DE102018107224A1

DE102018107224A1 - Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten

Info

Publication number: DE102018107224A1
Application number: DE102018107224.4A
Authority: DE
Inventors: Heiko Schuster; Franziska Hoffgaard; Jens FRITSCHE; Oliver Schoor; Toni Weinschenk; Chih-Chiang Tsou; Daniel Kowalewski
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2019-08-22
Also published as: US11141437B2; CL2021000841A1; US20230241114A1; US10695374B2; US10869896B2; US20200323916A1; US11357797B2; US10772915B2; US20200179453A1; US20230241109A1; US20200323911A1; CL2020002123A1; US20200171091A1; US20210145886A1; AU2022202512A1; US11147839B2; US20210052653A1; US11020434B2; US20200323906A1; US10888584B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen zur Verwendung in immuntherapeutischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Zell-Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die zum Beispiel als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren, oder um T-Zellen ex vivo zu stimulieren und Patienten zu verabreichen. Peptide, die an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, oder Peptide als solche, können auch Ziele von Antikörpern, löslichen T-Zell-Rezeptoren und anderen Bindungsmolekülen sein.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen zur Verwendung in immuntherapeutischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Zell-Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die zum Beispiel als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren, oder um T-Zellen ex vivo zu stimulieren und Patienten zu verabreichen. Peptide, die an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, oder Peptide als solche, können auch Ziele von Antikörpern, löslichen T-Zell-Rezeptoren und anderen Bindungsmolekülen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuartigen Peptidsequenzen und deren Variante, die von Molekülen der HLA-Klasse-I menschlicher Tumorzellen abgeleitet sind, welche in Impfstoffkompositionen zur Auslösung von antitumoralen Immunantworten, oder als Targets für die Entwicklung von pharmazeutisch / immunologisch aktiven Verbindungen und Zellen verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gehörte Krebs 2012 zu den vier bedeutendsten nicht übertragbaren tödlichen Krankheiten weltweit. Im selben Jahr wurden Darmkrebs, Brustkrebs und Atemwegskrebs unter den Top 10 der Todesursachen in Ländern mit hohem Einkommen aufgeführt (http://www.who.int/mediacentre/factsheets /fs310/en/).
Epidemiologie

Im Jahr 2012 wurden weltweit 14,1 Millionen neue Krebsfälle, 32,6 Millionen krebskranke Patienten (innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose) und 8,2 Millionen Krebstodesfälle geschätzt (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013). Tabelle 1 und Tabelle 2 geben einen Überblick über die geschätzte Inzidenz, die 5-jährige Prävalenz und die Mortalität bei verschiedenen Krebsarten, die für die vorliegende Intervention relevant sind, weltweit bzw. in ausgewählten Regionen. Tabelle 1: Geschätzte Inzidenz, 5-jährige Prävalenz und Mortalität verschiedener Krebsarten (erwachsene Bevölkerung, beide Geschlechter) weltweit im Jahr 2012 (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

Krebs	Inzidenz	Häufigkeit (5-jährig)	Mortalität
Gehirn, Nervensystem	256213	342914	189382
Brust	1671149	6232108	521907
Kolorektum	1360602	3543582	693933
Speiseröhre	455784	464063	400169
Niere	337860	906746	143406
Leukämie	351965	500934	265471
Leber	782451	633170	745533
Lunge	1824701	1893078	1589925
Melanom	232130	869754	55488
Eierstock	238719	586624	151917
Pankreas	337872	211544	330391
Prostata	1094916	3857500	307481
Magen	951594	1538127	723073
Gallenblase	178101	205646	142823
Blase	429793	1319749	165084
Gebärmutterkörper	319605	1216504	76160
Non-Hodgkin-Lymphom	385741	832843	199670

Tabelle 2: Geschätzte Inzidenz, 5-jährige Prävalenz und Mortalität verschiedener Krebsarten (erwachsene Bevölkerung, beide Geschlechter) in den USA, EU-28, China und Japan im Jahr 2012 (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

Krebs	Inzidenz	Häufigkeit (5-jährig)	Mortalität
Gehirn, Nervensystem	135884	172497	100865
Brust	837245	3358034	197279
Kolorektum	845797	2334303	396066
Speiseröhre	294734	323723	255752
Niere	226733	631350	83741
Leukämie	178296	309154	129500
Leber	513172	441007	488485
Lunge	1274568	1394735	1107546
Melanom	163043	636364	32999
Eierstock	108947	270204	65130
Pankreas	220842	134864	214886
Prostata	681069	2586710	136419
Magen	615641	1076332	447735
Gallenblase	106202	118588	81391
Blase	270335	879140	91553
Gebärmutterkörper	199211	765101	41734
Non-Hodgkin-Lymphom	205955	515154	90092

Innerhalb der Gruppen Hirnkrebs, Leukämie und Lungenkrebs konzentriert sich die aktuelle Erfindung insbesondere auf Glioblastom (GBM), chronische lymphatische Leukämie (CLL) und akute myeloische Leukämie (AML), nicht-kleinzelligen und kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC und SCLC).
GBM ist die häufigste Malignität des zentralen Nervensystems mit einer altersbereinigten Inzidenzrate von 3,19 pro 100.000 Einwohner in den USA. GBM hat eine sehr schlechte Prognose mit einer 1-jährigen Überlebensrate von 35% und einer 5-jährigen Überlebensrate von weniger als 5%. Männliches Geschlecht, Alter und ethnische Zugehörigkeit scheinen Risikofaktoren für GBM zu sein (Thakkar et al., 2014).
CLL ist die am weitesten verbreitete Leukämie in der westlichen Welt, wo sie etwa ein Drittel aller Leukämien ausmacht Die Inzidenzraten sind in den USA und Europa ähnlich und geschätzte neue Fälle liegen bei etwa 16.000 pro Jahr. CLL ist bei Kaukasiern häufiger anzutreffen als bei Afrikanern, seltener bei Hispanoamerikanern und Indianern und selten bei Asiaten. Bei Menschen asiatischer Herkunft sind die CLL-Inzidenzraten um das Dreifache niedriger als bei Kaukasiern (Gunawardana et al., 2008). Die fünfjährige Gesamtüberlebenszeit für Patienten mit CLL beträgt etwa 79%.
AML ist die zweithäufigste Form der Leukämie, die sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern diagnostiziert wird. Die geschätzte Anzahl der neuen Fälle beträgt etwa 21.000 pro Jahr in den USA. Die fünfjährige Überlebensrate von Menschen mit AML liegt bei etwa 25%.
Lungenkrebs ist die weltweit häufigste Krebsart und in vielen Ländern die häufigste Todesursache durch Krebs. Lungenkrebs wird in kleinzelligen Lungenkrebs und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs unterteilt. NSCLC umfasst die histologischen Typen Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom und Großzellkarzinom und macht 85% aller Lungenkrebsarten in den USA aus. Die Inzidenz von NSCLC ist eng mit der Raucherprävalenz verbunden, einschließlich aktueller und ehemaliger Raucher, und die Fünfjahresüberlebensrate betrug 15% (World Cancer Report, 2014; Molina et al., 2008).
Therapie
Akute myeloische Leukämie (AML)
Die AML-Behandlung gliedert sich in zwei Phasen: Induktionstherapie und Post-Remissions-/ „Konsolidierungstherapie“. Die Induktionstherapie wird zur Induktion der Remission durchgeführt und besteht aus einer kombinatorischen Chemotherapie. Die Konsolidierungstherapie besteht aus einer zusätzlichen Chemotherapie oder einer hämatopoetischen Zelltransplantation (HCT) (Showel and Levis, 2014).
