DE69434136T2

DE69434136T2 - Dolastatin-derivate

Info

Publication number: DE69434136T2
Application number: DE69434136T
Authority: DE
Inventors: Kyoichi Sakakibara; Masaaki Yokohama-shi GONDO; Koichi Ebina-shi MIYAZAKI; Takeshi Kawasaki-shi ITO; Akihiro Kawasaki-shi SUGIMURA; Motohiro Kawasaki-shi KOBAYASHI
Original assignee: Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-10-01
Filing date: 1994-09-22
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2014-09-23
Also published as: JP3469580B2; AU7666194A; SG44794A1; EP0731106A4; KR100332254B1; US6124431A; CA2173150C; ATE282630T1; EP0731106B1; US5767237A; KR960704919A; DE69434136D1; ES2233928T3; EP0731106A1; AU689131B2; WO1995009864A1; CA2173150A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein neues Peptidderivat mit einer Antitumor-Aktivität und insbesondere betrifft sie ein Peptidderivat der folgenden Formel oder ein Salz davon
worin A für ein Wasserstoffatom steht und B für eine Phenylgruppe, die mit einer o-Fluorgruppe oder Hydroxylgruppe substituiert ist, oder eine Heteroarylgruppe steht.
Stand der Technik
Peptide mit einer zytostatischen Aktivität und/oder einer antineoplastischen Aktivität sind aus Meeresweichtieren, Seepferdchen Dolabella auricularia isoliert worden und diese Peptide werden als Dolastatine 1 bis 15 bezeichnet. Darunter ist Dolastatin 10 ein Pentapeptid, das 1987 von G. R. Pettit, et al. aus der im Indischen Ozean vorkommenden Dolabella auricularia isoliert worden ist, das die folgende Strukturformel aufweist und die stärkste bislang bekannte zytostatische Substanz sein soll (siehe G. R. Pettit, et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 6883 (1987) und U.S.-Patent Nr. 4,816,444).
Dolastatin 10
Kürzlich wurde die Totalsynthese von Dolastatin 10 veröffentlicht (siehe U.S.-Patent Nr. 4,978,744).
In diesem Zusammenhang haben die benannten Erfinder bereits in der internationalen Patentanmeldung WO93/03054 bestimmte Dolastatin 10-Derivate offenbart, die ein Tetrapeptidderivat der allgemeinen Formel (A) oder sein Salz
beschreibt, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sein können und jeweils für Wasserstoff, Niedrigalkyl oder Aralkyl stehen und Q bedeutet (a) oder -A₂-R₇, worin A₁ für eine einfache Bindung oder -CHR₅ steht, Y Wasserstoff oder -COR₆ bedeutet, R₅ für Wasserstoff, Niedrigalkyl oder Aralkyl steht, R₆ Hydroxy, Niedrigalkoxy, Aralkyloxy oder -NR₈R₉ bedeutet, worin R₈ und R₉ gleich oder verschieden sein können und jeweils für Wasserstoff, Niedrigalkyl, Phenyl oder eine 4- bis 7-gliedrige heterocyclische Gruppe mit ein oder zwei Heteroatomen, ausgewählt aus S, O und N, stehen oder alternativ R₈ und R₉ mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 4- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der weiter ein Heteroatom, ausgewählt aus S, O und N, tragen kann, A₂ für eine direkte Bindung oder Niedrigalkylen steht und R₇ Cycloalkyl, Arylorindolyl bedeutet, mit der Maßgabe, dass der Fall, in dem R₁ und R₂ Isopropyl bedeuten, R₃ für sek.-Butyl steht, R₄ Methyl bedeutet und Q für α-(2-Thiazolyl)phenethyl steht, ausgeschlossen ist.
Die benannten Erfinder haben gefunden, dass bestimmte Dolastatin 10-Derivate, worin das Dolaphenin (dies bedeutet eine α-(Thiazolyl)phenethylamino-Gruppe) an dem C-Terminus von Dolastatin 10 mit einem anderen Substituenten substituiert ist, eine wesentlich stärkere Antitumoraktivität aufweist als die von Dolastatin 10.
Offenbarung der Erfindung
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff „niedrig", dass die Anzahl der Kohlenstoffatome einer Gruppe oder einer Verbindung, die mit diesem Begriff belegt wird, 6 oder weniger, vorzugsweise 4 oder weniger beträgt.
„Heteroarylgruppe" bedeutet eine aromatische, heterocyclische Gruppe, die (ein) Heteroatom(e) enthält, die aus O, S und N ausgewählt sind, vorzugsweise eine 5- oder 6-gliedrige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 4 Heteroatome enthält, wie Thienyl-, Furyl-, Pyrrolyl-, Imidazolyl-, Thiazolyl-, Oxazolyl-, Thiadiazolyl-, Tetrazolyl-, Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Triazinylgruppen, etc.
Die substituierte Phenylgruppe, dargestellt durch das Symbol B, schließt eine Phenylgruppe ein, die mit einer Hydroxylgruppe und 2-Fluorphenyl substituiert ist.
Die Verbindungen in der Erfindung sind Verbindungen der oben genannten Formel (I), worin A für ein Wasserstoffatom steht und B für eine Phenylgruppe, die mit einer o-Fluorgruppe oder Hydroxylgruppe substituiert ist, oder ein Heteroarylgruppe steht, insbesondere eine Thienylgruppe oder eine Pyridylgruppe.
