wurde festgestellt, dass der Gehalt an Aminogruppen auf dem festen Träger 330 μmol/g betrug, entsprechend der Bestimmung durch einen Pikrinsäureassay.
Der feste Träger (1 g) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (20 ml) suspendiert, nach Zugabe von p-Nitrophenylchlorformiat (4,02 g, zur Herstellung einer 1 M Lösung) wurde Collidin (3,95 ml, zur Herstellung einer 1,5 M Lösung) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (16–20 Stunden) geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit trockenem CH₂Cl₂ (5 × 20 ml) gewaschen und im Vakuum während 2 Stunden getrocknet.
Dann wurde der feste Träger (1 g) in trockenem CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert. Nach Zugabe von 2',3'-O-Methoxyethylidenuridin (3 g, zur Herstellung einer 1 M Lösung) wurde TEA (1,52 ml, zur Herstellung einer 1 M Lösung) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von n-Propylamin (0,82 ml, zur Herstellung einer 1 M Lösung) gequencht und das Schütteln wurde während einer weiteren Stunde fortgesetzt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₂Cl₂ (2 × 10 ml), CH₃OH (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 10 ml) gewaschen und unter Vakuum während 2 Stunden getrocknet. Das 2',3'-Orthoesterzwischenprodukt wurde hydrolysiert, woraus sich eine Mischung aus 2',3'-Acetaten durch Behandlung des festen Trägers mit 80 % wässriger Essigsäure (10 ml) bei Raumtemperatur während 4 Stunden ergab. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₃OH (2 × 10 ml) und Diethylether (10 ml) gewaschen und im Vakuum während 3 Stunden getrocknet.
Der feste Träger (1 g) wurde dann in trockenem CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert und nach Zugabe von Collidin (0,66 ml, 0,05 M) wurde Tetrabutylammoniumperchlorat (0,17 g, 0,05 M) und Dimethoxytritylchlorid (0,169 g, 0,5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (2 × 10 ml), CH₃OH (2 × 10 ml) und Diethylether (2 × 10 ml) gewaschen und unter Vakuum während 3 Stunden getrocknet. Es wurde festgestellt, dass die Beladung des festen Trägers mit der Uridineinheit im Bereich von 20– 30 mmol/g lag, entsprechend der Bestimmung durch Asoonm des freigesetzten Dimethoxytritylkations.
Beispiel 18
Synthese eines 51-mers
Im folgenden wird die Synthese eines Oligonukleotids und die anschließende Spaltung des Oligonukleotids unter Verwendung eines Spaltungsreagenz der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Ein Oligonukleotid mit der Sequenz:
^5'TCC.ATG.GCA.ACT.GTC.AAG.GCA.CTG.GCT.CGT.AGC.CTA.CTG.GCT.TGA.CC G.TAA^3' (SEQ ID Nr. 1) wurde auf dem festen Träger von Beispiel 15 unter Verwendung einer Oligo-1000 DNA-Synthesevorrichtung (Beckman Instruments, Brea, CA) und eines Standard Syntheseprotokolls zusammengesetzt. Nach Entfernung der letzten Tritylgruppe wurde das, eine 3'-endständige Uridineinheit aufweisende Oligomer von dem festen Träger abgespalten, indem der feste Träger mit einer Lösung aus CH₃NH₂/Me₃N bei Raumtemperatur während 5 Minuten in Kontakt gebracht wurde. Die Lösung war 40% wässriges Methylamin und wässriges Trimethylamin mit 24 Gew.-% im Verhältnis 1 : 1, v/v. Nach Entfernung des abgespaltenen Oligonukleotids von dem festen Träger wurde die das abgespaltene Oligonukleotid enthaltende Methylamin/Trimethylamin-Lösung bei 65°C während 3 Stunden erhitzt. Das Reagenz wurde unter Verwendung eines Geschwindigkeits-Vak-Konzentrators zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in zweifach destilliertem Wasser (200 ml) gelöst und das Produkt wurde durch Kapillargelelektrophorese analysiert. Das P/ACE-Elektropherogramm zeigte ein Produkt von hoher Qualität, das durch Vergleich seiner Elutionszeit mit derselben Sequenz identifiziert wurde, die unabhängig auf einem üblichen CPG-A-Träger synthetisiert worden war.