Die häufigsten Chemotherapeutika zur Behandlung von AML sind Cytarabin, Daunorubicin, Idarubicin und Mitoxantron, gefolgt von Cladribin, Fludarabin und verschiedenen Anderen. Azacitidin und Decitabin (DNA-Hypomethylierungsmittel) werden nun zur Behandlung von MDS/AML eingesetzt. Die Behandlung von APL/AML M3 umfasst all-trans Retinsäure (ATRA) und Arsentrioxid (ATO) (National Cancer Institute, 2015).
„Standardbehandlung“ für AML wird als „3+7“ bezeichnet: 3 Tage Idarubicin oder Daunorubicin und 7 Tage Cytarabin, gefolgt von mehreren ähnlichen Kursen zur Erreichung einer vollständigen Remission (CR) (Estey, 2014). Die Entscheidung zwischen Standardtherapie und klinischer Studie basiert auf der Risikostratifizierung.
FLT3-Mutationen sind mit einer aggressiven Art von AML und einer schlechten Prognose verbunden. Sie treten oft zusammen mit NPM1- und DNMT3a (DNA-Methyltransferase 3A)-Mutationen auf. NPM1 (Nucleophosmin)-Mutationen sind ein günstiger prognostischer Indikator, wenn sie nicht zusammen mit FLT3-Mutationen gefunden werden. CEPBA (CCAAT-enhancer-binding protein alpha/ C/EBPα)-Mutationen bieten einen Überlebensvorteil bei doppelten oder homozygoten CEBPA-Mutationen ohne Wildtyp-Expression. Veränderte Methylierungsmuster in einer Vielzahl von Genen werden durch Mutationen in der Isocitratdehydrogenase (IDH1 und IDH2) und DNMT3A verursacht. Diese Mutationen sind mit einem schlechten Überleben verbunden.
AML-Fälle mit günstigem Risikokaryotyp bestehen aus APL (akute promyelozytische Leukämie) und CBF (corebinding factor) Leukämien. APL-Fälle sind mit der Fusion des myeloischen Transkriptionsfaktors PML zur Retinsäurerezeptor-Untereinheit alpha (RARA) verbunden. Die PML/RARA-Translokation ist eine günstige prognostische Mutation. CBF-Leukämiefälle zeigen Translokationen, an denen eine Untereinheit von CBF beteiligt ist. In t(8;21) ist CBF-alpha mit dem ETO-Gen fusioniert. In inv(16) ist CBF-beta mit der schweren Kette des glatten Muskelmyosins fusioniert. CBF-Translokationen sind sehr günstige prognostische Mutationen.
AML-Fälle mit ungünstigem Risikokaryotyp sind durch einen komplexen Karyotyp gekennzeichnet, der chromosomalen Aberrationen wie Translokationen, unausgewogene Umlagerungen und Gewinne/Verluste ganzer Chromosomen beinhaltet. Sie sind mit einer schlechten Prognose verbunden.
MDS/AML-Fälle entwickeln sich aus myelodysplastischen Syndromen und haben eine schlechtere Prognose als andere AML-Subgruppen (Showel and Levis, 2014).
Neben den oben genannten prognostischen Faktoren können zusätzliche molekulare Marker oder Markerkombinationen verwendet werden, um die Prognose in bestimmten zytogenetischen Untergruppen zu beurteilen:

TP53-Mutationen sind die ungünstigste genetische Veränderung in der AML. NPM1 mutiert und FLT3 WT zusammen mit einer Mutation in IDH1 oder IDH2 wird als günstig angesehen Ungünstige Faktoren sind eine partielle Tandemduplikation im MLL-Gen, ein mutiertes TET2-Gen, FLT3 ITD + zusammen mit einer Mutation in DNMT3a und CEBPA, FLT3 ITD - zusammen mit einer Mutation in ASXL1 oder PHF6 und CD25-Expression (stammzellähnliche „Signatur“ und schlechteres Ergebnis). Das Vorhandensein von CKIT-Mutationen ermöglicht es, die Prognose von Patienten mit einem günstigen inv(16) oder t(8;21) in einen mittleren Bereich zu überführen. SPARC wird bei NK-Patienten (normaler Karyotyp) mit ungünstiger Genexpressionssignatur hochreguliert und in Verbindung mit der günstigen NPM1-Mutation - herunterreguliert. miR-155-Überexpression vermittelt eine schlechte Prognose bei NK AML. Differentiell methylierte Regionen (DMRs) sind prognostisch, wenn sie in Verbindung mit mehreren Genen gefunden werden (FLT3-Mutation, NPM1-Mutation). In diesem Fall ist eine geringere Expression mit einer besseren Prognose verbunden (Estey, 2014).

Brustkrebs (BRCA)
Die Standardbehandlung bei Brustkrebspatientinnen hängt von verschiedenen Parametern ab: Tumorstadium, Hormonrezeptorstatus und HER2-Expressionsmuster. Zur Standardtherapie gehört die komplette chirurgische Resektion des Tumors mit anschließender Strahlentherapie. Die Chemotherapie mit hauptsächlich Anthracyclinen und Taxanen kann vor oder nach der Resektion begonnen werden. In fortgeschrittenen Stadien können zusätzliche Chemotherapeutika wie Alkylierungsmittel, Fluorpyrimidine, Platinanaloga etc. als Mono- oder Kombinationstherapie eingesetzt werden. Patienten mit HER2-positiven Tumoren erhalten neben den Chemotherapeutika auch den Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab. Der VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)-Inhibitor, Bevacizumab, wirkt synergistisch mit der Monotherapie mit Paclitaxel oder Capecitabin. Die Chemotherapie ist bei Patienten mit Östrogen- oder Progesteronrezeptor-positiven Tumoren in der Regel weniger effizient. Für diese Patienten umfasst das Standardschema eine endokrine Therapie mit Tamoxifen (Erstlinientherapie) oder Aromatasehemmern (zweite Therapie) nach der ersten Chemotherapie (S3-Leitlinie Mammakarzinom, 2012).
Brustkrebs ist eine immunogene Krebsart und verschiedene Arten von infiltrierenden Immunzellen in Primärtumoren weisen eine ausgeprägte prognostische und prädiktive Bedeutung auf. Eine große Anzahl von Immuntherapie-Studien in frühen Erkrankungsphasen wurde an Brustkrebspatientinnen durchgeführt. Die meisten der abgeschlossenen Impfstudien zielten auf HER2- und Kohlenhydratantigene wie MUC-1 und zeigten eher enttäuschende Ergebnisse. Klinische Daten über die Auswirkungen der Immun-Checkpoint-Modifikation mit Ipilimumab und anderen T-Zell-aktivierenden Antikörpern bei Brustkrebspatientinnen werden gesammelt (Emens, 2012).
Cholangiokarzinom (CCC) und Gallenblasenadenokarzinom (GBC)
Das Cholangiokarzinom wird meist im fortgeschrittenen Stadium identifiziert, da es schwierig zu diagnostizieren ist. Die Symptome sind unspezifisch und die Diagnose des biliären Ursprungs bleibt schwierig, da es keinen spezifischen antigenen Marker gibt. Daher erfordert die Diagnose von CCC den klinischen und radiologischen Ausschluss von Metastasen von anderen Standorten. Steigende Werte von Serummarkern wie CA19-9 und CEA können bei Patienten mit zugrunde liegenden Lebererkrankungen hilfreich sein (World Cancer Report, 2014).
