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DE19757250A1 - Insulin-like growth factor binding protein und seine Verwendung - Google Patents

Insulin-like growth factor binding protein und seine Verwendung

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DE19757250A1
DE19757250A1 DE19757250A DE19757250A DE19757250A1 DE 19757250 A1 DE19757250 A1 DE 19757250A1 DE 19757250 A DE19757250 A DE 19757250A DE 19757250 A DE19757250 A DE 19757250A DE 19757250 A1 DE19757250 A1 DE 19757250A1
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peptides
acid sequence
amino acid
peptide
peptides according
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DE19757250A
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Wolf-Georg Prof Dr Forssmann
Ludker Dr Staendker
Hossein Dr Mostafavi
Maik Dr Obendorf
Lothar Dr Kling
Hans-Georg Dr Opitz
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FORSSMANN WOLF GEORG PROF DR
Original Assignee
FORSSMANN WOLF GEORG PROF DR
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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften, Kom­ plexe der Peptide mit humanem Insulin-like growth factor I und II sowie die damit in Verbindung stehenden Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2 (IBP)
worin
R1 NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X1 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Amino­ säuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz um­ fassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosy­ lierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IBP.
Das Peptid weist zellproliferative und zellprotektive Eigen­ schaften auf.
Diese Peptide werden als Insulin-like growth factor binding protein (IBP) bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Peptide können Disulfidbrücken auf­ weisen, so daß sie der allgemeinen Formel
entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide an einer oder mehrerer der folgenden Positionen der Aminosäure­ sequenz ein Glycin auf. X2 an Position 4, X3 an Position 9, X4 an Position 4 oder 5 und/oder X4 an Position 9 oder 10.
Es ist weiter bevorzugt, daß X1 an der Position 8 L oder V ist und/oder X1 an der Position 11 L oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird R1 aus­ gewählt aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP und/oder
X1 ausgewählt aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV,
X2 ausgewählt aus
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKRK,
DHRGFYRKR und/oder
X3 ausgewählt aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP und/oder
x4 ausgewählt aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS und/oder
R2 ausgewählt aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.
Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid­ synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikro­ organismen erhalten.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Komplexe der erfindungsgemäßen Peptide mit humanem Insulin-like growth factor-I und/oder humanem Insulin-like growth factor-II sowie dessen physiologisch aktiven Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphory­ lierte und/oder glykosylierte Derivate.
Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, Antisense­ nucleotide, die unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure binden, die für das erfindungsgemäße Peptid kodiert, Antikörper, die an die erfindungsgemäßen Peptide binden, Inhibitoren, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptiden hemmen, Inhibitoren, die die Expression von IBP hemmen.
Die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren eignen sich insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be­ handlung der Über- oder Unterexpression von IBP, zur Be­ handlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Ent­ zündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neo­ plastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.
Die erfindungsgemäßen Peptide und die Komplexe der Peptide mit Insulin-like growth factor weisen eine zellproliferative Aktivität auf.
Die erfindungsgemäßen Peptide regulieren die Freisetzung des IGF-I und IGF-II aus den Komplexen an ihrem Wirkort. Die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide mit IGF-I oder IGF-II verlängert die biologische Halbwertzeit und damit die Verfügbarkeit der letztgenannten. Die durch Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte Hypoglykämie wird durch die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide ver­ hindert.
Die erfindungsgemäßen Peptide haben desweiteren eine wachs­ tumsfördernde Wirkung auf Knochenzellen und führen zu einer Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstums­ hormonen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungs­ gemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisense­ nucleotide, Antikörper und Inhibitoren in einer pharma­ zeutisch üblichen Darreichungsform in einem Arzneimittel enthalten. Sie eignen sich zur oralen, intravenösen, intra­ muskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 µg bis 1 g pro Darreichungs­ einheit pro Tag.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und/oder Antisense­ nucleotide eignen sich auch zur Herstellung eines Medikamen­ tes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Gen­ erkrankungen.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält die erfindungs­ gemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisense­ nucleotide, Antikörpern und/oder Inhibitoren.