Beispiel 19
Synthese eines 101-mers und 35-mers
Im folgenden wird die Synthese eines Oligonukleotids unter Verwendung eines Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung und Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Ein Oligonukleotid mit der Sequenz:
^5'AAC.GTC.GGT.AAC.GTA.CAC.GGT.AGC.TAC.GGA.CAC.CGT.000.AAT.ACG.A CA.GGT.AAC.CTG.TGG.AAC.GTA.CAC.GGA.AGA.GAC.TAG.GGA.TGG.GAG.TAC. GGA.TGG.GT^3' (SEQ ID Nr. 2) wurde auf dem festen Träger von Beispiel 11 unter Verwendung einer Oligo-1000 DNA-Synthesevorrichtung und eines Standard Syntheseprotokolls zusammengesetzt. Nach Entfernung der letzten Tritylgruppe wurde der feste Träger getrocknet und in ein Gläschen mit Schraubverschluß mit 300 ml MeNH₂/Me₃N (1 : 1, v/v entsprechend der Beschreibung in Beispiel 18) gegeben und bei 65°C (Wasserbad) während 90 Min erhitzt. Das Reagenz wurde vorsichtig in ein anderes Fläschchen dekantiert und unter Verwendung eines Geschwindigkeits-Vak-Konzentrators zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in zweifach destilliertem Wasser (500 ml) gelöst und der gesamte A₂₆₀ nm-Wert wurde berechnet. Das Produkt wurde durch Kapillargelelektrophorese analysiert. Das P/ACE-Elektropherogramm zeigte ein Produkt von guter Qualität. Dieses Produkt wurde durch Vergleich seiner Elutionszeit mit derselben Sequenz identifiziert, die unabhängig auf einem üblichen CPG-A-Träger synthetisiert worden war.
Ein 35-mer mit der Sequenz ^5'-GAT.GCC.AGT.TCG.GTC.ATA.CAC.GTA.GTA.CTA.CGA.CC^3' (Seq ID Nr. 3) wurde auf dem festen Träger von Beispiel 11 synthetisiert und durch Kapillargelelektrophorese und durch HPLC mit umgekehrter Phase als 5'-DMT-Oligonukeotide analysiert.
Beispiel 20
Synthese eines 10-meren Oligoribonukleotids (RNA)
0,2 μmol (Beladung 20 μmol/g) eines wie in Beispiel 15 derivatisierten CPG-Trägers wurde in eine Säule gegeben und ein 10-mer mit der Sequenz ^5'UCC.GAU.AGC.U^3' (SEQ ID Nr. 4) wurde auf einer automatischen Oligo-1000 Synthesevorrichtung unter Verwendung der Verfahren von Scarings et al., Nucleic Acid Research 18, 5433– 5411 (1990) synthetisiert. Die Kopplungszeit für die RNA-Synthese betrug 12 Minuten. Die letzte DMT-Gruppe wurde auf dem Oligonukleotid gelassen. Nach der Synthese wurde die RNA entschützt und von dem festen Träger unter Verwendung einer CH₃NH₂/(CH₃)₃N-Lösung mit 1 : 1 v/v während 4 Stunden bei 65°C gespalten. Die 1 : 1 Lösung wurde unter Verwendung einer wässrigen Methylaminlösung mit 40% w/v und einer wässrigen Trimethylaminlösung mit 23 Gew.-%-25 Gew.-% hergestellt. Die 2'-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 1,0 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF während 15 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das Oligoribonukleotid wurde unter Verwendung einer Nap-10-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) entsalzt. Nach HPLC-Reinigung war das resultierende Produkt, das die DMT-Gruppe noch immer an ihrer richtigen Stelle hatte, chemisch und physikalisch von einem 10-mer ununterscheidbar, das unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen CPG-Trägers synthetisiert war.
HPLC: Retentionszeit 21,40 Minuten. Bedingungen: C18 Microsorb MV (Rainin) 5 m Teilchen, 4,6 mm × 25 cm. Flasche A: 0,1 m Ammoniumacetat (pH-Wert 6,9), Flasche B: Acetonitril. Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/Min, 0–25 Min Gradient auf 50 B 25–27 Min bei 50% B. 27030 Min Gradient auf 0% B, 30–32 Min bei 0% B.
Beispiel 21
Synthese einer 21-meren RNA
Im folgenden wird die Synthese einer Oligonukleotid-RNA unter Verwendung eines Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung und Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung beschrieben.