Die molekulare Karzinogenese des CCC umfasst viele bekannte Onkogene und Signalwege. Aktivierende KRAS-Mutationen, Funktionsverlustmutationen von TP53, FGFR2-Fusionsgenen, IDH1/2-Mutationen, Hypermethylierung von p16^INK4A und SOCS3, JAK-STAT-Aktivierung, Überexpression von EGFR/HER2, anomale MAPK/ERK-Aktivierung und c-Met-Überexpression kommen bei CCC häufig vor. Der Zusammenhang zwischen einer chronischen biliären Infektion und der CCC-Karzinogenese wird als die Aktivierung des IL-6/STAT3-Weges angesehen. IL-6 wird nicht nur von Tumorzellen sekretiert, die das Zellwachstum durch autokrine Mechanismen fördern, sondern es reguliert auch die Expression anderer Gene, wie beispielsweise EGFR (World Cancer Report, 2014). Die molekulare Stratifizierung auf der Grundlage dieser genetischen Anomalien ist jedoch nicht für den klinischen Einsatz bereit (Bridgewater et al., 2014).
Das Cholangiokarzinom ist schwer zu behandeln und meist tödlich. Die einzige kurative Behandlungsoption ist die komplette Resektion (R0). Leider sind nur etwa 30% der Tumore resektabel. Die meisten Tumore des Stadiums 0, I und II und einige Tumore des Stadiums III sind je nach ihrer genauen Position resektabel, während andere Tumore des Stadiums III und die meisten Tumore des Stadiums IV nicht resektabel sind (American Cancer Society, 2015a). Die 5-Jahres-Überlebensrate nach kurativer Resektion (R0) beträgt 40%. Es gibt keine Hinweise darauf, dass eine adjuvante Chemotherapie das 5-Jahres-Überleben nach einer Tumorresektion verlängert. Die Beteiligung des Lymphknotens ist bei einem Drittel der Patienten, die für eine chirurgische Behandlung in Frage kommen, vorhanden und mit einem schlechten operativen Ergebnis verbunden. Die 5-Jahres-Überlebensrate nach nicht-kurativer Resektion (R1) beträgt 20%. Aufgrund des prognostischen Wertes wird eine Lymphadenektomie der regionalen Lymphknoten empfohlen. Während N1 manchmal noch als für das chirurgische Management geeignet angesehen wird, ist die Operation bei N2 und M1 kontraindiziert (Bridgewater et al., 2014).
Ist eine Resektion des Tumors nicht möglich, sind die Behandlungsmöglichkeiten sehr begrenzt. Verschiedene palliative Chemotherapeutika wie 5-Fluorouracil, Gemcitabin, Cisplatin, Capecitabin, Oxaliplatin sind im Einsatz (American Cancer Society, 2015a). Standard der Pflege für die palliative Chemotherapie ist die Kombination von Gemcitabin und Cisplatin. Die mediane Überlebenszeit nach einer Chemotherapie beträgt lediglich 12 Monate.
Die Lebertransplantation kann bei Patienten mit nicht resektablen Tumoren im Frühstadium angezeigt sein, wird aber kontrovers diskutiert.
Die Wirksamkeit biologischer Therapien bei Gallenwegskrebs war gemischt. Medikamente, die auf das Wachstum von Blutgefäßen abzielen, wie Sorafenib, Bevacizumab, Pazopanib und Regorafenib, werden nun für die Behandlung von CCC untersucht. Darüber hinaus werden EGFR-orientierte Medikamente wie Cetuximab und Panitumumab in klinischen Studien in Kombination mit Chemotherapie eingesetzt (American Cancer Society, 2015a). Für die meisten bisher getesteten Medikamente wurden die Krankheitskontrolle und das Gesamtüberleben nicht signifikant verbessert, aber es laufen weitere klinische Studien.
Gallenblasenkrebs ist die häufigste und aggressivste Malignität des Gallenwegs weltweit. Unspezifisches klinisches Auftreten verzögert auch die Diagnose und führt dazu, dass nur 10% aller Patienten für eine Operation in Frage kommen. Aufgrund der anatomischen Komplexität des Gallensystems und der hohen Rezidivrate ist die Operation nur in wenigen Fällen heilbar. Die Risikofaktoren sind ähnlich wie bei CCC, aber GBC ist dreimal häufiger bei Frauen. Neben Gallenblasenerkrankungen sind Infektionen mit Salmonellen oder Helicobacter häufige Risikofaktoren. GBC ist bei Südamerikanern, indem, Pakistanis, Japanern und Koreanern verbreitet, während es in der westlichen Welt selten ist. Genetische Veränderungen in GBC sind wenig verstanden. Molekulare Veränderungen wie p53-Mutation, COX2-Überexpression, CDKN-Inaktivierung, KRAS-Mutationen, aber auch Mikrosatelliteninstabilität sollen an der GBC-Karzinogenese beteiligt sein (Kanthan et al., 2015).
Was die GBC betrifft, so sind nur 10% der Tumore resektabel und selbst mit Operation entwickeln sich bei den Meisten Metastasen , die Prognose ist noch schlechter als bei der CCC mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5%. Obwohl die meisten Tumore inoperabel sind, gibt es immer noch keine wirksame adjuvante Therapie (Rakic et al., 2014). Einige Studien zeigten, dass die Kombination von Chemotherapeutika oder die Kombination von gezielter Therapie (Anti-VEGFR/EGFR) mit Chemotherapie zu einem erhöhten Gesamtüberleben führte und viel versprechende Behandlungsmöglichkeiten für die Zukunft sein könnten (Kanthan et al., 2015).
Aufgrund der Seltenheit der Gallengangskarzinome im Allgemeinen gibt es nur wenige GBC- oder CCC-spezifische Studien, von denen die meisten alle Gallenwegskrebsarten umfassen. Dies ist der Grund, warum sich die Behandlung in den letzten Jahrzehnten nicht verbessert hat und die R0-Resektion nach wie vor die einzige kurative Behandlungsoption ist.
Chronische lymphatische Leukämie (CLL)
Während CLL derzeit nicht heilbar ist, zeigen viele Patienten nur ein langsames Fortschreiten der Erkrankung oder eine Verschlechterung der Symptome. Da die Patienten nicht von einem frühen Behandlungsbeginn profitieren, lautet der erste Ansatz „Beobachten und Warten“ (Richards et al., 1999). Für Patienten mit symptomatischen oder schnell fortschreitenden Erkrankungen stehen mehrere Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung. Dazu gehören Chemotherapie, gezielte Therapie, immunbasierte Therapien wie monoklonale Antikörper, chimäre AntigenRezeptoren (CARs) und aktive Immuntherapie sowie Stammzelltransplantationen.
Chemotherapeutische Medikamente, die zur CLL-Behandlung eingesetzt werden, sind meist Alkylierungsmittel wie Chlorambucil und Cyclophosphamid oder Purinanaloga wie Fludarabin. Die deutsche CLL-Studiengruppe (GCLLSG) CCL4 zeigte, dass die Kombinationstherapie Fludarabin/Cyclophosphamid der alleinigen Fludarabinbehandlung überlegen ist (vollständige Remission (CR) von 24% vs. 7%) (Eichhorst et al., 2006).
Ibrutinib und Idelalisib sind Kinase-Inhibitoren, die Moleküle in der B-Zell-Rezeptor-Signalkaskade angreifen. Ibrutinib hemmt Brutons Tyrosinkinase (BTK), eine für die B-Zell-Reifung wichtige, src-bezogene cytoplasmatische Tyrosinkinase, die für die Erst- oder Zweitlinientherapie verwendet wird (Byrd et al., 2013; O'Brien et al., 2014). Idelalisib ist ein PI3K-Delta-lnhibitor, der in Kombination mit Rituximab in refraktärer CLL verwendet wird (Furman et al., 2014).
Hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSCTs) können für Patienten mit schlechter Prognose in Betracht gezogen werden, z.B. Patienten mit Deletionen am Chromosom 17p (del 17p) oder p53-Mutationen. HSCTs können entweder allogen sein, bei denen die transplantierten Zellen von einer HLA-kompatiblen Person gespendet werden, oder autolog, bei denen die patienteneigenen Stammzellen nach einer Chemotherapie re-infundiert werden (Schetelig et al., 2008).
