DE69637408T2

DE69637408T2 - Antikörper gegen cd-80

Info

Publication number: DE69637408T2
Application number: DE69637408T
Authority: DE
Inventors: Darrell R. Escondido ANDERSON; Peter San Diego BRAMS; Nabil Olivenhain Hanna; William S. San Diego SHESTOWSKY
Original assignee: Biogen Idec Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: EP0837927A1; NO975598L; YU35996A; AU707023B2; EP0837927A4; ES2301169T3; PT837927E; AR001288A1; SA96170473B1; JPH11508764A; JP4242451B2; AU6331296A; MY136224A; ZA964547B; DK0837927T3; NO328554B1; EP1914301A1; US6709654B1; CA2223532C; BR9609035A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Identifizierung von neuen monoklonalen Antikörpern gegen humanes B7, d. h. humanes B7.1 und humanes B7.2, und primatisierte Formen davon. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung und Identifizierung von Makaken-Antikörpern gegen humanes B7, d. h. humanes B7.1 und humanes B7.2, die durch Screening von Phagen-Display-Bibliotheken und Affen-Heterohybridomen unter Verwendung von B-Lymphozyten, die aus B7-immunisierten Affen erhalten werden, produziert werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung spezifische primatisierte Antikörper, die an humanes B7, d. h. humanes B7.1 und B7.2 binden, sowie ihre entsprechenden Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die monoklonale Affen- oder primatisierte Antikörper enthalten, die auf humanes B7.1 und/oder humanes B7.2 spezifisch sind, und ihre Verwendung als Immunsuppressiva durch Modellierung des B7:CD28-Weges, d. h. zur Behandlung von Autoimmunstörungen, und die Vorbeugung von Organabstoßung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die klinische Grenzfläche zwischen Immunologie, Hämatologie und Onkologie ist seit langem bekannt. Viele von dem Hämatologen oder Onkologen behandelte Zustände besitzen entweder eine autoimmune oder immundefiziente Komponente an ihrer Pathophysiologie, die zu der weit verbreiteten Übernahme von immunsuppressiven Medikationen durch Hämatologen führt, wohingegen Onkologen nach immunologischen Adjuvantien gesucht haben, die vielleicht die endogene Immunität gegenüber Tumoren verstärken könnten. Derzeit haben diese Eingriffe im Allgemeinen aus nicht-spezifischen Wegen der Immunsuppression und Immunstimulation bestanden. Zusätzlich zu der eingeschränkten Wirksamkeit dieser Eingriffe haben auch die zu ihrer Nichtspezifität sekundären Toxizitäten ihren Gesamterfolg eingeschränkt. Darum wurde nach alternativen Strategien gesucht.
Die Aufklärung der funktionellen Rolle einer schnell zunehmenden Anzahl von Zelloberflächenmolekülen hat viel zu der Integration der Immunologie in die klinische Hämatologie und Onkologie beigetragen. Nahezu 200 Zelloberflächenantigene wurden bereits auf Zellen des immunen und hämatopoietischen Systems identifiziert (Schlossman SF. Boumsell L. Gilks JM, Harlan T. Kishimoto, C. Morimoto C, Ritz J. Shaw S, Silverstein RL, Springer TA, Tedder TF, Todd RF: CD antigens (1993), Blood 83: 879, 1994). Diese Antigene stellen Moleküle dar, die sowohl auf die Abstammungslinie begrenzt als auch breit verteilt an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt sind, einschließlich Zellerkennung, Adhäsion, Induktion und Aufrechterhaltung von Proliferation, Zytokinsekretion, Effektorfunktion und auch Zelltod. Das Erkennen der funktionellen Attribute dieser Moleküle hat neue Versuche zur Manipulation der Immunantwort hervorgebracht. Obwohl Moleküle, die an der Zellhaftung und antigenspezifischen Erkennung beteiligt sind, bereits als Ziele eines therapeutischen immunologischen Eingriffs bewertet worden sind, hat sich die jüngste Aufmerksamkeit auf eine Untergruppe von Zelloberflächenmolekülen konzentriert, die als kostimulatorische Moleküle bezeichnet werden (Bretscher P: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later." Immunol. Today 13: 73, (1992); Jenkins MK, Johnson JG: "Molecules involved in T-cell co-stimulation." Curr Opin Immunol 5: 351, 1993; Geppert T, Davis L. Gur H. Wacholtz M. Lipsky P: "Accessory cell signals involved in T-cell activation." Immunol Rev 117: 5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: "The co-stimulatory function of antigenpresenting cells." Immunol Today 11: 49, (1990); Stennam RM, Young JW: "Signals arising from antigen-presenting cells." Curr Opin Immunol 3: 361, (1991).
Kostimulatorische Moleküle lösen nicht die Erzeugung und Amplifikation von antigenspezifischen T-Zell-Antworten und der Effektorfunktion aus, sondern ermöglichen sie stattdessen (Bretscher P: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later." Immunol. Today 13: 73, (1992); Jenkins MK, Johnson JG: "Molecules involved in T-cell co-stimulation." Curr Opin Immunol 5: 351, (1993); Geppert T, Davis L. Gur H. Wacholtz M. Lipsky P: "Accessory cell signals involved in T-cell activation." Immunol Rev 117: 5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: "The co-stimulatory function of antigen-presenting cells." Immunol Today 11: 49, (1990); Stennam RM, Young JW: "Signals arising from antigen-presenting cells." Curr Opin Immunol 3: 361, (1991); June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation." Immunol Today 15: 321, (1994).
Unlängst wurde ein spezifischer kostimulatorischer Weg, der als B7:CD28 bezeichnet wird, von verschiedenen Forschergruppen aufgrund seiner signifikanten Rolle bei der B- und T-Zell-Aktivierung untersucht (June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation." Immunol Today 15: 321, (1994); June CH, Ledbetter JA: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen." Annu Rev Immunol 11: 191, (1993); Schwartz RH: "Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, und B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy." Cell 71: 1065, (1992). Seit dieser Liganden:Rezeptor-Weg vor vier Jahren entdeckt wurde, haben sich viele Beweise angesammelt, die nahe legen, dass B7:CD28-Wechselwirkungen eine der kritischen Verbindungsstellen bei der Bestimmung der Immunreaktivität gegenüber Anergie darstellen (June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation." Immunol Today 15: 321, (1994); June CH, Ledbetter JA: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen." Annu Rev Immunol 11: 191, (1993); Schwartz RH: "Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 und B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy." Cell 71: 1065, (1992); Cohen J: "Mounting a targeted strike an unwanted immune responses" (news; comment). Science 257: 751, (1992); Cohen J: "New Protein steals the show as "co-stimulator' of T cells" (news; comment). Science 262: 844, (1993).
Insbesondere wurde berichtet, dass die Rolle der humanen B7-Antigene, d. h. humanes B7.1 und B7.2 eine kostimulatorische Rolle bei der T-Zell-Aktivierung spielt.
1. B7.1- und B7.2-kostimulatorische Rolle bei der T-Zell-Aktivierung
Die Ausarbeitung einer erfolgreichen Immunantwort hängt von einer Serie von spezifischer Wechselwirkung zwischen einer T-Zelle und einer Antigen präsentierenden Zelle ab. Obwohl der essenzielle erste Schritt bei diesem Prozess von der Bindung von Antigen an den T-Zell-Rezeptor abhängt, reicht im Zusammenhang mit dem MHC-Klasse-II-Molekül (Lane, P.J.L., F.M. McConnell, G.L. Schieven, E.A. Clark und J.A. Ledbetter, (1990), "The Role of Class II Molecules in Human B Cell Activation." The Journal of Immunology, 144: 3 684–3 692), diese Wechselwirkung allein nicht aus, um sämtliche Ereignisse auszulösen, die für eine lang anhaltende Antwort auf ein gegebenes Antigen notwendig sind (Schwartz, R.H. (1990), "A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy." Science, 248: 1 349; Jenkins, M.K. (1992). "The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy." Immunology Today, 13: 69; Azuma, M., M. Catabyab, D. Buck, J.H. Philipps, and L.L. Lanier, (1992). "Involvement of CD28 in MHC-unrestricted Cytotoxicity Mediated by a Human Natural Killer Leukemia Cell Line." The Journal of Immunology, 149: 1 556–1 561; Azuma, M., M. Catabyab, D. Buck, J.H. Phillips, and L.L. Lanier, (1992). "CD28 Interaction with B7 Costimulates Primary Allogeneic Proliferative Responses and Cytotoxicity Mediated by Small Resting T Lymphocytes." J. Exp. Med., 175: 353–360).
Die Beteiligung von bestimmten anderen kostimulatorischen Molekülen ist notwendig (Norton, S.D., L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller, and M.K. Jenkins. (1992), "The CD28 Ligand, B7, Enhances IL-2 Production by Providing A Costimulatory Signal to T Cells." The Journal of Immunology, 149: 1 556–1561). "The homodimers CD28 and CTLA-4 expressed an T cells" (June, C.H., J.A. Ledbetter, P.S. Linsley, and C.B. Thompson, (1990), "Role of the CD28 Receptor in T-Cell Activation." Immunology Today, 11: 211–216; Linsley, P.S., W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle, and J.A. Ledbetter, (1991), "CTLA-4 is a Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7." J. Exp. Med., 174: 561). Zugleich sind B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), die auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert werden, die wichtigsten Paare der kostimulatorischen Moleküle, die für eine verstärkte Immunantwort notwendig sind (Azume, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), "Functional Expression of B7/BB1 an Activated T Lymphocytes." J. Exp. Med., 177: 845–850; Freeman, G.J., A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and L.M. Nadler, (1989), "B7, A New Member of the Ig Superfamily with Unique Expression an Activated and Neoplastic B Cells." The Journal of Immunology, 143: 2 714–2 722; Hathcock, K.S. G. Laslo, H.B. Dickler, J. Bradshaw, P. Linsley, and R.J. Rodes, (1993), "Identification of an Alternative CTLA-4 Ligand Costimulatory for T Cell Activation." Science, 262: 905–911; Hart, D.N.J., G.C. Starling, V.L. Calder, and N.S. Fernando, (1993). "B7/BB-1 is a Leucocyte Differentiation Antigen an Human Dendritic Cells Induced by Activation." Immunology, 79: 616–620). Es kann in vitro gezeigt werden, dass die Abwesenheit von diesen kostimulatorischen Signalen zu einem fehlgeschlagenen T-Zell-Aktivierungsweg und zur Entwicklung einer Unempfänglichkeit gegenüber spezifischen Antigenen oder zur Anergie führt. (See e.g., Harding, F.A., J.G. McArthur, J.A. Gross, D.M. Raulet, and J.P. Allison, (1992). "CD28 Mediated Signalling Co-sbmulates Murine T Cells and Prevents Induction of Anergy in T Cell Clones." Nature, 356: 607–609; Gimmi, C.D., G.J. Freeman, J.G. Gribben, G. Gray, and L.M. Nadler, (1993). "Human T-Cell Clonal anergy is Induced by Antigen Presentation in the Absence of B7 Costimulation." Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6 586–6 590; Tan, P., C. Anasefti, J.A. Hansen, J. Melrose, M. Brunvand, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, and P.S. Linsley, (1993), "Induction of Alloantigen-specific Hyporesponsiveness in Human T Lymphocytes by Blocking Interaction of CD28 with Its Natural Ligand B7/BB1." J. Exp. Med., 177: 165–173). Achievement of in vitro tolerance constitutes a mechanism for immunosuppression and a viable therapy for organ transplant rejection and for the treatment of autoimmune diseases. This has been achieved in experimental models following the administration of CTLA4-Ig (Lenschow, D.J., Y. Zeng, R.J. Thistlethwaite, A. Montag, W. Brady, M.G. Gibson, P.S. Linsley, and J.A. Bluestone, (1992), "Long-Term Survival of Xenogeneic Pancreatic Islet Grafts Induced by CTLA-4Ig." Science, 257: 789–795).
Die Moleküle B7.1 und B7.2 können entweder an CD28 oder CTLA-4 binden, obwohl B7.1 an CD28 mit einer Kd von 200 nm und an CTLA-4 mit einer 20-fach höheren Affinität bindet (Linsley, P.S., E.A. Clark, and J.A. Ledbetter, (1990), "T-Cell Antigen CD28 Mediates Adhesion with B Cells by Interacting with Activation antigen B7/BB-1." Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 5 031–5 035; Linsley et al., (1993), "The Role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen," Annu. Rev. Immunol., 11: 191–192; Linsley, et al., (1993), "CD28 Engagement by B7/BB-1 Induces Transient Down-Regulation of CD28 Synthesis and Prolonged Unresponsiveness to CD28 Signaling", The Journal of Immunology, 150: 3 151–3 169). B7.2 wird auf aktivierten B-Zellen und Interferon-induzierten Monozyten, jedoch nicht auf ruhenden B-Zellen exprimiert (Freeman, G.J., G.S. Gray, C.D. Gimmi, D.B. Lomarrd, L.-J. Zhou, M. White, J.D. Fingeroth, J.G. Gribben, and L.M. Nadler, (1991). "Structure, Expression and T Cell Costimulatory Activity of the Murine Homologue of the Human B Lymphocyte Activation Antigen B7", J. Exp. Med., 174: 625–631). B7.2 wird andererseits konstitutiv auf sehr niedrigen Niveaus auf ruhenden Monozyten, dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert, und seine Expression ist auf aktivierten T-Zellen, NK-Zellen und B-Lymphozyten verstärkt (Azuma, M. D. Ito, H. Yagita, K. Ohumura, J.H. Phillips, L.L. Lanier, and C. Somoza, "1993", "B70 Antigen ist a Second Ligand for CTLA-4 and CD28", Nature, 366: 76–79). Obwohl B7.1 und B7.2 auf dem gleichen Zelltyp exprimiert werden können, tritt ihre Expres sion auf B-Zellen mit unterschiedlicher Kinetik auf (Lenschow, D.J., G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, C.L. Jellis, G.S. Gray, J. Miller, and J.A. Bluestone, (1993), "Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11 054–11 058; Boussiotis, V.A., G.J. Freeman, J.G. Gribben, J. Daley, G. Gray, and L.M. Nadler, (1993), "Activated Human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counterreceptors that Co-stimulate T-Cell Activation." Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11 059–11 063). Eine weitere Analyse auf RNA-Niveau hat gezeigt, dass B7.2 mRNA konstitutiv exprimiert wird, wohingegen B7.1 mRNA 4 Stunden nach Aktivierung nachgewiesen wird und initiale niedrige Niveaus an B7.1-Protein erst 24 Stunden nach der Stimulation nachweisbar sind (Boussiotis, V.A., G.J. Freeman, J.G. Gribben, J. Daley, G. Gray, and L.M. Nadler, (1993), "Activated Human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counter-receptors that Co-stimulate T-Cell Activation", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11 059–11 063). CTLA-4/CD29-Gegenrezeptoren können darum zu verschiedenen Zeiten nach der B-Zellen-Aktivierung exprimiert werden.
Die differenzielle zeitliche Expression von B7.1 und B7.2 legt nahe, dass die Wechselwirkung dieser beiden Moleküle mit CTLA-4 und/oder CD28 distinkte jedoch mit der T-Zelle verwandte Signale abgibt (LaSalle, J.M., P.J. Tolentino, G.J. Freeman, L.M. Nadler, and D.A. Hafler, (1992), "CD28 and T Cell Antigen Receptor Signal Transduction Coordinately Regulate Interleukin 2 Gene Expression In Response to Superantigen Stimulation", J. Exp. Med., 176: 177–186; Vandenberghe, P., G.J. Freeman, L.M. Nadler, M.C. Fletcher, M. Kamoun, L.A. Turka, J.A. Ledbetter, C.B. Thompson, and C.H. June, (1992), "Antibody and B7/BB1-mediated Ligation of the CD28 Receptor Induces Tyrosine Phosphorylation in Human T Cells", The Journal of Experimental Medicine, 175: 951–960). Die genaue Signalgebungsfunktion von CTLA-4 und CD28 auf der T-Zelle sind derzeit unbekannt (Janeway, C.A., Jr. and K. Bottomly, 1994), "Signals and Signs for Lymphocyte Responses", Cell, 76.275285). Allerdings ist es möglich, dass eine Serie von Rezeptoren den initialen Stimulus für die T-Zell-Aktivierung bereitstellen könnte und ein verstärktes Signal stimuliert, welches eine sorgfältige Ausführung des Weges und ein Stattfinden der klonalen Expression ermöglicht (Linsley, P.S., J.L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti, and N.K. Damle, (1992), "Coexpression and Functional Cooperation of CTLA-4 and CD28 an Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1 595–1 604). Die derzeitigen Daten stützen die Zwei-Signal-Hypothese, die von Jenkins und Schwartz vorgeschlagen wurde (Schwartz, R.H., (1990), "A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy", Science, 248: 1 349; Jenkins, M.K., (1992), "The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy", Immunology Today, 13: 69), dass beides, eine TCR und ein kostimulatorisches Signal zur T-Zell-Aktivierung, Lymphokin-Sekretion und der vollständigen Entwicklung der Effektor-Funktion notwendig sind (Greenan, V. and G. Kroemer, (1993), "Multiple Ways to Cellular Immune Tolerance", Immunology Today, 14: 573). Das Versagen, das zweite Signal abzugeben, führt zu der Unfähigkeit von T-Zellen IL-2 zu sezernieren und macht die Zelle gegenüber einem Antigen unempfänglich.
