DE69620903T2

DE69620903T2 - Nachweiss von nukleinsäuren durch bildung von template abhängigen produkt

Info

Publication number: DE69620903T2
Application number: DE69620903T
Authority: DE
Inventors: J. Rose; F. Ullman; Marie Western
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: JPH11510369A; EP0857218A1; US5882867A; ES2175097T3; CA2223774A1; EP0857218B1; WO1996040999A1; DE69620903D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Zur Untersuchung der Identität und zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren wurde die Nukleinsäurehybridisierung eingesetzt. Die Hybridisierung beruht auf komplementärer Basenpaarung. Werden komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren zusammen inkubiert, paaren sich die komplementären Basensequenzen zur Ausbildung von doppelsträngigen Hybridmolekülen. Die Fähigkeit einzelsträngiger Deoxyribonukleinsäure (ssDNS) oder Ribonukleinsäure (RNS), eine wasserstoffverbrückte Struktur mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz zu bilden, wurde als analytisches Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung eingesetzt. Die Verfügbarkeit radioaktiver Nucleosidtriphosphate mit hoher spezifischer Aktivität und die ³²P-Markierung von DNS mit T4- Polynucleotidkinase ermöglichten die Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung verschiedener biologisch interessanter Nukleinsäuresequenzen. Die Nukleinsäurehybridisierung besitzt großes Potential bei der Diagnose von mit einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen assoziierten Krankheitszuständen. Diese einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen können das Ergebnis einer genetischen Veränderung oder einer Umgebungsveränderung in der DNS durch Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder durch Aufnahme von Fremd-DNS oder -RNS mittels Infektion mit Bakterien, Schimmelpilzen, Pilzen und Viren sein. Bis jetzt wurde die Nukleinsäurehybridisierung vorwiegend in akademischen und industriellen molekularbiologischen Labors eingesetzt. Aufgrund der häufig sehr niedrigen Konzentrationen von mit einer Krankheit zusammenhängender, in der Körperflüssigkeit eines Patienten vorkommender DNS oder RNS und der Nichtverfügbarkeit eines ausreichend empfindlichen Verfahrens zur Nukleinsäurehybridisierungsanalyse ist die Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung als Diagnosewerkzeug in der klinischen Medizin eingeschränkt.
Bei den derzeitigen Verfahren zur Bestimmung spezifischer Nukleinsäuresequenzen wird die Zielnukleinsäure im allgemeinen auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran immobilisiert. Nach dem Fixieren der Zielnukleinsäure auf dem Träger wird dieser mit einer in geeigneter Weise markierten Nukleinsäuresonde etwa zwei bis achtundvierzig Stunden in Kontakt gebracht. Nach Ablauf der obigen Zeitdauer wird der feste Träger mehrmals unter Temperaturkontrolle zur Entfernung von nicht hybridisiertem Sondenmaterial gewaschen. Der Träger wird danach getrocknet und das hybridisierte Material über Autoradiographie oder spektrometrische Verfahren bestimmt.
Die derzeitigen Verfahren sind, falls sehr niedrige Konzentrationen bestimmt werden müssen, langsam und arbeitsaufwendig, und nichtisotopische Markierungen (Labels), die sich gegenüber radioaktiven Markierungen (Labels) weniger leicht nachweisen lassen, sind häufig nicht geeignet. Daher ist ein Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit wünschenswert, um die Verwendung einfacher, schneller, nichtisotopischer, homogener oder heterogener Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen zu ermöglichen.
Kürzlich wurde ein als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekanntes Verfahren zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNS-Abschnitte beschrieben. Dieser invitro-Amplifikationsprozeß beruht auf wiederholten Zyklen von Denaturierung, Oligonucleotidprimer- Annealing und Primerverlängerung mittels einer thermophilen Polymerase, was zu einem exponentiellen Anstieg von Kopien des von den Primern begrenzten Bereichs führt. Die an entgegengesetzte Stränge der DNS annealenden PCR-Primer werden so positioniert, daß das Produkt der von der Polymerase katalysierten Verlängerung des einen Primers als Vorlagenstrang für das zweite Produkt dienen kann, wodurch sich ein diskretes Fragment anreichert, dessen Länge durch den Abstand zwischen den 5'-Enden der Oligonucleotidprimer definiert ist.
Weitere Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation sind die Einzelprimeramplifikation, Ligasekettenreaktion (LCR), die Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA) und das Q-Beta-Replikaseverfahren. Unabhängig von der verwendeten Amplifikation muß jedoch das amplifizierte Produkt bestimmt werden.
Je nachdem, welches der obigen Amplifikationsverfahren eingesetzt wird, werden in den Verfahren im allgemeinen 7 bis 12 oder mehr Reagenzien eingesetzt. Weiterhin sehen die obigen Verfahren die exponentielle Amplifikation eines Ziel- oder Reporteroligonucleotids vor. Dementsprechend ist es notwendig, die Verunreinigung der Testlösungen mit den amplifizierten Produkten mit allen Mitteln zu vermeiden, um falschpositive Ergebnisse zu vermeiden. Für einige der obigen Verfahren benötigt man teure Thermocycler- Instrumentierung, und zusätzliche Reagenzien und Schritte für die Handhabung der Proben werden zur Bestimmung des amplifizierten Produkts benötigt.
Bei den meisten Testverfahren, die keine exponentielle Amplifikation einer Ziel-DNS beinhalten, wird das Verunreinigungsproblem vermieden, aber diese Verfahren sind weder hinreichend empfindlich noch einfach. Bei einigen Verfahren kommt eine gewisse Art von Größentrennung, wie z. B. die Elektrophorese, zum Einsatz, was diese Verfahren weiter verkompliziert.
Bei einem Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren werden Nukleinsäuresonden eingesetzt. Ein Verfahren zur Benutzung solcher Sonden ist im U.S.-Patent Nr. 4,868,104 beschrieben. Eine Nukleinsäuresonde kann oder kann potentiell mit einer Reportergruppe markiert oder kann oder kann potentiell an einen Träger gebunden werden.
Die Signalbestimmung hängt von der Beschaffenheit der Markierung (Label) oder der Reportergruppe ab. Handelt es sich bei der Markierung (Label) oder der Reportergruppe um ein Enzym, so gehören Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System. Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff, der jeweils spektrophotometrisch bestimmt werden kann, oder um ein Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen Mitteln bestimmt werden kann. Ist die Markierung ein Fluoreszenzmolekül, läßt sich das Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls die Markierung (Label) eine radioaktive Gruppe ist, kann man die Radioaktivität im Medium durch Zählen bestimmen.
Es ist daher wünschenswert, über ein empfindliches, einfaches Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren zu verfügen. Durch das Verfahren sollten die Anzahl und Komplexität der Schritte und Reagenzien auf ein Minimum reduziert werden. Die Notwendigkeit einer Sterilisation und anderer zur Verhinderung einer Verunreinigung der Testmischungen benötigter Schritte sollte vermieden werden.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Expression auf hohem Niveau, Reinigung und enzymatische Charakterisierung einer vollständigen DNS- Polymerase von Thermus aquaticus sowie einer gekürzten Form mit fehlender 5 '- bis 3'-Exonukleaseaktivität wird von Lawyer, et al., in PCR Methods and Applications (1993) 2: 275-287 erörtert.
Ein Verfahren zum Amplifizieren, Bestimmen und/oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen ist aus den U.S.-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188 und 5,008,182 bekannt. Die Sequenzpolymerisation mittels Polymerasekettenreaktion wird von Saiki, et al., (1986), Science, 230: 1350-1354 beschrieben. Die primergerichtete enzymatische DNS-Amplifikation mit einer thermostabilen DNS-Polymerase wird von Saiki, et al., Science (1988) 239: 487 beschrieben.
In den U.S.-Patentanmeldungen mit den Serien-Nrn. 07/299,282 und 07/399,795, eingereicht am 19. Januar 1989 bzw. 29. August 1989 (die der EP-Patentschrift Nr. 379,369 entsprechen), wird die Nukleinsäureamplifikation mit einem einzigen Polynucleotidprimer beschrieben.
In WO 94/01447 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Identität einer Nucleotidbase an einer spezifischen Position in einer gewünschten Nukleinsäure beschrieben. Die Identität eines Nucleotids beruht darauf, ob ein Primer in Gegenwart eines spezifischen Substratnucleotids verlängert werden kann oder nicht.
In WO 94/03624 wird ein Verfahren zum Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, bei dem ein einziger Primer zum Einsatz kommt und die Amplifikation unter isothermen Bedingungen durchgeführt wird.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz. Dabei wird ein Oligonucleotid mit einer Zielpolynucleotidsequenz in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase unter isothermen Bedingungen, d. h. einer Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotids: Zielpolynucleotidkomplexes, reversibel hybridisiert. Die Zielpolynucleotidsequenz dient als Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern. Man erhält mindestens einen 100-fachen molaren Überschuß an verlängertem Oligonucleotid relativ zur Molarmasse an Zielpolynucleotidsequenz. Die Anwesenheit des verlängerten Oligonucleotids wird bestimmt und zeigt die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz an.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft wiederum ein Verfahren zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz. Es wird eine Kombination zur Verfügung gestellt, die ein Medium, welches vermutlich die Zielpolynucleotidsequenz enthält, einen in bezug auf die vermutliche Konzentration der Zielpolynucleotidsequenz molaren Überschuß eines Oligonucleotids, welches in der Lage ist, mit der Zielpolynucleotidsequenz zu hybridisieren, 1 bis 3 Nucleosidtriphosphate und eine Nucleotidpolymerase umfaßt. Die Zielpolynucleotidsequenz und das Oligonucleotid werden unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert, wobei das Oligonucleotid an seinem 3'-Ende verlängert ist, um eine Menge eines verlängerten Oligonucleotids herzustellen, die mindestens der 100-fachen Molarmasse an Zielpolynucleotidsequenz entspricht. Die Anwesenheit des verlängerten Oligonucleotids wird als ein Anzeichen für die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz bestimmt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines DNS- Analyten. Das Verfahren umfaßt das Zurverfügungstellen einer Kombination aus einem Medium, welches vermutlich den DNS-Analyten enthält, einem Oligonucleotid, welches in der Lage ist, mit dem DNS-Analyten zu hybridisieren, 1 bis 3 Nucleosidtriphosphaten und einer vorlageabhängigen DNS-Polymerase. Der DNS-Analyt und das Oligonucleotid werden unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert, und das Oligonucleotid wird an seinem 3'-Terminus verlängert, so daß mindestens ein in bezug auf den DNS-Analyten 100-facher Überschuß eines verlängerten Oligonucleotids hergestellt wird. Die Anwesenheit des verlängerten Oligonucleotids zeigt die Anwesenheit des DNS-Analyten an.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Zielpolynucleotidsequenz. Bei diesem Verfahren wird mindestens ein in bezug auf die Zielpolynucleotidsequenz 100-facher Überschuß eines verlängerten Oligonucleotids, welches mindestens zwei Markierungen (Labels) aufweist, in bezug auf die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz gebildet. Während der obigen Bildung wird ein Oligonucleotid unter isothermen Bedingungen mit der Zielpolynucleotidsequenz reversibel hybridisiert, wobei die Zielpolynucleotidsequenz als Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids an den 3'-Terminus des Oligonucleotids dient, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern. Eine der genannten Markierungen (Labels) ist Teil eines der Nucleotide und die andere Markierung (Label) ist Teil des Oligonucleotids. Beide Markierungen (Labels) werden in dem verlängerten Oligonucleotid als ein Anzeichen für die Anwesenheit des verlängerten Oligonucleotids, dessen Anwesenheit wiederum die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz anzeigt, bestimmt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung eines Oligonucleotids, welches mindestens zwei Markierungen (Labels) aufweist. Das Verfahren umfaßt das Zurverfügungstellen einer Kombination aus einer katalytischen Menge eines Zielpolynucleotids, einer Nucleotidpolymerase, einem erst-markierten Deoxynucleosidtriphosphat und einem zweitmarkierten Oligonucleotid, welches zu mindestens einem Teil des Zielpolynucleotids komplementär ist. Die Kombination wird unter isothermen Bedingungen so behandelt, daß das markierte Oligonucleotid reversibel zum Zielpolynucleotid hybridisiert, um ein Duplex zu bilden, und das markierte Deoxynucleosidtriphosphat mit dem markierten Oligonucleotid verbunden wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Bestimmung eines Polynucleotids. Der Kit umfaßt in abgepackter Kombination (a) 1 bis 3 Nucleosidtriphosphate, von welchen mindestens eines markiert ist, (b) ein markiertes Oligonucleotid, welches an seinem 3'-Ende zu dem Polynucleotid komplementär ist, (c) eine Nucleotidpolymerase und (d) Mittel zur Bestimmung der Nucleotidtriphosphatmarkierung, wenn die Markierung (Label) an das Oligonucleotid gebunden ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielpolynucleotidsequenz. In diesem Verfahren wird ein Oligonucleotid mit einer Zielpolynucleotidsequenz, in welcher eine Mutation vermutet wird, in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert. Die Zielpolynucleotidsequenz dient als eine Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern, wobei mindestens ein 100-facher molarer Überschuß des verlängerten Oligonucleotids relativ zur Molarmasse der Zielpolynucleotidsequenz erhalten wird. Eines der Nucleotide enthält eine Markierung (Label). Die Anwesenheit der Markierung (Label) im verlängerten Oligonucleotid wird bestimmt, wobei dessen Anwesenheit die Anwesenheit der Mutation in der Zielpolynucleotidsequenz anzeigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Bei den Fig. 1-8 handelt es sich um schematische Darstellungen unterschiedlicher Ausführungsformen im Sinne der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die lineare Amplifikation eines Oligonucleotids, das einem Teil eines auch als Zielpolynucleotidsequenz bezeichneten Polynucleotidanalyten entspricht, d. h. dazu komplementär ist. Somit sorgen die Verfahren der vorliegenden Erfindung für sehr hoch empfindliche Tests für Polynucleotidanalyten. Die Verfahren sind einfach durchzuführen, und ein Temperaturcycling ist nicht erforderlich. Folglich wird keine teure thermocyclische Instrumentation benötigt. Weiterhin werden nur wenige Reagenzien verwendet, so daß sich der Kosten- und Arbeitsaufwand für einen Test weiter verringert. Für die Bestimmung von amplifiziertem Produkt wird kein separater Schritt benötigt. Außerdem ist es nicht notwendig, die Verunreinigung von Testlösungen durch amplifizierte Produkte zur Vermeidung von falschpositiven Ergebnissen mit allen Mitteln zu vermeiden.
In ihrem weitesten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz vor. Ein Oligonucleotid wird mit einer Zielpolynucleotidsequenz in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert. Die Zielpolynucleotidsequenz dient als eine Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern. Ein mindestens 100-facher molarer Überschuß des verlängerten Oligonucleotids in bezug auf die Molarmasse der Zielpolynucleotidsequenz wird erhalten. Die Anwesenheit von verlängertem Oligonucleotid wird bestimmt und zeigt die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz an.
Bevor mit einer Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, sollen eine Reihe von Ausdrücken definiert werden.
Polynucleotidanalyt - eine zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, bei der es sich um ein polymeres Nucleotid handelt. Der Polynucleotidanalyt kann 106 oder mehr Nucleotide enthalten, stellt jedoch normalerweise ein kleineres Fragment dar, das etwa 10 bis 500 000 oder mehr Nucleotide, normalerweise etwa 20 bis 200 000 Nucleotide aufweist. Zu den Polynucleotidanalyten gehören Nukleinsäuren und deren Fragmente aus jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNS (dsDNS und ssDNS) und RNS, einschließlich t-RNS, m-RNS, r-RNS, mitochondriale DNS und RJNIS, Chloroplasten-DNS und -RNS, DNS-RNS-Hybride oder deren Mischungen, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Mensch, und deren Fragmente, und ähnliches. Der Polynucleotidanalyt kann lediglich einen kleineren Anteil einer komplexen Mischung wie z. B. einer biologischen Probe darstellen. Der Analyt kann aus verschiedenem biologischem Material mittels im Fachgebiet gut bekannter Verfahren erhalten werden. Einige Beispiele für ein solches biologisches Material sind zur Erläuterung, aber nicht einschränkend, in der folgenden Tabelle I offenbart.