Monoklonale Antikörper werden häufig bei hämatologischen Malignitäten eingesetzt. Dies ist auf das Wissen um geeignete Antigene zurückzuführen, das auf der guten Charakterisierung von Oberflächenmolekülen der Immunzellen und der Zugänglichkeit von Tumorzellen in Blut oder Knochenmark basiert. Gemeinsame monoklonale Antikörper, die in der CLL-Therapie verwendet werden, zielen entweder auf CD20 oder CD52 ab. Rituximab, der erste monoklonale Anti-CD20-Antikörper, der ursprünglich von der FDA zur Behandlung von NHLs zugelassen wurde, wird heute in der CLL-Therapie eingesetzt Die kombinatorische Behandlung mit Rituximab/Fludarabin/Cyclophosphamid führt zu höheren CR-Raten und einem verbesserten Gesamtüberleben (OS) im Vergleich zur Kombination Fludarabin/Cyclophosphamid und ist zur bevorzugten Behandlungsoption geworden (Hallek et al., 2008). Ofatumomab zielt auf CD20 ab und wird zur Therapie von refraktären CLL-Patienten eingesetzt (Wierda et al., 2011). Obinutuzumab ist ein weiterer monoklonaler Anti-CD20-Antikörper, der in der Erstlinienbehandlung in Kombination mit Chlorambucil verwendet wird (Goede et al., 2014).
Alemtuzumab ist ein Anti-CD52-Antikörper, der zur Behandlung von Patienten mit chemotherapieresistenter Erkrankung oder Patienten mit schlechten prognostischen Faktoren wie del 17p oder p53-Mutationen eingesetzt wird (Parikh et al., 2011).
Neue monoklonale Antikörper gegen CD37 (Otlertuzumab, BI 836826, IMGN529 und (177)Lu-Tetulomab) oder CD40 (Dacetuzumab und Lucatumumab) und werden in präklinischen Studien getestet (Robak and Robak, 2014).
Mehrere abgeschlossene und laufende Studien basieren auf modifizierten autologen chimären Antigenrezeptor (CAR)-modifizierten T-Zellen mit CD19-Spezifität (Maus et al., 2014). Bisher zeigte nur die Minderheit der Patienten nachweisbare oder persistente CARs. Eine partielle Reaktion (PR) und zwei komplette Reaktionen (CR) wurden in den CAR-T-Zellversuchen von Porter et al. and Kalos et al. nachgewiesen (Kalos et al., 2011; Porter et al., 2011).
Die aktive Immuntherapie umfasst folgende Strategien: Gentherapie, vollständig modifizierte Tumorzellenimpfstoffe, DC-basierte Impfstoffe und tumorassoziierte Antigen-(TAA)-abgeleitete Peptidvakzine.
Ansätze in der Gentherapie nutzen autologe gentechnisch veränderte Tumorzellen. Diese B-CLL-Zellen werden mit immunstimulierenden Genen wie IL-2, IL-12, TNFalpha, GM-CSF, CD80, CD40L, LFA-3 und ICAM-1 transfiziert, um die Antigenpräsentation und die Aktivierung der T-Zellen zu verbessern (Carballido et al., 2012). Während spezifische T-Zell-Antworten und die Reduktion von Tumorzellen leicht zu beobachten sind, sind Immunantworten nur vorübergehend.
Mehrere Studien haben autologe DCs als antigenpräsentierende Zellen verwendet, um Antitumorreaktionen hervorzurufen. DCs wurden ex vivo mit tumorassoziierten Peptiden, vollständigem Tumorzelllysat und tumorabgeleiteter RNA oder DNA beladen. Eine andere Strategie nutzt ganze Tumorzellen für die Fusion mit DCs und die Erzeugung von DC-B-CLL-Zellhybriden. Transfizierte DCs initiierten sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zell-Antworten (Muller et al., 2004). Fusionshybride und DCs, die mit Tumorzelllysat oder apoptotischen Körpern beladen waren, erhöhten die tumorspezifischen CD8+ T-Zell-Antworten. Patienten, die eine klinische Reaktion zeigten, wiesen einen erhöhten IL-12-Serumspiegel und eine geringere Anzahl von Tregs auf (Palma et al., 2008).
Verschiedene Ansätze nutzen veränderte Tumorzellen, um CLL-spezifische Immunantworten zu initiieren oder zu erhöhen. Ein Beispiel für diese Strategie ist die Generierung von Triomazellen: B-CLL-Zellen sind mit Anti-Fc-Rezeptor-exprimierenden Hybridomzellen fusioniert, die eine Anti-APC-Spezifität aufweisen. Triomazellen induzierten CLL-spezifische T-Zell-Antworten in vitro (Kronenberger et al., 2008).
Eine weitere Strategie ist die Verwendung von bestrahlten autologen CLL-Zellen als Impfstoff mit Bacillus Calmette-Guerin als Adjuvans. Mehrere Patienten zeigten eine Senkung des Leukozytenspiegels oder eine stabile Erkrankung (Hus et al., 2008).
Neben isolierten CLL-Zellen wurde Vollblut von CLL-Patienten nach der Vorbereitung in einer Blutbehandlungseinheit als Impfstoff verwendet. Der Impfstoff löste CLL-spezifische T-Zellreaktionen aus und führte bei mehreren Patienten zu partiellen klinischen Reaktionen oder stabilen Erkrankungen (Spaner et al., 2005).
Mehrere TAAs werden in der CLL überexprimiert und sind für Impfungen geeignet. Diese umfassen Fibromodulin (Mayr et al., 2005), RHAMM/CD168 (Giannopoulos et al., 2006), MDM2 (Mayr et al., 2006), hTERT (Counter et al., 1995), das onkofetale Antigen-Immatur-Laminin-Rezeptor-ProteinOFAiLRP) (Siegel et al., 2003), Adipophilin (Schmidt et al., 2004), Survivin (Granziero et al., 2001), KW1 bis KW14 (Krackhardt et al., 2002) und die von Tumor-abgeleitete IgVHCDR3 Region (Harig et al., 2001; Carballido et al., 2012). Eine klinische Phase-I-Studie wurde mit dem von RHAMM abgeleiteten R3-Peptid als Impfstoff durchgeführt. 5 von 6 Patienten hatten nachweisbare R3-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten (Giannopoulos et al., 2010).
Kolorektales Karzinom (CRC)
Je nach Stadium des kolorektalem Karzinoms (CRC) stehen verschiedene Standardtherapien für Dickdarm- und Rektalkrebs zur Verfügung. Zu den Standardverfahren gehören Chirurgie, Strahlentherapie, Chemotherapie und gezielte Therapie bei CRC (Berman et al., 2015a; Berman et al., 2015b).
Die Entfernung des Tumors ist für die Behandlung von CRC unerlässlich. Anatomische Bedingungen unterscheiden sich bei Rektalkarzinomen von anderen CRCs, da sich das Rektum im Becken befindet und der Tumor schwer zugänglich sein kann. Gut differenzierte kleine Rektumtumore (Stadium T1) erfordern eine Exzision, aber keine weitere Behandlung mit Chemotherapie. Patienten mit Rektumtumoren höherer T-Stadien erhalten eine neoadjuvante Radiochemotherapie mit einem Fluoropyrimidin vor der vollständigen mesorektalen Exzision (TME) und der adjuvanten Chemotherapie. Für die chemotherapeutische Behandlung werden die Medikamente Capecitabin oder 5-Fluorouracil (5-FU) verwendet. Für die kombinatorische Chemotherapie wird ein Cocktail mit 5-FU, Leucovorin und Oxaliplatin (FOLFOX) empfohlen (Stintzing, 2014; Berman et al., 2015b).