Bevorzugterweise enthält das Diagnostikmittel poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid, wobei die Antikörper fluoreszenz- oder radioaktiv-markiert sein können, um in den bekannten ELISA oder RIA eingesetzt werden zu können. Jedoch kann das Diagnostikmittel auch Nucleinsäuren enthalten, die in modifizierter oder markierter Form in dem Fachmann bekannten Tests wie PCR oder Finger- Printing zum Einsatz kommen.
Die erfindungsgemäßen Diagnostikmittel eignen sich insbe­ sondere zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammato­ rischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptids bzw. seine Komplexes wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1 Aufreinigung und peptidchemische Analyse des IBP-2-13
Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch ein Reinigungsver­ fahren ausgehend vom humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses patentierte Verfahren (Forssmann, W.-G. (1988), Offenlegungs­ schrift DE 36 33 707 A1), welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat entwickelt wurde, wurde in modifizierter Form auch zur Aufreinigung des Peptidkomplexes eingesetzt.
Hämofiltrat-Batch-Extraktion
Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.
800 bis 1000 l Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 l/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 l/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftragung der insgesamt 1.000 l Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6,8 bis 7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 l Eluat er­ reicht.
Erste Präparative Auftrennung
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5000 bis 10 000 l Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2,7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 l/min während des Auftrages, 0,5 bis 1 l während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden).
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 l erreicht werden.
Zweite präparative Auftrennung
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleich­ zeitigen Entsalzung über eine Reverse Phase Chromatographie getrennt.
Chromatographiebedingungen
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm 10 × 12,5 cm (FineLine 100)
Fluß: 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0 bis 60% Puffer B in 5 Säulenvolumen.
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A ge­ spült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay ge­ testet. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert.
Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie
Die im Assay bioaktiven Fraktionen 11 und 12 aus pH-Pool V wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufge­ trennt. Die Fraktionen 21 bis 25 enthielten die erfindungs­ gemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 42 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des Gradienten
Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie
Die bioaktiven Fraktionen 21 bis 25 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über die gleiche semipräparative Reverse Phase Säule aufgetrennt. Als Laufmittel wurde jedoch Methanol verwendet. Die Fraktion 24 enthielt die erfindungs­ gemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA, 20% Methanol
Puffer B: 0,1% TFA, 100% Methanol
Gradient: 0 bis 20% B in 6,5 min, 20 bis 80% B in 55 min, 80 bis 100% B in 13 min
Fluß: 30 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des Gradienten
Kationenaustauschchromatographie
Die bioaktiven Fraktionen 19 und 20 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Kationenaustauscher-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 45 bis 47 enthielten die er­ findungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 1 cm × 5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Pepkat, Biotek 5 µm, 300 Å
Puffer A: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0
Puffer B: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0, 1,5 M NaCl
Gradient: 0 bis 50% B in 50 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 3 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad Sprint
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des Gradienten
Analytische Reverse-Phase Chromatographie
Die bioaktiven Fraktionen 45 bis 47 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden sukzessive in mehreren identischen Läufen über eine Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 56 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 1 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1 min ab Start des Gradienten
Zweite Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie
Die bioaktive Fraktion 56 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter auf­ gereinigt.
Chromatographiebedingungen
Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 15 bis 50% B in 75 min, 75 bis 100% B in 10 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Dritte Analytische Reverse-Phase C3-Chromatographie
Ein Teil der bioaktiven Fraktion 45 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde direkt der Massen- und Sequenzanalyse unterzogen. Ein anderer Teil wurde reduziert und alkyliert (wie unter Beispiel 2 beschrieben) und dann auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.
Chromatographiebedingungen
Säule: 0,1 cm × 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Zorbax RP-C3, 5 µm, 300 Å Analytik verwandt wird, deutlich.
Massenbestimmungen
Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten und modifizierten Peptide wurden auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer durch­ geführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden als
IGF-II, 7471 Da;
IBP-2, 12 681 Da;
IBP-2, 12 865 Da
bestimmt.
Bestimmung von Cysteinen/Modifizierung von Peptiden
Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivati­ sierung, zum Beispiel nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid- Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm × 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekular­ gewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämofiltrat sechs Cysteine enthalten, welche zudem mit drei Disulfidbrücken unter­ einander verbunden sind.