0,2 mmol (Beladung 8,09 mmol/g) eines wie in Beispiel 12 derivatisierten CPG-Trägers wurde in eine Säule gegeben und ein 21-mer mit der Sequenz ^5'CUG.GAC.ACU.AGU.CCG.ACU.GCU^3' (SEQ ID Nr. 5) wurde auf einem Oligo-1000 synthetisiert. Die Kopplungszeit betrug 12 Minuten. Spaltung und Entschützung wurde unter Verwendung von MeNH₂/Me₃N (1 : 1 v/v), wie in Beispiel 20 beschrieben ist, während 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die 2'-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 1,0 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF während 15 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das Oligoribonukleotid wurde unter Verwendung von Sep-Pak (C18-Patronen von Millipore) entsalzt. Die Proben wurden gefriergetrocknet und durch Kapillarelektrophorese auf einem Beckman P/ACE 200 analysiert. Die Kapillargelsäule war eine Beckman Instruments U100P Harnstoffgelsäule, mit einer Gesamtlänge von 37 cm. Ein Beckman Tris-Borat, 7 M Harnstoffpuffergel-Pufferkit wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Extinktionen der Oligoribonukleotide lagen im Bereich von 1,0 bis 2 OD260 nm/ml, in Abhängigkeit von der Qualität und Länge des Oligoribonukleotids. Die Injektion war bei 10 kV während 5 Sek, während die Trennung bei 11 kV während 30–60 Min war, in Abhängigkeit von der Länge.
Beispiel 22
Synthese von Phosphorthiaten
Im folgenden wird die Synthese von Phosphorthioaten und ihre anschließende Spaltung durch ein erfindungsgemäßes Verfahren beschrieben.
Ein 25-meres Phosphorthioat mit der Sequenz ^5'AGT. CGA.TCA.GTC.AGT.CAG.TCA.GTC.T^3' (SEQ ID Nr. 6) wurde auf dem in Beispiel 15 hergestellten festen Träger synthetisiert. Die Synthese wurde unter Verwendung einer 0,2 μmol Skala (Beladung 20 μmol/g) auf einem Oligo-1000 durchgeführt. Nach der Synthese wurde das Oligo unter Verwendung von MeNH₂/Me₃N- (1 : 1) Lösung, die in Beispiel 20 hergestellt wurde, während 4 Stunden bei 65°C gespalten und entschützt. Die Probe wurde durch HPLC und CE analysiert. Die HPLC-Retentionszeit für das Phosphorthioat mit dem letzten DMT an seinem Ort betrug 17,23 Minuten unter den in Beispiel 20 beschriebenen Bedingungen. Die CE-Retentionszeit betrug 27,40 Minuten für das Phosphorthioat mit dem letzten DMT entfernt. Die Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 21. Das resultierende Produkt war chemisch und physikalisch von einem 25-mer ununterscheidbar, das auf einem handelsüblichen CPG-Träger synthetisiert worden war.
Beispiel 23
Synthese von Phosphorthioat
Im folgenden wird die Synthese eines Phosphorthioats unter Verwendung eines Oligonukleotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung und eines Spaltungsreagenz der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren wurde ein Oligophosphorthioat mit der Sequenz ^5'AGT.CAG.TCA.GTC.AGT.CAG.TCA.GTC.T^3' (SEQ ID Nr. 6) auf dem in Beispiel 12 hergestellten festen Träger synthetisiert. Spaltung und Entschützung wurde mit dem MeNH₂/Me₃N (1 : 1 v/v) Reagenz von Beispiel 20 während 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die HPLC-Retentionszeit des gespaltenen Phosphorthioats mit dem letzten DMT an seinem Ort betrug 17,22 Minuten. Die CE-Retentionszeit betrug 26,64 für das Phosphorthioat mit dem letzten DMT entfernt. Die Bedingungen waren für HPLC dieselben wie in Beispiel 20 und für CE dieselben wie in Beispiel 21.
Beispiel 24
Enzymverdauung des auf dem CPG-Universal festen Trägers synthetisierten rohen Hetero 15-mers
Ein 15-mer mit der Sequenz ^5'GAC.CAG.TAC.TCA.CGA^3' (SEQ ID Nr.7) wurde auf dem festen CPG-Träger von Beispiel 15 und auf einem üblichen CPG-A-Träger mit einem Succinyllinker zusammengesetzt. Nach Entfernung der letzten DMT-Schutzgruppe wurde das auf dem festen Träger von Beispiel 15 synthetisierte Oligomer mit der in Beispiel 20 hergestellten CH₃NH₂/Me₃N (1 : 1 v/v) Lösung bei 65°C während 4 Stunden gespalten und entschützt. Das auf dem üblichen CPG-A-Träger synthetisierte Oligomer wurde mit Ammoniak bei 65°C während 3 Stunden gespalten und entschützt.