Tabelle I

Zu den infragekommenden Mikroorganismen gehören:

Corynebacteria
Corynebacterium diphtheria
Pneumococci
Diplococcus pneumoniae
Strentococci
Streptococcus pyrogenes
Streptococcus salivarus
Staphylococci
Staphylococcus aureus
Staphylococcus albus
Neisseria
Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrhea
Enterobacteriaceae
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes Coliforme
Klebstella pneumoniae
Salmonella typhosa
Salmonella choleraesuis Salmonella sp.
Salmonella typhimurium
Shigella dysenteria
Shigella schmitzii
Shigella arabinotarda
Shigella sp.
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
Andere Darmbazillen
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis Proteus sp.
Proteus morgani
Pseudomonas aeruginosa
Alcaligenes faecalis
Vibrio cholerae
Hemonhilus-Bordetella-Gruppe Rhizopus oryzae
Hemophilus influenca, H. ducryi Rhizopus arrhizua
Phycomycetes
Hemophilus hemophilus Rhizopus nigricans
Hemophilus aegypticus Sporotrichum schenkii
Hemophilus parainfluenza Flonsecaea pedrosol
Bordetella pertussis Fonsecacea compact
Pasteurellae Fonsecacea dermatidis
Pasteurella pestis Cladosporium carrionii
Pasteurella tulareusis Phialophora verrucosa
Brucellae Aspergillus nidulans
Brucella melitensis Madurella mycetomi
Brucella abortus Madurella grisea
Brucella suis Allescheria boydii
Aerobe sporenbildende Bazillen Phialophora jeanselmei
Bacillus anthracis Microsporum gypseum
Bacillus subtilis Trichophyton mentagrophytes
Bacillus megaterium Keratinomyces ajelloi
Bacillus cereus Microsporum canis
Anaerobe sporenbildende Bazillen Trichophyton rubrum
Clostridium botulinum Microsporum adouini
Clostridium tetani Viren
Clostridium perfringens Adenoviren
novyi
Clostridium septicum Herpes simplex
Clostridium histolyticum Varicella (Windpocken)
Clostridium tertium Herpes Zoster (Gürtelrose)
Clostridium bifermentans Virus B
Clostridium sporogenes Cytomegalievirus
Mycobacteria Pockenviren
Mycobacterium tuberculosis hominis Variola (Pocken)
Mycobacterium bovis Vaccinia
Mycobacterium avium Poxvirus bovis
Mycobacterium leprae Paravaccinia
Mycobacterium paratuberculosis Molluscum contagiosum
Actinomvceten (pilzähnliche Bakterien) Picornaviren
Actinomyces Isaeli Poliovirus
Actinomyces bovis Coxsackievirus
Actinomyces naeslundii Echoviren
Nocardia asteroides Rhinoviren
Nocardia brasiliensis Myxoviren
Spirocheten-Spezies Influenza (A, B und C)
reponema pallidum Parainfluenza (1-4)
Spirillum minus
Treponema pertenue Mumpsvirus
Streptobacillus monoiliformis Newcastle Disease Virus
Treponema carateum Masernvirus
Borrelia recurrentis Rinderpestvirus
Leptospira icterohemorrhagiae Hundestaupevirus
Leptospira canicola Respiratory Syncytial Virus
Mycoplasmen Arboviren
Mycoplasma pneumoniae
Andere Krankheitserreger Östlicher equiner
Enzephalitisvirus
Listeria monocytogenes Westlicher equiner Enzephalitisvirus
Erysipelothrix rhusiopathiae Sindbis Virus
Streptobacillus Chikugunya Virus
moniliformis
Donvania granulomatis Semliki Forest Virus
Bartonella bacillisformis Mayora Virus
Rickettsiae (bakterienähnliche Parasiten) St. Louis Enzephalitis Virus
Rickettsia prowazekii California Enzephalitis Virus
Rickettsia mooseri Colorado Tick Fever Virus
Rickettsia rickettsii Gelbfiebervirus
Rickettsia conori Dengue-Virus
Rickettsia australis Reoviren
Rickettsia sibiricus Reovirus Typ 1-3 Retroviren
Rickettsia akari Menschliche Immunschwächeviren (HIV)
Rickettsia tsutsugamushi Menschlicher lymphotropher T-Zellenvirus I & II (HTLV)
Rickettsia burnetti Hepatitis
Rickettsia quintana Hepatitis A Virus Chlamydia (nicht klassifizierbare Parasiten, bakteriell/viral) Chlamydia-Agenzien) (Bezeichnung unsicher) Hepatitis B Virus
Hepatitis nonA-nonB Virus
Tumorviren
Pilze Rauscher Leukemia Virus
Cryptococcus neoformans Gross Virus
Blastomyces dermatidis Maloney Leukemia Virus
Hisoplasma capsulatum
Coccidioides immitis Menschlicher Papillomavirus
Paracoccidioides brasiliensis
Candida albicans Aspergillus fumigatus
Mucor corymbifer (Absidia corymbifera)
Ebenfalls eingeschlossen sind Gene wie z. B. Hämoglobingene für die Sichelzellanämie, das Gen für zystische Fibrose, Onkogene, cDNS und ähnliche.
Gegebenenfalls kann der Polynucleotidanalyt zur Spaltung des Analyten behandelt werden, um ein eine Zielpolynucleotidsequenz enthaltendes Fragment zu erhalten, zum Beispiel durch Scherung oder durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease oder einem anderen stellenspezifischen chemischen Spaltungsverfahren. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß der Polynucleotidanalyt in seinem isoliertem Zustand ohne weitere Spaltung verwendet werden kann.
Im Sinne dieser Erfindung wird der Polynucleotidanalyt oder ein aus dem Polynucleotidanalyten erhaltenes Spaltfragment normalerweise mindestens teilweise denaturiert oder liegt in einzelsträngiger Form vor oder wird so behandelt, daß er bzw. es in denaturierter oder einzelsträngiger Form vorliegt. Solche Behandlungen sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen beispielsweise Wärme- oder Alkalibehandlung ein. So läßt sich beispielsweise doppelsträngige DNS auf 90 bis 100ºC über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 10 Minuten zur Herstellung von denaturiertem Material erhitzen.
Ende eines Oligonucleotids - in der hier verwendeten Form bezieht sich diese Formulierung auf ein oder mehrere Nucleotide, einschließlich dem terminalen Nucleotid, jeweils an dem 3'- und 5'-gegenüberliegenden Stellen eines Oligonucleotids.
Terminus eines Oligonucleotids - in der hier verwendeten Form bezieht sich dieser Ausdruck jeweils auf das Terminalnucleotid am 3'- oder 5'-Ende eines Oligonucleotids.
Zielpolynucleotidsequenz - eine Sequenz zu identifizierender Nucleotide, bei der es sich um den Polynucleotidanalyten handeln kann, die jedoch normalerweise innerhalb eines Stranges eines Polynucleotidanalyten aus 10 bis 100 000 oder mehr Nucleotiden, normalerweise etwa 20 bis 50 000 Nucleotiden, häufiger 20 bis 20 000 Nucleotiden, vorkommt. Die Sequenz kann eine kontinuierliche Sequenz sein oder aus zwei diskontinuierlichen Sequenzen auf demselben Strang, die durch ein bis etwa 50 Nucleotide voneinander getrennt sind, bestehen. Die Zielpolynucleotidsequenz kann eine Mutation wie etwa eine Punkt- oder Einzelnucleotidmutation enthalten, deren Bestimmung erwünscht ist. Die Identität der Zielpolynucleotidsequenz ist in einem ausreichenden Maß bekannt, so daß die Herstellung eines zur Durchführung einer Amplifikation der Sequenz notwendigen Oligonucleotids ermöglicht wird, und ist normalerweise vollständig bekannt und etwa 10 bis 100 Nucleotide, vorzugsweise 15 bis 50 Nucleotide lang. Im allgemeinen wird im folgenden Verfahren der Terminus eines Oligonucleotids wie folgt "modifiziert": Das Oligonucleotid hybridisiert an die Zielpolynucleotidsequenz, und somit wirkt die Zielpolynucleotidsequenz als eine Vorlage zur Addition von Nucleotiden an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, wodurch sich ein "verlängertes Oligonucleotid" ergibt. Das Oligonucleotid hybridisiert zunächst mit der ganzen Zielpolynucleotidsequenz, außer etwa 1 bis 10 Zielnucleotiden, die 5' von der Hybridisierungsstelle liegen. Dieser zunächst unhybridisierte Teil der Zielpolynucleotidsequenz dient als die Vorlage zur Verlängerung des Oligonucleotids, und der Teil, an dem entlang das Oligonucleotid verlängert wird, ist normalerweise 1 bis 10 Nucleotide, häufig 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Nucleotide lang. Entsprechend werden 1 bis 10 Nucleotide, vorzugsweise 1 bis 5 Nucleotide und weiter bevorzugt 1, 2 oder 3 Nucleotide an das Oligonucleotid angefügt. Falls die Bestimmung einer Mutation gewünscht ist, so liegt die Mutation innerhalb der obenerwähnten 1 bis 10 Nucleotide und bevorzugterweise am ersten Nucleotid der Vorlage, das nicht mit dem Oligonucleotid hybridisiert ist. Die Zielpolynucleotidsequenz ist ein Teil des Polynucleotidanalyten und kann, wie oben erwähnt, den gesamten Polynucleotidanalyten bilden.
In der Zielpolynucleotidsequenz wird die geringstmögliche Anzahl an Nucleotiden ausgewählt, um sicherzustellen, daß die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz in einer Probe ein spezifischer Indikator für die Anwesenheit des Polynucleotidanalyten in einer Probe ist. Sehr grob gesagt ist die Sequenzlänge normalerweise größer als etwa 1,6 log L Nucleotide, wobei L die Anzahl an Basenpaaren im Genom der biologischen Quelle der Probe ist. Die maximale Anzahl an Nucleotiden in der Zielsequenz wird normalerweise von der Bedingung bestimmt, daß das Oligonucleotid teilweise an der Zielsequenz gebunden und teilweise ungebunden während der Bildung des verlängerten Oligonucleotids vorliegen muß. Ist die Zielsequenz zu lang, üblicherweise größer als etwa 50 Nucleotide, so würde die zur Erzielung dieser Bedingung notwendige Temperatur die Temperatur, bei der zur Zeit erhältliche Polymerasen aktiv sind, überschreiten.
Oligonucleotid - ein Polynucleotid, üblicherweise ein synthetisches Polynucleotid, üblicherweise einzelsträngig und im Hinblick auf eine bekannte (Zielpolynucleotid-) Sequenz eines Polynucleotidanalyten ausgewählt. Das bzw. die Oligonucleotid(e) besteht bzw. bestehen üblicherweise aus einer Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden, vorzugsweise 10 bis 80 Nucleotiden und weiter bevorzugt 15 bis 50 Nucleotiden.
Das Oligonucleotid besteht aus einer ersten Sequenz von etwa 8 bis 30 Nucleotiden, die am 3'-Ende des Oligonucleotids, welches mit mindestens einem Teil der Zielpolynucleotidsequenzen komplementär ist, endet. Eine zweite Sequenz von 1 bis etwa 50 Nucleotiden kann gegebenenfalls an das 5'-Ende der ersten Sequenz angefügt werden, wobei ein Teil der zweiten Sequenz mit einem Teil der Zielpolynucleotidsequenz hybridisierbar sein kann.
Zur Herstellung eines Oligonucleotids oder anderer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynucleotide lassen sich verschiedene Techniken einsetzen. Diese können mittels biologischer Synthese oder chemischer Synthese erhalten werden. Für kurze Oligonucleotide (bis zu etwa 100 Nucleotiden) ist die chemische Synthese häufig wirtschaftlicher als eine biologische Synthese. Neben Wirtschaftlichkeit stellt die chemische Synthese einen bequemen Weg zur Verfügung, niedrigmolekulare Verbindungen und/oder modifizierte Basen während des Syntheseschrittes einzubauen. Weiterhin zeigt sich die chemische Synthese sehr flexibel bei der Wahl der Länge und des Bereichs der Zielpolynucleotidsequenz. Die Oligonucleotide lassen sich mit Standardverfahren wie etwa denjenigen, die in kommerziellen automatischen Nukleinsäuresyntheseapparaturen verwendet werden, synthetisieren. Die chemische Synthese von DNS an geeignet modifiziertes Glas oder Harz führt zu kovalent an diese Oberfläche gebundener DNS. Dadurch können sich Vorteile beim Waschen und Handhaben der Probe ergeben. Für längere Sequenzen lassen sich in der Molekularbiologie eingesetzte Standardreplikationsverfahren verwenden, wie z. B. die Verwendung von M13 bei einzelsträngiger DNS, wie beschrieben von J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101, 20-78.