Strukturell enthalten sowohl B7.1 als auch B7.2. die extrazellulären Immunglobulin-Superfamilie V und C-artigen Domänen, eine hydrophobe Transmembranregion und einen Zytoplasmaschwanz (Freeman, G.J., J.G. Gribben, V.A. Boussiotis, J.W. Ng, V. Restivo, Jr., L.A. Lombard, G.S. Gray, and L.M. Nadler, (1993), "Cloning of B7-2: A CTLA-4 Counterreceptor that Co-stimulates Human T Cell Proliferation", Science, 262: 909). Sowohl B7.1 als auch B7.2 sind schwer glykosyliert. B7.1 ist ein 44–54 kD-Glykoprotein, das aus einer 223 Aminosäure-extrazellulären Domäne, einer 23 Aminosäure-Transmembrandomäne und einem 61 Aminosäure-Zytoplasmaschwanz besteht. B7.1 enthält 3 potenzielle Proteinkinase-Phosphorylisierungsstellen (Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), "Functional Expression of B7/BB1 an Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845–850). B7.2 ist ein 306 Aminosäure-Membranglykoprotein. Es besteht aus einer 220 Aminosäure-extrazellulären Region, einer 23 Aminosäure-hydrophoben Transmembrandomäne und einem 60 Aminosäure-Zytoplasmaschwanz (Freeman, G.J., A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and L.M. Nadler, (1989), "B7, A New Member of the Ig Superfamily with Unique Expression an Activated and Neoplastic B Cells", The Journal of Immunology, 143: 2 714–2 722). Obwohl sowohl B7.1- als auch B7.2-Gene in der gleichen Chromosomenregion lokalisiert sind (Freeman, G.J., D.B. Lombard, C.D. Gimmi, S.A. Brod, L. Lee, J.C. Laning, D.A. Hafler, M.E. Dorf, G.S. Gray, H. Reiser, C.H. June, C.B. Thompson, and L.M. Nadler, (1992) "CTLA-4 and CD28 MRNA are Coexpressed in Most T-Cells After Activation", The Journal of Immunology, 149: 3 795–3 801; Schwartz, R.H., (1992), "Costimulation of T-Lymhocytes: The Role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1" in Selvakumar, A., B.K. Mohanraj, R.L. Eddy, T.B. Shows, P.C. White, C. Perrin, and B. Dupont, (1992), "Genomic Organization and Chromosomal Location of the Human Gene Encoding the B-Lymphocyte Activation Antigen B7", Immunogenetics, 36: 175–181) ist diesem Antigen kein hohes Ho mogenitätsniveau gemeinsam. Die gesamte Homologie zwischen B7.1 und B7.2 beträgt 26% und zwischen murinem B7.1 und humanem S7 27% (Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), "Functional Expression of B7/BB1 an Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845–850; Freeman, G.J., A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and L.M. Nadler, (1989), "B7, A New Member of the Ig Superfamily with Unique Expression an Activated and Neoplastic B Cells", The Journal of Immunology, 143: 2 714–2 722). Obwohl der Vergleich von humanen B7.1-, humanen B7.2- und murinen B.1-Sequenzen wenige Strecken einer längeren Homologie zeigt, ist bekannt, dass alle drei Moleküle an humanes CTLA-4 und CD28 binden. Somit existiert am wahrscheinlichsten eine gemeinsame oder nahezu homologe Region, die den drei Molekülen gemeinsam ist, die entweder zusammenhängend oder konformationell sein kann. Diese Region kann die Bindungsstelle der B7.1- und B7.2-Moleküle zu ihren Gegen-Rezeptoren darstellen. Antikörper, die gegen diese Epitope gezüchtet wurden, könnten potenziell die Wechselwirkung von B7 mit seinem Gegen-Rezeptor auf der T7-Zelle hemmen. Außerdem hätten Antikörper, die mit dieser Region sowohl auf B7.1- als auch B7.2-Molekülen kreuzreagieren potenziell praktische Vorteile gegenüber Antikörpern, die getrennt gegen B7.1 oder B7.2 gerichtet sind.
2. Blockade der B7/CD28-Wechselwirkung
Das Blockieren der B7/CD28-Wechselwirkung bietet die Möglichkeit der Induktion einer spezifischen Immunsuppression mit dem Potenzial zur Erzeugung lang anhaltender antigenspezifischer therapeutischer Wirkungen. Antikörper entweder gegen B7.1 oder B7.2 haben gezeigt, die T-Zell-Aktivierung zu blockieren, wie gemessen durch die Hemmung der IL-2-Produktion in vitro (DeBoer, M., P. Parren, J. Dove, F. Ossendorp, G. van der Horst, and J. Reeder, (1992), "Functional Characterization of a Novel Anti-B7 Monoclonal Antibody", Eur. Journal of Immunology, 22: 3 071–3 075; Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), "Functional Expression of B7/BB1 an Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845–850). Allerdings hat sich gezeigt, dass verschiedene Antikörper in ihrer immunsuppressiven Potenz schwanken, was entweder ihre Affinität oder ihre Epitop-Spezifität widerspiegeln kann. CTLA-4/Ig-Fusionsprotein und Anti-CD28 Fabs haben gezeigt, ähnliche Wirkungen auf die Abregulierung der IL-2-Produktion zu besitzen.
Die in vivo-Verabreichung eines löslichen CTLA-4/Ig-Fusionsprotein hat gezeigt, T-Zell-abhängige Antikörperantworten in Mäusen zu unterdrücken (Linsley, P.S., J.L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti, und N.K. Damle, (1992), "Coexpression and Functional Cooperation of CTLA-4 and CD28 an Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1 595–1 604; Lin, H., S.F. Builing, P.S. Linsley, R.O. Wie, C.D. Thompson, and L.A. Turka, (1993), "Long-term Acceptance of Major Histocompatibility Complex Mismatched Cardiac Allografts Induced by CTLA-4-Ig Plus Donor Specific Transfusion", J. Exp. Med., 178: 1 801) und weiterhin waren höhere Dosen auch in der Lage Antworten auf eine zweite Immunisierung zu unterdrücken, was die Möglichkeit dieses Ansatzes zur Behandlung einer Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankung zeigt. Zusätzlich war CTLA-4/Ig in der Lage, die pankreatische Inselzell-Abstoßung in Mäusen durch direktes Hemmen der Wechselwirkung von T-Zellen und B7.1/B7.2-Antigen-präsentierenden Zellen zu verhindern (Lenschow, D.J., G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, C.L. Jellis, G.S. Gray, J. Miller, and J.A. Bluestone, (1993), "Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11 054–11 058). In diesem Fall wurde eine langzeitige donorspezifische Toleranz erzielt.
3. Rekombinante Phagen-Display-Technologie zur Antikörperselektion
Bisher wurden keine monoklonalen Antikörper beschrieben, die sowohl mit B7.1 als auch B7.2 kreuzreagieren. Wie angemerkt, wären solche Antikörper potenziell als Immunsuppressiva äußerst erwünscht. Die Phage-Display-Technologie beginnt gerade traditionelle Verfahren der Isolierung von Antikörpern, die während der Immunantwort erzeugt wurden, zu ersetzen, da ein viel größerer Prozentsatz des immunen Repertoire bewertet werden kann, als es unter Verwendung von traditionellen Verfahren möglich ist. Dies beruht zum Teil auf der PEG-Fusionsineffizienz, der chromosomalen Instabilität und auf der großen Menge an Gewebekultur und dem Screening, das mit der Heterohybridom-Produktion zusammenhängt. Die Phage-Display-Technologie beruht im Gegensatz dazu auf molekularen Techniken zum potenziellen Einfangen des gesamten Repertoires der Immunglobulingene, die mit der Reaktion auf ein gegebenes Antigen im Zusammenhang stehen.
Diese Technik wird beschrieben von Barber et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 7 978–7 982, (1991). Im Wesentlichen werden die Immunglobulin-schweren Kettengene PCR-amplifiziert und in einen Vektor kloniert, der das Gen enthält, das das kleine Hüllprotein des filamentösen Phagen M13 so codiert, dass ein schweres Kettenfusionsprotein erzeugt wird. Das schwere Kettenfusionsprotein wird in das M13-Phageteilchen zusammen mit den leichten Kettengenen eingebaut, wenn es zusammengefügt wird. Jeder rekombinante Phage enthält in seinem Genom die Gene für ein unterschiedliches Antikörper-Fab-Molekül, welches er auf seiner Oberfläche zeigt. Innerhalb dieser Bibliotheken können über 10⁶ verschiedene Antikörper kloniert und gezeigt werden. Die Phagebibliothek wird auf antigenbeschichtete Mikroliter-Vertiefungen ausgestrichen, nicht-spezifische Phagen werden abgewaschen, und Antigen bindende Phagen werden bewertet. Das Genom aus den antigenspezifischen Klonen wird isoliert, und das Gen III wird ausgeschnitten, sodass der Antikörper in löslicher Fab-Form zur weiteren Charakterisierung exprimiert werden kann. Nachdem ein einziges Fab als potenzieller therapeutischer Kandidat gewählt wurde, kann er leicht in einen ganzen Antikörper übergeführt werden. Ein bereits beschriebenes Expressionssystem zur Umwandlung von Fab-Sequenzen in ganze Antikörper ist der Säugerexpressionsvektor NEOSPLA von IDEC. Dieser Vektor enthält entweder humane konstante Gamma 1- oder Gamma 4-Genregionen. CHO-Zellen werden mit den NEOSPLA-Vektoren transfiziert, und nach der Amplifikation können sehr hohe Expressionsniveaus (> 30 pg/Zelle/Tag) erreicht werden, wie von diesem Vektorsystem bekannt ist
4. Primatisierte Antikörper
Ein weiteres hochwirksames Mittel zur Erzeugung von rekombinanten Antikörpern wird von Newman (1992), Biotechnology, 10, 1 455–1 460, offenbart. Insbesondere ergibt diese Technik die Erzeugung von primatisierten Antikörpern, die variable Affen Domänen und humane konstante Sequenzen enthalten. Ferner ist diese Technik auch in der allgemein zugesprochenen US-Anmeldung Nr. 08/379 972, eingereicht am 25. Januar 1995, die eine Teilfortsetzung der US-Seriennummer 07/912 292, eingereicht am 10. Juli 1992, ist, die eine Teilfortsetzung der US-Seriennummer 07/856 281, eingereicht am 23. März 1992, ist, die schließlich eine Teilfortsetzung der US-Seriennummer 07/735 064, einreicht am 25. Juli 1991, ist, beschrieben.
Diese Technik modifiziert Antikörper derart, dass sie bei Verabreichung an Menschen nicht antigenisch abgestoßen werden. Diese Technik beruht auf der Immunisierung von Cynomolgus-Affen mit humanen Antigenen oder humanen Rezeptoren. Diese Technik wurde entwickelt, um hochaffine monoklonale Antikörper zu entwickeln, die gegen humane Zelloberflächenantigene gerichtet sind.
Es wurde bereits beschrieben, dass die auf diese Weise erzeugten Antikörper eine humane Effektorfunktion aufweisen, eine herabgesetzte Immunogenizität und eine lange Serumhalbwertszeit besitzen. Die Technik beruht auf der Tatsache, dass Cynomolgus-Affen phylogenetisch dem Menschen ähnlich sind, die immer noch viele humane Proteine als fremd erkennen und darum eine Immunantwort manifestieren. Da jedoch die Cynomolgus-Affen phylogenetisch den Menschen nahestehen, wurde festgestellt, dass die in diesen Affen erzeugten Antikörper einen hohen Grad an Aminosäurehomologie mit denjenigen aufweisen, die in Menschen produziert wurden. In der Tat wurde festgestellt, dass nach Sequenzierung der variablen Genregionen der leichten und schweren Immunglobulinketten von Makaken die Sequenz von jeder Genfamilie 85–98% homolog zu seinem humanen Gegenspieler war (Newman et al., (1992), Id.). Der erste auf diese Weise erzeugte Antikörper, ein Anti-CD4-Antikörper war zu 91–92% homolog mit der Konsensussequenz der Rasteregionen von humanem Immunglobulin. Newman et al., Biotechnology, 10: 1 458–1 460, (1992).
Monoklonale Antikörper, die auf das humane B7-Antigen spezifisch sind, wurden bereits in der Literatur beschrieben. Beispielsweise beschreiben Weyl et al., Hum. Immunol., 31(4), 271–276, (1991) die Epitop-Kartierung von humanen monoklonalen Antikörpern gegen HLA-B-27 unter Verwendung von natürlichen und mutierten antigenischen Varianten. Auch beschreiben Toubert et al., Clin. Exp. Immunol., 82(1), 16–20, (1990) die Epitop-Kartierung eines HLA-B27-monoklonalen Antikörpers, der auch mit einem 35-kD-bakteriellen Außenmembranprotein reagiert. Auch Valle et al., Immunol., 69(4), 531–535, (1990) beschreiben einen monoklonalen Antikörper der IgG1-Unterklasse, der das B7-Antigen erkennt, das in aktivierten B-Zellen und HTLV-1-transformierten T-Zellen exprimiert wird. Außerdem beschreiben Toubert et al., J. Immunol., 141(7), 2503-9, (1988) die Epitop-Kartierung von HLA-B27- und HLA-B7-Antigenen unter Verwendung von rekombinanten Intradomänen, die durch das Herstellen von Hybridgenen zwischen diesen beiden Allelen in E. coil konstruiert wurden.
Die hohe Expression an B7-Antigen wurde mit Autoimmunerkrankungen von einigen Forschern in Verbindung gebracht. Beispielsweise berichten Ionesco-Tirgoviste et al., Med. Interre, 24(1), 11–17, (1986) über die erhöhte B7-Antigenexpression bei insulinabhängiger Typ-1-Diabetes. Auch die Beteiligung der B7-Antigenexpression an dermalen dendritischen Zellen, die aus Psoriasis-Patienten erhalten wurden, wurde beschrieben (Nestle et al., J. Clin. Invest., 94(1), 202–209, (1994)).
Außerdem wurde in der Literatur die Hemmung eines anti-HLA-B7-alloreaktiven CTL unter Verwendung von affinitätsgereinigtem löslichem HLA-B7 beschrieben (Zavazava et al., Transplantation, 51(4), 838-42, (1991)). Außerdem wurde die Verwendung von B7-Rezeptor-löslichem Liganden, das Blockieren der B7-Aktivität durch CTLA-4-Ig (siehe z. B. Lenschow et al., Science, 257, 789, 7 955 (1992)) in Tiermodellen und ein B7-1-Ig-Fusionsprotein, das zur Hemmung von B7 in der Lage war, beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG UND ZIELE DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung und Identifizierung neuer Makaken-Antikörper gegen humanes B7-Antigen, insbesondere gegen humanes B7.1-Antigen und/oder humanes B7.2-Antigen.
Insbesondere besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Herstellung und Identifizierung von neuen Makaken-Antikörpern gegen humanes B7-Antigen, d. h. gegen humanes B7.1- und humanes B7.2-Antigen, durch Screening von Phagen-Display-Bibliotheken und/oder Affen-Heterohybridomen unter Verwendung von B-Lymphozyten, die aus humanem B7-Antigen, d. h. humanem B7.1- oder B7.2-Antigen-immunisierten Affen, erhalten wurden.
Ein weiteres spezielles Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von monoklonalen Anti-B7-Affen-Antikörpern und primatisierten Formen davon, die spezifisch humanes B7.1- und/oder B7.2-Antigen binden, welches den B7/CD86-Weg und die B7-Stimulierung von aktivierten T-Zellen hemmt, wodurch die IL-2-Produktion und T-Zell-Proliferation und das Funktionieren als wirksame Immunsuppressiva gehemmt werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von monoklonalen Anti-humanen B7.1- und Anti-humanen B7.2-Affen-Antikörpern und primatisierten Formen davon, die Antigen angetriebene Reaktionen in Donor-Milzzellenkulturen hemmen, z. B. antigenspezifische IgG-Antworten, die IL-2-Produktion und -Zellproliferation.
Ein weiterer spezieller Gegenstand der Erfindung ist die Identifizierung bestimmter monoklonaler Affen-Antikörper, die auf humanes B7.1- und humanes B7.2-Antigen spezifisch sind, und der primatisierten Formen davon mit zweckmäßigen Eigenschaften, d. h. Affinität, immunsuppressive Aktivität, die als Therapeutika geeignet sind. Insbesondere sind diese Affen-Antikörper und primatisierten Formen davon z. B. als Immunsuppressiva zu verwenden, d. h. um Antigen-angetriebene Immunreaktionen zu blockieren, und um Autoimmunerkrankungen, wie Psoriasis, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus Erythematodes (SLE), Diabetes mellitus Typ I, idiopathische Thrombozytopenie-Purpurs (ITP) zu behandeln und um Organabstoßung zu verhindern.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die einen oder mehrere monoklonale Affen-Antikörper, die auf humanes B7-Antigen, d. h. humanes B7.1- und/oder humanes B7.2-Antigen spezifisch sind oder primatisierte Formen davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Exzipiens enthalten. Diese Zusammensetzungen werden z. B. als Immunsuppressiva zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, z. B. idiopathische Thrombozytopenie purpura (ITP) und systemischer Lupus Erythematodes (SLE), zur Blockierung von Antigen-angetriebenen Immunantworten und zur Verhinderung der Organabstoßung in Transplantatempfängern eingesetzt.
Die Erfindung ist bei neuen Verfahren der Therapie durch Verabreichung von therapeutisch wirksamen Mengen von einem oder mehreren monoklonalen Affen- oder primatisierten Antikörpern geeignet, die spezifisch an B7-Antigen, d. h. humanes B7.1- und/oder B7.2-Antigen, binden. Solche therapeutischen Verfahren sind zur Behandlung von Krankheiten, die durch Hemmung des B7:CD28-Weges behandelbar sind, z. B. Autoimmunkrankheiten, wie idiopathische Thrombozytopenie purpura (ITP), systemischer Lupus Erythematodes (SLE), TypI-Diabetes mellitus, Psoriasis, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, aplastischer Anämie, sowie zur Verhinderung der Abstoßung in Transplantationsindividuen geeignet.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Transfektanten, z. B. CHO-Zellen, die mindestens die variablen schweren und leichten Domänen von monoklonalen Affen-Antikörpern exprimieren, die auf das humane B7.1- und/oder B7.2-Antigen spezifisch sind.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die die variable schwere und/oder leichte Domäne von monoklonalen Affen-Antikörpern kodieren, die auf das humane B7.1- und/oder humane B7.2-Antigen spezifisch sind, und Expressionsvektoren, die die Expression von primatisierten Antikörpern, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten, bereitstellen.
Definitionen
Die folgenden Begriffe werden definiert, sodass die Erfindung eindeutiger verstanden werden kann.
Depletierender Antikörper – ein Antikörper, der aktivierte B-Zellen oder andere Antigen-präsentierende Zellen abtötet.
Nicht-depletierender Antikörper – ein Antikörper, der die kostimulatorische Wirkung von B7- und T-Zell-Aktivierungsliganden CD28 und CTLA-4 blockiert. Somit anergisiert er die Antigen-präsentierende Zelle, beseitigt sie jedoch nicht.