Die rohen Oligomere wurden einer enzymatischen Verdauung unter Verwendung von Phosphodiesterase I (Sigma) unterzogen, mit 5 ml 40 mM Tris, 10 mM MgCl₂, pH-Wert 7,5 (unter Verwendung von 0,01 U pro Assay) und alkalischer Phosphatase (Sigma) von E. coli 200 u/1 ,8 ml (unter Verwendung von 0,2 u pro Assay) wiederhergestellt. Zu 1–2 OD₂₆₀ nm des Oligonukleotids wurden 25 ml Phosphodiesterase und 2 ml alkalischer Phosphatase zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Min bis 2 Stunden inkubiert. Die Probe wurde als solche auf eine HPLC C-18 Säule mit umgekehrter Phase injiziert.

HPLC-Säule: C18 Ultrasphere (Beckman) 5 m Teilchen, 4,6 mm × 25 cm.
Puffer A: 0,1 M Ammoniumacetat
Puffer B: Acetonitril
Programm: Durchflussgeschwindigkeit 1 ml/Min. 0–20 Min Gradient auf 15% B 20–25 Min Gradient auf 25% B 25–27 Min Gradient auf 50% B 27–30 Min bei 50% B 30–35 Min bei 0% B

Tabelle I zeigt, dass es eine enge Übereinstimmung zwischen den theoretischen und den beobachteten Werten der Oligonukleotide gibt, die auf dem festen Träger von Beispiel 15 (Universal CPG) und einem üblichen CPG-A-Träger synthetisiert wurden.
TABELLE I
Beispiel 25
Analyse der Nukleosidzusammensetzung eines 35 mers
Ein 35-mer mit der Sequenz ^3'GAT.GCC.AGT.TCG.GTC.ATA.CAC.GTA.GTA.CTA.CGA.CC^3' (SEQ ID Nr. 3) wurde auf 0,2 μmol (Beladung 20 μmol/g) von CPG-T und auf dem, wie in Beispiel 15 beschrieben ist, synthetisiert. Es wurde eine Oligo-1000 DNA-Synthesevorrichtung verwendet. Nach Synthese wurde die Spaltung und Entschützung unter Verwendung von MeNH₂/Me₃N (1 : 1, v/v), wie in Beispiel 20 beschrieben ist, während 4 Stunden bei 65°C durchgeführt. 1 OD₂₆₀ nm Probe wurde genommen und mit 25 ml Schlangengift-Phosphodiesterase und 2 ml alkalischer Phosphatase gemischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten stehengelassen und auf eine HPLC-Säule unter Verwendung der in Beispiel 24 beschriebenen Bedingungen injiziert. Die Ergebnisse werden in Tabelle II berichtet.
TABELLE II
Beispiel 26
Wiederverwendbarer Träger zur Oligodesoxyribonukleotid/Oligoribonukleotidsynthese
Nach Zusammensetzen des Oligonukleotids auf dem, entsprechend dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren, synthetisierten festen Träger, wurde das Oligonukleotid von dem festen Träger unter Verwendung von MeNH₂/Me₃N (1 : 1 v/v), hergestellt wie in Beispiel 20 beschrieben, bei 65°C während 2 Stunden gespalten. Der feste Träger wurde mit destilliertem Wasser (1 ml) gewaschen und mit [(Co)Triethylentetramin(OH)H₂O]⁺² wie in Y. Matsumoto et al., Chemistry Letters 427 (1990) beschrieben behandelt. Zu einer 0,05 M [Co(Triethylentetramin)Cl₂]Cl-Lösung (15,57 mg/1 ml Wasser), die entsprechend dem Verfahren aus der Literatur [J. Chin und X. Zou, Can. J. Chem. 65, 1882 (1987), J. Chin und X. Zou, J. Amer. Chem. Soc. 110, 223 (1988)] hergestellt worden war, wurden 1,5 Äquivalente NaOH (0,075 M, 3 mg/ml Wasser) zugegeben. Nach 10 Min. wurde der pH-Wert der Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von 1 N HCl eingestellt. Diese Lösung wurde zu dem vorstehenden festen Träger gegeben und bei Raumtemperatur während 30 Min geschüttelt. Dieser Schritt hydrolysiert das cyclische Phosphat zu cis-Diol. Der feste Träger wurde filtriert, mit destilliertem Wasser (2 ml), CH₃CN (2 × 2 ml) und Diethylether (1 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Dann wurde der feste Träger in 1 ml trockenem CH₂Cl₂ suspendiert. Nach Zugabe von Collidin (1,3 ml, 0,001 M) wurde Tetrabutylammoniumperchlorat (0,34 mg, 0,001 M) und Dimethoxytritylchlorid (0,338 mg, 0,001 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 15 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde filtriert, mit CH₂Cl₂ (1 ml), CH₃OH (1 ml) und Diethylether 1 ml) gewaschen und unter Vakuum während 1 Stunde getrocknet.