In den Verbindungen der oben genannte Formel (I) der Erfindung sind die Kohlenstoffatome, an die eine Isopropylgruppe, eine sek.-Butylgruppe, eine Methoxygruppe bzw. eine Methylgruppe binden, asymmetrische Kohlenstoffatome und deshalb können sie willkürlich eine R- oder S-Konfiguration aufweisen. Sämtliche dieser Verbindungen sind in den Umfang der Erfindung eingeschlossen aber im Hinblick auf ihre pharmakologische Aktivität sind Verbindungen, welche die gleiche Konfiguration wie Dolastatin 10 aufweisen, bevorzugt.
Die Peptidverbindungen der oben genannten Formel (I) können weiterhin auch als Salze vorliegen und als Beispiele für solche Salze könne Hydrochloride, Hydrobromide, Trifluoracetate, p-Toluolsulfonate, Acetate, etc. erwähnt werden.
Erfindungsgemäß kann eine Peptidverbindung der oben genannten Formel (I) durch Kondensieren der entsprechenden Aminosäuren oder Peptidfragmente, zum Beispiel gemäß der Flüssigphasensynthesemethode (vgl. E. Schröder und K. Lübke, „The Peptides", Band 1, Seiten 76–136, 1965, veröffentlicht von Academic Press), die auf dem Gebiet der Peptidchemie bekannt ist, hergestellt werden.
Zum Beispiel ist es zur Vermeidung der Racemisierung bei der Kondensationsreaktion bevorzugt die Synthese durchzuführen, indem ein Tripeptidfragment der folgenden Formel (II)
mit einem Fragment der folgenden Formel (III)
worin A und B wie oben definiert sind, kondensiert wird.
Des Weiteren ist es für die effiziente Synthese von vielen erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt die Synthese durchzuführen, indem ein Tetrapeptidfragment der folgenden Formel (IV)
mit einem Fragment der folgenden Formel V
worin A und B wie oben definiert sind, kondensiert wird.
Die Kondensationsreaktion kann im Allgemeinen durch Behandeln der Fragmente mit einem Kondensationsmittel, z. B. Dicyclohe xylcarbodiimid (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA) oder Diethylphosphorcyanidat (DEPC), ein sogenanntes BOP-Reagens oder dergleichen, in einem inerten Lösungsmittel wie beispielsweise Chloroform, Ethylacetat, Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF) oder Acetonitril, erforderlichenfalls in Gegenwart einer organischen Base, wie beispielsweise Triethylamin, N-Methylmorpholin oder Diisopropylethylamin (DIEA) durchgeführt werden.
Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise –10°C bis Raumtemperatur, vorzugsweise etwa 0°C. Die Verhältnisse der Verbindung der Formel (III), der organischen Base und des Kondensationsmittels zu der Verbindung der Formel (II) sind keinen besonderen Beschränkungen unterworfen, üblicherweise ist es jedoch vorteilhaft die Verbindung der Formel (III) in einer Menge von 1,0 bis 1,1 Mol, die organische Base in einer Menge von 2 Mol und das Kondensationsmittel in äquimolarer Menge pro Mol der Verbindung der Formel (II) zu verwenden.
Die Isolierung und Reinigung der so erhaltenen Peptidverbindung der Formel (I) aus dem Reaktionsgemisch kann durch an sich bekannte Verfahren, zum Beispiel durch Umkristallisation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), etc., durchgeführt werden.
Die Verbindungen der oben genannten Formel (III) und (IV), die als Ausgangsmaterialien in der oben genannten Reaktion verwendet werden, sind neue Verbindungen, die nicht vorher in der Literatur beschrieben worden sind, und können in einfacher Weise durch Kondensation von Aminosäuren, die Bestandteile davon sind, nach einer Flüssigphasensynthesemethode hergestellt werden.
Die Peptidverbindungen der Formel (I) der Erfindung weisen eine höhere Antitumoraktivität als Dolastatin 10 auf und haben einen breiten bzw. hohen therapeutischen Index und sind für die Behandlung von akuter myelozytischer Leukämie, akuter lymphozytischer Leukämie, chronischen Melanomen, Lungenadenokarzinomen, Neuroblastomen, kleinzelligem Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, etc. nützlich.
Die Antitumoraktivität der Verbindungen kann wie folgt getestet werden.
(1) Assay für die Antitumoraktivität
0,1 ml (10⁶ Zellen/Maus)-Mengen von Mäuseleukämie-P388-Zellen wurden intraperitoneal sieben Wochen alten CDF1-Mäusen implantiert. Eine Verbindung wurde am ersten Tag (d. h. dem ersten Tag nach der Implantation) intraperitoneal verabreicht und am fünften Tag nach der Implantation und die Letalität der Mäuse wurde über 60 Tage verfolgt. Aus den Ergebnissen wurden gemäß der folgenden Gleichung Verlängerungen der Lebensdauer (ILS, %) berechnet. In der folgenden Gleichung bedeutet T den Mittelwert der Tage des Überlebens der Gruppe mit Chemotherapie und C bedeutet den Mittelwert. der Tage des Überlebens der Vergleichsgruppe.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Die Antitumoraktivität ist gezeigt als das relative Verhältnis in dem Fall in dem der ILS-Wert von Dolastatin 10 mit 100 angesetzt wird.