Primatisierter Antikörper – ein rekombinanter Antikörper, der gentechnisch hergestellt wurde, um die variable schwere und leichte Domäne eines Affen-Antikörpers zu enthalten, insbesondere eines Cynomolgus-Affen-Antikörpers, und der humane konstante Domänsequenzen enthält, vorzugsweise die humane konstante Immunglobulin-Gamma-1- oder -Gamma-4-Domäne (oder die PE-Variante). Die Herstellung von solchen Antikörpern ist bei Newman et al., (1992), "Primatization of Recombinant Antibodies for Immunotherapy of Human Diseases: A Macaque/Human Chimeric Antibody Against Human CDH, Biotechnology, 10: 1 458–1 460; allgemein als 08/379 072 bezeichnet, beschrieben. Es wurde berichtet, dass diese Antikörper einen hohen Homologiegrad mit humanen Antikörpern, d. h. 85–98%, humane Ef fektorfunktionen und eine herabgesetzte Immunogenizität aufweisen und hohe Affinität gegenüber humanen Antigen zeigen können.
B7-Antigene – B7-Antigene umfassen bei dieser Anmeldung z. B. humane B7-, B7.1- und B7.2-Antigene. Diese Antigene binden an CD28 und/oder CTLA-4. Diese Antigene besitzen eine kostimulatorische Rolle bei der T-Zell-Aktivierung. Auch enthalten diese B7-Antigene alle extrazellulären Immunglobulin-Superfamilie V- und C-artigen Domänen, eine hydrophobe Transmembranregion und einen Zytoplasmaschwanz. (Siehe Freeman et al., Science, 262: 90, (1993)), und sind schwer glykosyliert.
Anti-B7-Antikörper – Antikörper, vorzugsweise monoklonale Affen-Antikörper oder primatisierte Formen davon, die spezifisch humane B7-Antigene binden, z. B. humanes B7.1- und/oder B7.2-Antigen, mit einer ausreichenden Affinität, um die B7:CD28-Wechselwirkung zu blockieren und dadurch die Immunsuppression auszulösen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 beschreibt den pMS-Vektor, der zum Screening von rekombinanten Immunglobulin-Bibliotheken eingesetzt wird, die gegen B7 erzeugt werden, die auf der Oberfläche von einem filamentösen Phagen, der Primer auf der Grundlage von Makaken-Immunglobulin-Sequenzen enthält, erscheinen.
2 beschreibt den NEOSPLA-Expressionsvektor, der zur Expression der Subjekt-primatisierten Antikörper verwendet wird, die auf humanes B7.1-Antigen spezifisch sind.
3 beschreibt die Titer von Affen-Anti-B7.1-Serum, die gegen die Zelloberfläche B7.1 auf transfizierten CHO-Zellen gerichtet sind.
4 beschreibt die Hemmung der radioaktiv markierten sB7.1-Bindung durch SB7.1-Affinitäts-gereinigten Affen-Antikörper in Gegenwart von unmarkiertem SB7- und Mab L307.4-murinem Anti-B7.1.
5 beschreibt die Hemmung der Bindung von radioaktiv markierten Affen-135 und L3707.4-Anti-B7.1-Antikörpern an B7-positive humane SB-Zellen durch Konkurrenz mit Affinitäts-gereinigtem SB7.1.
6 beschreibt die Hemmung der radioaktiv markierten B7-Ig-Bindung an aktivierte menschliche periphere Blut-T-Zellen durch Konkurrieren mit unmarkierten SB7.1-murinen Anti-B7.1(L307.4)- und Affen-1127-Affinitäts-gereinigten Serumantikörpern.
7 beschreibt die Hemmung von IL-2-Protein in Lymphozyten-Kulturgemischen durch Anti-B7.1-Affinitäts-gereinigte Affen-Serumantikörper.
8a beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten Form der leichten Kette von 7C10.
8b beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten Form der schweren Kette von 7C10.
9a beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten Form der leichten Kette von 7B6.
9b beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten Form der schweren Kette von 7B6.
10a beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten leichten Kette von 16C10.
10b beschreibt die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz einer primatisierten schweren Kette von 16C10.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend beschrieben, betrifft die Erfindung die Herstellung von neuen monoklonalen Affen-Antikörpern, die spezifisch humanes B7.1- und/oder humanes B7.2-Antigen binden, sowie davon abgeleitete primatisierte Antikörper. Diese Antikörper besitzen hohe Affinität gegenüber humanem B7.1 und/oder B7.2 und können darum als Immunsuppressiva eingesetzt werden, die den B7:CD86-Weg hemmen.
Die Herstellung von monoklonalen Affen-Antikörpern wird vorzugsweise durch Screening von Phagen-Display-Bibliotheken oder durch Herstellung von Affen-Heterohybridomen unter Verwendung von B-Lymphozyten, die aus B7(z. B. humanes B7.1 und/oder B7.2)-immunisierten Affen erhalten wurden, durchgeführt.
Wie angemerkt, umfasst das erste Verfahren zur Erzeugung von Anti-B7-Antikörpern die Phage-Display-Rekombinationstechnik. Diese Technik ist allgemein supra beschrieben.
Im Wesentlichen umfasst dies die Synthese von rekombinanten Immunglobulin-Bibliotheken gegen B7-Antigen, das auf der Oberfläche von einem filamentösen Phagen präsentiert wird, und die Selektion des Phagen mit sezernierten Antikörpern mit hoher Affinität gegenüber dem B7.1- und/oder dem B7.2-Antigen, wie supra angemerkt, werden vorzugsweise Antikörper gewählt, die sowohl an humanes B7.1 als auch B7.2 binden. Zur Durchführung einer solchen Methode haben die vorliegenden Erfinder eine einzigartige Bibliothek für Affen-Bibliotheken geschaffen, was die Möglichkeit der Rekombination herabsetzt und die Stabilität verbessert. Dieser Vektor, pMS, ist im Einzelnen infra beschrieben und ist in 1 gezeigt.
Um im Wesentlichen den Phagen-Display zur Verwendung mit Makaken-Bibliotheken zu übernehmen, enthält dieser Vektor spezifische Primer für die PCR-Amplifikation von Affen-Immunglobulingenen. Diese Primer beruhen auf Makaken-Sequenzen, die erhalten werden, während die primatisierte Technologie und Datenbasen, die humane Sequenzen enthalten, entwickelt werden.
Geeignete Primer sind in der allgemein zugesprochenen 08/379 072 offenbart.
Das zweite Verfahren umfasst die Immunisierung von Affen, d. h. Makaken, gegen humanes B7-Antigen, vorzugsweise gegen humanes B7.1- und B7.2-Antigen. Der natürliche Vorteil von Makaken zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern ist supra besprochen. Insbesondere können solche Affen, z. B. Cynomolgus-Affen, gegen humane Antigene oder Rezeptoren immunisiert werden. Ferner können die resultierenden Antikörper zur Herstellung primatisierter Antikörper gemäß der Methode von Newman et al., Biotechnology, 10, 1 455–1 460, 1992), und Newman et al., allgemein zugeordnete US-Serien-Nr. 08/379 072, eingereicht am 25. Januar 1995, verwendet werden.
Der wesentliche Vorteil von Antikörpern, die aus Cynomolgus-Affen erhalten werden, besteht darin, dass diese Affen viele humane Proteine als fremd erkennen und dadurch die Bildung von Antikörpern bereitstellen, einige mit hoher Affinität gegenüber gewünschten humanen Antigenen, z. B. humane Oberflächenproteine und Zellrezeptoren. Ferner zeigen die resultierenden Antikörper, da sie phylogenetisch dem Menschen nahe stehen, einen hohen Grad an Aminosäurehomologie mit denjenigen, die bei Menschen produziert werden. Wie vorstehend angemerkt, wurde nach Sequenzieren der variablen leichten und schweren Genregionen des Makaken-Immunglobulins festgestellt, dass die Sequenz von jeder Genfamilie zu 85–88% homolog mit ihrem menschlichem Pendant war (Newman et al., (1992), Id.).
Im Wesentlichen wird Cynomolgus-Makaken-Affen humanes B7-Antigen, z. B. humanes B7.1- und/oder humanes B7.2-Antigen verabreicht, B-Zellen werden daraus isoliert, z. B. werden Lymphknotenbiopsien aus den Tieren entnommen, und anschließend werden B-Lymphozyten mit KH6/B5 (Maus × Mensch)-Heteromyelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) fusioniert. Heterohybridome, die Antikörper sezernieren, die humanes B7-Antigen binden, z. B. humanes B7.1- und/oder humanes B7.2-Antigen, werden dann identifiziert.
Antikörper, die sowohl an B7.1 als auch an B7.2 binden, sind wünschenswert, da solche Antikörper potenziell zur Hemmung der Wechselwirkung von B7.1 und B7.2 sowie B7 mit ihren Gegenrezeptoren, d. h. humanes CTLA-4 und CD28, verwendet werden können. Antikörper gegen diese Epitope können die Wechselwirkung sowohl von humanem B7.1 als auch humanem B7.2 mit ihren Gegenrezeptoren auf der T-Zelle hemmen. Dies kann potenziell synergistische Effekte bereitstellen.
Allerdings sind auch Antikörper, die nur an eines von menschlichem B7-Antigen, B7.1-Antigen oder B7.2-Antigen, binden, ebenfalls sehr erwünscht, aufgrund der Co-Beteiligung dieser Moleküle an der T-Zell-Aktivierung, klonalen Expansion, Lymphokin(IL-2)-Sekretion und an der Ansprechbarkeit auf Antigen. Vorgegeben, dass sowohl B7.1 als auch B7.2 an humanes CTLA-4 und CD28 binden, ist es wahrscheinlich, dass mindestens eine gemeinsame oder homologe Region (vielleicht ein gemeinsames konformationelles Epitop oder Epitope) existieren, gegen die Makaken-Antikörper potenziell gezüchtet werden können.
Die vorliegenden Erfinder haben die Immunisierung von Makaken gegen humanes B7.1-Antigen unter Verwendung von rekombinantem löslichen B7.1-Antigen gewählt, das in CHO-Zellen produziert wird und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer L307.4-Sepharose-Affinitätssäule gereinigt wird. Allerdings ist die bestimmte Quelle von humanem B7-Antigen, humanem B7.1-Antigen oder humanem B7.2-Antigen nicht kritisch, mit der Maßgabe, dass sie ausreichend rein ist, um eine spezifische Antikörperreaktion gegenüber dem bestimmten verabreichten B7-Antigen und potenziell gegenüber anderen B7-Antigenen zu ergeben.
Die Gene von humanem B7-Antigen, humanem B7.1-Antigen (auch CD80 genannt) und humanem B7.2-Antigen (auch CD86 genannt) wurden bereits kloniert und sequenziert und können darum leicht durch Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
Vorzugsweise wird das verabreichte humane B7-Antigen, humane B7.1-Antigen und/oder humane B7.2-Antigen in löslicher Form verabreicht, z. B. durch Expression eines B7-, B7.1- oder B7.2-Gens, von dem seine Transmembran- und Zytoplasmadomänen entfernen wurden, wodurch nur der extrazelluläre Teil, d. h. die extrazellulären Superfamilie V- und C-artigen Domänen, zurückbleibt. (Siehe z. B. Grumet et al., Hum. Immunol., 40(3), S. 228–234, 1994, der die Expression einer löslichen Form von humanem B7 lehrt.)
Die Makaken werden mit dem B7-, B7.1- und/oder B7.2-Antigen immunisiert, vorzugsweise in einer löslichen Form davon, unter Bedingungen, die zur Produktion von darauf spezifischen Antikörpern führen. Vorzugsweise wird das lösliche humane B7-, B7.1- oder B7.2-Antigen, in Kombination mit einem Adjuvans, z. b. Freund's Komplett-Adjuvans (CFA), Alaun, Saponin oder andere bekannte Adjuvantien, sowie Kombinationen davon verabreicht. Im Allgemeinen erfordert dies wiederholte Immunisierung, z. B. durch wiederholte Injektion über mehrere Monate hinweg. Beispielsweise wurde die Verabreichung von löslichem B7.1-Antigen in Adjuvans mit Boosterimmunisierungen über einen Zeitraum von 3 bis 4 Monaten durchgeführt mit der resultierenden Produktion von Serum, das Antikörper enthält, die humanes B7.1-Antigen banden.
Nach der Immunisierung werden die B-Zellen gesammelt, z. B. durch Lymphknotenbiopsien, die den immunisierten Tieren entnommen wurden, und B-Lymphozyten, die mit KH6B5 (Maus × Mensch)-Heteromyelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert wurden. Verfahren zur Herstellung solcher Heteromyelome sind bekannt und können in der US-Serien-Nr. 08/379 072 von Newman et al., eingereicht am 25. Januar 1995, gefunden werden.
Heterohybridome, die Antikörper sezernieren, die humanes B7, B7.1 und/oder B7.2 binden, werden dann identifiziert. Dies kann durch bekannte Techniken durchgeführt werden. Beispielsweise kann dies durch ELISA oder Radioimmunassay unter Verwendung von Enzym oder radioaktiv markiertem humanem B7-, B7.1- und/oder B7.2-Antigen bestimmt werden.
Zelllinien, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität gegenüber humanem B7-, B7.1- und/oder B7.2-Antigen sezernieren, werden dann bis zur Monoklonalität subkloniert.
Bei der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder gereinigte Antikörper auf ihre Fähigkeit gescreent, an lösliche B7.1-Antigen-beschichtete Platten in einem ELISA-Assay, an Antigen-positive B-Zellen und an CHO-Transfektome, die humanes B7.1-Antigen auf ihren Zelloberflächen exprimieren, zu binden. Zusätzlich wurden die Antikörper auf ihre Fähigkeit zur Blockierung von B-Zellen/T-Zellen-Wechselwirkungen gescreent, wie gemessen durch IL-2-Produktion und tritiierte Thymidinaufnahme einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR), wobei die B7-Bindung unter Verwendung von ¹²⁵I-radioaktiv markiertem löslichen B7.1 (SB7.1) nachgewiesen wird.
Auch wurden affinitätsgereinigte Antikörper aus Makaken auf ihre Reaktivität gegen CHO-Transfektanten getestet, die B7.1/Ig-Fusionsproteine exprimieren, und gegen CHO-Zellen, die humanes B7.2-Antigen produzierten. Diese Ergebnisse zeigten an, dass die B7.1-Immunseren an B7.2-Transfektome banden. Die Bindung von Antikörpern an B7.2-Antigen kann unter Verwendung von löslichen B7.2-Ig-Reagenzien bestätigt werden. Wie in den Beispielen besprochen, kann dies durch Produktion und Reinigung von B7.2-Ig aus CHO-Transfektomen in ausreichenden Mengen zur Herstellung einer B7.2-Ig-Sepharose-Affinitätssäule durchgeführt werden. Diese Antikörper, die mit B7.2 kreuzreagieren, binden an die B7.2-Ig-Sepharose-Säule.
Zelllinien, die Antikörper exprimieren, die spezifisch an humanes B7-Antigen, B7.1- und/oder B7.2-Antigen binden, werden anschließend zur Klonierung variabler Domänsequenzen zur Herstellung von primatisierten Antikörpern verwendet, im Wesentlichen wie beschrieben bei Newman et al., (1992), Id. und Newman et al., US-Serien-Nr. 379 072, eingereicht am 25. Januar 1995. Im Wesentlichen hat dies die Extraktion von RNA daraus, die Umwandlung zu cDNA und die Amplifikation davon durch PCR unter Verwendung von Ig-spezifischen Primern zur Folge. Geeignete Primer sind bei Newman et al., 1992, Id. und in US-Serien-Nr. 379 072 beschrieben. (Siehe insbesondere 1 der US-Serien-Nr. 379 072.)
Die klonierten variablen Affen-Gene werden dann in einen Expressionsvektor inseriert, der konstante Genregionen der humanen schweren und leichten Kette enthält. Vorzugsweise wird dies unter Verwendung eines proprietären Expressionsvektor von IDEC, Inc., der als NEOSPLA bezeichnet wird, durchgeführt. Dieser Vektor ist in 2 gezeigt und enthält den Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer, den Maus-Beta-Globin-Haupt-Promotor, den SV40-Replikationsursprung und die bovine Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz, Neomycinphosphotransferase-Exon 1 und -Exon 2, die konstante Region von humanem Kappa- oder Lambda-Immunglobulin, das Dihydrofolatreduktasegen, die konstante Region und Leader-Sequenz des humanen Gamma-1- oder Gamma-4-PE-Immunglobulins. Es wurde festgestellt, dass dieser Vektor ein sehr hohes Expressionsniveau von primatisierten Antikörpern ergibt, bei Einarbeitung von variablen Affen-Genregionen, Transfektion in CHO-Zellen und anschließende Selektion in G418 enthaltenden Medium und Methotrexatamplifikation.
Beispielsweise hat dieses Expressionssystem bereits offenbart, zu primatisierten Antikörpern mit hoher Avidität (Kd ≤ 10^–10 M) gegenüber CD4- und anderen humane Zelloberflächenrezeptoren zu führen. Ferner wurde festgestellt, dass die Antikörper die gleiche Affinität, Spezifität und funktionelle Aktivität wie der ursprüngliche Affenantikörper aufweisen. Dieses Vektorsystem ist im Wesentlichen in der allgemein zugeordneten US-Seriennummer 379 072 sowie in der US-Serien-Nr. 08/149 099, eingereicht am 3. November 1993 offenbart. Dieses System liefert hohe Expressionsniveaus, d. H. > 30 pg/Zelle/Tag.
Wie infra besprochen, haben die vorliegenden Erfinder vier führende Kandidaten von monoklonalen Affen-Antikörpern ausgewählt, die spezifisch das B7.1-Antigen binden, und die auch das B7.2-Antigen binden können. Diese monoklonalen Affen- Antikörper werden hier als 7B6, 16C10, 7C10 und 20C9 bezeichnet.
Wie ausführlicher infra besprochen, wurden diese Antikörper auf ihre Fähigkeit zur Blockierung von B-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen bewertet, wie durch IL-2-Produktion und tritiierte Thymidinaufnahme in einer gemischten Lymphozytenreaktion für T-Zell-Bindungsexperimente für die T-Zell-Bindung bewertet, humane periphere Buffy-coat-Blutlymphozyten [wahrscheinlich wie unten, nicht body coat sondern buffy coat] wurden 3–6 Tage in Gegenwart von PHA-Stimulator kultiviert. Die B7-Bindung wurde unter Verwendung von ¹²⁵I-radioaktiv markiertem löslichem B7.1 in einem Radioassay geprüft. Die beobachteten Ergebnisse geben an, dass alle diese Antikörper B7.1-Antigen mit hoher Affinität binden und wirksam B-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen blockieren, wie durch reduzierte IL-2-Produktion und reduzierte Proliferation von gemischten Lymphozytenkulturen bewiesen.
Die Eigenschaften dieser bestimmten monoklonalen Affen-Antikörper sind nachstehend zusammengefasst:

1. Um die Fähigkeit der Affen-Antikörper zur Blockierung der physikalischen Wechselwir kung zwischen CTLA4-Ig zu zeigen, wurden variierende Konzentrationen der Affen-Anti-B7.1-Antikörper und unmarkiertes CTLA4-IG mit radioaktiv markiertem CTLA4-Ig¹¹²⁵ inkubiert. Die Ergebnisse des Inhibitionsassays zeigten, dass die IC50 (die Konzentration an Inhibitor, die zu 50% Hemmung führt) für die Affen-Antikörper Folgende sind:

a:	7C10:	0,39 μg/ml
b:	16C10:	1,60 μg/ml
c:	20C9	3,90 μg/ml
d:	7B6:	39,0 μg/ml

2. Scatchard-Analyse zeigte, dass die scheinbaren Affinitätskonstanten (Kd) für die Bindung von Affen-Antikörpern an B7-Ig-beschichtete Platten ungefähr Folgende waren:

a:	7C10:	6,2 × 10^–9 M
b:	16C10:	8,1 × 10^–9 M
c:	7B6:	10,7 × 10^–9 M
d:	20C9:	16,8 × 10^–9 M

3. Die Antikörper wurden in vitro in einem gemischten Lymphozytenreaktionsassay (MLR) getestet. Der MLR zeigte, dass alle 4 Anti-B7.1-Antikörper die IL-2-Produktion in verschiedenen Ausmaßen hemmen, wie durch die folgenden Ibgo-Werte gezeigt:

a:	7B6:	5,0 μg/M
b:	16C10:	< 0,1 μg/M
c:	20C9:	2,0 μg/M
d:	7C10:	5,0 μg/M

4. Die Affen-Anti-B7.1-Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit getestet B7 an humane periphere Blutlymphozyten (PBL) zu binden. Eine FACS-Analyse zeigte, dass alle 4 getesteten Affen-Antikörper positiv waren.
5. Affen-Antikörper 16C10, 7B6, 7C10 und 20C9 wurden auf C1q-Bindungsfähigkeit? (Seite 29, Original ohne Ability) durch FACS-Analyse getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass 7C10 Affen-Ig eine starke humane C1q-Bindung nach Inkubation mit B7.1-CHO-transfizierten Zellen aufwies. 16C10 war positiv, während 20C9- und 7B6-Affen-Antikörper negativ waren.
6. Zur Selektion eines Tiermodells für Path/Tox-Systemstudien wurden die Affen-Antikörper mit Tierblut verschiedener Spezies getestet. Es wurde bestimmt, dass die Affen-Anti-B7.1-Antikörper mit humanem, Schimpansen- und möglicherweise Pavian-Blut kreuzreagierten.