Dann wurde der feste Träger in trockenem Pyridin (1 ml) suspendiert. Nach Zugabe von DMAP (1,25 mg, 0,001 M) wurde Essigsäureanhydrid (12,5 ml, 0,0125 M) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 15 Min geschüttelt. Der feste Träger wurde mit CH₃CN (1 ml) und Diethylether (1 ml) gewaschen und unter Vakuum während 30 Min getrocknet.
Beispiel 27
Synthese von 2' 3'-O-Methoxyethylidenuridin-5'-O-(N,N-diisopropyl)-βcyanoethylphosphoramidit
Im folgenden wird die Synthese eines Reagenz und dessen anschließende Reaktion mit einem Amino-funktionalisierten festen Träger zur Bereitstellung eines Oligonukeotidsynthesereagenz der vorliegenden Erfindung beschrieben.
2',3'-O-Methoxyethylidenuridin (0,58 g, 2 mmol) wurde in wasserfreiem THF (10 ml) gelöst. Nach Zugabe von Diisopropylamin (1,4 ml, 8 mmol) bei Raumtemperatur wurde β-Cyanoethylmonochlor-N,N-diisopropylphosphoramidit (0,9 ml, 4 mmol) unter Rühren mit einem Magnetrührgerät zugegeben. Nach 1 Stunde Rühren wurde das Lösungsmittel bei 30°C unter Vakuum verdampft. Das Rohprodukt wurde in Ethylacetat (50 ml) wieder gelöst, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand in Ethylacetat (10 ml) aufgenommen und durch eine Silicagelsäule (vorgeheizt bei 100–120°C) gegeben, die mit Ethylacetat/DÜsopropylamin (95/5, v/v) gepackt worden war, und mit Ethylacetat eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, eingedampft und unter Hochvakuum getrocknet, woraus sich 2',3'-O-Methoxyethylidenuridin-5'-O-(N,N-diisopropyl)-βcyanoethylphosphoramidit (0,55 g, 56% Ausbeute) ergab.
IR (KBr-Pellet): u 1700 cm-1 (C=O des Ringamid), 2250 cm-1 (C=N) und 2900 cm-1 (s, NH).
¹H NMR (CDCl₃): δ 1,10–1,28 (m, 12H, 2 × CH(CH₃)₂), 1,62 und 1,68 (2s, 3H, COCH ₃), 2,66 und 2,76 (2t, 4H, CH ₂CH ₂), 3,27 und 3,40 (2s, 3H, OCH ₃), 3,55 (m, 2H, 2 × N-CH(CH₃)₂), 3,88 (m, 2H, C_5'-CH ₂), 4,15 (m, 1H, C_4'-_H), 4,97(m, 2H, C_2'H, C_3'H), 5,76 (m, 1H, C₅-H), 6,03 (d, 1H, C_1'-H) und 7,54 (d, 1H, C₆H).
2',3'-Isopropylidenuridin-5'-O-(N,N-diisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramidit wurde ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren hergestellt.