Sequenzbestimmung
Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die carboxamido­ methylierten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert.
Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergaben sich folgende N-terminale Sequenzen:
IBP-2-13, MW 12 681
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13 045)
Aminosäuren
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV . . .
IBP-2-13, MW 12 865
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13 223)
Aminosäuren
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV . . .
IGF-II, MW 7471
Aminosäuren
AYRPSETLCGGEL. . . .
Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des MALDI-TOF-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programm­ pakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzt eine hundert­ prozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Amino­ säuren des humanen IBP-2 bzw. zur Aminosäuresequenz von IGF-II.
IBP-2 wurde bisher als ein 34 kD großes Bindungsprotein be­ schrieben, dessen vollständige Sequenzanalyse durch Analyse der zugehörigen cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), Seiten 2497 bis 2502) erfolgte. IGF-II und auch IGF-I, welches ebenfalls an IBP-2 bindet, wurden dagegen in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon umfangreich beschrieben (als Review: Rechler, M.M., & Nissley, S.P. (1990) Insulin-like growth factors In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, M.B., Roberts, A.B. eds.), Seiten 263 bis 367, Springer-Verlag, Berlin).
Beispiel 2 Bestimmung der biologischen Aktivität des IGF/IBP-2-13
Die Isolierung des IGF/IBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Überlebensassay der PC-12 (Pheochromocytbm-Zellen)-Zellinie. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Auf­ reinigung unterzogen.
Der Assay mißt das Überleben der Zellen, nachdem sie serum­ frei gehalten wurden, indem 24 Stunden nach Serumentzug die Aktivität mitochondrialer Enzyme bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt.
In 96 Loch-Platten werden 10 000 PC-12 Zellen pro Loch in serumfreien Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 20 Stunden später wird die Überlebensrate der Zellen mittels eines Wst-1 Substrats gemessen. Dieses Substrat wird von mitochondrialen Enzymen umgesetzt. Die entstehende Farbstoffintensität wird bei 405 nm im ELISA- Keader gemessen, die Referenzwellenlänge liegt dabei bei über 600 nm.
Der IGF/IBP-2-13 Komplex besitzt in dosisabhängigerweise eine überlebensförderende Wirkung auf PC-12 Zellen. Diese Zellen entsprechen neuronalen Vorläuferzellen, so daß man davon aus­ gehen kann, das IGF/IBP-2-13 ein neuroprotektiver Faktor ist.
Beispiel 3 Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptids IBP-4-11
Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptid IBP-4-11 erfolgte bis zur Stufe der zweiten präparativen Auftrennung völlig analog zu der unter Beispiel 1 beschriebenen Auf­ reinigung des IBP-2-13. Die weitere Aufreinigung erfolgte durch
Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie
Die im Assay bioaktive Fraktion 33 aus pH-Pool IV wurden über eine analytische Keverse-Phase-Säule aufge­ trennt. Die Fraktion 34 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 1 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C4 5 ym, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0-80% B in 80 min, 80-100% B in 10 min
Fluß: 2,5 ml/min
Detektion: 230 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1 min ab Start des Gradienten
Massenbestimmungen
Die Massenbestimmungen wurden auf einem Elektrospray-Massen­ spektrometer durchgeführt. Die Molekülmasse des Peptids wurden als
IBP-4-11, 11 344 Da
bestimmt.
Sequenzbestimmung
Die Amionsäuresequenz des aufgereinigten nativen, biologisch aktiven Peptids IBP-4-11 wurde wie unter Beispiel 1 auf der Seite 13 beschrieben durchgeführt.
Es ergab sich die folgende N-terminale Sequenz:
IBP-4-11, MW 11 344 Da
KVNGAPREDARPVPQGSXQSELIIRALERL . . . .
Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des Elektrospray-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programm­ pakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäuredatenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundert­ prozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Amino­ säuren des humanen IBP-4.