Die Behandlung von Kolonkarzinomen umfasst eine radikale Hemikolektomie und Lymphknotenresektion. Im Frühstadium (UICC-Stadium I) ist keine zusätzliche Behandlung erforderlich. Patienten mit Tumoren des UICC-Stadiums II erhalten 5-FU oder Capecitabin. Die Behandlung von Patienten mit UICC-Stadium III umfasst die Arzneimittelkombinationen FOLFOX und XELOX (Capecitabin plus Oxaliplatin) (Berman et al., 2015a; Stintzing, 2014).
Metastatische, inoperable CRC werden mit chemotherapeutischen Cocktails wie FOLFIRI (5-FU, Leucovorin, Irinotecan), FOLFOX, FOLFOXIRI (5-FU, Irinotecan, Oxaliplatin), FOLFOX/ Capecitabin, FOLFOX/ Oxaliplatin, FOLFIRI/ Capecitabin und Irinotecan oder UFT (5-FU, Tegafur-Uracil) behandelt (Stintzing, 2014).
Neben Chemotherapeutika werden mehrere monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR, Cetuximab, Panitumumab) oder den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-A (VEGF-A, Bevacizumab) bei Patienten mit Erkrankungen auf späten Stadien verabreicht. Für die Zweitlinien- und Nachbehandlung können der Inhibitor für VEGF Aflibercept, der Tyrosinkinase-Inhibitor Regorafenib und der Thymidylat-Synthetase-Inhibitor TAS-102 und der DUTPase-Inhibitor TAS-114 verwendet werden (Stintzing, 2014; Wilson et al., 2014).
Neueste klinische Studien analysieren die aktive Immuntherapie als Behandlungsoption gegen CRC. Diese Strategien beinhalten die Impfung mit Peptiden aus tumorassoziierten Antigenen (TAAs), ganzen Tumorzellen, dendritischen Zellen (DC) und viralen Vektoren (Koido et al., 2013).
Peptidimpfstoffe sind bisher gegen das karzinoembryonale Antigen (CEA), Mucin 1, EGFR, das von den T-Zellen 3 (SART3) erkannte Plattenepithelkarzinom-Antigen, Betahumanes chorionisches Gonadotropin (beta-hCG), Wilms' Tumorantigen 1 (WT1), Survivin-2B, MAGE3, p53, Ringfingerprotein 43 und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 34 (TOMM34) oder mutiertes KRAS gerichtet. In mehreren klinischen Studien der Phase I und II zeigten Patienten antigenspezifische CTL-Reaktionen oder Antikörperproduktion. Im Gegensatz zu immunologischen Reaktionen profitierten viele Patienten auf klinischer Ebene nicht von Peptidimpfstoffen (Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).
Impfstoffe auf Basis dendritischer Zellen umfassen DCs, die entweder mit TAAbasierten Peptiden, Tumorzelllysaten, apoptotischen Tumorzellen oder Tumor-RNA- oder DC-Tumorzellfusionsprodukten gepulst werden. Während viele Patienten in Phase-I/II-Studien spezifische immunologische Reaktionen zeigten, hatte nur die Minderheit einen klinischen Nutzen (Koido et al., 2013).
Impfstoffe auf Basis ganzer Tumorzellen bestehen aus autologen Tumorzellen, die durch Bestrahlung oder durch Viren infiziert, bestrahlte Zellen, zur Sekretion von GM-CSF modifiziert sind. Die meisten Patienten zeigten in mehreren Phase-II/III-Studien keinen klinischen Nutzen (Koido et al., 2013).
Das Vaccinia-Virus oder das replikationsdefekte Vogelpockenvirus, das CEA sowie B7.1, ICAM-1 und LFA-3 kodiert, wurden in klinischen Studien der Phase I als Vehikel in viralen Vektorimpfstoffen eingesetzt. Eine andere Studie verwendete nicht replizierendes Kanarienpockenvirus, das CEA und B7.1 kodiert. Neben der Induktion von CEA-spezifischen T-Zellantworten zeigten 40% der Patienten objektive klinische Reaktionen (Horig et al., 2000; Kaufman et al., 2008).
Speiseröhrenkrebs (OSCAR)
Die primäre Behandlungsstrategie für Speiseröhrenkrebs hängt vom Tumorstadium und -ort, dem histologischen Typ und dem Gesundheitszustand des Patienten ab. Eine Operation allein ist nicht ausreichend, außer in einer kleinen Untergruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinom. Im Allgemeinen sollte die Operation mit einer prä- und postoperativen Chemotherapie oder einer präoperativen Radiochemotherapie kombiniert werden, während sich zeigte, dass die prä- oder postoperative Bestrahlung allein keinen Überlebensvorteil bietet. Chemotherapeutische Behandlungen umfassen Oxaliplatin plus Fluorouracil, Carboplatin plus Paclitaxel, Cisplatin plus Fluorouracil, FOLFOX und Cisplatin plus Irinotecan. Patienten mit HER2-positiven Tumoren sollten nach den Richtlinien für Magenkrebs behandelt werden, da randomisierte Daten für gezielte Therapien bei Speiseröhrenkrebs sehr begrenzt sind (Stahl et al., 2013).
Im Allgemeinen sind die meisten Arten von Speiseröhrenkrebs gut beherrschbar, wenn Patienten mit Frühstadiumstumoren auftreten, während der therapeutische Erfolg in späteren Stadien sehr begrenzt ist. So könnte die Entwicklung neuer Screening-Protokolle sehr effektiv sein, um die Mortalitätsraten bei Speiseröhrenkrebs zu reduzieren (World Cancer Report, 2014).
Die Immuntherapie könnte ein vielversprechender neuer Ansatz zur Behandlung von fortgeschrittenem Speiseröhrenkrebs sein. Mehrere krebsassoziierte Gene und Krebs-Testis-Antigene erwiesen sich bei Speiseröhrenkrebs als überexprimiert, darunter verschiedene MAGE-Gene, NY-ESO-1 und EpCAM (Kimura et al., 2007; Liang et al., 2005; Inoue et al., 1995; Bujas et al., 2011; Tanaka et al., 1997; Quillien et al., 1997). Diese Gene stellen sehr interessante Ziele für die Immuntherapie dar und die meisten von ihnen werden zur Behandlung anderer bösartiger Erkrankungen getestet (ClinicalTrials.gov, 2015). Darüber hinaus wurde die Hochregulation von PD-L1 und PD-L2 bei Speiseröhrenkrebs beschrieben, was mit einer schlechteren Prognose korrelierte. Somit könnten Patienten mit Speiseröhrenkrebs mit PD-L1-positiven Tumoren von der Anti-PD-L1-Immuntherapie profitieren (Ohigashi et al., 2005).
Klinische Daten zu immuntherapeutischen Ansätzen bei Speiseröhrenkrebs sind derzeit noch relativ selten, da nur eine sehr begrenzte Anzahl von klinischen Studien der frühen Phase abgeschlossen ist. Ein Impfstoff, bestehend aus drei Peptiden, die von drei verschiedenen Cancer-Testis-Antigenen (TTK-Proteinkinase, Lymphozytenantigen 6-Komplex Locus K und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)-II mRNA-Bindungsprotein 3) abgeleitet sind, wurde Patienten mit fortgeschrittenem Speiseröhrenkrebs in einer Phase-I-Studie mit moderaten Ergebnissen verabreicht. Intratumorale Injektion von aktivierten T-Zellen nach in vitro Challenge mit autologen malignen Zellen löste bei vier von elf Patienten in einer Phase-I/II-Studie vollständige oder partielle Tumorreaktionen aus (Toomey et al., 2013). Ein Impfstoff, bestehend aus drei Peptiden, die von drei verschiedenen Cancer-Testis-Antigenen (TTK-Proteinkinase, Lymphozytenantigen 6-Komplex Locus K und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)-II mRNA-Bindungsprotein 3) abgeleitet sind, wurde Patienten mit fortgeschrittenem Speiseröhrenkrebs in einer Phase-I-Studie mit moderaten Ergebnissen verabreicht. Intratumorale Injektion von aktivierten T-Zellen nach in vitro Challenge mit autologen malignen Zellen und Interleukin 2 löste bei vier von elf Patienten in einer Phase I/II-Studie vollständige oder partielle Tumorreaktionen aus (Toh et al., 2000; Toh et al., 2002). Weitere klinische Studien werden derzeit durchgeführt, einschließlich der adoptiven zellulären Therapie (NCT01691625, NCT01691664, NCT01691664, NCT01795976, NCT02096614, NCT02457650) Impfstrategien (NCT01143545, NCT01522820) und Anti-PD-L1-Therapie (NCT02340975), um die Auswirkungen verschiedener Immuntherapien auf Speiseröhrenkrebs zu untersuchen (ClinicalTrials.gov, 2015).