Die vorstehend synthetisierten Phosphoramiditverbindungen wurden zur Herstellung der Oligonukleotidreagenzien der vorliegenden Erfindung verwendet, indem die Phosphoramidite an eine Vielfalt fester Träger unter Bildung einer Phosphoramidatverknüpfung zwischen einer Oligonukleotidsynthesestelle und dem festen Träger gebunden wurden. Um das zu erreichen, wurden CPG und Fractogel, die Oberflächenaminogruppen aufwiesen, mit den Phosphoramiditen umgesetzt. Nach Behandlung dieses Reaktionsprodukts mit 80% wässriger Essigsäure öffnete sich die 2',3'-Ocyclische Orthoesterfunktionalität, um das Oligonukleotidsynthesereagenz von Beispiel 11 zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 28
Synthese von 1,2-O-Methoxybenzylidenglycerol
Im folgenden wird die Synthese einer glycerolartigen Verbindung zur Verwendung bei der Herstellung eines Oligonukleotidreagenz beschrieben, dass zur Synthese von Oligonukleotiden geeignet ist, die anschließend von dem festen Träger mit den Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung gespalten werden.
Glycerol (5,61 g, 61 mmol) wurde in THF (200 ml) suspendiert, das Trimethylorthobenzoat (22,8 g, 125 mmol) und wasserfreie Benzolsulfonsäure (0,6 g) enthielt. Nach Rühren bei 25°C während 1 Stunde unter Ausschluß von Feuchtigkeit wurde die Lösung klar. Das TLC zeigte eine vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials in eine neue Verbindung mit höherem R_f-Wert. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von methanolischer NaOCH₃-Lösung (1 M, 5 ml) gequencht und die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst und durch Aluminasäulenchromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit CH₂Cl₂/MeOH (99/1, v/v) eluiert und die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und unter verringertem Druck eingedampft, woraus sich die Titelverbindung als farbloses öliges Material (9,6 g, 74,9% Ausbeute) ergab.
¹H NMR (CDCl₃): δ 3,69 (m, 4H, 2-C₂), 4,0 (t, 1H, CH), 4,3 (d, 3H, -OCH₃), 7,37–8,0 (m, 5H, aromatisch).
Die vorstehend hergestellte Verbindung wurde zur Herstellung eines Oligonukleotidsynthesereagenz verwendet, indem sie mit einem succinylierten Standard-CPG-Träger und festen Fractogel-Trägern umgesetzt wurde. Das anschließende Kontaktieren des umgesetzten festen Trägers mit 80% wässriger Essigsäure bei Raumtemperatur liefert ein Reagenz, das eine an den festen Träger durch eine Esterverknüpfung gebundene Glyceroleinheit aufweist.
Beispiel 29
Im folgenden werden die unerwarteten Spaltungseigenschaften aufgezeigt, die mit den verschiedenen Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung zusammenhängen.
Das unter Verwendung des in Beispiel 25 beschriebenen festen Trägers hergestellte 35-mer wurde zur Untersuchung der Wirksamkeit verschiedener Spaltungsreagenzien verwendet. Der das synthetisierte 35-mer enthaltende feste Träger wurde mit jedem Spaltungsreagenz während 30 Minuten bei 65°C in Kontakt gebracht und der Prozentsatz des tatsächlich von dem festen Träger Iosgelösten Oligonukleotids wurde gemessen.

Die Ergebnisse der Spaltungsreaktion sind in Tabelle III gezeigt. TABELLE III

Spaltungsreagenz	Prozentsatz der von dem nachbarständigen Diol Iosgelösten synthetisierten Oligonukleotide
NH₄OH	23%
CH₃NH₂ (40% wässrig)	41%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 1)	62%
CH₃NH₂/(CH₃CH₂)₃N/CH₃CH₂OH 1 : 1 : 0,2)	58%
CH₃NH₂/N-Methylpyrrolidin (1 : 1)	58%
CH₃NH₂/ Dimethylamin (1 : 1)	56%
CH₃NH₂/Diisopropylethylamin (1 : 1)	52%
CH₃NH₂/Diisopropylamin (1 : 1)	45%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (9 : 1)	46%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 9)	30%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (3 : 1)	51%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 3)	40%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 2)	48%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 4)	40%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (99 : 1)	44%
CH₃NH₂/(CH₃)₃N (95 : 5)	45
NH₄OH/(CH₃)₃N (1 : 1)	30%
NH₄OH/(CH₃CH₂)₃N/CH₃CH₂OH 1 : 1 : 0,2)	30%

Die NH₄OH, CH₃NH₂, (CH3)₃N, (CH₃)₂NH enthaltende Lösungen wurden von wässrigen Lösungen mit ungefähr 29 Gew.-%, 40 Gew.-%, ungefähr 24 Gew.-% beziehungsweise 40 Gew.-% hergestellt.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung beschleunigen sogar kleine Mengen stärkerer Basen, wie zum Beispiel Trimethylamin und Triethylamin die Spaltungskinetik.