Auf der Grundlage dieser Eigenschaften würde es erscheinen, dass drei monoklonale Affen-Antikörper die besonders vorteilhaften Eigenschaften besitzen (16C10, 7C10 und 20C9), wobei 16C10 und 7C10 etwas besser als 20C9 waren.
Unter Verwendung der supra und in der allgemein zugeordneten US-Serien-Nr. 08/379 072 beschriebenen Technik haben die vorliegenden Erfinder die variablen Domänen von 7C10, 7B6 und 16C10 kloniert und stellen die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz von primatisierten Formen der 7C10-leichten Kette, 7C10-schweren Kette, 7B6-leichten Kette, 7B6- schweren Kette, 16C10-leichten Kette und 16C10-schweren Kette bereit. Diese Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen können in den 8a und 8b, 9a und 9b und 10a und 10b gefunden werden. Die DNA- und Aminosäuresequenz für die humane konstante Gamma 1-Domäne kann in 08/379 072 gefunden werden.
Wie supra besprochen werden diese primatisierten Antikörper vorzugsweise unter Verwendung des NEOSPLA-Expressionsvektor, der in 2 gezeigt ist, exprimiert, welcher im Wesentlichen in der allgemein zugeordneten 08/379 072 und 08/149 099 beschrieben ist.
Wie bereits angemerkt, enthalten die betreffenden primatisierten Antikörper vorzugsweise entweder die humane konstante Region von Gamma 1- oder Gamma 4-Immunglobulin, wobei Gamma 4 vorzugsweise an zwei Positionen zur Erzeugung von Gamma 4-PE mutiert ist. Die Gamma 4-PE-Mutante enthält zwei Mutationen, eine Glutaminsäure in der CH2-Region, die eingeschleust wurde, um das restliche FCR-Binden auszuschalten, und eine Prolinsubstitution in der Hinge-Region, die zur Verstärkung der Stabilität der Disulfid-Bindungswechselwirkung der schweren Kette beabsichtigt ist. (Siehe Alegre et al., J. Immunol., 148, 3 461–3 468, (1992), und Angel et al., Mol. Immunol., 30, 105–158, (1993).)
Ob die betreffenden primatisierten Antikörper die konstante Region von Gamma 1-, Gamma 4- oder Gamma 4-PE enthält, hängt großen Teils von dem bestimmten Krankheitsziel ab. Vorzugsweise werden depletierende und nicht-depletierende primatisierte IgG1- und IgG4-Antikörper erzeugt und gegen spezifische Krankheitsziele getestet.
Angesichts der beschriebenen Bindungs- und der funktionellen Eigenschaften der betreffenden monoklonalen Affen-Antikörper sollten diese monoklonalen Anti-B7.1-Antikörper und primatisierte Formen davon als therapeutische Mittel zum Blockieren der B7:CD28-Wechselwirkung gut geeignet sein und dadurch Immunsuppression bereitstellen. Insbesondere, angesichts ihrer Affinität gegenüber B7.1-Antigen und der Fähigkeit zur Blockierung der B-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen, wie gemessen durch IL-2-Produktion und tritiierte Thymidin-Aufnahme in gemischter Lymphozytenkultur sowie ihre Fähigkeit zur wirksamen Hemmung von Antigen angetriebenen Antworten in Donor-Milzkulturen, wie durch reduzierte Antigen-spezifische IgG-Antworten, IL-2-Produktion und Zellproliferation gezeigt, sollten diese monoklonalen Affen-Antikörper und die primatisierten Formen davon als wirksame Immunsuppressiva funktionieren, die den B7:CD28-Weg modulieren. Dies ist für die Behandlung von vielen Krankheiten signifikant, wobei Immunsuppression therapeutisch erwünscht ist, z. B. Autoimmunerkrankungen, um unerwünschte Antigen-spezifische IgG-Antworten zu hemmen und auch zur Prävention von Organabstoßung und Graft-versus-Host-Krankheit. Im Wesentlichen sind die betreffenden Antikörper bei der Behandlung jeder Krankheit geeignet, wobei Suppression des B7:CD28-Weges therapeutisch wünschenswert ist.
Therapeutische Schlüsselindikationen für die betreffenden Anti-B7.1-Antikörper umfassen beispielsweise Autoimmunkrankheiten, wie idiopathische thrombozytopenische Purpurea (ITP), systemischer Lupus Erythematodes (SLE), Typ-I-Diabetes mellitus, multiple Sklerose, aplastische Anämie, Psoriasis und rheumatoide Arthritis.
Eine weitere signifikante therapeutische Indikation für die betreffenden Anti-B7.1-Antikörper ist die Verhinderung von Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD) während der Organtransplantation und Knochenmarkstransplantation (BMT). Die betreffenden Antikörper können zur Induktion von Wirtstoleranz gegenüber donorspezifischen Alloantigenen verwendet werden und erleichtern dadurch die Implantation und setzen die Inzidenz von Implantatabstoßung herab. Es wurde in einem Mausmodell für die allogene Herztransplantation gezeigt, dass intravenöse Verabreichung von CTLA4-Ig zur Immunsuppression oder auch Induktion von Toleranz gegenüber Alloantigen führen kann (Lin et al., J. Exp. Med., 178: 1 801; 1993; Torka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 11 102, 1992). Es wird erwartet, dass die betreffenden primatisierten Anti-B7.1-Antikörper vergleichbare oder größere Aktivität aufweisen.
Antikörper, die auf die vorstehend beschriebene Weise oder durch vergleichbare Techniken produziert werden, können durch eine Kombination von Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie zur Charakterisierung in funktionellen biologischen Assays gereinigt werden. Diese Assays umfassen die Bestimmung von Spezifität und Bindungsaffinität sowie die Effektorfunktion, die mit dem exprimierten Isotypen, z. B. ADCC, oder Komplement-Fixierung zusammenhängt. Solche Antikörper können als passive oder aktive therapeutische Mittel gegen eine Anzahl von menschlichen Krankheiten, einschließlich B-Zellen-lymphoma, Infektionskrankheiten, einschließlich AIDS, Autoimmunkrankheiten und entzündliche Krankheiten und Transplantation verwendet werden. Die Antikörper können entweder in ihrer nativen Form oder als Teil eines Antikörper/Chelat-, Antikörper/Arzneimittel- oder An tikörper/Toxin-Komplex verwendet werden. Zusätzlich können ganze Antikörper oder Antikörperfragmente (Fab₂, Fab, Fv) als bildgebende Reagenzien oder als potenzielle Impfstoffe oder Immunogene bei der aktiven Immuntherapie zur Erzeugung von antiidiotypischen Antworten verwendet werden.
Die Menge an Antikörper, die geeignet ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen, kann durch Standardtechniken, die den Fachleuten wohl bekannt sind, bestimmt werden. Die Antikörper werden im Allgemeinen durch Standardtechniken in einem pharmazeutisch verträglichen Puffer bereitgestellt und können durch jeden gewünschten Weg verabreicht werden. Aufgrund der Wirksamkeit der derzeit beanspruchten Antikörper und ihrer Toleranz durch Menschen ist es möglich, diese Antikörper wiederholt zu verabreichen, um verschiedene Krankheiten oder Krankheitszustände in einem Menschen abzuwehren.
Die Anti-B7.1-Antikörper (oder Fragmente davon) der Erfindung sind zur Induktion der Immunsuppression, z. B. Induktion einer Suppression eines menschlichen oder tierischen Immunsystems geeignet. Die Erfindung betrifft darum ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Induktion von Immunsuppression in einem Menschen oder einem anderen Tier, das dessen bedarf, durch Verabreichung einer wirksamen nicht-toxischen Menge eines solchen erfindungsgemäßen Antikörpers an einen Menschen oder ein anderes Tier.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Auslösung von Immunsuppression wurde in Standardtests, die für diesen Zweck verwendet wurden, beispielsweise ein gemischter Lymphozytenreaktionstest oder ein Test, der die Thymidinaufnahme der T-Zell-Proliferation misst, gezeigt.
Die Tatsache, dass die erfindungsgemäßen Antikörper bei der Induktion von Immunsuppression Brauchbarkeit besitzen, gibt an, dass sie bei der Behandlung oder Prävention von Resistenz gegenüber oder von Abstoßung von transplantierten Organen oder Geweben (z. B. Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Haus, Cornea etc.) geeignet sein sollten; die Behandlung oder Prävention von autoimmunen, entzündlichen, proliferativen und hyperproliferativen Krankheiten und von kutanen Manifestationen von immunologisch vermittelten Krankheiten (z. B. rheumatoide Arthritis, Lupus Erythematodes, systemischer Lupus Erythematodes, Hashimoto-Thyroiditis, multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, Typ-I-Diabetes, Uveitis, nephrotisches Syndrom, Psoriasis, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis und weitere ekzematöse Dermatitiden, seborrhoische Dermatitis, Lichen planus, Pemplugus, bullous Pemphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, Angioödem, Vaskulitis, Erythema, cutaneous eosinophilias, Alopecia areata etc.); die Behandlung von reversiblen Atemwegsverstopfungskrankheiten, Darmentzündungen und Allergien (z. B. Zöliakie, Proktitis, Eosinophilie-Gastroenteritis, Mastozytose, Morbus Crohn und ulzerative Colitis und mit Nahrungsmittel zusammenhängende Allergien (z. B. Migräne, Rhinitis und Ekzem).
Ein Fachmann wäre in der Lage durch routinemäßiges Experimentieren zu bestimmen, was eine wirksame nicht-toxische Menge an Antikörper für den Zweck der Auslösung von Immunsuppression wäre. Im Allgemeinen jedoch liegt eine wirksame Dosis im Bereich von etwa 0,05 bis 100 Milligramm pro Kilogramm pro Tag.
Die Antikörper (oder Fragmente davon) dieser Erfindung sollten auch zur Behandlung von Tumoren in einem Säuger geeignet sein. Insbesondere sollten sie zur Herabsetzung der Tumorgröße, der Hemmung des Tumorwachstums und/oder der Verlängerung der Überlebensdauer von Tumor-tragenden Tieren geeignet sein. Demnach betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum Behandeln von Tumoren bei einem Menschen oder einem anderen Tier durch Verabreichung einer wirksamen nicht-toxischen Menge eines Antikörpers an einen solchen Menschen oder ein Tier. Ein Fachmann wäre in der Lage durch routinemäßiges Experimentieren zu bestimmen, was eine wirksame nicht-toxische Menge eines Anti-B7-Antikörpers für den Zweck der Behandlung von karzinogenen Tumoren wäre. Im Allgemeinen wird erwartet, dass eine wirksame Dosis im Bereich von etwa 0,05 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können an einen Menschen oder ein anderes Tier nach dem zuvor genannten Verfahren der Behandlung in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um eine solche Wirkung in einem therapeutischen oder prophylaktischen Ausmaß zu erzeugen. Solche erfindungsgemäßen Antikörper können an einen solchen Menschen oder ein anderes Tier in einer herkömmlichen Dosierungsform verabreicht werden, die durch Kombinieren des Antikörpers der Erfindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel nach bekannten Techniken hergestellt wird. Von einem Fachmann wird erkannt, dass die Form und der Charakter dieser pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel von der Menge des Wirkstoffs, mit der er kombiniert werden soll, dem Verabreichungsweg und anderen wohl bekannten Variablen vorgegeben wird.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers (oder Fragments davon) der Erfindung kann oral, parenteral durch Inhalation oder topisch sein. Der Begriff parenteral, wie hier verwendet, umfasst intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, rektale oder vaginale Verabreichung. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung sind im Allgemeinen bevorzugt.
Die tägliche parenterale und orale Dosisvorgabe zum Anwenden der erfindungsgemäßen Verbindungen, um prophylaktisch oder therapeutisch Immunsuppression auszulösen oder um therapeutisch karzinogene Tumore zu behandeln, liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 bis 100, jedoch vorzugsweise von etwa 0,5 bis 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch durch Inhalation verabreicht werden. "Inhalation" bedeutet intranasale und orale Inhalationsverabreichung. Geeignete Dosierungsformen für eine solche Verabreichung, wie eine Aerosolformulierung oder ein Inhalator für eine abgemessene Dosis kann durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Die bevorzugte Dosierungsmenge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die einzusetzen ist, liegt im Allgemeinen in dem Bereich von etwa 10 bis 100 Milligramm.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch topisch verabreicht werden. Topische Verabreichung bedeutet nicht-systemische Verabreichung und umfasst die externe Anwendung einer Antikörper-Verbindung (oder eines Fragments davon) der Erfindung auf die Epidermis, auf die Mundhöhle und Instillation eines solchen Antikörpers in das Ohr, Auge und Nase und wo sie nicht signifikant in den Blutstrom eintritt. Systemische Verabreichung bedeutet oral, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung. Die Menge an Antikörper, die zur therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung erforderlich ist, variiert natürlich mit dem gewählten Antikörper, der Natur und Schwere des Zustandes, der behandelt wird, und dem Tier, das Behandlung erfährt und liegt schließlich bei der Diskretion des Arztes. Eine geeignete topische Dosis eines erfindungsgemäßen Antikörpers liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht täglich.
Formulierungen
Obgleich es für einen Antikörper oder ein Fragment davon möglich ist, allein verabreicht zu werden, ist es bevorzugt, ihn als pharmazeutische Formulierung darzureichen. Der Wirkstoff kann für die topische Verabreichung 0,001% bis 10% Gew./Gew., z. B. 1% bis 2 Gew.-% der Formulierung einschließen, obwohl sie so viel wie 10% Gew./Gew., jedoch vorzugsweise nicht über 5% Gew./Gew. und stärker bevorzugt 0,1% bis 1% Gew./Gew. der Formulierung umfassen.
Die erfindungsgemäßen topischen Formulierungen umfassen einen Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern) dafür und gegebenenfalls einem beliebigen anderen therapeutischen Bestandteil (Bestandteilen). Der (die) Träger müssen in dem Sinne "verträglich" sein, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger davon nicht von Vorteil sind.
Formulierungen, die zur topischen Verabreichung geeignet sind, umfassen flüssige oder halbflüssige Zubereitungen, die zum Durchdringen der Haut an die Stelle, wo die Behandlung erforderlich ist, geeignet sind, wie Linimente, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und Tropfen, die zur Verabreichung an das Auge, das Ohr oder die Nase geeignet sind.
Erfindungsgemäße Tropfen können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können durch Auflösen des Wirkstoffes in einer geeigneten wässrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder eines jeden anderen geeigneten Konservierungsstoffes hergestellt werden und schließen vorzugsweise ein Tensid ein. Die resultierende Lösung kann anschließend durch Filtration geklärt, in einen geeigneten Behälter übergeführt werden, der anschließend durch Autoklavieren oder Halten eine halbe Stunde lang bei 90–100°C abgeschlossen und sterilisiert wird. Alternativ kann die Lösung durch Filtration und Transferieren in den Behälter durch eine aseptische Technik sterilisiert werden. Beispiele für Bakterizide und fungizide Mittel, die zum Einschluss in die Tropfen geeignet sind, sind Phenylmercurinitrat oder -acetat (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Geeignete Lösungsmittel zur Herstellung einer Öllösung umfassen Glyzerin, verdünnten Alkohol und Propylenglykol.
Erfindungsgemäße Lotionen umfassen diejenigen, die zur Anwendung auf die Haut oder das Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung umfassen, die gegebenenfalls ein Bakterizid enthält, und kann durch Verfahren entsprechend denjenigen zur Herstellung von Tropfen hergestellt werden. Lotionen oder Linimente zur Anwendung auf die Haut können auch ein Mittel zum Beschleunigen des Trocknens und zum Kühlen der Haut, wie ein Alkohol oder Aceton, und/oder ein Befeuchter, wie Glyzerin, oder ein Öl, wie Castoröl oder Erdnussöl, einschließen.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs für die externe Anwendung. Sie können durch Mischen des Wirkstoffes in fein zerteilter oder pulverisierter Form allein oder in Lösung oder Suspension in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Fluid mithilfe von einer geeigneten Maschinerie, mit einer fettigen oder nicht-fettigen Basis, hergestellt werden. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe einschließen, wie Hart-Weich- oder Flüssigparaffin, Glyzerin, Bienenwachs, eine Metallseife, ein Schleimstoff; ein Öl natürlichen Ursprungs wie Mandelöl, Maisöl, Erdnussöl, Castoröl oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate oder eine Fettsäure, wie Stearinsäure oder Ölsäure zusammen mit einem Alkohol, wie Propylenglykol oder Macrogols. Die Formulierung kann jedes geeignete Tensid einschließen, wie aasionisches, kationisches oder nicht-ionisches Tensid, wie Sorbitanester oder Polyoxyethylenderivate davon. Suspensionsmittel, wie natürliche Gummen, Cellulosederivate oder anorganische Materialien wie kieselsäureartige Siliciumdioxide und andere Bestandteile, wie Lanolin, können ebenfalls eingeschlossen sein.
Die betreffenden Anti-B7.1-Antikörper oder Fragmente davon, können auch in Kombination mit anderen Gruppierungen verabreicht, die den B7:CD28-Weg modulieren. Solche Gruppierungen umfassen beispielsweise Zytokine, wie IL-7 und IL-10, CTLA4-Ig, lösliches CTLA-4 und Anti-CD28-Antikörper und Fragmente davon.
Ein Fachmann erkennt, dass die optimale Menge und der optimale Abstand von individuellen Dosen eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung von der Natur und dem Ausmaß des zu behandelnden Zustandes der Form, den Weg und der Stelle der Verabreichung und dem bestimmten Tier, das behandelt wird, bestimmt wird, und dass solche Optima durch herkömmliche Techniken bestimmt werden können. Ein Fachmann weiß auch, dass der optimale Verlauf der Behandlung, d. h. die Anzahl von Dosen eines Antikörpers oder Fragments da von, welches pro Tag für eine definierte Anzahl von Tagen gegeben wird durch Fachleute unter Verwendung herkömmlicher Behandlungsverlaufsbestimmungstests sichergestellt werden kann.
Ohne weitere Ausarbeitung wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß nutzen kann. Die folgenden Formulierungen sind dafür so konstruiert, dass sie hauptsächlich erläuternde Ausführungsformen sind und nicht eine Beschränkung des Schrittes der vorliegenden Erfindung sind.
Kapselzusammensetzung
Eine pharmazeutische erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form einer Kapsel wird durch Füllen einer zweistückigen Hartgelatine-Standardkapsel mit 50 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in pulverisierter Form, 100 mg Lactose, 32 mg Talg und 8 mg Magnesiumstearat gefüllt wird.
Injizierbare parenterale Zusammensetzung
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist, wird durch Rühren von 1,5 Gew.-% eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in 10 Vol.-% Propylenglykol und Wasser hergestellt. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert.
Salbenzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Weißes Weichparaffin auf 100,0 g.

Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung wird in einem kleinen Volumen des Vehikels dispergiert, um ein glattes, homogenes Produkt zu erzeugen. Kollabierbare Metallröhren werden dann mit der Dispersion gefüllt.
Topische Creme-Zusammensetzung

Antikörper oder ein Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Polawachs GP 200 20,0 g.
Wasserfreies Lanolin 2,0 g.
Weißes Bienenwachs 2,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,1 g.
Destilliertes Wasser auf 100,0 g.

Polawachs, Bienenwachs und Lanolin werden miteinander bei 60°C erwärmt. Eine Lösung von Methylhydroxybenzoat wird zugesetzt und die Homogenisierung wird unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsrühren erreicht. Anschließend wird die Temperatur auf 50°C fallen gelassen. Der erfindungsgemäße Antikörper oder Fragment davon wird dann zugesetzt und überall dispergiert, um die Zusammensetzung wird mit langsamem Geschwindigkeitsruhren abkühlen gelassen.
Topische Lotion-Zusammensetzung

Erfindungsgemäße Antikörper oder Fragment davon 1,0 g.
Sorbitanmonolaurat 0,6 g.
Polysorbat 20 0,6 g.
Cetostearylalkohol 1,2 g.
Glyzerin 6,0 g.
Methylhydroxybenzoat 0,2 g.
Gereinigtes Wasser B. P. bis auf 100–00 ml (B. P. = British Pharmakopöe).

Das Methylhydroxybenzoat und Glyzerin werden in 70 ml des Wassers bei 75°C gelöst. Das Sorbitanmonolaurat, Polysorbat 20 und Cetostearylalkohol werden bei 75°C miteinander geschmolzen und der wässrigen Lösung zugesetzt. Die resultierende Emulsion wird homogenisiert, unter kontinuierlichem Rühren abkühlen gelassen, und der erfindungsgemäße Antikörper oder das Fragment davon wird als Suspension in dem verbleibenden Wasser zugesetzt. Die gesamte Suspension wird, bis sie homogen ist, gerührt.
Augentropfenzusammensetzung

Erfindungsgemäße Antikörper oder Fragment davon 0,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,01 g.
Propylhydroxybenzoat 0,04 g.
Gereinigtes Wasser B. P. auf 100–00 ml.

Das Methyl- und Propylhydroxybenzoat werden in 70 ml gereinigtem Wasser bei 75°C gelöst, und die resultierende Lösung wird abkühlen gelassen. Der erfindungsgemäße Antikörper oder ein Fragment davon werden zugesetzt, und die Lösung wird durch Filtration über einen Membranfilter (0,022 μm Porengröße) sterilisiert und aseptisch in geeignete sterile Behälter verpackt.
Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml: Mischen von 10 mg eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon mit 0,2–0,5% eines Gleitmittels, wie Polysorbat 85 oder Oleinsäure und Dispergieren eines solchen Gemisches in ein Treibmittel, wie Freon, vorzugsweise in einer Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan und Verbringen in einen geeigneten Aerosolbehälter, der entweder zur intranasalen oder oralen Inhalationsverabreichung ausgelegt ist.
Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml: Auflösen von 10 mg eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon in Ethanol (6–8 ml), Zugeben von 0,1–0,2% eines Gleitmittels, wie Polysorbat 85 oder Ölsäure, und Dispergieren in einem Treibmittel wie Freon, vorzugsweise in Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan und Verbringen in einen geeigneten Aerosolbehälter, der entweder zur intranasalen oder oralen Inhalationsverabreichung ausgelegt ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders zur parenteralen Verabreichung geeignet, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen im Allgemeinen eine Lösung eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon oder eines Cocktails davon, aufgelöst in einem verträglichen Träger, vorzugsweise in einem wässrigen Träger. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann eingesetzt werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von Stoffteilchen. Diese Lösungen können durch herkömmliche wohl bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, wie sie erforderlich sind, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie pH-Einstell-Puffermittel etc. Die Konzentration des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann breit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,5% in der Regel bei oder mindestens etwa 1% bis so viel wie 15 oder 20 Gew.-%, und wird hauptsächlich auf der Grundlage von Fluidvolumina, Viskositäten etc. je nach gewählter Verabreichungsweise, gewählt.
Somit könnte eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur intramuskulären Injektion so hergestellt werden, um 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon zu enthalten. Gleichermaßen könnte eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion hergestellt werden, um 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon zu enthalten. Die derzeitigen Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen sind wohl bekannt oder den Fachleuten geläufig und sind im Einzelnen beispielsweise bei Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Antikörper (oder Fragmente davon) können zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich als wirksam erwiesen mit herkömmlichen Immunglobulinen, und auf dem Fachgebiet bekannte Lyophilisations- und Rekonstitutionstechniken können eingesetzt werden.
In Abhängigkeit von dem beabsichtigten Ergebnis kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden Zusammensetzungen an einem Patienten verabreicht, der bereits an einer Krankheit leidet, in einer Menge, die ausreicht, um zu heilen oder mindestens teilweise die Krankheit und ihre Komplikationen zu stoppen. Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die vorliegenden Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der sich noch nicht in einem Zustand der Krankheit befindet, um die Widerstandskraft des Patienten zu stärken.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen können durchgeführt werden, wobei die Dosisniveaus und das Dosismuster durch den behandelnden Arzt gewählt werden. In jedem Fall sollte die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine Menge der erfindungsgemäßen geänderten Antikörper (oder Fragmente davon) bereitstellen, um wirksam den Patienten zu behandeln.
Es sollte auch festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Antikörper zur Konstruktion und Synthese entweder von Peptid- oder Nicht-Peptid-Verbindungen (Mimetika) verwendet werden können, die bei der gleichen Therapie wie der Antikörper geeignet wären. Siehe z. B. Saragovi et al., Science, 253, 792–795 (1991).
Um die Erfindung weiterhin zu erläutern, sind die folgenden Beispiele bereitgestellt. Diese Beispiele sollen nicht als weitere Einschränkung der Erfindung gedacht noch konstruiert sein.
Beispiel 1
Rekombinante Immunglobulin-Bibliotheken, die auf der Oberfläche von einem filamentösen Phagen präsentiert wurden, wurden zuerst von McCafferty et al., Nature, 348: 552–554, 1990 und Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7 978–7 982, 1991, beschrieben. Unter Verwendung dieser Technologie wurden hochaffine Antikörper aus immunen humanen rekombinanten Bibliotheken isoliert (Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 589: 10 164–10 168, 1992). Obwohl das verwendete Phage-Display-Konzept im Wesentlichen demjenigen entspricht, das von Barbas, 1991, Id., beschrieben wurde, wurde die Technik durch Ersatz eines einzigartigen Vektors für Affen-Bibliotheken modifiziert, um die Möglichkeit der Rekombination herabzusetzen und um die Stabilität zu verbessern. Dieser Vektor, pMS, 1, enthält einen einzelnen lac-Promotor/Operator zur wirksamen Transkription und Translation von polyzystronischer schwerer und leichter Ketten von Affen-DNA. Dieser Vektor enthält zwei verschiedene Leader-Sequenzen, die ompA (Movva et al., J. Biol. Chem., 255: 27–29, (1980)), für die leichte Kette, und die pel B (Lei, J. Bact., 4379-109: 4 383 (1987)) für die schwere Kette Fd. Beide Leader-Sequenzen werden zu hydrophoben Signalpeptiden translatiert, die die Sekretion der klonierten Produkte der schweren und leichten Ketten in den periplasmatischen Raum steuern. In der oxidativen Umgebung des Periplasmas falten sich die beiden Ketten, und Disulfidbindungen bilden sich, um stabile Fab-Fragmente zu erzeugen.
Wir haben das Grundgerüst des Vektors von dem Phagemid Bluescript abgeleitet (Stratagene, La Jolla, CA). Er enthält das Gen für das Enzym Beta-Lactamase, die Ampicillin(Carbenicillin)-Resistenz an Bakterien verleiht, die pMS-DNA beherbergen. Wir haben aus Bluescript auch den Replikationsursprung des Multicopy-Plasmids Co1E1 und den Replikationsursprung des filamentösen Bakteriophagen f1 abgeleitet. Der Replikationsursprung des Phagen f1 (die so genannte intragene Region) signalisiert die Initiation der Synthese von einzelsträngiger pMS DNA, die Initiation von Capsidbildung und die Termination der RNA-Synthese durch virale Enzyme. Die Replikation und der Zusammenbau von pMS DNA-Strängen zu Phageteilchen erfordert virale Proteine, die von einem Helferphagen bereitgestellt werden müssen. Wir haben den Helferphagen VCSM13 verwendet, der besonders hierfür geeignet ist, da er auch ein Gen enthält, das Kanamycin-Resistenz codiert. Bakterien, die mit VCSM13 infiziert sind, und pMS können durch Zugabe sowohl von Kanamycin als auch Carbenicillin zu dem Wachstumsmedium selektiert werden. Die Bakterien erzeugen schließlich filamentöse Phageteilchen, die entweder pMS- oder VCSM13-Genome enthalten. Das Packen des Helferphagen ist weniger wirksam als dasjenige von pMS, was zu einem Phagen-Populationsgemisch führt, das überwiegend rekombinante pMS-Phagen enthält. Die Enden des Phagen nehmen kleinere Hüllproteine, die für jedes Ende spezifisch sind, auf. Von besonderem Interesse ist hier das Gen III-Produkt, das in drei bis fünf Kopien an einem Ende des Phagen vorhanden ist. Das Gen-III-Produkt besitzt 406 Aminosäurereste und ist für Phageinfektion von E. coli über F pili erforderlich. Die ersten beiden Domänen der schweren Kette, die variable Domäne und die CH1-Domäne, werden mit der Carboxy-terminalen Hälfte des Gen-III-Proteins fusioniert. Dieses rekombinante pili-Protein, was durch den pel B Leader gesteuert wird, wird in das Peroplasma sezerniert, wo es sich akkumuliert und Disulfidbindungen mit der leichten Kette bildet, bevor es in die Hülle des Phagen eingebaut wird. Auch ein anderer Vektor enthält eine FLAG-Sequenz, die stromabwärts des Gens III gentechnisch erzeugt wurde. Die FLAG ist ein 8 Aminosäurepeptid, das an den Carboxy-Terminus des Fd-Proteins exprimiert wird. Wir verwenden im Handel erhältliches monoklonales Anti-FLAG M2 sowohl zur Reinigung als auch zum Nachweis von Phage-Fab durch ELISA (Brizzard, Bio Techniques, 16(4): 730–731, (1994)).
Nach Konstruktion des Vektors pMS testeten wir seine Fähigkeit zur Produktion von Phagegebundenem Fab unter Verwendung von Kontroll-Antikörpergenen. Wir klonierten einen Antitetanus-Toxoid-Antikörper (erhalten von Dr. Carlos Barbas) in pMS und transformierten XLI-blue. Unsere Zellen co-infizierten wir mit VCSM13 und erzeugten einen Phagen, der den Antitetanus-Toxoid-Antikörper zeigte. Wir führten Effizienz-Experimente durch, wobei Anti-Tetanus-Toxoid-Phagen mit Phagen kombiniert wurden, die einen irrelevanten Antikörper bei 1:100 000 banden. Wir führten drei Runden Panning durch Aufbringen von 50 μl des Phage-Gemischs auf Antigen (Tetanus-Toxoid)-beschichtete Polystyrol-Vertiefungen durch. Nichtadhärente Phagen wurden abgewaschen, und adhärente Phagen wurden mit Säure eluiert. Die eluierten Phagen wurden zur Infektion eines frischen Aliquots XL1-Blue-Bakterien verwendet, und Helferphage wurde zugesetzt. Nach Übernacht-Amplifikation wurden die Phagen präpariert und wiederum Panning auf Antigen-beschichteten Platten durchgeführt. Nach drei Runden Panning waren wir in der Lage zu zeigen, dass wir erfolgreich den Anti-Tetanus-Toxoidphagen angereichert hatten. Der Erfolg dieser Technik hängt auch von der Fähigkeit zur Herstellung von löslichem Fabs zur Charakterisierung des finalen durch Panning erhaltenen Produkts ab. Dies wurde durch Ausschneiden von Gen III aus der pMS DNA unter Verwendung des Restriktionsenzyms Nhe I und durch anschließende Relegation erzielt. Nach dem Ausschneiden des Gens III wurde der Fab nicht mehr auf der Phagenoberfläche gezeigt, sondern sammelte sich im pyroplasmatischen Raum an. Lysate wurden aus Bakterien hergestellt, die lösliches Fab exprimieren, und auf Antigen-Spezifität unter Verwendung eines ELISA's getestet. Hohe Konzentrationen an löslichem Fab wurden nachgewiesen.
Um die Phage-Display-Technologie zur Verwendung mit Makaken-Bibliotheken zu übernehmen, entwickelten wir spezifische Primer für PCR-amplifizierende Affen-Immunglobulin-Gene. Diese beruhten auf Makaken-Sequenzen, die wir während der Entwicklung der PRIMATIZED^TM-Antikörper-Technologie erhielten (siehe 08/379 072) und auf Datenbanken, die humane Sequenzen enthalten (Kabat et al., (1991), "Sequences of Protein of Immunological Interest", U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health).
Wir entwickelten drei Serien von Primern, um die Amplifikation des Makaken-Repertoires abzudecken. Unsere erste Serie von Primern war zur Amplifikation der VH- und CH1(Fd)-Domänen der schweren Kette ausgelegt. Sie bestand aus einem 3'-CH1-Domänenprimer und sechs 5'-VH-Familien-spezifischen Primern, die in der Rasterwerk-1-Region binden. Unsere zweite Serie von Primern zur Amplifikation der gesamten Lambda-Kette deckt die vielen Lambda-Kette-Untergruppen ab. Sie bestand aus einem 3'-Primer und drei 5'-degenerierten Primern, die in der VL-Rahmenwerk-1-Region binden. Unsere dritte Serie von Primern war zur Amplifikation der Kappa-Kette-Untergruppen ausgelegt. Sie besteht aus einem 3'-Primer und fünf VK-Rahmenwerk-1-Primern. Unter Verwendung von jeder dieser Serien wurden die PCR-Parameter zum Erhalt von ausreichend starken Signalen von jedem Primerpaar optimiert, sodass reichlich Material zum Klonieren der Bibliothek zur Verfügung stand. Neuerdings erzeugten wir Makaken-Kombinations-Bibliotheken in unserem pMS-Vektor unter Verwendung dieser optimierten PCR-Bedingungen. Knochenmarkbiopsien wurden als Quelle von Immunglobulin-RNA aus CD4-immunen Affen genommen. Die Bibliotheken enthielten ungefähr 10⁶ Mitglieder und werden derzeit durch Panning auf spezifische Binder auf Antigen beschichteten Vertiefungen untersucht.
Beispiel 2
Entwicklung von B7/CTLA-4-Reagenzien
Wir haben eine Anzahl von Reagenzien für den Zweck der Immunisierung von Affen, zur Entwicklung von Bindungs- und funktionellen Assays in vitro, zum Screening von Heterohybridomen und zum Panning von Phage-Bibliotheken erzeugt. Tabelle 1 führt jedes Reagens und seinen beabsichtigten Zweck auf. Im Falle von B7.1 wurde RNA aus SB-Zellen extrahiert und in cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase übergeführt. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung von B7.1-spezifischen Primern amplifiziert und in IDEC's NEOSPLA-Säuger-Expressionsvektoren kloniert. CHO-Zellen wurden mit B7.1-NEOSPLA DNA transfiziert, und Klone, die Membran assoziiertes B7.1 exprimierten, wurden identifiziert.