Neben Standardklonierungstechniken können in vitro enzymatische Verfahren wie z. B. Polymerase-katalysierte Reaktionen verwendet werden. Für die Herstellung von RNS lassen sich T7-RNS-Polymerase und eine geeignete DNS-Vorlage verwenden. Für DNS sind die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Einzelprimeramplifikation geeignet.
Weitere chemische Verfahren zur Polynucleotid- oder Oligonucleotidsynthese schließen die Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren (Narang, et al., Meth. Enzymol (1979) 68: 90) und Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al., Tetrahedron (1981) Letters 22: 1859- 1862) ebenso wie Phosphoramidattechniken, Caruthers, M. H., et al., "Methods in Enzymology", Band 154, Seiten 287-314 (1988) und weitere in "Synthesis and Applications of DNS and RNS", S. A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987 und den darin zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren ein.
Katalytische Menge - unter dem wie in der folgenden Erfindung angewandten Ausdruck katalytische Menge versteht man eine Menge an Zielpolynucleotidsequenz, die als eine Vorlage zur Modifizierung einer größeren, üblicherweise 10 bis 10&sup4;-fach größeren Menge eines obengenannten Oligonucleotids dient. Die katalytische Menge besteht im allgemeinen aus etwa 1 bis 10&sup9;, vorzugsweise 1 bis 10&sup6; Kopien der Zielpolynucleotidsequenz.
Isotherme Bedingungen - eine gleichmäßig verteilte oder konstante Temperatur, bei der die Modifikation des Oligonucleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. Die Temperatur wird so gewählt, daß das durch Hybridisierung des Oligonucleotids an ein Polynucleotid mit einer Zielpolynucleotidsequenz gebildete Duplex im Gleichgewicht mit dem freien oder unhybridisierten Oligonucleotid und der freien oder unhybridisierten Zielpolynucleotidsequenz steht, eine Bedingung, die hier anderswo als "reversibles Hybridisieren" des Oligonucleotids mit einem Polynucleotid bezeichnet wird. Normalerweise wird mindestens 1%, vorzugsweise 20 bis 80%, üblicherweise weniger als 95% des Polynucleotids unter den isothermen Bedingungen an das Oligonucleotid hybridisiert. Entsprechend gibt es unter isothermen Bedingungen Polynucleotidmoleküle, die mit dem Oligonucleotid oder Teilen davon hybridisiert sind und in dynamischen Gleichgewicht mit Molekülen, die nicht mit dem Oligonucleotid hybridisiert sind, stehen. Die Temperatur kann etwas schwanken und dennoch die Vorzüge der vorliegenden Erfindung erzielen. Diese Schwankung ist im allgemeinen zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung unnötig und bietet üblicherweise keine wesentliche Verbesserung.
Entsprechend schließt der Ausdruck "isotherme Bedingungen" die Verwendung von Temperaturschwankungen, besonders von beliebigen oder unkontrollierten Temperaturschwankungen ein, doch ist die als Thermocycling bezeichnete Temperaturschwankung, die in einigen bekannten Amplifikationsverfahren, z. B. der Polymerasekettenreaktion, eingesetzt wird, spezifisch ausgeschlossen. Normalerweise beträgt die Durchschnittstemperatur 25 bis 95ºC, vorzugsweise 40 bis 85ºC, weiter bevorzugt 60 bis 80ºC.
Die isothermen Bedingungen umfassen das reversible Hybridisieren eines Oligonucleotids mit einer Zielpolynucleotidsequenz bei einer konstanten Temperatur zwischen 40 und 80ºC mit einer Varianz von weniger als ±2ºC. Im allgemeinen wird die isotherme Temperatur auf empirischem Wege erreicht, indem das folgende Verfahren bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt und die optimale Temperatur bestimmt wird, so daß die größte Amplifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung erreicht wird. Zum Auswählen der geeigneten Temperatur lassen sich auch Computermodelle verwenden. Eine Kombination aus dem obenerwähnten kann auch eingesetzt werden.
Nucleosidtriphosphate - Nucleoside mit einem 5'- Triphosphatsubstituenten. Bei den Nucleosiden handelt es sich um Pentosezuckerderivate stickstoffhaltiger Basen, die sich entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten und kovalent an den 1'-Kohlenstoff des Pentosezuckers, der üblicherweise eine Deoxyribose oder eine Ribose ist, gebunden sind. Zu den Purinbasen gehören Adenin (A), Guanin (G), Inosin sowie deren Derivate und Analoge. Zu den Pyrimidinbasen zählen Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) sowie deren Derivate und Analoge. Zu den Nucleosidtriphosphaten gehören Deoxyribonucleosidtriphosphate wie z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP und Ribonucleosidtriphosphate wie z. B. rATP, rCTP, rGTP und rUTP. Der Ausdruck "Nucleosidtriphosphate" schließt ebenfalls Derivate und Analoge davon ein. Solche Derivate und Analoge, die der Erläuterung dienen und nicht einschränkend sind, sind beispielsweise diejenigen, die mit einer Reportergruppe modifiziert, biotinyliert, aminmodifiziert, radioaktiv markiert, alkyliert und ähnliches sind und ebenfalls Phosphorthioat, Phosphit, am Ringatom modifizierte Derivate und ähnliche einschließen. Bei der Reportergruppe kann es sich um eine Fluoreszenzgruppe wie z. B. Fluorescein, eine Chemilumineszenzgruppe wie z. B. Luminol, einen Terbium-Chelator wie z. B. N- (Hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, die zur Bestimmung mittels verzögerter Fluoreszenz fähig ist, und ähnliches handeln.
Nucleotid - eine Basen-Zucker-Phosphatkombination, die die Monomereinheit von Nukleinsäurepolymeren, d. h. DNS und RNS, darstellt.
Modifiziertes Nucleotid - ist diejenige Einheit in einem Nukleinsäurepolymer, die aus dem Einbau eines modifizierten Nucleosidtriphosphats während der vorlageabhängigen enzymkatalysierten Addition an ein Oligonucleotid hervorgeht und daher Teil des Nukleinsäurepolymers wird.
Nucleosid - ist eine Basen-Zuckerkombination oder ein Nucleotid ohne einen Phosphatanteil.
Nucleotidpolymerase - ein Katalysator, üblicherweise ein Enzym, zur Bildung einer Verlängerung eines Oligonucleotids entlang einer DNS-Vorlage, wobei die Verlängerung dazu komplementär ist. Die Nucleotidpolymerase ist eine vorlageabhängige Polynucleotidpolymerase oder ein "modifizierendes Enzym" und verwendet Nucleosidtriphosphate als Bausteine für die Verlängerung des 3'-Endes eines Oligonucleotids, um eine Sequenz zur Verfügung zu stellen, die zu dem einzelsträngigen Teil des Polynucleotids, an den das Oligonucleotid unter Ausbildung eines Duplex hybridisiert, komplementär ist. Üblicherweise handelt es sich bei den Katalysatoren um Enzyme wie z. B. DNS-Polymerasen, beispielsweise prokaryontische DNS-Polymerase (I, II oder III), T4- DNS-Polymerase, T7-DNS-Polymerase, Klenow-Fragment und reverse Transkriptase, vorzugsweise thermostabile Enzyme wie z. B. Vent-DNS-Polymerase, VentR-DNS- Polymerase, Pfu-DNS-Polymerase, Taa-DNS-Polymerase, und ähnliche, die von einer beliebigen Quelle, wie z. B. Zellen, Bakterien, z. B. E. coli, Pflanzen, Tieren, Viren, thermophilen Bakterien und so weiter, stammen. Für den Fall, daß es sich bei dem Polynucleotid oder der Zielpolynucleotidsequenz um RNS handelt, wäre die reverse Transkriptase eingeschlossen, um die Verlängerung des Oligonucleotids entlang des Polynucleotids oder der Zielpolynucleotidsequenz zu vereinfachen. Bevorzugte Nucleotidpolymerasen besitzen im wesentlichen keine 3'-Exonukleaseaktivität, weder im natürlichen Zustand noch nach Modifikation mit rekombinanten DNS-Techniken zur Eliminierung von 3'- Exonukleaseaktivität, im allgemeinen als "exo-" oder "exo minus" bezeichnet. Im Rahmen dieser Erfindung weist die Nucleotidpolymerase im wesentlichen keine 3'- Exonukleaseaktivität auf, wenn das Niveau einer solchen Aktivität so ist, daß sie keinen Einfluß auf die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, ihr Ziel, nämlich die Addition von mindestens einem Nucleotid an das Oligonucleotid unter isothermen Bedingungen, zu erreichen, hat.
Ganz oder teilweise sequentiell - falls die Probe und verschiedene in der vorliegenden Erfindung verwendete Substanzen auf andere Weise denn als concomitant (gleichzeitig) kombiniert werden, kann man eine oder mehrere mit einer oder mehreren der verbliebenen Substanzen unter Ausbildung einer Subkombination kombinieren. Jede Subkombination läßt sich dann einem oder mehreren Schritten des vorliegenden Verfahrens unterziehen. Somit kann jede Subkombination unter Bedingungen zur Erzielung eines oder mehrerer der gewünschten Ergebnisse inkubiert werden.
Hybridisierung (hybridisieren) und Bindung - im Zusammenhang mit Nucleotidsequenzen werden diese Ausdrücke hier miteinander austauschbar verwendet. Die Fähigkeit zweier Nucleotidsequenzen, miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Komplementaritätsgrad der zwei Nucleotidsequenzen, der wiederum auf dem Anteil an passenden komplementären Nucleotidpaaren beruht. Je mehr zu einer anderen Sequenz komplementäre Nucleotide in einer gegebenen Sequenz vorliegen, desto stringenter dürfen die Bedingungen für die Hybridisierung sein und desto spezifischer ist die Bindung der zwei Sequenzen. Eine erhöhte Stringenz läßt sich durch Erhöhung der Temperatur, Erhöhung des Cosolventienverhältnisses, Erniedrigung der Salzkonzentration und ähnliches erzielen.
Homolog oder im wesentlichen identisch - Im allgemeinen sind zwei Polynucleotidsequenzen, die entweder identisch sind oder jeweils an die gleiche Polynucleotidsequenz hybridisieren können, homolog. Die beiden Sequenzen sind homolog oder im wesentlichen identisch, wenn die Sequenzen jeweils mindestens 90%, vorzugsweise 100%, derselben oder analogen Basensequenz besitzen, wobei Thymin (T) und Uracil (U) als gleich angesehen werden. Somit nimmt man die Ribonucleotide A, U, C und G als Analoge für die Deoxynucleotide dA, dT, dC bzw. dG. Von zwei homologen Sequenzen können beide aus DNS oder eine aus DNS und die andere aus RNS bestehen.
Komplementär - Zwei Sequenzen sind komplementär, wenn die eine Sequenz an die andere Sequenz in einer antiparallelen Weise binden kann, wobei das 3'-Ende jeder Sequenz an das 5'-Ende der jeweils anderen Sequenz bindet und jedes A, T(U), G und C der einen Sequenz auf jeweils ein T (U), A, C bzw. G der anderen Sequenz ausgerichtet wird.
Kopie - bedeutet eine Sequenz, die eine direkte identische oder homologe Kopie einer einzelsträngigen Polynucleotidsequenz ist, im Unterschied zu einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz eines solchen einzelsträngigen Polynucleotids ist.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ("sbp- Mitglied") - eines von zwei unterschiedlichen Molekülen, mit einer auf der Oberfläche oder in einer Höhlung befindlichen Fläche, die spezifisch an eine besondere räumliche und polare Struktur des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaars werden auch als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Bei diesen kann es sich um Mitglieder eines immunologischen Paares wie z. B. Antigen-Antikörper oder um Operator-Repressor-, Nuklease-Nucleotid-, Biotin-Avidin-, Hormon- Hormonrezeptor-Paare, Nukleinsäureduplexe, IgG-Protein A-, DNS-DNS-, DNS-RNS- und ähnliche Paare handeln.