Magenkrebs (GC)
Die Wand des Magens besteht aus 3 Gewebeschichten: der Schleimhaut (innerste Schicht), der Muscularis (mittlere Schicht) und der Serosa (äußerste Schicht). Magenkrebs (GC) entsteht in den Zellen entlang der Schleimhautschicht und breitet sich durch die äußeren Schichten aus, wenn er wächst. Vier Arten der Standardtherapie werden verwendet. Die Behandlung von Magenkrebs kann endoskopische oder chirurgische Operation, Chemotherapie, Strahlentherapie oder Radiochemotherapie beinhalten. Eine Operation ist die primäre Behandlung und die einzige kurative Behandlung für Magenkrebs. Da die Frühstadien von Magenkrebs meist asymptomatisch sind, wird die Krankheit in der Regel in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. Bei metastasierendem Magenkrebs wurde bisher kein weltweit anerkanntes Standard-Chemotherapie-Kombinationsschema etabliert. Die Kombination von 5-FU und einem Platinanalog ist jedoch immer noch das weltweit am weitesten verbreitete Referenzschema, obwohl 5-FU durch Capecitabin oder Irinotecan und Cisplatin durch Oxaliplatin ersetzt werden kann. Zusätzlich können dreifach kombinierte Therapien, bestehend aus Cisplatin, 5-FU und Docetaxel oder bei HER-2-überexprimierenden Tumoren Cisplatin, 5-FU und Trastuzumab angewendet werden (Leitlinie Magenkarzinom, 2012).
Die Wirksamkeit der derzeitigen Therapieschemata für fortgeschrittene GC ist schlecht, was zu niedrigen 5-Jahres-Überlebensraten führt. Die Immuntherapie könnte ein alternativer Ansatz sein, um das Überleben von GC-Patienten zu verbessern. Der adoptive Transfer von tumorassoziierten Lymphozyten und zytokininduzierten Killerzellen, peptidbasierten Impfstoffen gegen HER2/neu, MAGE-3 oder vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptoren 1 und 2 und dendritischen zellbasierten Impfstoffen gegen HER2/neu zeigte vielversprechende Ergebnisse in klinischen GC-Studien. Die Hemmung des Immun-Checkpoints und optimierte (engineered) T-Zellen könnten zusätzliche therapeutische Optionen darstellen, die derzeit in präklinischen und klinischen Studien untersucht werden (Matsueda and Graham, 2014).
Glioblastom (GBM)
Die Therapiemöglichkeiten für das Glioblastom (WHO Grad IV) sind sehr begrenzt. Nach den Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Neurologie umfasst die Standardtherapie bei jungen Patienten die Resektion oder Biopsie des Tumors, die fokale Strahlentherapie und die Chemotherapie mit Temozolomid. Alternative Chemotherapieschemata bestehen aus CCNU/Iomustin oder einer Kombination von Procarbazin mit CCNU und Vincristin (PCV). Bei älteren Patienten wird eine Resektion oder Biopsie des Tumors nicht empfohlen. Diese Patienten erhalten eine Chemo- oder Strahlentherapie, abhängig vom Methylierungszustand des O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase-(MGMT)-Promotors. Der negative Methylierungszustand ist ein Indikator für die fokale Strahlentherapie, während der positive Methylierungszustand ein Indikator für die Temozolomidbehandlung mit oder ohne fokale Strahlentherapie ist. Die Rückfalltherapie umfasst erneut die Resektion sowie die Chemo- und Strahlentherapie. In den USA, Kanada und der Schweiz ist die Behandlung mit Bevacizumab (Anti-VEGF-Antikörper) auch für die Rückfalltherapie zugelassen (Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 2014).
Verschiedene immuntherapeutische Ansätze werden für die Behandlung von GB untersucht, einschließlich Immun-Checkpoint-Blokade, Impfung und adoptiver Transfer von modifizierten T-Zellen.
Antikörper, die gegen inhibitorische T-Zell-Rezeptoren oder deren Liganden gerichtet sind, konnten die T-Zell-vermittelte Anti-Tumor-Immunantwort bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich Melanomen und Blasenkrebs, effizient verbessern. Die Auswirkungen von T-Zell-aktivierenden Antikörpern wie Ipilimumab und Nivolumab werden daher in klinischen GB-Studien untersucht, aber erste Daten deuten auf autoimmunbedingte Nebenwirkungen hin.
Derzeit werden verschiedene Impfstrategien für GBM-Patienten untersucht, darunter peptidbasierte Impfstoffe, Hitzeschockproteinimpfstoffe, autologe Tumorzellimpfstoffe, Impfstoffe auf Basis dendritischer Zellen und Impfstoffe auf Basis viraler Proteine. In diesen Ansätzen werden Peptide, die von GBM-assoziierten Proteinen wie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Variante III (EGFRvlll) oder Hitzeschockproteinen oder dendritischen Zellen abgeleitet sind, die mit autologen Tumorzelllysat- oder Zytomegalievirus-Komponenten gepulst werden, eingesetzt, um eine antitumorale Immunantwort bei GBM-Patienten zu induzieren. Mehrere dieser Studien zeigen gute Sicherheits- und Verträglichkeitsprofile sowie vielversprechende Wirksamkeitsdaten.
Der adoptive Transfer von gentechnisch veränderten T-Zellen ist ein zusätzlicher immuntherapeutischer Ansatz zur Behandlung von GBM. Verschiedene klinische Studien untersuchen derzeit die Sicherheit und Wirksamkeit von chimären Antigenrezeptoren mit T-Zellen gegen HER2, IL-13-Rezeptor alpha 2 und EGFRvlll (Ampie et al., 2015).
Leberkrebs (HCC)
Die Krankheitsbewältigung hängt vom Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnose und vom Allgemeinzustand der Leber ab. Nach Möglichkeit werden Teile der Leber (partielle Hepatektomie) oder das ganze Organ (Leberresektion) operativ entfernt. Insbesondere Patienten mit kleinen oder vollständig resezierbaren Tumoren sind für eine Lebertransplantation qualifiziert.
Wenn eine Operation keine Behandlungsoption ist, stehen verschiedene andere Therapien zur Verfügung. Für die Tumorablation wird eine Sonde in die Leber injiziert und der Tumor durch Radio- oder Mikrowellen oder Kryotherapie zerstört. Bei Embolisationsverfahren wird die Blutversorgung des Tumors durch mechanische oder chemische Mittel blockiert. Hochenergetische Radiowellen können in der Strahlentherapie zur Zerstörung des Tumors eingesetzt werden.
Die Chemotherapie gegen HCC umfasst Kombinationen von Doxorubicin, 5-Fluorouracil und Cisplatin für die systemische Therapie und Doxorubicin, Floxuridin und Mitomycin C für Infusionen in die Leberarterie. Die meisten HCC weisen jedoch eine hohe Resistenz gegen Chemotherapeutika auf (Enguita-German and Fortes, 2014).