Das B7.1-Fusionsprotein wurde ebenso erzeugt, außer dass, das PCR-amplifizierte B7.1-Gen in einen NEOSPLA-Kassettenvektor kloniert wurde, der die humanen CH2- und CH3-Immunglobulingene enthielt. CHO-Zellen wurden mit der B7.1/Ig-NEOSPLA-DNA transformiert, und stabile Klone, die B7.1/Ig-Fusionsprotein sezernieren, wurden amplifiziert. Im Allgemeinen wurden die B7.2- und CTLA4-Reagenzien auf die gleiche Weise erzeugt, außer dass für B7.2 die RNA aus humanen Milzzellen isoliert wurde, die 24 Stunden mit Anti-Ig und IL-4 stimuliert wurden, und für die CTLA4-Konstrukte die Genquelle PHA-aktivierte humane T-Zellen waren. Tabelle 1

Reagens	Zweck	CHO-Expression
Lösliches B7.1	Immunisierung, Immunassay	Ja
B7.1-Transfektante	Screening, ELISA	Ja
B7.1/Ig-Fusionsprotein	Inhibitionsstudien, Panning	Ja
B7.2-Transfektante	Schreening, ELISA	Ja
B7.2/Ig-Fusionsprotein	Inhibitionsstudien, Panning	zu ergänzen
CTLA4-Transfektante	Inhibitionsstudien	zu ergänzen
CTLA4/Ig	Inhibitionsstudien	zu ergänzen

Die Verfügbarkeit dieser Reagenzien, zusammen mit monoklonalen Antikörpern auf B7.1 (L3074) (Becton Dickinson, 1994) und B7.2 (Fun-1 (Engel et al., Blood, 84, 1 402–1 407, (1994) und gereinigte Ziegen- und Kaninchen-Antiseren, die spezifisch zum Nachweis von Affen-Fab-Fragmenten entwickelt wurden, erleichtert die Identifizierung von Antikörpern mit den gewünschten Eigenschaften.
Beispiel 3
Untersuchung der Immunantwort in Cynomolgus-Affen auf lösliches und zellassoziiertes humanes B7.1
Zur Bewertung der Machbarkeit der Produktion von Affen-Antikörpern gegen humanes B7.1-Antigen, reinigten wir zuerst rekombinantes SB7.1 aus CHO-Zellmedien durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer L307.4-Sepharose-Affinitätssäule. SB7.1 wurde anschließend mit Adjuvans in fünf reife Cynomolgus-Makaken injiziert. Nach einem Zeitraum von 3 bis 4 Monaten von Boosterimmunisierungen wurden Seren aus den mit SB7.1 oder humanen SB-Zellen immunisierten Affen auf Antigen-Bindung getestet.
Serumproben aus den fünf mit SB7.1 immunisierten Affen und drei zusätzlichen mit B7.1-positiven humanen SB-Zellen immunisierten Tieren wurden auf Antikörpertiter gegen Membran-assoziiertes B7.1, das in transfizierten CHO-Zellen exprimiert ist, getestet. Die in 3 zusammengefassten Ergebnisse zeigten, dass vier von fünf Affen, die mit Affinitätsgereinigtem SB7.1 immunisiert waren, Antikörpertiter über 1:5 000 produzierten. Die drei Tiere, die mit SB-Zellen immunisiert wurden, die Zell-assoziiertes B7.1 enthielten, exprimierten niedrigere Titer an Antikörpern im Bereich von 1:1 400 bis 1:2 800.
Beispiel 4
Wir reinigten Antikörper aus Seren von sämtlichen acht immunisierten Affen unter Verwendung von SB7.1-Sepharose und dann testeten wir ihre Fähigkeit zur Bindung an 1) SB7.1-beschichtete Platten in ELISA; 2) Antigen-positive B-Zellen und 3) B7.1-CHO-Transfektome. Zusätzlich wurden sie auf ihre Fähigkeit zur Blockierung von B-Zell-Wechselwirkungen bewertet, wie durch IL-2-Produktion und tritiierte Thymidinaufnahme in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) gemessen. Für die T-Zell-Bindungsexperimente wurden humane periphere Buffy-coat-Blutlymphozyten 3–6 Tage in Gegenwart von PHA-Stimulator kultiviert. Die B7-Bindung wurde durch Radioassay unter Verwendung von ¹²⁵I-radiomarkiertem löslichem B7.1 (SB7.1) nachgewiesen.
Beispiel 5
Direkte Bindung von Affen-Antikörpern an radiomarkiertes SB7

¹²⁵I-radiomarkiertes SB7.1 wurde auf die Bindung an Anti-B7.1-Antikörpern in 4, 1 und 0,25 μg/ml in Lösung getestet. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der Antikörper, die von mit SB7.1 immunisierten Affen produziert wurden, in der Lage waren, dass affinitätsgereinigte ¹²⁵I-SB7.1 in konzentrationsabhängiger Weise zu binden. Zu Bewertung der Bindungsspezifität an markiertes SB7.1 wurden unmarkierte SB7.1-Konkurrenzexperimente mit Antikörpern aus zwei Tieren durchgeführt. Affinitätsgereinigte Antikörper aus den Affen 1133 und 1144 wurden auf Mikrowellplatten mit 400 ng/Vertiefung geschichtet. Affinitätsgereinigtes unmarkiertes SB7.1 (500 und 100 ng/Vertiefung) wurde als Kompetitor verwendet. Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass SB7.1-Präparationen bei der Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-SB7.1 an die Antikörper wirksam sind. Tabelle 2 Bindung von SB7-I¹²⁵ an Affen-Antikörpern, affinitätsgereinigt über eine SB7-Sepharose- Affinitätssäule

Antikörper (μg/ml)	Affe Nummer
Antikörper (μg/ml)	769	908	1133	1135	1137	1139	1144	1146
4	175	213	9 056	12 771	4 318	226	5 781	108
1	106	142	6 569	7 940	3 401	110	3 901	80
0,25	95	104	1 803	2 673	1 219	100	1 186	94