Ligand - eine beliebige Verbindung, für die es natürlicherweise einen Rezeptor gibt oder für die ein solcher Rezeptor hergestellt werden kann.
Rezeptor ("Antiligand") - eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Erkennung einer besonderen räumlichen und polaren Struktur eines Moleküls, z. B. eines Epitops oder einer Determinante, fähig ist. Zu beispielhaften Rezeptoren zählen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxinbindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Repressoren, Schutzenzyme, Protein A, Komplementkomponente C1q, DNS-bindende Proteine oder Liganden und ähnliche.
Kleines organisches Molekül - eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 1 500, vorzugsweise 100 bis 1 000, weiter bevorzugt 300 bis 600, wie z. B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere proteinbindende Moleküle, und Haptene, usw. Bei dem kleinen organischen Molekül kann es sich um ein Mittel zur Anbindung einer Nucleotidsequenz an eine Markierung (Label) oder an einen Träger handeln oder es kann selbst eine Markierung (Label) darstellen.
Träger oder Oberfläche - ein poröses oder nichtporöses wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden und umfaßt anorganische Pulver wie z. B. Silica, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien, besonders Cellulosematerialien und aus Cellulose abgeleitete Materialien wie z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier, usw.; synthetische oder modifizierte, natürliche vorkommende Polymere wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, quervernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), usw.; entweder allein oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; als Bioglass erhältliches Glas, Keramik, Metalle und ähnliches. Natürliche oder synthetische Zusammensetzungen wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel und Zellen lassen sich ebenfalls einsetzen.
Die Bindung von sbp-Mitgliedern an einen Träger oder an eine Oberfläche kann mittels bekannter Techniken, die üblicherweise aus der Literatur erhalten werden, bewerkstelligt werden. Siehe beispielsweise "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970). Die Oberfläche kann in einer Anzahl von Formen, wie z. B. Streifen, Stäbchen, Partikel, einschließlich Kügelchen, und ähnliches, vorliegen.
Markierung (Label) oder Reportergruppe oder Reportermolekül - ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems. Üblicherweise ist die Markierung (Label) oder die Reportergruppe oder das Reportermolekül an ein Oligonucleotid oder ein Nucleosidtriphosphat konjugiert, d. h. ist Teil davon, oder wird daran gebunden und ist in der Lage, direkt oder durch eine spezifische Bindungsreaktion bestimmt zu werden, und kann ein bestimmbares Signal produzieren. Allgemein läßt sich jede bestimmbare Markierung (Label) verwenden. Die Markierung (Label) kann isotop oder nichtisotop, üblicherweise nichtisotop, sein und kann ein Katalysator, z. B. ein Enzym, ein für einen Katalysator codierendes Polynucleotid, ein Promotor, Farbstoff, fluoreszentes Molekül, Chemilumineszierer, Coenzym, Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe, ein kleines organisches Molekül, eine amplifizierbare Polynucleotidsequenz, ein Partikel, z. B. ein Partikel aus Latex oder Kohlenstoff, ein Metallsol, Kristallit, Liposom, eine Zelle usw. sein, und kann gegebenenfalls weiter mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen bestimmbaren Gruppe und ähnlichem markiert sein. Zu den Markierungen (Labels) zählt auch eine Oligonucleotid- oder spezifische Polynucleotidsequenz, die eine Vorlage zur Amplifikation oder Ligation liefert oder als Ligand, z. B. für ein Repressorprotein, fungiert. Die Markierung (Label) ist ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems und kann ein bestimmbares Signal entweder allein oder zusammen mit anderen Mitgliedern des signalproduzierenden Systems erzeugen. Die Markierung (Label) kann entweder direkt an eine Nucleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden werden, indem sie an ein sbp-Mitglied, das komplementär zu einem an eine Nucleotidsequenz gebundenen sbp-Mitglied ist, gebunden wird (womit die Nucleotidsequenz in eine Markierung (Label) umgewandelt werden kann). Die Markierung (Label) kann eine spezifische Polynucleotidsequenz innerhalb einer Nucleotidsequenz sein und somit eine Markierung (Label) umfassen. Ist die Markierung (Label) an ein Nucleotidtriphosphat gebunden, ist sie vorzugsweise klein, üblicherweise kleiner als 1000 Dalton, vorzugsweise kleiner als 400 Dalton.
Signalproduzierendes System - Das signalproduzierende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei es sich bei mindestens einer Komponente um die Markierung oder die Reportergruppe oder das Reportermolekül handelt. Das signalproduzierende System erzeugt ein Signal, das in Beziehung zur Anwesenheit oder Menge einer Zielpolynucleotidsequenz oder eines Polynucleotidanalyten in einer Probe steht. Das signalproduzierende System enthält alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals benötigt werden. Wenn die Markierung (Label) nicht an eine Nucleotidsequenz konjugiert ist, ist sie normalerweise an ein sbp-Mitglied gebunden, welches komplementär zu einem sbp-Mitglied, das an eine Nucleotidsequenz gebunden oder Teil dieser Nucleotidsequenz ist, ist. Andere Komponenten des signalproduzierenden Systems können in einer Entwicklerlösung enthalten sein und können Substrate, Verstärker, Aktivatoren, Chemilumineszierer, Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger- Moleküle, Metallionen, zur Bindung an signalerzeugende Substanzen benötigte spezifisch bindende Substanzen und ähnliches umfassen. Weitere Komponenten des signalproduzierenden Systems können Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und ähnliches sein. Das signalproduzierende System liefert ein Signal, das über externe Mittel, über die Verwendung elektromagnetischer Strahlung und wünschenswerterweise über visuelle Untersuchung bestimmt werden kann. Das signalproduzierende System wird ausführlicher in EP Patentschrift Nr. 469,755 beschrieben.
Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynucleotiden - jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien oder Komplemente einer Nukleinsäure oder eines Polynucleotidmoleküls, üblicherweise eine in einem Medium vorhandene Nukleinsäure oder Polynucleotidanalyt, führt.
Exponentielle Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynucleotiden - jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder Polynucleotidmoleküls, üblicherweise einer Nukleinsäure oder eines Polynucleotidanalyten, führt.
Eines dieser Verfahren zur enzymatischen Amplifikation spezifischer doppelsträngiger DNS-Sequenzen ist als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannt, wie oben beschrieben. Dieses in-vitro-Amplifikationsverfahren beruht auf wiederholten Zyklen aus Denaturierung, Oligonucleotidprimer-Annealing und Primerverlängerung mit einer thermophilen, vorlageabhängigen Polynucleotidpolymerase und führt zu einem exponentiellen Anstieg der Kopienzahl der gewünschten Sequenz des von den Primern flankierten Polynucleotidanalyten. Die zwei unterschiedlichen PCR- Primer, die an den überliegenden Strängen der DNS annealen, sind so positioniert, daß das polymerasekatalysierte Verlängerungsprodukt des einen Primers als ein Vorlagestrang für den anderen dienen kann, was zur Anreicherung eines eigenständigen doppelsträngigen Fragments, dessen Länge durch den Abstand zwischen den 5'-Enden der Oligonucleotidprimer definiert ist, führt.
Ein weiteres Verfahren zur Amplifikation wird ebenfalls oben erwähnt und beinhaltet die exponentielle Amplifikation eines einzelsträngigen Polynucleotids unter Verwendung eines einzelnen Polynucleotidprimers. Das zu amplifizierende einzelsträngige Polynucleotid enthält zwei nicht aufeinanderfolgende Sequenzen, die komplementär zueinander sind und somit in der Lage sind, unter Bildung einer Damm-Schlaufen(stem-loop)- Struktur zusammenzuhybridisieren. Dieses einzelsträngige Polynucleotid kann bereits Teil eines Polynucleotidanalyten sein oder als Ergebnis der Anwesenheit eines Polynucleotids geschaffen werden.
Ein weiteres Verfahren, um das Ergebnis einer Amplifikation von Nukleinsäuren zu erreichen, ist als Ligasekettenreaktion (LCR) bekannt. Dieses Verfahren verwendet ein Ligaseenzym, um zuvor gebildete Nukleinsäuresonden zu verbinden. Diese Sonden hybridisieren mit dem gegebenenfalls vorhandenen Nukleinsäureanalyten, und die Ligase wird zur Verknüpfung der Sonden eingesetzt, wodurch zwei Vorlagen entstehen, die im nächsten Zyklus dazu dienen können, die jeweilige Nukleinsäuresequenz in exponentieller Weise zu wiederholen.
Ein weiteres Verfahren, um eine Nukleinsäureamplifikation zu erreichen, ist die Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA). Bei diesem Verfahren handelt es sich um einen promotorgesteuerten enzymatischen Prozeß, der in vitro eine kontinuierliche, homogene und isotherme Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäure induziert.
Ein weiteres Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Gruppe von Nukleinsäuren ist das Q-Beta- Replikase-Verfahren, das auf der Fähigkeit der Q-Beta- Replikase beruht, sein RNS-Substrat exponentiell zu amplifizieren.
Ein weiteres Verfahren zur Durchführung einer Amplifikation von Nukleinsäuren wird als Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification, SDA) bezeichnet. Bei SDA handelt es sich um eine isotherme in-vitro-DNS-Amplifikationstechnik, die auf der Fähigkeit eines Restriktionsenzyms beruht, den unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorthioatform seiner Restriktionsstelle zu "nicken", und der Fähigkeit einer DNS-Polymerase, die Replikation an diesem "Nick" zu initiieren und den stromabwärts gelegenen Nichtvorlagenstrang in intakter Form zu verdrängen. Die exponentielle Amplifikation wird von den die Erkennungsstellen für das Nicking-Restriktionsenzym enthaltenden Primern gesteuert.
Ein weiteres Amplifikationsverfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist unter dem Namen 3SR bekannt, und hierbei handelt es sich um ein RNS-spezifisches Zielverfahren, wodurch die RNS in einem isothermen Prozeß, in dem promotorgesteuerte RNS-Polymerase, reverse Transkriptase und RNSse H mit der Ziel-RNS kombiniert werden, amplifiziert wird.