Beispielverbindungsnummer Antitumoraktivität

8 190

12 190

14 190

Dolastatin 10 100
Die erfindungsgemäße Verbindung kann als Arzneimittel verwendet werden indem sie in eine beliebige Dosierungsform gebracht wird, d. h. feste Formen (z. B. Tabletten, Hartkapseln, Weichkapseln, Granulat, Pulver, feines Granulat, Pillen, Pastillen, etc.), halbfeste Formen (z. B. Zäpfchen, Salben, etc.) und flüssige Formen (z. B. Injektionen, Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Sprays, etc.). Als nicht toxische Additive, die in den oben genannten Formulierungen verwendet werden können, sind zum Beispiel Stärke, Gelatine, Glukose, Laktose, Fruktose, Maltose, Magnesiumcarbonat, Talk, Magnesiumstearat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Salz davon, Gummiarabikum, Polyethylenglykol, p-Hydroxybenzoesäurealkylester, Sirupe, Ethanol, Propylenglykol, Vaseline, Carbowachs, Glycerol, Natriumchlorid, Natriumsulfit, Natriumphosphat, Zitronensäure, etc. zu erwähnen. Das Arzneimittel kann auch ein weiteres therapeutisch wirksames Arzneimittel enthalten.
Der Gehalt der erfindungsgemäßen Verbindung in dem Arzneimittel hängt von der Dosierungsform ab, aber es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass das Arzneimittel die Verbindung in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-% im Fall von festen und halbfesten Formen enthält und in einer Konzentration von 0,5 bis 10 Gew.-% im Fall einer flüssigen Form.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung kann in weitem Umfang variiert werden und zwar in Abhängigkeit von der Art der zu behandelnden warmblütigen Tiere, unter Einschluss des Menschen, der Verabreichungswege, der Schwere der Symptome, der ärztlichen Diagnose, etc., liegt aber im Allgemeinen in der Größenordnung von 0,01 bis 50 mg/kg pro Tag. Es ist jedoch natürlich möglich, die Verbindung in einer Menge zu verabreichen, die kleiner als die Untergrenze des oben genannten Bereichs ist, oder in einer Menge, die über der Obergrenze des oben genannten Bereichs liegt, entsprechend der Schwere des Symptoms des Patienten und der ärztlichen Diagnose wie oben erwähnt. Die vorgenannte Dosis kann einmal pro Tag oder in mehreren Dosen über den Tag verteilt verabreicht werden.
Beispiele
Die Erfindung wird nachstehend gemäß den Bezugsbeispielen und Beispielen erläutert. Das folgende Flussschema 1 zeigt die Struktur der Verbindungen entsprechend den in den Bezugsbeispielen und Beispielen verwendeten Verbindungsnummern.
Hierin bedeutet Bu^t eine tert-Butylgruppe, Boc eine tert-Butoxycarbonylgruppe, Bzl eine Benzylgruppe, Me eine Methylgruppe, B eine Phenylgruppe, die mit einer o-Fluorgruppe oder Hydroxylgruppe substituiert ist, oder eine Heteroarylgruppe.
Flussschema 1
Bezugsbeispiel 1
Herstellung der Verbindung 2