Die therapeutischen Möglichkeiten bei fortgeschrittenem, nicht resezierbarem HCC beschränken sich auf Sorafenib, einen Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor (Chang et al., 2007; Wilhelm et al., 2004). Sorafenib ist das einzige systemische Medikament, das die Überlebensdauer um etwa 3 Monate verlängert und stellt derzeit die einzige experimentelle Behandlungsoption für solche Patienten dar (Chapiro et al., 2014; Llovet et al., 2008).
In letzter Zeit wurde eine begrenzte Anzahl von Immuntherapie-Studien für HCC durchgeführt. Zytokine wurden verwendet, um Untergruppen von Immunzellen zu aktivieren und/oder die Immunogenität des Tumors zu erhöhen (Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). Andere Studien haben sich auf die Infusion von tumorinfiltrierenden Lymphozyten oder aktivierten peripheren Blutlymphozyten konzentriert (Shi et al., 2004; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000).
Bisher wurden nur wenige therapeutische Impfstudien durchgeführt. Butterfield et al. führten zwei Studien mit Peptiden aus Alpha-Fetoprotein (AFP) als Impfstoff oder mit AFP-Peptiden ex vivo beladenen DCs durch (Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). In zwei verschiedenen Studien wurden autologe dendritische Zellen (DCs) ex vivo mit autologem Tumorlysat (Lee et al., 2005) oder Lysat der Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 (Palmer et al., 2009) gepulst. Bisher haben Impfstudien nur begrenzte Verbesserungen der klinischen Ergebnisse gezeigt.
Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC)
Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC) sind heterogene Tumore mit Unterschieden in Epidemiologie, Ätiologie und Behandlung (Economopoulou et al., 2016). Diese Tumore werden nach dem Bereich kategorisiert, in dem sie beginnen. Dazu gehören Krebserkrankungen der Mundhöhle (Lippen, vordere zwei Drittel der Zunge, Zahnfleisch, Auskleidung der Wangen und Lippen, Mundboden, harter Gaumen), des Rachens (Nasenrachen, Oropharynx einschließlich weichem Gaumen, Zungengrund, Mandeln, Hypopharynx), Kehlkopf, Nasennebenhöhlen und Nasen- und Speicheldrüsen (National Cancer Institute, 2015).
Die Behandlung des frühen HNSCC beinhaltet eine Einzelmodaltherapie mit Operation oder Bestrahlung (World Health Organization, 2014). Fortgeschrittene Krebserkrankungen werden durch eine Kombination aus Chemotherapie mit Operation und/oder Strahlentherapie behandelt.
Die Chemotherapie umfasst hauptsächlich Cisplatin oder Medikamentenkombinationen, die Cisplatin wie Docetaxel, Cisplatin, Fuorouracil (5-FU) oder Cisplatin, Epirubicin, Bleomycin oder Cisplatin, 5-FU enthalten. Isotretinoin (13-cis-Retinsäure) wird bei dem SCC der Mundhöhle und SCC des Kehlkopfes täglich für 1 Jahr verwendet, um die Inzidenz von Zweittumoren zu reduzieren (National Cancer Institute, 2015).
HNSCC gilt als immunsuppressive Krankheit, die durch die Dysregulation immunkompetenter Zellen und eine beeinträchtigte Zytokinsekretion gekennzeichnet ist (Economopoulou et al., 2016). Immuntherapeutische Strategien unterscheiden sich zwischen HPV-negativen und HPV-positiven Tumoren.
Bei HPV-positiven Tumoren stellen die viralen Onkoproteine E6 und E7 gute Ziele dar, da sie kontinuierlich von Tumorzellen exprimiert werden und für die Aufrechterhaltung des Transformationsstatus von HPV-positiven Krebszellen unerlässlich sind. Mehrere Impftherapien werden derzeit bei HPV-positivem HNSCC untersucht, darunter DNA-Impfstoffe, Peptidimpfstoffe und Impfstoffe mit dendritischen Zellen (DCs). Darüber hinaus untersucht eine laufende klinische Phase-II-Studie die Wirksamkeit der Lymphodepletion und anschließend die autologe Infusion von TILs bei Patienten mit HPV-positiven Tumoren (Economopoulou et al., 2016).
Bei HPV-negativen Tumoren werden derzeit mehrere immuntherapeutische Strategien eingesetzt und untersucht. Der chimäre monoklonale IgG1 Anti-EGFR-Antikörper Cetuximab wurde von der FDA in Kombination mit einer Chemotherapie als Standardbehandlung der ersten Wahl für wiederkehrenden/metastatischen HNSCC zugelassen. Andere monoklonale Anti-EGFR-Antikörper, einschließlich Panitumumab, Nimotuzumab und Zalutumumab, werden in HNSCC evaluiert. Mehrere Immun-Checkpoint-Inhibitoren werden in klinischen Studien auf ihren Einsatz bei HNSCC untersucht. Sie beinhalten die folgenden Antikörper: Ipilimumab (anti-CTLA-4), Tremelimumab (anti-CTLA-4), Pembrolizumab (anti-PD-1), Nivolumab (anti-PD-1), Durvalumab (anti-PD-1), anti-KIR, Urelumab (anti-CD137) und anti-LAG-3.
Zwei klinische Studien mit HNSCC-Patienten untersuchten den Einsatz von mit p53-Peptiden beladenen DCs oder apoptotischen Tumorzellen. Die immunologischen Reaktionen waren zufriedenstellend und die Nebenwirkungen akzeptabel.
Es wurden mehrere Studien mit der adoptiven T-Zelltherapie (ACT) durchgeführt. T-Zellen wurden entweder gegen bestrahlte autologe Tumorzellen oder EBV induziert. Die Ergebnisse bei der Krankheitskontrolle und dem Gesamtüberleben waren vielversprechend (Economopoulou et al., 2016).
Melanom (MEL)
Die Standardtherapie beim Melanom ist die komplette chirurgische Resektion mit umgebendem gesundem Gewebe. Ist die Resektion nicht vollständig oder gar nicht möglich, erhalten die Patienten eine Primärbestrahlung, die in fortgeschrittenem Stadium (Stadium IIB/C und IIIA-C) mit Interferon-alpha kombiniert werden kann. In Deutschland gibt es kein Standardtherapieprogramm für die Behandlung von Patienten mit Spätstadium und metastasierendem Melanom. Daher sollten Patienten mit Spätstadium und metastasierendem Melanom im Rahmen einer klinischen Studie behandelt werden. Die therapeutischen Möglichkeiten umfassen Monochemotherapie, Polychemotherapie und gezielte Therapien mit spezifischen Inhibitoren. Dacarbazin, Temozolamid und Fotemustin werden derzeit in in einer Studie als Monochemotherapie eingesetzt. In polychemotherapeutischen Studien werden verschiedene Kombinationen von Chemotherapeutika untersucht: das CarboTax-Schema (Carboplatin plus Paclitaxel), das GemTreo-Schema (Gemcitabin plus Treosulfan), das DVP-Schema (Dacarbazin plus Vindesin plus Cisplatin), das BHD-Schema (Carmustin plus Hyroxyharnstoff plus Dacarbazin) und das BOLD-Schema (Bleomycin plus Vincristin plus Lomustin plus Darcarbazin). Darüber hinaus wird die Chemotherapie in Kombination mit Ipilimumab und die Verabreichung spezifischer BRAF-, c-KIT- und N-RAS-Inhibitoren an Patienten mit Mutationen innerhalb der jeweiligen Gene derzeit in klinischen Studien evaluiert (S3-Leitlinie Melanom, 2013).