Die Bedingungen zur Durchführung einer Amplifikation variieren somit, je nachdem welches Verfahren gewählt wird. Einige dieser Verfahren, wie z. B. PCR, benutzen ein Temperaturcycling, um die Denaturierung von Duplexen, das Annealing von Oligonucleotidprimern und die Primerverlängerung mit thermophiler vorlageabhängiger Polynucleotidpolymerase zu erreichen. Andere Verfahren, wie z. B. NASBA, Q-Beta-Replikaseverfahren, SDA und 3SR, sind isotherm. Wie man sieht, gibt es eine Vielfalt bekannter Amplifikationsverfahren und viele verschiedene Bedingungen, unter denen diese Verfahren ausgeführt werden, um eine exponentielle Amplifikation zu erzielen.
Lineare Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynucleotiden - jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung einer oder mehrerer Kopien von lediglich dem Komplement einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder Polynucleotidmoleküls, üblicherweise einer Nukleinsäure oder eines Polynucleotidanalyten, führt. Somit besteht ein Unterschied zwischen linearer Amplifikation und exponentieller Amplifikation darin, daß letztere Kopien des Polynucleotids produziert, wohingegen erstere nur den komplementären Strang des Polynucleotids produziert. In der linearen Amplifikation ist die Anzahl der gebildeten Komplemente im Prinzip direkt proportional zu der Reaktionszeit, im Gegensatz zur exponentiellen Amplifikation, bei der die Kopienanzahl im Prinzip von der Zeit oder der Anzahl an Temperaturzyklen in exponentieller Weise abhängt.
Hilfsmaterialien - verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in den im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahren und Tests eingesetzt. So sind normalerweise Puffer ebenso im Testmedium vorhanden wie Stabilisatoren für dieses Testmedium und die Testkomponenten. Zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen können häufig Proteine, z. B. Albumine, organische Lösungsmittel, z. B. Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen, z. B. Dextransulfat, Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, oder ähnliches enthalten sein.
Im Sinne einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz wird ein Oligonucleotid mit einer Zielpolynucleotidsequenz innerhalb eines Polynucleotidanalyten unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert. Die Zielpolynucleotidsequenz dient als eine Vorlage zur Addition von mindestens einem Nucleotid, üblicherweise von 1 bis 10 Nucleotiden, vorzugsweise 1 bis 5 Nucleotiden, weiter bevorzugt 1, 2 oder 3 Nucleotiden, die entweder gleich oder unterschiedlich sein können, an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern. Im allgemeinen wird die Anzahl an addierten Nucleotiden über die dem Reaktionsmedium zugesetzte Anzahl an unterschiedlichen Nucleosidtriphosphaten und über die Länge der Folge von zu den addierten Nucleotidtriphosphaten komplementären Nucleotiden, das heißt, in der Vorlage, die an das 5'-Ende der an das Oligonucleotid bindenden Sequenz angrenzt, gesteuert. In der vorliegenden Erfindung werden 1 bis 3 unterschiedliche Nucleosidtriphosphate eingesetzt. Solch eine Situation ergibt eine Kontrolle über die Anzahl an Nucleotiden, die an die Vorlage unter den eingesetzten isothermen Bedingungen addiert werden. Ferner ist anzumerken, daß ein verlängertes Oligonucleotid mit mehr als etwa 5 zusätzlichen Nucleotiden die Geschwindigkeit der Nucleotidaddition mit dem vorliegenden Verfahren herabsetzt. Allgemein nimmt mit einem Anstieg der Länge des verlängerten Oligonucleotids die Fähigkeit des entstehenden verlängerten Oligonucleotids, von der Vorlage bei der isothermen Reaktionstemperatur zu dissoziieren, ab. Die Beschaffenheit der Nucleotidzusammensetzung ist ebenfalls ein Faktor, so daß die Addition von mehr G- und/oder C-Nucleotiden relativ zu A- und/oder T- Nucleotiden die Gesamtanzahl an Nucleotiden, die addiert werden können, um die Reaktion bei der isothermen Temperatur durchführen zu können, herabsetzt.
Auf diese Weise werden mehrere Moleküle des verlängerten Oligonucleotids erhalten, von denen jedes ein Komplement der Zielpolynucleotidsequenz ist. Vorzugsweise wird mindestens ein 100-facher molarer Überschuß, weiter bevorzugt mindestens ein 10 000facher molarer Überschuß an verlängertem Oligonucleotid in bezug auf die Molarmasse an Zielpolynucleotidsequenz im vorliegenden Verfahren erhalten. Die obere Grenze für die Anzahl an gebildeten Molekülen des verlängerten Oligonucleotids hängt von solchen Faktoren wie Reaktionszeit, Reaktionsbedingungen, Enzymaktivität usw. ab. Das verlängerte Oligonucleotid wird nur dann gebildet, wenn die Zielpolynucleotidsequenz in der Probe vorhanden ist. Deshalb signalisiert die Anwesenheit von verlängertem Oligonucleotid die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz.
Eine solche Ausführungsform des Verfahrens ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Oligonucleotid OL wird mit Polynucleotidanalyt PA mit einer Zielpolynucleotidsequenz TPS und mit funktionierenden Deoxynucleosidtriphosphaten (dATP, dUTP und dGTP) und einer Polynucleotidpolymerase (PP) kombiniert. In dieser Ausführungsform werden drei der vier allgemein erkannten Deoxynucleosidtriphosphate beispielhaft und nicht einschränkend eingesetzt. Der Ausdruck "funktionierend" bedeutet, daß die Deoxynucleosidtriphosphate eine Kettenverlängerung unter entsprechenden Verlängerungsbedingungen unterstützen. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, 1 bis 3 solcher unterschiedlichen Deoxynucleosidtriphosphate zu verwenden und die verbliebenen Triphosphate wegzulassen oder anstelle der fehlenden Deoxynucleosidtriphosphate modifizierte Nucleosidtriphosphate, die, sobald sie durch Kettenverlängerung eingebaut worden sind, eine weitere Kettenverlängerung nicht mehr unterstützen, z. B. Dideoxynucleosidtriphosphate, zu verwenden. OL ist etwa 10 bis 80 Nucleotide lang, vorzugsweise 15 bis 30 oder mehr Nucleotide lang. Das OL muß in der Lage sein, mit TPS zu hybridisieren, und ist in dieser Ausführungsform 1 bis 10 Nucleotide kürzer als TPS und wird so gewählt, daß die Addition von nicht mehr als 1 bis 10 Nucleotiden daran zum EOL, einem verlängerten OL, das die gleiche Länge wie TPS besitzt, führt.
Wie man anhand der Fig. 1 sehen kann, hybridisiert OL mit TPS zum Duplex I. Die Hybridisierung wird unter isothermen Bedingungen bei einer Temperatur, bei der OL und EOL mit TPS reversibel hybridisiert werden, durchgeführt. OL in Duplex I wird in Gegenwart der Deoxynucleosidtriphosphate und Polynucleotidpolymerase PP verlängert, und Nucleotide werden bis zum ersten Nucleotid in der TPS, die zum fehlenden Deoxynucleosidtriphosphat (dCTP in diesem Beispiel) komplementär ist, addiert. An dieser Stelle stoppt die OL-Verlängerung. Verlängertes OL (EOL), das das Komplement zur TPS ist, ergibt sich durch Addition von maximal drei unterschiedlichen Nucleotiden zum OL. Die isothermen Bedingungen werden so gewählt, daß ein Gleichgewicht zwischen Duplex I und seinen einzelsträngigen Gegenstücken vorliegt. Entsprechenderweise besitzt die denaturierte Form des Duplex I nach Bildung des EOL freies EOL, PA und OL. OL rehybridisiert danach mit TPS des PA, und die Reaktion, in der EOL gebildet wird, wird wiederholt. Man läßt die Reaktion fortfahren, bis sich eine ausreichende Anzahl von Komplementmolekülen der TPS, nämlich EOL, gebildet hat, um die Bestimmung von EOL als Indikator für die Anwesenheit des Polynucleotidanalyten zu erlauben. Auf diese Weise ist die Addition von Nucleotiden an dem 3'- Terminus von OL vorlageabhängig und steht in Beziehung zur Anwesenheit des Polynucleotidanalyten.
Das Verfahren wird über eine Zeitdauer hinweg ausgeführt, die dazu ausreicht, die gewünschte Anzahl an Molekülen von verlängertem Oligonucleotid zu erzielen. Üblicherweise läßt sich eine ausreichende Anzahl an Molekülen zur Bestimmung erhalten, wenn die Reaktionszeit etwa 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 2 Stunden beträgt. Aus praktischen Gründen ist üblicherweise eine Minimalisierung der Zeitdauer wünschenswert, solange die erforderliche Anzahl an Molekülen von verlängertem Oligonucleotid erzielt wird.
Die Bestimmung wird auf mehrere Art und Weisen erleichtert. So läßt sich beispielsweise ein EOL- Binder, z. B. Streptavidin, oder eine mit EOL hybridisierende Nucleotidsequenz verwenden. Sowohl das Oligonucleotid OL als auch ein Deoxynucleosidtriphosphat oder auch beide können mit einem Reportermolekül, z. B. einem Rezeptor oder einem Liganden, einem kleinen organischen Molekül oder einer bestimmbaren Markierung (Label), einer Polynucleotidsequenz, einem Protein einschließlich Enzymen, einem Träger, intercalierendem Farbstoff und ähnlichem markiert werden, und/oder das Deoxynucleosidtriphosphat kann mit einem kleinen organischen Molekülliganden oder einer bestimmbaren Markierung (Label) einschließlich einem Fluorophor, Chemilumineszenzmolekül, einer radioaktiven Markierung, einem Sensitizer, einem Metallchelator, Farbstoff, usw. markiert werden. Die Bestimmung des EOL wird üblicherweise durchgeführt, indem die Assoziation der OL-Sequenz oder ihres Reportermoleküls mit einer Markierung (Label) auf den addierten Nucleotiden bestimmt wird. Die Bestimmung läßt sich über jedes beliebige Standardverfahren durchführen, wie z. B. Binden des EOL an einen Träger und Bestimmen des Reportermoleküls oder der Markierung (Label) auf diesem Träger oder Bestimmen der nächsten Umgebung des Reportermoleküls und der Markierung (Label) durch ein homogenes Verfahren wie etwa einem induzierten Lumineszenzimmunoassay, auf den unten eingegangen wird, oder Fluoreszenzenergietransfer. Alternativ läßt sich das EOL über vorlageabhängige Ligation an ein einzelsträngiges Polynucleotid unter Verwendung einer Polynucleotidvorlage, die eine Ligation des OL nicht unterstützt, bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird nur ein markiertes Deoxynucleosidtriphosphat verwendet, wobei die Markierung (Label) während der Reaktion in OL' eingebaut wird, so daß EOL' gebildet wird. Solch ein Ansatz ist in Fig. 2 gezeigt, wobei dATP markiert ist, wie mit dem Sternchen angedeutet ist. In dieser Ausführungsform stehen OL' und PA' in reversiblem Gleichgewicht mit Duplex 1'. Dabei ist anzumerken, daß OL' in Fig. 2 einen Anteil SOL enthält, der nicht mit TPS' des PA' hybridisiert und der als ein Reportermolekül dienen kann.
Ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren ist der Einsatz von Nukleinsäuresonden. Weitere Test- und Bestimmungsformate sind in der EP-Patentschrift Nr. 379,369, der EP-Patentschrift Nr. 469,755, dem U.S.- Patent Nr. 5,439,793 und der EP-Patentschrift Nr. 549,107 offenbart.
Beispiele für bestimmte Markierungen (Labels) oder Reportermoleküle und ihre Bestimmung lassen sich der EP-Patentschrift Nr. 469,755 entnehmen.