Die Messwerte sind Mittelwerte aus zwei Assays und stellen cpm von gebundenem SB7-I¹²⁵ dar.
Beispiel 6
Direkte Bindung von radiomarkierten affinitätsgereinigten Affen-Antikörpern an B7⁺-Zellen und Hemmung durch SB7.1
Affinitätsgereinigte radiomarkierte Affen-Anti-B7.1-Antikörper aus Affen-PRI135 wurden mit radioaktiv markiertem L307.4 MAb auf die direkte Bindung an B7-positive humane SB-Zellen verglichen. Als eine Spezifitätskontrolle wurde unmarkiertes SB7.1 (0,002–20 μg/ml) zugesetzt, um so mit beiden radiomarkierten Antikörpern zu konkurrieren. Wir zeigten, dass Affenantikörper zellassoziiertes B7.1 binden können und mit SB7.1 gehemmt werden, wie in 5 gezeigt. Die Hemmung von so hoch wie 90% wurde mit SB7.1 festgestellt.
Beispiel 7
Direkte Bindung von radiomarkierten B7-Ig-Fusionsprotein an aktivierte T-Zellen und Hemmung durch affinitätsgereinigte Affen-Antikörper
Humane periphere Blut-T-Lymphozyten wurden 3–6 Tage aktiviert und auf die direkte Bindung von ¹²⁵I-B7.1-Ig getestet. Aufgrund der Fc-Rezeptoraufregulierung auf aktivierten humanen T-Zellen war es nötig, die Zellen mit wärmeaggregiertem Präimmun-Immunglobulin zu inkubieren, um Fc-Bindungsstellen vor Zugabe von B7.1-Ig zu den Zellen zu blockieren. Eine Hintergrundkontrolle unter Verwendung von SP2/0-murinen Myelomzellen wurde eingeschlossen, um die Korrektur der Hintergrundbindung zu ermöglichen. 6 zeigt, dass die Hemmung der ¹²⁵I-B7.1-Ig-Fusionsprotein-Bindung an aktivierte T-Zellen mit affinitätsgereinigten Affen-Antikörpern bei Konzentrationen von 200 bis 8 μg/ml erreicht wurde. Unmarkiertes SB7.1 und L307.4 MAb, die als Kontrolle verwendet wurden, waren ebenfalls bei der Hemmung der B7.1-Ig-Fusionsprotein-Zellbindung wirksam.
Beispiel 8
Hemmung der IL-2-Produktion in gemischten Lymphozytenreaktionen durch Affen-Anti-B7-Antikörper
Das Blockieren der CD28/B7-Wechselwirkung führt zur Hemmung der IL-2-Produktion durch T-Lymphozyten. In dem in 7 gezeigten Experiment wurden affinitätsgereinigte Affen-Antikörper aus zwei mit SB7.1 immunisierten Affen (Affen 1137 und 1135) und einem mit B7-positiven SB-Zellen immunisierten Affen (Affe 1146) auf ihre Fähigkeit zur Hem mung der humanen T-Zellen-Aktivierung in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) bewertet, wie durch Hemmung der IL-2-Produktion gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass affinitätsgereinigte Anti-B7.1-Antikörper aus den Affen 1146 und 1137 die IL-2-Produktion hemmten bei Zugabe in Konzentrationen von 50 μg/ml. Affen-1135-Antikörper konnten bei den beiden höchsten Konzentrationen aufgrund von Materialmangel nicht bewertet werden, jedoch gab es bei niedrigeren Konzentrationen eine signifikante Hemmung. Das murine MAb L307.4 war bei Konzentrationen von 10 μg/ml inhibitorisch. Weitere Affenseren, die bei diesen Konzentrationen getestet wurden, waren negativ (Messwerte nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass mindestens drei der Affen, die sowohl mit löslichen als auch membranassoziierten Formen des B7-Antigens immunisiert wurden, B7 blockierende Antikörper mit immunsuppressivem Potenzial produzieren.
Beispiel 9
Untersuchung der Kreuzreaktivität in B7.1-immunisiertem Affenserum auf B7.2-Antigen
Antikörper, die gegen B7.1 gezüchtet wurden, sollen auf die Kreuzreaktivität gegenüber B7.2 getestet werden. Vorläufige Ergebnisse unter Verwendung von B7.1-affinitätsgereinigten Antikörpern aus B7.1-Immunseren lieferten einen naheliegenden Beweis der Bindung an B7.2-transfizierte CHO-Zellen (nicht gezeigt). Diese Messwerte sollten unter Verwendung von löslichen B7.2-Ig-Reagenzien bestätigt werden. Zuerst reinigen wir zusätzliche Affenantikörper aus B7.1 immunisierten Tieren durch Affinitätschromatographie über B7.1-Ig-Sepharose. Anschließend produzieren und reinigen wir B7.2Ig aus CHO-Zellen in ausreichenden Mengen auf, um eine B7.2Ig-Sepharose-Affinitätssäule herzustellen. Wir wählen aus der B7.1-spezifischen Antikörperpopulation diejenigen Antikörper aus, die mit B7.2 kreuzreagieren, durch Bindung an die B7.2Ig-Sepharosesäule. Alle kreuzreaktiven Antikörper, die identifiziert wurden, werden durch direkte Bindung sowohl an B7.1- als auch B7.2-transfizierte CHO-Zellen und durch Bindungshemmung an B7.2-transfizierte Zellen durch B7.1Ig charakterisiert.
Beispiel 10
Erzeugung einer Phage-Display-Bibliothek
Rekombinante Phage-Display-Bibliotheken werden aus B7.1- und B7.2-immunen Affen erzeugt. Lymphknoten- und Knochenmarksbiopsien werden 7–12 Tage nach Immunisierung durchgeführt, um RNA-reiche B-Zellen und Plasmazellen zu ernten. RNA wird aus den Lymphozyten unter Verwendung des bei Chomczynski Anal. Biochem., 162(1), 156–159, (1987) beschriebenen Verfahrens isoliert. RNA wird in cDNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und von reverser Transkriptase umgewandelt. Der erste cDNA-Strang wird in Aliquote aufgeteilt und unter Verwendung einer Serie von Primern von Kappa-, Lambda- und der schweren Ketten-Fd-Region, die früher beschrieben wurden, und entweder Pfu-Polymerase (Stragene, San Diego) oder Taq-Polymerase (Promega, Madison) amplifiziert. Die amplifizierten PCR-Produkte der schweren Kette werden vereinigt, mit Xho VSpe I-Restriktionsenzymen geschnitten und in den Vektor pMS kloniert. Anschließend werden die PCR-Produkte der leichten Kette vereinigt, mit Sac I/Xba I-Restriktionsenzymen geschnitten und zur Erzeugung der rekombinanten Bibliothek kloniert. XLI-Blue E. coli wird mit der DNA-Bibliothek transformiert und mit VCSM13 superinfiziert, um die Phage-Display-Antikörper zu produzieren. Die Bibliothek wird vier Runden Panning auf Polystyrolvertiefungen, beschichtet mit B7.1- oder B7.2-Antigen, unterzogen. Einzelne Phagenklone aus jeder Runde des Pannings werden analysiert. Die pMS-Vektor-DNA wird isoliert, und das Gen III ausgeschnitten. Lösliche Fab-Fragmente werden erzeugt und im ELISA auf die Bindung an B7.1 und B7.2 getestet.
Beispiel 11
Charakterisierung von Phage-Fab-Fragmenten
Die Affen-Phage-Fab-Fragmente werden auf ihre Spezifität und die Fähigkeit zur Blockierung der B7.1-Ig- und B7.2-Ig-Bindung an CTLA-4-IG- oder CTLA-4-transfizierte Zellen charakterisiert. Phage-Fragmente werden ebenfalls auf Kreuzreaktivität nach dem ersten Panning für 4 Runden auf den B7-Species, die zur Immunisierung eingesetzt werden, um hochaffine Fragmente zu selektieren, charakterisiert. Fab-Fragmente, die aus vier Runden Panning entweder auf B7.1- oder B7.2-Antigen-beschichteten Oberflächen identifiziert wurden, werden durch Infektion vermehrt und in 24 Stunden Fermentationskulturen von E. coli gezüchtet. Die Fragmente werden durch Kodak FLAG-Bindung an eine Anti-FLAG-Affinitätssäule gereinigt. Gereinigte Phage-Fabs werden auf Affinität durch eine ELISA-basierte Direktbindungs-modifizierte Scatchard-Analyse (Katoh et al., J. Chem. BioEng., 76: 451–454, (1993) unter Verwendung von Ziegen-Anti-Affen-Fab-Antikörpern oder Anti-FLAG MAb, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, getestet. Die Anti-Affen-Fab-Reagenzien werden gegen die konstante Ig-Region von humaner schwerer Kette absorbiert, um jede Kreuzreaktivität gegen über B7-Ig zu entfernen. Die Kd-Werte werden für jedes Fragment nach Messungen der direkten Bindung an B7.1-Ig- oder B7.2-Ig-beschichteten Platten berechnet.
Beispiel 12
Phage-Fab-Fragment-Blockierung der CTLA-4/B7-Bindung
Fab-Fragmente, die besonders wirksam die Bindung von B7-Ig bei den niedrigsten Konzentrationen blockieren, werden als Leitkandidaten ausgewählt. Die Selektionen werden durch die Konkurrenz (of und nicht off?) der ¹²⁵I-B7-Ig-Bindung an CTLA-4-Ig- oder an CTLA-4-transfizierte Zellen vorgenommen. Zusätzliche Selektionskriterien umfassen das Blockieren von gemischter Lymphozytenreaktion (MLR), wie durch Hemmung der 3H-Thymidin-Aufnahme in Responderzellen gemessen (Azuma et al., J. Exp. Med., 177: 845–850; Azuma et al., Nature, 301: 76–79, (1993)) und die direkte Analyse der IL-2-Produktion unter Verwendung von IL-2-Assay-Testsätzen. Die drei oder vier Kandidaten, die bei der Hemmung von MLR- und CTLA-4-Bindungstests besonders wirksam sind, werden zum Klonieren in den oben beschriebenen Säugerexpressionsvektor zur Transfektion in CHO-Zellen und Expression von chimären Affen/Human-Antikörpern gewählt.
Beispiel 13
Erzeugung von Affen-Heterohybridomen
Affen-Heterohybridome, die monoklonale Antikörper sezernieren, werden aus existierenden immunisierten Tieren erzeugt, deren Seren auf B7.1 und/oder B7.2 positiv getestet wurden. Lymphknotenbiopsien werden den Tieren, die auf eines oder auf beide Antigene positiv sind, entnommen. Das Verfahren der Hybridomproduktion entspricht dem entwickelten Verfahren, das zur Erzeugung von Affen-Anti-CD4-Antikörpern eingesetzt wird (Newman, 1992 (Id.)). Affen mit hohen Serumtitern besitzen Sektionen von inguinalen Lymphknoten, die unter Anästhesie entfernt werden. Die Lymphozyten werden aus dem Gewebe herausgewaschen und mit KH6/B5-Heteromyeolomzellen fusioniert (Carrol et al., J. Immunol. Meth., 89: 61–72, (1986)) unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG). Hybridome werden auf H.A.T.-Medien selektiert und durch wiederholtes Subklonieren in 96 Wellplatten stabilisiert.
Monoklonale Affen-Antikörper, die auf B7.1-Antigen spezifisch sind, werden auf Kreuzreaktivität gegenüber B7.2 gescreent. Affen-Anti-B7-Antikörper werden auf Blockieren der B7/CTLA-4-Bindung unter Verwendung des ¹²⁵I-B7-Ig-Bindungstests charakterisiert. Die Hemmung von MLR durch 3H-Thymidinaufnahme und direkte Messung der IL-2-Produktion wird zur Selektion von drei Kandidaten eingesetzt. Zwei Kandidaten werden in die Phase-II-Studie weitergebracht und in CHO-Zellen exprimiert, während sämtliche funktionelle Studien wiederholt werden. Für die Zwecke der Entwicklung eines Tiermodels für die in vivo Pharmakologie werden Anti-B7-Antikörper auf Zellen von mehreren Tierspezies getestet. Die Entwicklung eines Tiermodels erlaubt die Durchführung vorklinischer Studien für die gewählte klinische Indikation.
Beispiel 14
Wie supra besprochen, wurden unter Verwendung der obigen Heterohybridomverfahren 4 Leitaffen-Anti-B7.1-Antikörper identifiziert: 16C10, 7B6, 7C10 und 20C9. Diese Antikörper wurden wie folgt charakterisiert:
Zum Zeigen der Fähigkeit der Affen-Antikörper, die physikalische Wechselwirkung zwischen CTLA4-Ig zu blockieren, wurden verschiedene Konzentrationen der Affen-Anti-B7.1-Antikörper und von urmarkiertem CTLA4-Ig mit radioaktiv markiertem CTLA4-1G¹¹²⁵ inkubiert. Die Ergebnisse des Inhibitionsassays zeigten, dass die IC50 (die Konzentration an Inhibitor, die zu 50% Hemmung führt) für die Affen-Antikörper sind:

a: 7C10: 0,39 μg/ml

b: 16C10: 1,60 μg/ml

c: 20C9: 3,90 μg/ml

d: 7B6: 39,0 μg/ml
Die Scatchard-Analyse zeigte, dass die scheinbaren Affinitätskonstanten (Kd) für die Affen-Antikörper-Bindung an B7-Ig-beschichtete Platten ungefähr Folgende waren:

a: 7C10: 6,2 × 10^–9 M

b: 16C10: 8,1 × 10^–9 M

c: 7B6: 10,7 × 10^–9 M

d: 20C9: 16,8 × 10^–9 M
Die Antikörper wurden in vitro in einem gemischten Lymphozytenreaktionsassay (MLR) getestet. Der MLR zeigte, dass alle 4 Anti-B7.1-Antikörper die IL-2-Produktion in verschiedenen Ausmaßen hemmten:

a: 7B6: 5,0 μg/ml

b: 16C10: 0,1 μg/ml

c: 20C9: 2,0 μg/ml

d: 7C10: 5,0 μg/ml
Die Affen-Anti-B7.1-Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung von B7 auf humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) getestet. Die FACS-Analyse zeigte, dass alle 4 Affen-Antikörper positiv getestet wurden.
Die Affen-Antikörper 16C10, 7B6, 7C10 und 20C9 wurden auf C1q-Bindung durch FACS-Analyse getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass 7C10-Affen-Ig eine starke humane C1q-Bindung nach Inkubation mit B7.1-CHO-transfizizierten Zellen aufwies. 16C10 war negativ, ebenso wie die 20C9- und 7B6-Affen-Antikörper.
Beispiel 15
Unter Verwendung der primatisierten Antikörpermethode, die in der US-Serien-Nr. 08/379 072 beschrieben ist, und unter Verwendung des in 2 gezeigten NEOSPLA-Vektorsystems, wurden die variablen schweren und leichten Domänen von 7C10, 7B6 und 16C10 kloniert und die primatisierten Formen davon wurden in CHO-Zellen unter Verwendung des NEOSPLA-Vektorsystems synthetisiert. Die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen für die primatisierte 7C10-leichte und schwere Kette, die 7B6-leichte und schwere Kette und die 16C10-leichte und schwere Kette sind repräsentativ in den 8a, 8b, 9a, 9b, 10a und 10b gezeigt.
Es wird erwartet, dass diese primatisierten Antikörper, angesichts ihrer wahrscheinlichen niedrigen Antigenizität und der humanen Effektorfunktion als Therapeutika gut geeignet sind. In der Tat wurde unlängst gezeigt, dass primatisierter 16C10 humane C1₉-Bindung zeigt, wohingegen 16C10 es nicht zeigt.
Die Fachleute erkennen, oder sind in der Lage, unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten viele Äquivalente der speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die hier beschrieben sind, sicherzustellen. Einige Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche mit umfasst sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Affenantikörper, primatisierte Form davon oder Fragment des monoklonalen Affenantikörpers oder der primatisierten Form davon, welche an humanes CD80-Antigen binden und leichte und schwere variable Kettenregion-Polypeptidsequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 1 beziehungsweise SEQ ID Nr. 2; (b) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7B6, dargelegt als SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise SEQ ID Nr. 4; und (c) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6.
Monoklonaler Affenantikörper, primatisierte Form davon oder Fragment des monoklonalen Affenantikörpers oder der primatisierten Form davon, welche an ein Epitop von humanem CD80-Antigen binden, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, umfassend leichte und schwere variable Kettenregion-Polypeptidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 1 beziehungsweise SEQ ID Nr. 2; (b) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7B6, dargelegt als SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise SEQ ID Nr. 4; und (c) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, welcher eine konstante leichte Kettenregion einer leichten humanen Antikörperkette und eine konstante schwere Kettenregion einer schweren humanen Antikörperkette umfasst.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 3, welcher eine konstante schwere Kettenregion, ausgewählt aus konstanter humaner Gamma 1-Region, konstanter humaner Gamma 4-Region und konstanter humaner Gamma 4 PE-Region, umfasst.
Monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welcher ein depletierender Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welcher ein nicht-depletierender Antikörper ist.
Antikörperfragment gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches ein (Fab')₂-, Fab- oder Fv-Fragment ist.
Isolierte Nukleinsäure, welche Nukleotidsequenzen umfasst, die die leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen eines Antikörpers oder Fragments davon gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodieren.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 8, welche Nukleotidsequenzen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: a) den Nukleotidsequenzen, dargelegt in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2; b) den Nukleotidsequenzen, dargelegt in SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4; und c) den Nukleotidsequenzen, dargelegt in SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6.
Kultivierte Zelle, welche einen Antikörper oder ein Fragment davon gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 herstellt.
Kultivierte Zelle nach Anspruch 10, welche ein CHO-Transfektant ist.
Kultivierte Zelle nach Anspruch 10, welche einen chimären Antikörper herstellt, der an humanes CD80-Antigen bindet und eine konstante leichte Kettenregion einer leichten humanen Antikörperkette und eine konstante schwere Kettenregion einer schweren humanen Antikörperkette umfasst und ferner variable Region-Polypeptidsequenzen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 1 beziehungsweise SEQ ID Nr. 2; (b) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 7B6, dargelegt als SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise SEQ ID Nr. 4; und (c) den leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, dargelegt als SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6.
Arzneimittel, welches einen Antikörper oder ein Fragment davon enthält, die an humanes CD80-Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 binden.
Arzneimittel nach Anspruch 13 zur Verwendung als ein Immunsuppressivum.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Antikörper oder ein Fragment davon, welche an humanes CD80-Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 binden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung oder Störung, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Autoimmunstörung, Transplantat-Wirt-Abstoßung, Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes, Infektionserkrankung, Entzündungserkrankung und B-Zellen-Lymphom besteht.
Verwendung nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Transplantat-Wirt-Abstoßung oder Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes, wobei das Transplantat oder transplantierte Organ oder Gewebe aus Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Haut und Korea ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Erkrankung oder Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus AIDS, Hashimoto-Thyroiditis, Myasthenia gravis, Uveitis, nephrotischem Syndrom, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis, Seborrhoe, ekzematöser Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, Alterspemphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, Quincke-Ödem, Vaskulitiden, Erythem, kutane Eosinophilie, Alopecia areata, reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Migräne, Ekzem, Rhinitis, anderen allergischen Zuständen, proliferativer Erkrankung, hyperproliferativer Erkrankung und Erkrankungen, welche mit Darmentzündung, einschließlich Zöliakie, Proktitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastozytose, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, in Zusammenhang stehen, besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die Autoimmunstörung aus idiopathischer thrombozytopenischer Purpura, Lupus erythematodes, systemischem Lupus erythematodes, Diabetes mellitus Typ 1, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Multipler Sklerose und aplastischer Anämie ausgewählt ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13, wobei das Arzneimittel einen Antikörper oder ein Fragment gemäß Anspruch 2 enthält und der Antikörper oder das Fragment an ein Epitop von humanem CD80-Antigen bindet, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, der die leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, wie in SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6 dargelegt, umfasst.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13, wobei das Arzneimittel einen Antikörper gemäß Anspruch 2 enthält und der Antikörper eine primatisierte Form eines monoklonalen Affenantikörpers ist, welche an ein Epitop von humanem CD80-Antigen bindet, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, der die leichten und schweren vari ablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, wie in SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6 dargelegt, umfasst.
Antikörper gemäß Anspruch 2, wobei der Antikörper eine primatisierte Form eines monoklonalen Affenantikörpers ist, welche an ein Epitop von humanem CD80-Antigen bindet, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, der die leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, wie in SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6 dargelegt, umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Antikörper oder ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung eines B-Zellen-Lymphoms.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung mindestens einen Antikörper oder ein Fragment gemäß Anspruch 2 umfasst und der Antikörper oder das Fragment an ein Epitop von humanem CD80-Antigen bindet, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, der die leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, wie in SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6 dargelegt, umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung einen Antikörper gemäß Anspruch 2 umfasst und der Antikörper eine primatisierte Form eines monoklonalen Affenantikörpers ist, welche an ein Epitop von humanem CD80-Antigen bindet, welches auch gebunden wird durch einen Antikörper, der die leichten und schweren variablen Kettenregion-Polypeptidsequenzen des Antikörpers 16C10, wie in SEQ ID Nr. 5 beziehungsweise SEQ ID Nr. 6 dargelegt, umfasst.