Bestimmung der Schwefelbrückenverknüpfung des IBP-4-11
Die Analyse der Schwefelbrückenverknüpfung erfolgte, indem das native Peptid IBP-4-11 parallel in zwei verschiedenen Ansätzen mit den Endoproteasen Chymotrypsin und Arg-C ge­ spalten wurde. Die erhaltenen Spaltfragmente wurden dann mittels analytischer Reverse Phase Chromatographie von­ einander getrennt und der Molekularmassen- und Sequenzanalyse unterzogen. Folgende Fragmente, welche jeweils zwei Cysteine und eine Schwefelbrücke enthalten, wurden erhalten:
Daraus ist ersichtlich, daß im nativen IBP-4-11 die Schwefel­ brücken zwischen Cystein 1 und 2, zwischen Cystein 3 und 4 sowie zwischen Cystein 5 und 6 ausgebildet sind.
Beispiel 4 Bestimmung der biologischen Aktivität des IBP-4-11
Die Isolierung des IBP-4-11 erfolgte anhand seiner bio­ logischen Aktivität in einem Proliferationsassay mit primären Knochenzellen (Osteoblasten), die zunächst aus Schädeldecken von Rattenembryonen isoliert werden.
Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 3 be­ schriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen. Der Assay mißt die Proliferation der Zellen, indem 48 oder 72 Stunden nach Zugabe der Fraktionen der Einbau von radioaktivem Thymidin, also die DNA-Syntheserate, bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Transforming Growth Factor­ beta (TGF-beta) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 5000 Osteoblasten-Zellen pro Loch in serumhaltigem Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 48 oder 72 Stunden später wird die Proliferations­ rate (DNA-Syntheserate) der Zellen mittels der Zugabe und des Einbaus von radioaktivem Thymidins gemessen. Das Peptid IBP-4-11 besitzt in dosisabhängigerweise eine proliferations­ förderende Wirkung auf diese primären Osteoblasten. Diese Zellen entsprechen typischen Knochenzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IBP-4-11 ein osteoanaboler Faktor ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (24)

1. Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2 (IBP)
worin
R1 NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X1 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Amino­ säuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähig­ keit des IBP.
2. Peptide gemäß Anspruch 1 mit Disulfidbrücken der Formel
3. Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X2 an Position 4 seiner Aminosäure­ sequenz ein Glycin aufweist und/oder X3 an der Position 9 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 4 oder 5 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 9 oder 10 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist.
4. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß X1 an der Position 8 oder V ist und/oder X1 an der Position 11 oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
5. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß K1 ausgewählt wird aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP.
6. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß X1 ausgewählt wird aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV.
7. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß X2 ausgewählt wird aus
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKKK,
DHRGFYRKR.
8. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß X3 ausgewählt wird aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP.
9. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß X4 ausgewählt wird aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS.
10. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ausgewählt wird aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.
11. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid­ synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikro­ organismen.
12. Komplexe von Peptiden gemäß mindestens einem der An­ sprüche 1 bis 10 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor-I, MW 7649) oder hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor-II, MW 7491) sowie dessen biologisch aktive Fragmenten und/oder Derivaten, ins­ besondere amidierten, acetylierten, sulfatierten, phosphorylierten und/oder glykosylierten Derivaten.
13. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.
14. Antisensenucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es unter stringenten Bedingungen eine Nucleinsäuresequenz bindet, die für ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.
15. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 bindet.
16. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die bio­ logische Aktivität von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 hemmt.
17. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Ex­ pression von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 hemmt.
18. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexen gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Unterexpression von IBP.
19. Verwendung von Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß An­ spruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Überexpression IBP.
20. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der An­ sprüche 1 bis 10, Komplexen gemäß Anspruch 12, Nuclein­ säuren gemäß Anspruch 13, Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 zur Behandlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachs­ tumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.
21. Arzneimittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexe gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 in einer pharmazeutisch üblichen Dar­ reichungsform zur oralen, intravenösen, intramusku­ lären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
22. Verwendung der Nucleinsäure gemäß Anspruch 13 und/oder der Antisensenucleotide gemäß Anspruch 14 zur Her­ stellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.
23. Diagnostikmittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexe gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, Antisense­ nucleotide gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß An­ spruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 sowie weitere Hilfs­ mittel.
24. Verwendung der Diagnostikmittel gemäß Anspruch 23 zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflamma­ torischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
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