30 ml einer Tetrahydrofuran-n-Hexan(1 : 1)-Lösung von 23,8 Lithiumdiisopropylamid (LDA, 66,4 mmol) wurde allmählich in 40 ml wasserfreies Tetrahydrofuran unter Rühren bei –20°C in einer Stickstoffatmosphäre gegossen, das Gemisch auf –78°C abgekühlt und 9,84 g (60 mmol) Benzylpropionat tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben. 5 Minuten später wurde eine Lösung von 7,96 g (40 mmol) Boc-prolinal in 40 ml Tetrahydrofuran tropfenweise bei derselben Temperatur über einen Zeitraum von 1 Stunde zugegeben. Das Gemisch wurde bei derselben Temperatur 15 Minuten lang gerührt, anschließend 150 ml eisgekühlte 1 N-Salzsäure zugegeben und das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert, die Ethylacetatschicht mit Wasser gewaschen und getrocknet, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abdestilliert und die verbleibende ölige Phase durch Kieselgel-Flashchromatographie unter Verwendung von Acetat-n-Hexan (1 : 5) als Elutionsmittel gereinigt, wodurch die gewünschte Verbindung 2 als farbloses Öl erhalten wird. 3,86 g (26,6%).
[α]_D ²⁷ –28,4° (c = 0,82, MeOH)
¹H-NMR (CDCl₃, δ) 1,30 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,45 (9H, s), 1,6–2,1 (m), 2,61 (1H, Quintett, J = 7,0 Hz), 3,0–3,6 (m), 3,7–4,1 (m), 5,13 (2H, s), 7,34 (5H), s)
Bezugsbeispiel 2
Herstellung der Verbindung 3
730 mg (2,01 mmol) der Verbindung 2, die in Bezugsbeispiel 1 erhalten wurde, werden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst, 0,7 ml (11,22 mmol) Methyljodid werden unter Rühren eingegossen und 0,16 g (4,00 mmol) Natriumhydrid (60% in Mineralöl) werden zugegeben. Man lässt bei 0°C 1 Stunde lang rühren, anschließend wird Eiswasser zugesetzt und das Gemisch mit Ethylacetat-Benzol (4 : 1) extrahiert. Die organische Phase wird mit 5%igem Kaliumhydrogensulfat, gesättigter, wässriger Natriumbicarbonatlösung, 5% Natriumthiosulfat und gesättigter Kochsalzlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und getrocknet. Das resultierende Rohprodukt wird mit Kieselgel-Flashchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-n-Hexan (1 : 10) als Elutionsmittel gereinigt, wodurch die gewünschte Verbindung 3 als farbloses Öl erhalten wird. 530 mg (72,5%).
[α]_D ²⁷ –25,7° (c = 0,389, MeOH)
¹H-NMR (CDCl₃, δ) 1,26 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,45 (9H, s), 1,65–2,1 (m), 2,56 (1H, Quintett, J = 7,0 Hz), 3,0–4,0 (m), 3,38 (3H, s), 5,14 (2H, s), 7,34 (5H, s)
Bezugsbeispiel 3
Herstellung der Verbindung 4

(a) 1 ml konzentrierte Salzsäure wird zu 97,1 mg (0,2 mmol) der Verbindung 1 (bekannte Verbindung) unter Eiskühlung gegeben und das Gemisch wird bei 0°C eine Stunde lang gerührt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 2 ml Dimethylformamid aufgelöst, anschließend werden 0,15 ml Triethylamin tropfenweise bei 0°C zugegeben und das Gemisch wird unter reduziertem Druck wiederum zur Trockne eingedampft.
(b) Daneben werden 76 mg (0,2 mmol) der in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Verbindung 3 in 0,5 ml Ethylacetat aufgelöst, mit 2,0 ml 2 N-Salzsäure/Ethylacetat unter Eiskühlung versetzt und das Gemisch auf Raumtemperatur gebracht, für 1,5 Stunden gerührt, unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft und anschließend getrocknet.