Die Bestimmung des Signals hängt von der Beschaffenheit des verwendeten signalproduzierenden Systems ab. Handelt es sich bei der Markierung (Label) oder der Reportergruppe um ein Enzym, so gehören Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System. Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff, der jeweils spektrophotometrisch bestimmt werden kann, oder um ein Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen Mitteln bestimmt werden kann. Ist die Markierung (Label) ein fluoreszentes Molekül, läßt sich das Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls die Markierung (Label) eine radioaktive Gruppe ist, kann man die Radioaktivität im Medium durch Zählen bestimmen.
Es gibt für das vorliegende Verfahren eine Anwendung, bei der die Zielpolynucleotidsequenz DNS oder RNS ist.
Die Verlängerung eines Oligonucleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen unter Verwendung einer Nucleotidpolymerase, von Nucleosidtriphosphaten oder deren Analogen, die in der Lage sind, als Substrate für die Polynucleotidpolymerase zu fungieren, und anderer für die Enzymaktivität benötigten Materialien und Bedingungen wie z. B. eines zweiwertigen Metallions (üblicherweise Magnesium), pH, Ionenstärke, organischen Lösungsmittels (z. B. Formamid) und ähnlicher Substanzen, durchgeführt.
Die Polynucleotidpolymerase ist üblicherweise eine reverse Transkriptase, wenn die Zielpolynucleotidsequenz RNS ist, und eine DNS-Polymerase, wenn die Zielpolynucleotidsequenz DNS ist. Die Polynucleotidpolymerase ist im allgemeinen in einer Menge vorhanden, die dazu ausreicht, die Addition von Nucleotiden an das Oligonucleotid mit mindestens zwanzig Prozent der mit überschüssigem Enzym erreichbaren Maximalgeschwindigkeit, vorzugsweise mit mindestens 50% der Maximalgeschwindigkeit, ablaufen zu lassen. Die Konzentration der Polynucleotidpolymerase wird üblicherweise empirisch bestimmt. Vorzugsweise wird eine Konzentration verwendet, die so ausreicht, daß ein weiterer Konzentrationsanstieg die Zeitdauer der Amplifikation um mehr als das 5-fache, vorzugsweise 2-fache, reduziert. Der hauptsächliche limitierende Faktor ist im allgemeinen der Preis für das Reagens.
Das durch das Enzym verlängerte Oligonucleotid liegt üblicherweise in einem großen Überschuß, vorzugsweise 10&supmin;&sup9; M bis 10&supmin;&sup5; M vor und wird in einer Menge verwendet, die die Gesamtgeschwindigkeit seiner Verlängerung im Sinne der folgenden Erfindung maximiert, wobei die Geschwindigkeit mindestens 10%, vorzugsweise 50%, weiter bevorzugt 90% der maximal möglichen Reaktionsgeschwindigkeit beträgt. Oligonucleotidkonzentrationen, die niedrigere Geschwindigkeiten als 50% der Maximalgeschwindigkeit produzieren, können dazu verwendet werden, eine mögliche Störung durch das Oligonucleotid bei der Bestimmung des bzw. der im Sinne der vorliegenden Erfindung hergestellten Produkts bzw. Produkte zu minimieren. Üblicherweise beträgt die Oligonucleotidkonzentration 0,1 Nanomolar bis 1 Millimolar, vorzugsweise 1 Nanomolar bis 10 Mikromolar. Dabei ist anzumerken, daß ein Anstieg der Oligonucleotidkonzentration dazu führt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit einen Grenzwert erreicht, der von der Oligonucleotidsequenz, der Temperatur, der Konzentration der Zielpolynucleotidsequenz und der Enzymkonzentration abhängt. Bei vielen Bestimmungsverfahren können sehr hohe Oligonucleotidkonzentrationen die Bestimmung erschweren. Die Menge an Oligonucleotid ist mindestens so groß wie die Anzahl an Molekülen des gewünschten Produkts und liegt üblicherweise bei 10&supmin;¹&sup6; bis 10&supmin;&sup8; Mol pro Probe, wobei die Probe 1 bis 1000 ml groß ist. Üblicherweise liegt das Oligonucleotid in einer Konzentration von mindestens 10&supmin;&sup9; M, vorzugsweise 10&supmin;&sup7; M und weiter bevorzugt mindestens 10&supmin;&sup6; M vor. Vorzugsweise liegt die Oligonucleotidkonzentration wesentlich oberhalb der Konzentration der Zielpolynucleotidsequenz und ist vorzugsweise 100mal höher als diese.
Die Menge an zu amplifizierender Zielpolynucleotidsequenz kann nur ein bis zwei Moleküle in einer Probe betragen, kann jedoch im allgemeinen von etwa 10² bis 10¹&sup0;, üblicher von 10³ bis 10&sup8; Molekülen in einer Probe variieren und beträgt vorzugsweise mindestens 10&supmin;²¹ M in der Probe und kann 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;¹&sup9; M, üblicher 10&supmin;¹&sup4; bis 10&supmin;¹&sup9; M betragen.
Bei der Durchführung des Verfahrens im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein wäßriges Medium eingesetzt. Als Cosolventien lassen sich auch andere polare Lösungsmittel einsetzen, üblicherweise oxygenierte organische Lösungsmittel mit 1 bis 6, üblicher mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Formamid, DMSO und ähnliche. Üblicherweise liegen diese Cosolventien, falls sie verwendet werden, in weniger als etwa 70 Gew.-%, üblicher in weniger als etwa 30 Gew.-% vor.
Der pH-Wert des Mediums liegt üblicherweise im Bereich von etwa 4,5 bis 9,5, üblicher im Bereich von etwa 5,5 bis 8,5 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6 bis 8. Der pH-Wert und die Temperatur werden so gewählt, daß die reversible Hybridisierung oder der Gleichgewichtszustand, bei dem die Verlängerung eines Oligonucleotids stattfindet, im Sinne der vorliegenden Erfindung erreicht wird. In einigen Fällen wird bei den Reaktionsparametern ein Kompromiß eingegangen, um die Geschwindigkeit, Effizienz und Spezifität dieser Schritte des vorliegenden Verfahrens zu optimieren. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Beibehaltung dieses pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Zu den beispielhaften Puffern gehören Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliche. Der jeweilige verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, jedoch kann bei einzelnen Verfahren ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt sein.
Wie oben erwähnt, wird die Reaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung unter isothermen Bedingungen durchgeführt. Die Reaktion wird im allgemeinen bei einer Temperatur durchgeführt, die in der Nähe der Schmelztemperatur für die Oligonucleotid: Zielpolynucleotidsequenz- und die verlängertes Oligonucleotid:Zielpolynucleotidsequenz-Komplexe liegt. Entsprechenderweise hängt die verwendete Temperatur von einer Reihe Faktoren ab. Üblicherweise beträgt die Temperatur für Verlängerung des Oligonucleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung etwa 35ºC bis 90ºC, je nach Menge und Sequenz der Zielpolynucleotidsequenz. Üblicherweise ist die Verwendung einer relativ hohen Temperatur von 60ºC bis 85ºC wünschenswert, um für eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit zu sorgen. Üblicherweise liegt die verwendete Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidsequenz-Komplexes. Die Menge der gebildeten verlängerten Moleküle hängt von der Inkubationszeit und -temperatur ab.
Die jeweilige verwendete Temperatur variiert ebenfalls je nach Salzkonzentration, pH, verwendeten Lösungsmitteln und der Länge und Zusammensetzung der Zielpolynucleotidsequenz ebenso wie des Oligonucleotids, wie oben erwähnt. Somit läßt sich beispielsweise das Oligonucleotid so aufbauen, daß es einen oder mehrere Teile mit Nucleotiden gibt, die zur Zielpolynucleotidsequenz oder zu entsprechenden Nucleotiden in der Zielpolynucleotidsequenz nicht hybridisierbar oder komplementär sind. Dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, für eine gegebene Anzahl an Nucleotidpaaren bei einer niedrigeren Temperatur zu arbeiten. Die Spezifität der Reaktion läßt sich auf einem hohen Niveau beibehalten, ohne daß Temperaturen benötigt werden, die die optimale Funktionstemperatur der Nucleotidpolymerase überschreiten. Beispiele für solche Ausführungsformen sind als Veranschaulichung und nicht limitierend in Fig. 3 bis 5 gezeigt. In Fig. 3 weist Oligonucleotid OL einen Teil POL auf, der nicht mit TPS hybridisierbar ist. In Fig. 4 ist Oligonucleotid OL nicht mit dem PTPS-Teil der TPS hybridisierbar. In Fig. 5 weist Oligonucleotid OL einen POL-Teil auf, der mit dem PTPS-Teil der TPS nicht hybridisierbar ist. Die Anzahl an Nucleotiden in solchen obenerwähnten Teilen beträgt etwa 1 bis 30, vorzugsweise 5 bis 25. Die Anzahl an Nucleotiden, die diejenigen Teile, die zu TPS oder OL hybridisierbar sind, flankieren, beträgt etwa 6 bis 24 Nucleotide auf jeder Seite solcher Teile, vorzugsweise 8 bis 18.
Die Konzentration der Deoxynucleosidtriphosphate im Medium kann stark variieren; vorzugsweise liegen diese Reagenzien in einem Überschuß vor. Die Deoxynucleosidtriphosphate liegen üblicherweise in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;² M, vorzugsweise 10&sup5; bis 10&supmin;³ M vor.
Die Reihenfolge beim Zusammenbringen der verschiedenen Reagenzien zur Bildung der Kombination kann von ganz oder partiell sequentiell bis zu simultan oder gleichzeitig variieren. Im allgemeinen wird die Zielpolynucleotidsequenz als Teil des Polynucleotidanalyten aus einer Probe erhalten, die einen solchen Polynucleotidanalyten enthält und die wie oben erwähnt vorbehandelt werden kann. Im allgemeinen wird die Zielpolynucleotidsequenz mit dem Oligonucleotid kombiniert. Eine zuvor vorbereitete Kombination aus Deoxynucleosidtriphosphaten und Polynucleotidpolymerase kann in der vorbereiteten Kombination eingeschlossen sein oder kann anschließend hinzugefügt werden. Es kann jedoch auch eine simultane Addition aller obigen Reagenzien, ebenso wie andere stufenweise oder sequentielle Reihenfolgen der Addition angewendet werden.
Die Konzentration und Reihenfolge der Addition der Reagenzien und die Bedingungen für das Verfahren werden im allgemeinen von dem Wunsch bestimmt, die Anzahl an Molekülen von verlängertem Oligonucleotid und die Geschwindigkeit, mit der solche Moleküle gebildet werden, zu maximieren.
Die Endkonzentration eines jeden Reagens wird normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Tests über den gewünschten Bereich hinweg zu optimieren. Die hauptsächliche Erwägung bei einem Test gilt der Produktion einer ausreichenden Anzahl an Molekülen von verlängertem Oligonucleotid, so daß solche Moleküle leicht bestimmt werden können und eine genaue Bestimmung der Zielpolynucleotidsequenz liefern.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bildung eines Oligonucleotids mit mindestens zwei Markierungen (Labels). Es wird eine Kombination zur Verfügung gestellt, die eine katalytische Menge einer Zielpolynucleotidsequenz, eine Nucleotidpolymerase, ein erst-markiertes Deoxynucleosidtriphosphat, ein zweit-markiertes Oligonucleotid, das zu einem Teil der Zielpolynucleotidsequenz komplementär ist, umfaßt. Die Kombination wird unter isothermen Bedingungen behandelt, so daß das markierte Oligonucleotid an die Zielpolynucleotidsequenz unter Bildung eines Duplex reversibel hybridisiert und das markierte Deoxynucleosidtriphosphat dadurch mit dem markierten Oligonucleotid verknüpft wird. In einem Test für eine Zielpolynucleotidsequenz wird das Oligonucleotid bestimmt, indem auf die Anwesenheit beider Markierungen (Labels) innerhalb desselben Moleküls hin untersucht wird. Die Anwesenheit des Oligonucleotids mit beiden Markierungen (Labels) ist ein Hinweis auf die Anwesenheit der Zielpolynucleotidsequenz.
Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist schematisch in Fig. 6 dargestellt. In dieser Ausführungsform wird ein Oligonucleotid OL" eingesetzt, das eine Markierung (Label) (**) aufweist, welche entweder direkt bestimmbar ist oder ein Ligand wie z. B. ein kleines Molekül, z. B. Biotin, Fluorescein, oder ein zweites Oligonucleotid, beispielsweise (dT)40, ist. Die verwendeten Deoxynucleosidtriphosphate enthalten ein markiertes Deoxynucleosidtriphosphat (dNTP1*). In Gegenwart der Nucleotidpolymerase und von dNTP1* wird OL" entlang des Polynucleotidanalyten PA" verlängert, so daß ein oder mehrere markierte Nucleotide addiert werden, wodurch sich verlängertes OL" (EOL") ergibt. EOL" ist das Komplement von TPS". Unter entsprechenden isothermen Bedingungen liegt ein Gleichgewicht vor, wobei Duplex I" im Gleichgewicht mit einzelsträngigem PA" und EOL", dem Produktoligonucleotid, steht. EOL" enthält nun beide Markierungen (Labels) * und **. EOL" dissoziiert von PA", wobei PA" freigesetzt wird, um danach von einem weiteren Molekül OL" gebunden zu werden. Die isothermen Bedingungen werden entsprechenderweise so gewählt, daß PA" mit einem weiteren Molekül OL" zum Duplex I" hybridisiert und die oben beschriebenen Reaktionen sich wiederholen. Die Reaktionszeit wird so gewählt, daß eine ausreichende Anzahl an Molekülen des TPS"-Komplements, nämlich EOL", erreicht wird, um eine Bestimmung des Polynucleotidanalyten zu erlauben.
Das zwei Markierungen (Labels) enthaltende Produktoligonucleotid läßt sich mit einem beliebigen Verfahren bestimmen. So kann man beispielsweise ein Verfahren verwenden, das eine Modulation durch die Assoziation der zwei Markierungen (Labels) beinhaltet. Es lassen sich Sandwich-Ligandenbindungstests einsetzen, wie beispielsweise ein ELISA-Test oder ein Enzym-Channeling-Immunoassay, bei dem Rezeptoren für die Markierungen (Labels) verwendet werden. Alternativ kann ein Rezeptor für eine der zwei Markierungen (Labels) verwendet werden, um das Produktoligonucleotid zu fangen, wobei die andere Markierung (Label) direkt bestimmt werden kann, wie z. B. mit Fluoreszenz. In einem besonders attraktiven Ansatz handelt es sich bei der einen Markierung (Label) um einen Photosensitizer, und mit der anderen Markierung (Label) läßt sich das Produktoligonucleotid auf einer rezeptorbeschichteten Oberfläche fangen, wie z. B. mit Beads, die in einem Flüssigmedium eine Suspension bilden, wobei die Oberfläche ein chemilumineszierendes Reagens enthält. Nach Zugabe der Oberfläche und Inkubation über eine Zeitdauer, die für die Bindung des Produktoligonucleotids an die Oberfläche ausreicht, wird die Suspension mit Licht bestrahlt, das vom Photosensitizer, aber nicht von dem chemilumineszierenden Reagens absorbiert werden kann. Das Licht wird dann abgeschaltet, und die Lumineszenz auf der Oberfläche ist ein Maß für die Anwesenheit des Polynucleotidanalyten.
Das markierte Molekül läßt sich durch einen beliebigen Standard-Bindungstest bestimmen, entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung (heterogen) von irgendeinem der Testkomponenten oder -produkte. Als Beispiel für homogene Immungssays dienen die in Rubenstein et al., U.S.-Patent Nr. 3, 817, 837, Spalte 3, Zeile 6 bis Spalte 6, Zeile 64 offenbarten "Enzyme Multiplied Immunoassay"-Techniken ("EMIT"), Immunfluoreszenzverfahren, wie z. B. die in Ullman, et al., U.S.-Patent Nr. 3,996,345, Spalte 17, Zeile 59 bis Spalte 23, Zeile 25 offenbarten; Enzym-Channeling- Techniken, wie z. B. die in Maggio, et al., US-Patent Nr. 4,233,402, Spalte 6, Zeile 25 bis Spalte 9, Zeile 63 offenbarten; und andere Enzym-Immungssays, wie z. B. der "Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)" werden in Maggio, E. T. supra diskutiert. Ein Beispiel für heterogene Tests ist der Radioimmungssay, offenbart in Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39: 1157 (1960). Für eine ausführlichere Erörterung der obigen Immungssaytechniken, siehe "Enzyme-Immunoassay", von Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Siehe auch z. B. U.S.-Patente Nr. 3,690,834; 3,791,932; 3,817,837; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345 und 4,098,876, wobei es sich hier nicht um eine vollständige Liste handeln soll.
Heterogene Tests beinhalten üblicherweise einen oder mehrere Trennschritte und können kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Verschiedene kompetitive und nichtkompetitive Testformate sind in Davalian, et al., U.S.-Patent Nr. 5,089,390, Spalte 14, Zeile 25 bis Spalte 15, Zeile 9 offenbart. Ein typischer nichtkompetitiver Test ist ein in David, et al., U.S.- Patent Nr. 4,486,530, Spalte 8, Zeile 6 bis Spalte 15, Zeile 63 offenbarter Sandwich-Test.
Ein weiterer Bindungstestansatz umfaßt den induzierten Lumineszenz-Immungssay.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielpolynucleotidsequenz. Bei diesem Verfahren wird ein Oligonucleotid mit einer vermutlich eine Mutation enthaltenden Zielpolynucleotidsequenz in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert. Die Zielpolynucleotidsequenz dient als eine Vorlage zur Addition von mindestens einem Nucleotid, üblicherweise von 1 bis 10 Nucleotiden, vorzugsweise von 1 bis 5 Nucleotiden, weiter bevorzugt 1, 2 oder 3 Nucleotiden an den 3'-Terminus des Oligonucleotids, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern, wobei mindestens ein 100-facher molarer Überschuß des verlängerten Oligonucleotids in bezug auf die Molarmasse der Zielpolynucleotidsequenz erhalten wird. Eines der Nucleotide enthält eine Markierung (Label). Die Anwesenheit der Markierung (Label) im verlängerten Oligonucleotid wird bestimmt, wobei ihre Anwesenheit die Anwesenheit der Mutation in der Zielpolynucleotidsequenz anzeigt.
Eine solche Ausführungsform ist in Fig. 7 dargestellt. Es wird angenommen, daß TPS' eine Punktmutation enthält. Ein Oligonucleotid OL' wird hergestellt, um mit einem Teil der TPS' bis zur vermuteten Mutationsstelle (in Fig. 7 durch einen Pfeil angedeutet), die unmittelbar 5' vom letzten Nucleotid der TPS', an der OL' hybridisiert ist, zu hybridisieren. Vermutet man, daß es sich bei der Mutation um ein Nucleotid T handelt, so wird ein einfach markiertes Nucleotid, dA*TP, zusammen mit PP in die Reaktionsmischung mit eingeschlossen. Wie man anhand von Fig. 7 erkennt, hybridisiert OL' mit TPS' zum Duplex 1'. Die Hybridisierung wird unter isothermen Bedingungen bei einer Temperatur durchgeführt, bei der OL' und EOL' mit TPS' reversibel hybridisiert werden. OL' in Duplex 1' wird zur Addition des markierten Nucleotids A* nur dann verlängert, wenn die vermutete Mutation in TPS' vorhanden ist. Ist die vermutete Mutation T nicht vorhanden, findet keine OL'- Verlängerung statt und die Markierung (Label) wird nicht in das EOL' eingebaut. Ist hingegen die Mutation vorhanden, wird die Verlängerung des OL nach Addition des A* gestoppt. Wie oben werden die isothermen Bedingungen so gewählt, daß ein Gleichgewicht zwischen Duplex 1' und seinen einzelsträngigen Gegenstücken besteht. Entsprechenderweise weist die denaturierte Form des Duplex I nach Bildung des EOL', falls die Mutation vorhanden ist, freies EOL', PA' und OL' auf. OL' rehybridisiert danach mit TPS' des PA', und die EOL'-bildende Reaktion wird wiederholt. Man läßt die Reaktion fortfahren, bis eine ausreichende Anzahl an EOL'-Molekülen gebildet wird, um die Bestimmung des EOL' als Indikator für die Anwesenheit der Mutation in der Zielpolynucleotidsequenz TPS' zu ermöglichen.
Eine Variante des Obenerwähnten ist in Fig. 8 dargestellt. In dieser Ausführungsform werden zwei Nucleotide eingesetzt. Eines der Nucleotide ist urunarkiert, nämlich dATP, und ist komplementär zu demjenigen TPS'-Nucleotid, nämlich T, von dem man annimmt, daß es mutiert wurde (in Fig. 8 durch einen Pfeil angedeutet). Das zweite Nucleotid enthält eine Markierung (Label), hat die Bezeichnung dC*TP und ist komplementär zu demjenigen Nucleotid, nämlich G, das 5' von und unmittelbar benachbart zu dem vermuteten mutierten Nucleotid liegt. OL' hybridisiert mit TPS' zum Duplex I'. Die Hybridisierung wird unter isothermen Bedingungen bei einer Temperatur durchgeführt, bei der OL' und EOL' mit TPS' reversibel hybridisiert werden. OL' in Duplex I' wird zur Addition des markierten Nucleotids C* und Nucleotids A nur dann verlängert, wenn die vermutete Mutation in TPS' vorhanden ist. Ist die vermutete Mutation T nicht vorhanden, findet keine OL'-Verlängerung statt und die Markierung (Label) wird nicht in das EOL' eingebaut. Ist hingegen die Mutation vorhanden, wird die Verlängerung des OL nach Addition des C* gestoppt.
Zweckmäßigerweise können vorbestimmte, in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Reagenzien in abgepackter Kombination in einem Kit zur Verfügung gestellt werden. Dabei kann ein Kit in abgepackter Kombination (a) ein bis drei Nucleosidtriphosphate, von denen mindestens eines aus einer Markierung (Label) besteht oder in eine Markierung (Label) umwandelbar ist, (b) ein an seinem 3'-Ende zu einem zu bestimmenden Polynucleotid komplementäres Oligonucleotid, (c) eine Nucleotidpolymerase und (d) Mittel zur Bestimmung der Deoxynucleosidtriphosphatmarkierung, wenn diese Markierung (Label) an das Oligonucleotid gebunden ist, umfassen. In einer Ausführungsform des obigen Kits ist das Oligonucleotid ein Oligodeoxynucleotid.
Die obigen Kits können weiterhin Mitglieder eines signalproduzierenden Systems sowie verschiedene gepufferte Medien, von denen einige ein oder mehrere der obigen Reagenzien enthalten, einschließen. Ebenso können die obigen Kits eine schriftliche Beschreibung eines oder mehrerer Verfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz, die oben beschrieben sind, einschließen.
Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits lassen sich über einen weiten Bereich variieren, um für Reagenskonzentrationen zu sorgen, die die während des vorliegenden Verfahrens stattzufindenden Reaktionen wesentlich optimieren, und weiter die Empfindlichkeit eines beliebigen Tests wesentlich zu optimieren. Unter entsprechenden Umständen können ein oder mehrere Reagenzien als trockenes, üblicherweise lyophilisiertes Pulver zur Verfügung gestellt werden, einschließlich Hilfsstoffen, die nach Auflösung für eine Reagenslösung mit den für die Durchführung eines Verfahrens oder Tests im Sinne der vorliegenden Erfindung geeigneten Konzentrationen sorgen. Jedes Reagenz kann entweder in getrennte Behältnisse abgepackt werden, oder einige Reagenzien können in einem Behältnis kombiniert werden, falls dies im Hinblick auf Kreuzreaktivität und Haltbarkeit zulässig ist.