Dies wird durch die Spaltungsdaten gezeigt, die mit einer aus 99 Teilen 40% wässrigem Methylamin und 1 Teil wässrigem Trimethylamin mit 24 Gew.-% (39,6% Methylamin und 0,24% Trimethylamin) hergestellten Lösung erhalten wurden, im Vergleich zu den Daten mit 40 Gew.-% Methylamin (44% Spaltung nach 30 Minuten im Vergleich zu 41% Spaltung nach 30 Minuten). Die Tatsache, dass CH₃NH₂/(CH₃)₃N (99 : 1) eine viel schnellere Kinetik ergibt, als CH₃NH₂/(CH₃)₃N (1 : 9) veranschaulicht, dass Methylamin in der Spaltungsreaktion ebenfalls eine signifikante Rolle spielt. Der vorstehend bemerkte Ethylalkohol wird in dem Spaltungsreagenz verwendet, um die Lösungen mischbar zu machen.
Wie vorstehend erwähnt wurde, sind Ammoniak, Methylamin und Trimethylamin Gase bei Standardtemperaturen und Druck. Sie sind in wässrigen Lösungen leicht verfügbar, die die Formen sind, die zur Herstellung der vorstehend erwähnten Lösungen verwendet werden. Die verwendeten Lösungen waren wässriges Methylamin mit 40 Gew.-% und Trimethylamin mit 23–25 Gew.-%. Somit ist 1 : 1 Methylamin : Trimethylamin ungefähr 20 Gew.-% Methylamin und ungefähr 12 Gew.-% Trimethylamin. Ähnlich wurde Ammoniumhydroxid NH₄OH unter Verwendung von konzentriertem Ammoniumhydroxid oder ungefähr 28 Gew.-% bis 30 Gew.-% hergestellt. Das vorstehend beschriebene Methylamin und Trimethylamin enthaltende Spaltungsreagenz kann in den Konzentrationen von ungefähr 0,4 Gew.-% bis 39,6 Gew.-% Methylamin und von ungefähr 0,24 Gew.-% bis ungefähr 22,5 Gew.-% Timethylamin variieren.
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde ist es klar, dass die Erfindung durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

Oligonucleotidsynthesereagens, umfassend eine Zusammensetzung mit der Formel: SS-R⁶-O-R³ Iwobei SS ein fester Träger ist, R⁶
ist, wobei R⁵ Wasserstoff oder Alkyl ist, und R⁴ eine Phosphorschutzgruppe ist, und R³ eine Ringeinheit mit der Struktur:
ist, wobei B eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, jedes X und Y unabhängig voneinander aus O, S und NH ausgewählt ist, und eines von R¹ und R² eine Blockierungseinheit ist, welche befähigt ist, durch ein Reagens, ausgewählt aus Ammoniumhydroxid und Methylamin, entfernt zu werden, und die andere Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe ist, welche zum Schützen von – OH-, -SH- oder NH₂-Gruppen geeignet ist.
Oligonucleotidreagens nach Anspruch 1, wobei B Uridyl ist.
Oligonucleotidsynthesereagens nach Anspruch 1, wobei eines von R¹ und R² aus Acetyl, Benzoyl und FMOC ausgewählt ist.
Oligonucleotidsynthesereagens nach Anspruch 1, wobei eines von R¹ und R² Dimethoxytrityl ist.
Oligonucleotidsynthesereagens nach Anspruch 1, wobei der feste Träger aus Glas mit kontrollierten Poren, Copolymeren aus Ethylen und Acrylat, Copolymeren aus Ethylen und Methacrylat, Polystyrol und Nylon ausgewählt ist.
Oligonucleotidsynthesereagens, umfassend eine Verbindung mit der Formel:
wobei SS ein fester Träger ist, jedes X und Y unabhängig voneinander aus O, S und NH ausgewählt ist, und eines von R¹ und R² eine Alkylcarbonyloder Arylcarbonylgruppe ist und das andere Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe ist.
Oligonucleotidsynthesereagens nach Anspruch 6, wobei X und Y beide O sind, und eines von R¹ und R² Acetyl ist und das andere Dimethoxytrityl ist.