Die in (a) und (b) erhaltenen Produkte werden miteinander verbunden und in 0,8 ml Dimethylformamid aufgelöst, mit 34,3 mg (1,1 Äquivalenten) DEPC versetzt, anschließend wird das Gemisch mit Eis gekühlt, mit 56 μl (2 Äquivalenten) Triethylamin versetzt, weiter 1 Stunde lang unter Eiskühlung gerührt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck verdampft, der Rückstand in Dichlormethan aufgelöst und die Lösung wird mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet. Das resultierende Rohprodukt wird durch Kieselgel-Flashchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-Methanol (20 : 1) als Elutionsmittel gereinigt und dann anschließend mittels Sephadex LH-20-Chromatographie unter Verwendung von n-Hexan-Dichlormethan-Methanol (2 : 7,5 : 2,5) als Elutionsmittel wodurch die gewünschte Verbindung 4 als amorpher Feststoff erhalten wird. 117 mg (85,0%)
[α]_D ²⁶ –44,0° (c = 0,80, MeOH)
¹H-NMR (CDCl₃, δ) 0,7–1,5 (m), 1,27 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,5–2,25 (m), 2,25–2,9 (m), 3,01 (3H, s), 3,29 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,8–4,3 (m), 4,5–5,0 (m), 5,13 (2H, s), 7,34 (5H, s)
Beispiel 1 (dient nur der Bezugnahme)
Herstellung von Verbindung 5-A (in Verbindung 5,
)

(a) 400 mg (0,58 mmol) der in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Verbindung 4 werden in 6 ml t-Butanol-Wasser (9 : 1) aufgelöst, 80 mg 5% Palladium-Kohlenstoff werden zugebenen und die Lösung wird unter einem Wasserstoffstrom 5 Stunden lang gerührt. Der Katalysator wird abfiltriert und gewaschen und das Filtrat und die Waschlösungen werden unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft und getrocknet, wodurch die Verbindung 4', eine Carbonsäure, als farbloser glasartiger Feststoff erhalten wird. 337 mg (quantitativ).
(b) 35 mg (60 μmol) der in (a) erhaltenen Carbonsäure und 14 mg (1,5 Äquivalente) p-Chlorphenethylamin werden in 0,5 ml Dimethylformamid aufgelöst und unter Eiskühlung und Rühren werden 12,4 mg (1,2 Äquivalente) DEPC und 16 μl (1,88 Äquivalente) Triethylamin zugegeben, anschließend wird bei 0° mindestens 3 Stunden lang weitergerührt und danach über Nacht, wobei man das Eis schmelzen lässt. Die Reaktionslösung wird unter reduziertem Druck konzentriert, der Rückstand in Dichlormethan aufgelöst und die Lösung mit gesättigter, wässriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet. Das resultierende Rohprodukt wird durch präparative TLC unter Verwendung von Dichlormethan-Methanol (10 : 1) als Entwicklungslösung gereinigt und anschließend durch Sephadex LH-20-Chromatographie unter Verwendung von n-Hexan-Dichlormethan-Methanol (2 : 7,5 : 2,5) als Elutionsmittel, wodurch die gewünschte Verbindung 5-A als amorphes Pulver erhalten wird. 35,2 mg (79,6%).

_D

²⁸

¹

₃

Beispiele 2 bis 15
Die folgenden Verbindungen werden durch Umsetzung der Verbindung 4' mit dem entsprechenden Phenethylaminderivat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten. In der folgenden Tabelle sind die mit einem Stern gekennzeichneten Verbindungen (d. h. Beispiele 2, 4–6, 9–11 und 13) lediglich zu Vergleichszwecken angegeben.

Claims

Peptidderivat der folgenden Formel oder ein Salz davon
worin A für ein Wasserstoffatom steht und B für eine Phenylgruppe, die mit einer o-Fluorgruppe oder Hydroxylgruppe substituiert ist, oder eine Heteroarylgruppe steht.