BEISPIELE

Die Erfindung wird mit den folgenden veranschaulichenden Beispielen weiter demonstriert. Falls nicht anders angegeben, sind Temperaturen in Grad Celsius (ºC) und Anteile und Prozente als Gewichtsanteile und Gewichtsprozente aufgeführt.
Es werden hier die folgenden Abkürzungen verwendet: DTT - Dithiothreitol (von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).

BEISPIEL 1

Eine einzelsträngige Ziel-DNS (108 Moleküle) (M13mp18 von 'GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland) wurde mit einer 5'³²P-markierten Oligonucleotidsonde (markierte Sonde) (10 mM) 5' GAC-GGC-CAG-TGA-ATT-CGA-GC 3 (SEQ ID NO: 1), synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler, Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, 100 mM TTP und 2,5 Einheiten Pfu exo minus DNS-Polymerase (von Stratagene, San Diego, California) in 50 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Triton® X-100, 7,5 mM DTT) kombiniert. Die Reaktionsmischung wurde bei 74ºC inkubiert, und die Anreicherung von Produkt, d. h. 5' GAC-GGC-CAG-TGA-ATT- CGA-GCT 3' (SEQ ID NO: 2) wurde durch Visualisierung mittels Autoradiographie nach Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt.
Das Ausmaß der Amplifikation wurde mittels Flüssigszintillationsspektrometrie von ausgeschnittenem Reaktionsprodukt bestimmt. Eine 1,5 · 10&sup4;fache Amplifikation wurde beobachtet.
In den obigen Beispielen ermöglichte eine Polymerase die Addition einer einzelnen modifizierten Base an das 3'-Ende einer Oligonucleotidsonde in einer vorlagegesteuerten Weise, d. h. bei Annealing der Sonde an die Ziel-DNS. Die Amplifikation fand bei einer konstanten Temperatur statt, wenn die Schmelztemperatur (Tm) der modifizierten oder markierten Sonde sehr dicht bei derjenigen der ursprünglichen nichtmodifizierten Sonde lag. Bei oder nahe der Tm der Sonde durchgeführte Reaktionen erlaubten kontinuierliches Annealing und Dissoziation der Sonde (modifiziert und nichtmodifiziert) an das bzw. von dem Ziel. Sobald die Sonde durch das Enzym modifiziert worden war, dissoziierte sie von dem Ziel, wodurch das Annealing einer nichtmodifizierten Sonde (in diesem Beispiel im molaren Überschuß) ermöglicht wurde. Über eine bestimmte Zeitdauer wurde eine Anreicherung einer spezifisch markierten Oligonucleotidsonde erzielt.

BEISPIEL 2

Das in Beispiel 1 durchgeführte Reaktionsprotokoll wurde mit weiteren Oligonucleotidsonden und mit Biotin- 16-dUTP anstelle von TTP wiederholt. Im folgenden werden die Reagenzien und Bedingungen sowie die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt: A) Kontrolle:
Bedingungen: Puffer, Oligonucleotidsonde und Ziel- DNS (zuvor beschrieben) in äguimolaren Konzentrationen (0,4 Picomol/50 ml-Reaktion); 30 Minuten inkubiert bei 74ºC mit 2,5 Einheiten Pfu exo minus DNS-Polymerase und 50 mM oder 100 mM Biotin- 16-dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.)
Diese kurzen Inkubationen wurden ausgeführt, um zu sehen, ob das Enzym (Pfu) das Biotin-16-dUTP effizient an das 3'-Ende des obigen Oligos addieren würde. Die modifizierte Base wurde, wie durch PAGE- Analyse (zuvor beschrieben) bestimmt wurde, effizient addiert. B) Reaktionen:
Bedingungen: Puffer und Volumen wie oben beschrieben; Ziel-DNS (dieselbe wie oben) Konzentration wurde variiert: 10¹¹ bis 10&sup7; Moleküle; Oligonucleotidsondenkonzentration wurde variiert:
0,01 bis 100 mM; Temperatur wurde variiert: 74ºC bis 82ºC; Pfu exo minus DNS-Polymerase (Pfu exo-) Konzentration wurde variiert: 2,5 bis 10 Einheiten pro Reaktion. Die Inkubationen wurden über eine Dauer von bis zu 5 Stunden durchgeführt. Alle Reaktionen wurden in Gegenwart von 100 mM TTP ausgeführt.
Ergebnisse: Bei 10&sup8; Zielen für 5 Stunden bei 74ºC, 50 ml-Reaktion, 100 mM TTP wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
a) 1 mM Oligonucleotid; 2,5 Einheiten Pfu exo-: 8 · 10³fache Amplifikation
b) 1 mM Oligonucleotid; 5,0 Einheiten Pfu exo-: 4,5 · 10³fache Amplifikation
c) 10 mM Oligonucleotid; 2,5 Einheiten Pfu exo-: 1,5 · 10&sup4;fache Amplifikation
d) 10 mM Oligonucleotid; 5,0 Einheiten Pfu exo-: 1,4 · 10&sup4;fache Amplifikation
Es wurde kein signifikanter Anstieg der Amplifikation mit ansteigender Enzymkonzentration bestimmt. Es wurde keine signifikante Amplifikation bei Temperaturen zwischen 76ºC und 82ºC, die vermutlich oberhalb der Schmelztemperatur (Tm) der Oligonucleotid: Zielpolynucleotidsequenz- und der verlängerten Oligonucleotid:Zielpolynucleotidsequenz-Komplexe liegen, bestimmt.
Die obigen Experimente zeigen, daß vom 3'-Ende einer Oligonucleotidsonde ein bestimmbares Amplifikationsprodukt in einer zielspezifischen Weise bei einer einzigen Temperatur unter Verwendung eines Enzyms mit Nucleotidpolymeraseaktivität erzeugt wird. Die Reaktionen werden bei Temperaturen durchgeführt, die sehr nahe an der Tm des Duplex, der die modifizierte Sonde enthält, liegen.
Die obige Diskussion schließt gewisse Theorien über die an der vorliegenden Erfindung beteiligten Mechanismen ein. Diese Theorien sollten nicht so verstanden werden, als daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken, da gezeigt wurde, daß die vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erzielt.
Die obige Beschreibung und obigen Beispiele offenbaren vollständig die Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen davon. Modifikationen der beschriebenen Verfahren, die denjenigen mit durchschnittlichen Fähigkeiten auf dem Fachgebiet wie z. B. Molekularbiologie und verwandten Wissenschaften bekannt sind, sollen im Rahmen der folgenden Ansprüche liegen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
(B) STRASSE: POSTFACH 11 40
(C) STADT: MARBURG
(D) STAAT: DEUTSCHLAND
(F) LAND: DEUTSCHLAND
(F) POSTLEITZAHL: 35001
(A) NAME: EDWIN F. ULLMAN
(B) STRASSE: 135 SELBY LANE
(C) STADT: ATHERTON
(D) STAAT: KALIFORNIEN
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94025
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nachweis von Nukleinsäuren durch Bildung eines vorlageabhängigen Produkts
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT/US BASIEREND AUF U.S.-ANMELDUNG 08/468,301 EINGEREICHT AM 07. JUNI 1995
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Reversibles Hybridisieren eines Oligonucleotids mit einer Zielpolynucleotidsequenz in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase und 1 bis 3 verschiedenen Nucleosidtriphosphaten unter isothermen Bedingungen, worin die genannte Zielpolynucleotidsequenz als eine Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids zum 3'-Ende des genannten Oligonucleotids dient, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern, worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidsequenzkomplexes beinhalten und

(b) Bestimmung der Anwesenheit des genannten verlängerten Oligonucleotids, welches die Anwesenheit der genannten Zielpolynucleotidsequenz anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens das genannte Nucleotid oder das genannte Oligonucleotid markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die genannte Zielpolynucleotidsequenz DNS ist.

4. Verfahren zur Bestimmung einer Zielpolynucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zurverfügungstellen einer Kombination aus einem Medium, welches vermutlich die genannte Zielpolynucleotidsequenz enthält, einem in bezug auf die vermutliche Konzentration der genannten Zielpolynucleotidsequenz molaren Überschuss eines Oligonucleotids, welches in der Lage ist, mit dem genannten Zielpolynucleotid zu hybridisieren, 1 bis 3 Nucleosidtriphosphaten und einer Nucleotidpolymerase,

(b) Reversibles Hybridisieren der genannten Zielpolynucleotidsequenz und des genannten Oligonucleotids unter isothermen Bedingungen, worin das genannte Oligonucleotid an seinem 3'-Ende verlängert ist, um eine Menge eines erweiterten Oligonucleotids herzustellen, worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid: Zielpolynucleotidkomplexes beinhalten und

(c) Bestimmung der Anwesenheit des genannten verlängerten Oligonucleotids, welches die Anwesenheit der genannten Zielpolynucleotidsequenz anzeigt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die genannten Nucleosidtriphosphate aus der Gruppe, die aus dUTP, dITP, dATP, dCTP und dGTP und aus Dideoxynucleosidtriphosphaten besteht, ausgewählt werden.

6. Verfahren zur Bestimmung eines DNS-Analyts, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zurverfügungstellen einer Kombination aus einem Medium, welches vermutlich den genannten DNS-Analyten enthält, einem Oligonucleotid, welches in der Lage ist, mit dem genannten DNS-Analyten zu hybridisieren, 1 bis 3 Nucleosidtriphosphaten und einer vorlageabhängigen DNS-Polymerase,

(b) Reversibles Hybridisieren des genannten DNS- Analyts und des genannten Oligonucleotids unter isothermen Bedingungen, worin das genannte Oligonucleotid an seinem 3'-Ende verlängert ist, um ein verlängertes Oligonucleotid herzustellen und worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidkomplexes beinhalten und

(c) Bestimmung der Anwesenheit des genannten verlängerten Oligonucleotids, welches die Anwesenheit des genannten DNS-Analyts anzeigt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das genannte Oligonucleotid einen Substituenten hat, welcher die Trennung des genannten Oligonucleotids vom genannten Medium erleichtert.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 6, worin mindesten eines der genannten Nucleosidtriphosphate markiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin die genannte Markierung (Label) ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Mitgliedern spezifischer Bindungspaare, Farbstoffen, fluoreszenten Molekülen, Chemilumineszierern, Coenzymen, Enzymsubstraten, radioaktiven Gruppen und organischen Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500.

10. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Zielpolynucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bildung eines, im Bezug auf die Anwesenheit der genannten Polynucleotidsequenz, verlängerten Oligonucleotids, welches mindestens zwei Markierungen (Labels) hat, im Bezug auf das Vorhandensein der genannten Polynucleotidsequenz, worin während der genannten Bildung das Oligonucleotid unter isothermen Bedingungen reversibel mit dem genannten Zielpolynucleotid hybridisiert wird, worin die genannte Zielpolynucleotidsequenz als Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids zum 3'-Ende des genannten Oligonucleotids dient, um ein erweitertes Oligonucleotid zu liefern, worin eine der genannten Markierungen (Labels) Teil des genannten Oligonucleotids ist, und worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidkomplexes beinhalten und

(b) Bestimmung beider genannter Markierungen (Labels) als ein Anzeichen für die Anwesenheit des genannten Oligonucleotids, welches die Anwesenheit der genannten Zielpolynucleotidsequenz anzeigt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Oligonucleotids mit mindestens zwei Markierungen (Labels), umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zurverfügungstellen einer Kombination eines Zielpolynucleotids, einer Nucleotidpolymerase, eines erst-markierten Deoxynucleosidtriphosphats und eines zweitmarkierten Oligonucleotids, welches zu mindestens einem Teil des genannten Zielpolynucleotids komplementär ist,

(b) Behandlung der genannten Kombination unter isothermen Bedingungen, so dass das genannte markierte Oligonucleotid reversibel zum genannten Zielpolynucleotid hybridisiert, um ein Duplex zu bilden, und das genannte markierte Deoxynucleosidtriphosphat mit dem genannten markierten Oligonucleotid am 3'- Ende des Oligonucleotids verbunden wird, worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidkomplexes beinhalten.

12. Kit zur Bestimmung eines Polynucleotids, welches in abgepackter Kombination enthält:

(a) 1 bis 3 Nucleosidtriphosphate, von welchen mindestens eins eine Markierung (Label) umfaßt, oder in eine Markierung (Label) umgewandelt werden kann,

(b) ein markiertes Oligonucleotid, welches an seinem 3'-Ende zu genanntem Polynucleotid komplementär ist,

(c) eine Nucleotidpolymerase und

(d) Mittel zur Bestimmung genannter Nucleotidtriphosphatmarkierungen, wenn die genannte Markierung (Label) an das genannte Oligonucleotid gebunden sind.

13. Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielpolynucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Reversibles Hybridisieren eines Oligonucleotids mit einer Zielpolynucleotidsequenz, in welcher die genannte Mutation vermutet wird, in Gegenwart einer Nucleotidpolymerase unter isothermen Bedingungen, worin die genannte Zielpolynucleotidsequenz als eine Vorlage zur Addition mindestens eines Nucleotids zum 3'-Ende des genannten Oligonucleotids dient, um ein verlängertes Oligonucleotid zu liefern, worin mindestens ein 100-facher molarer Überschuss des genannten verlängerten Oligonucleotids relativ zur Molarmasse der genannten Zielpolynucleotidsequenz erhalten wird, worin das genannte Nucleotid eine Markierung (Label) enthält und

(b) Bestimmung der Anwesenheit der genannten Markierung (Label) im genannten verlängerten Oligonucleotid, wobei dessen Anwesenheit die Anwesenheit der genannten Mutation in der genannten Zielpolynucleotidsequenz anzeigt, worin die genannten isothermen Bedingungen eine isotherme Temperatur zwischen 15ºC unter und 15ºC über der Schmelztemperatur des Oligonucleotid:Zielpolynucleotidkomplexes beinhalten.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin nur 1 bis 3 Nucleotide hinzugefügt werden.