Oligonucleotidsynthesereagens nach Anspruch 6, wobei der feste Träger aus Glas mit kontrollierten Poren, Copolymeren aus Ethylen und Acrylat, Copolymeren aus Ethylen und Methacrylat, Polystyrol, Polypropylen und Nylon ausgewählt ist.
Oligonucleotidsynthesereagens, umfassend das Folgende:
wobei SS ein fester Träger ist, X und Y beide O sind und eines von R¹ und R² eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppe ist und das andere Dimethoxytrityl ist.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, umfassend eine erste Verbindung, ausgewählt aus Methylamin und Ammoniumhydroxid, und eine zweite Verbindung, ausgewählt aus sekundären Aminen und tertiären Aminen, zum Entschützen oder Hydrolysieren einer blockierten Nachbarstellung eines Oligonucleotidsynthesereagens der Formel I (wie in Anspruch 1 definiert).
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 10 dargelegt, wobei die erste Verbindung Methylamin ist.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 10 dargelegt, wobei das sekundäre Amin aus Dimethylamin, Diisopropylamin und Diethylamin ausgewählt ist.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 10 dargelegt, wobei das tertiäre Amin aus wäßrigem Trimethylamin, N-Methylpyrrolidin, Triethylamin und Diisopropylethylamin ausgewählt ist.
Verwendung eines wäßrigen Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 10 dargelegt, wobei das Reagens Methylamin und ein tertiäres Amin, ausgewählt aus Trimethylamin, Triethylamin und N-Methylpyrrolidin, umfaßt.
Verwendung eines wäßrigen Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 14 dargelegt, wobei das Reagens ferner einen Niederalkylalkohol einschließt.
Verwendung eines wäßrigen Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 14 dargelegt, wobei das Methylamin in einer Konzentration von 4 Gew.-% bis 39,6 Gew.-% vorliegt, und das tertiäre Amin in einer Konzentration von 0,24 Gew.-% bis 22 Gew.-% vorliegt.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 16 dargelegt, wobei das tertiäre Amin Trimethylamin ist.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 17 dargelegt, wobei das Methylamin von 8 Gew.-% bis 39,6 Gew.-% vorliegt und das Trimethylamin von 0,24 Gew.-% bis 19,2 Gew.-% vorliegt.
Verfahren zum Spalten eines Oligonucleotids von einem festen Träger, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Bereitstellen eines Oligonucleotides, welches an einen festen Träger über eine Ringeinheit gebunden ist, wobei die Ringeinheit und der feste Träger durch die Formel I (definiert in Anspruch 1) dargestellt sind, wobei das Oligonucleotid an die Ringeinheit in Nachbarstellung zu einer blockierten reaktiven Gruppe gebunden ist, und das Kontaktieren des Oligonucleotids mit einem Reagens, umfassend Methylamin, und einer zweiten Verbindung, ausgewählt aus sekundären Aminen und tertiären Aminen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Oligonucleotid an die Ringeinheit in Nachbarstellung zu einer blockierten reaktiven Gruppe, ausgewählt aus Al kylcarbonyl und Arylcarbonyl, gebunden ist und der kontaktierende Schritt das Entschützen der reaktiven Gruppe einschließt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ringeinheit an den festen Träger über eine Verknüpfung, ausgewählt aus einer Phosphateinheit, Phosphoramidateinheit und Carbamateinheit, gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Reagens von 4 Gew.-% bis 36 Gew.-% Methylamin umfaßt und die Verbindung Trimethylamin in einer Konzentration von 2,4 Gew.-% bis 22,5 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Verknüpfung aus einer Phosphoramidit- oder Phosphoramidateinheit ausgewählt ist.
Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonucleotids, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Bereitstellen eines Oligonucleotidssynthesereagens, wie in Anspruch 1 definiert, und das aufeinanderfolgende Koppeln geschützter Nucleosidmonomereinheiten, um ein Oligonucleotid bereitzustellen.
Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonucleotids nach Anspruch 24, wobei das Synthesereagens
ist, wobei SS ein fester Träger ist, X und Y beide O sind, und eines von R¹ und R² eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppe ist und das andere eine Hydroxyschutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Synthesereagens ist:
wobei SS ein fester Träger ist, X und Y beide Osind, und eines von R¹ und R² eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppe ist und das andere Dimethoxytrityl ist.
Verwendung eines Oligonucleotidspaltungsreagens, wie in Anspruch 16 dargelegt, wobei das Reagens ferner LiCl einschließt.