Die Verbesserung der Immunantwort gegen Tumore scheint eine vielversprechende Strategie für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms zu sein. In den USA sind der Immun-Checkpoint-Inhibitor Ipilimumab sowie die BRAF-Kinase-Inhibitoren Vemurafenib und Dabrafenib und der MEK-Inhibitor Trametinib bereits für die Behandlung von fortgeschrittenem Melanom zugelassen. Beide Ansätze erhöhen die Immunität des Patienten gegen Tumore - Ipilimumab direkt, indem es die T-Zell-Hemmung und die Kinase-Hemmer indirekt reduziert, indem sie die Expression von Melanozytendifferenzierungsantigenen erhöht. Weitere Checkpoint-Inhibitoren (Nivolumab und Lambrolizumab) werden derzeit in klinischen Studien mit ersten ermutigenden Ergebnissen untersucht. Darüber hinaus werden verschiedene Kombinationstherapien, die auf die Immunantwort gegen Tumore abzielen, in klinischen Studien getestet, darunter Ipilimumab plus Nivolumab, Ipilimumab plus ein gp100-basierter Peptidvakzin, Ipilimumab plus Dacarbazin, Ipilimumab plus IL-2 und Iplimumab plus GM-CSF (Srivastava and McDermott, 2014).
Bei Patienten mit fortgeschrittenem Melanom wurden bereits mehrere verschiedene Impfansätze evaluiert. Bisher zeigten Phase-III-Studien eher enttäuschende Ergebnisse und die Impfstrategien müssen eindeutig verbessert werden. Daher zielen neue klinische Studien wie die OncoVEX GM-CSF-Studie oder die DERMA-Studie darauf ab, die klinische Wirksamkeit zu verbessern, ohne die Verträglichkeit zu beeinträchtigen (http://www.cancerresearchuk.org).
Der adoptive T-Zell-Transfer ist vielversprechend für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms. In vitro expandierte autologe Tumor-infiltrierende Lymphozyten sowie T-Zellen, die einen hochaffinen T-Zell-Rezeptor für das Cancer-Testis-Antigen NY-ESO-1 beherbergen, hatten signifikante positive und geringe toxische Effekte bei der Übertragung auf Melanompatienten. Leider haben T-Zellen mit hochaffinen T-Zell-Rezeptoren für die melanozytenspezifischen Antigene MART1 und gp100 und das Cancer-Testis-Antigen MAGEA3 in klinischen Studien erhebliche toxische Effekte hervorgerufen. So hat der adoptive T-Zell-Transfer ein hohes therapeutisches Potenzial, aber die Sicherheit und Verträglichkeit dieser Behandlungen muss weiter erhöht werden (Phan and Rosenberg, 2013; Hinrichs and Restifo, 2013).
Non-Hodgkin-Lymphom (NHL)
Von NHL gibt es mehr als 60 Subtypen. Die drei häufigsten Subtypen sind das diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL, der häufigste Subtyp), das follikuläre Lymphom (FL, der zweithäufigste Subtyp) und das kleinzellige lymphatische Lymphom/chronische lymphatische Lymphom (SLL/CLL, der dritthäufigste Subtyp). DLBCL, FL und SLL/CLL stehen für etwa 85% der NHL (Li et al., 2015).
Die Diagnose von NHL wird an einer exzisionalen Biopsie eines abnormalen Lymphknotens oder einer Inzisionsbiopsie eines beteiligten Organs durchgeführt. Neben der Immunohistochemie werden Zytogenetik, Molekulargenetik und fluoreszierende Hybridisierung (FISH) in situ zur Klärung der Diagnose eingesetzt (Armitage, 2007).
Entscheidend für die Prognose und Therapieentscheidung ist die Unterscheidung zwischen indolenten NHL-Typen und aggressiven NHLs. Indolente NHLs schreiten langsam voran, haben eine gute Prognose und reagieren im Frühstadium auf Strahlentherapie, Chemotherapie und Immuntherapie, sind aber im fortgeschrittenen Stadium nicht heilbar. Aggressive NHLs schreiten schnell voran, reagieren aber auf eine intensive Kombinationschemotherapie (National Cancer Institute, 2015). Die Behandlung von NHL hängt vom histologischen Typ und Stadium ab (National Cancer Institute, 2015):

Eine spontane Tumorregression kann bei Lymphompatienten beobachtet werden. Daher ist die aktive Immuntherapie eine Therapieoption (Palomba, 2012).

Eine wichtige Impfoption sind Id-Impfstoffe. B-Lymphozyten exprimieren Oberflächenimmunglobuline mit einer spezifischen Aminosäuresequenz in den variablen Regionen ihrer schweren und leichten Ketten, die für jeden Zellklon (= Idiotyp, Id) einzigartig ist. Der Idiotyp fungiert als tumorassoziiertes Antigen.
Es wurden drei klinische Phase-III-Studien durchgeführt (Biovest, Genitope, Favrille). In zwei Studien erhielten die Patienten Rituximab. GM-CSF wurde in allen drei Studien verabreicht. Biovest verwendete hybridomproduziertes Protein, Genitope und Favrille verwendeten rekombinantes Protein. In allen drei Studien wurde der Id mit KLH konjugiert. Nur Biovest zeigte ein signifikantes Ergebnis.
Zu den anderen Impfstoffen als Id gehören die Cancer-Testis-Antigene MAGE, NY-ESO1 und PASD-1, das B-Zell-Antigen CD20 oder zelluläre Impfstoffe. Die zuletzt genannten bestehen aus DCs, die mit apoptotischen Tumorzellen gepulst sind, Tumorzelllysat, DC-Tumorzellfusion oder DCs, die mit Tumor-abgeleiteter RNA gepulst sind.
Die In-situ-Impfung umfasst die Impfung mit intratumoralem CpG in Kombination mit Chemotherapie oder bestrahlten Tumorzellen, die in Gegenwart von GM-CSF gezüchtet werden, und die Gewinnung/Expansion/Re-Infusion von T-Zellen.
Die Impfung mit Antikörpern, die immunologische Checkpoints verändern, setzt sich zusammen aus
anti-CD40, anti-OX40, anti-41BB, anti-CD27, anti-GITR (Agonist-Antikörper, die die Anti-Tumor-Reaktion direkt verstärken) oder anti-PD1, anti-CTLA-4 (blockierende Antikörper, die den Checkpoint hemmen und die Immunreaktion behindern würden). Beispiele sind Ipilimumab (anti-CTLA-4) und CT-011 (anti-PD1) (Palomba, 2012).
Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC)
Die Behandlungsmöglichkeiten beruhen auf den Typus (kleinzellig oder nicht-kleinzellig) und dem Krebsstadium und umfassen Operation, Strahlentherapie, Chemotherapie und gezielte (targeted) biologische Therapien, wie beispielsweise Bevacizumab, Erlotinib und Gefitinib. Für lokalisierte Krebserkrankungen ist eine Operation normalerweise die Behandlung der Wahl. Neue Studien deuten darauf hin, dass die Überlebensrate bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs im frühen Stadium durch Chemotherapie nach einer Operation verbessert wird. Da die Krankheit normalerweise zum Zeitpunkt der Diagnose schon gestreut hat, werden oft Strahlentherapie und Chemotherapie, manchmal in Verbindung mit einer Operation, angewandt (S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011a).
Um die Therapiemöglichkeiten für NSCLC zu erweitern, wurden oder werden verschiedene immuntherapeutische Ansätze untersucht. Während die Impfung mit L-BLP25 oder MAGEA3 bei NSCLC-Patienten keinen durch Vakzin vermittelten Überlebensvorteil zeigte, zeigte ein allogener Zelllinienimpfstoff vielversprechende Ergebnisse in klinischen Studien. Darüber hinaus laufen derzeit weitere Impfstudien gegen Ganglioside, den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors und mehrere andere Antigene. Eine alternative Strategie zur Verbesserung der antitumoralen T-Zellantwort des Patienten besteht darin, hemmende T-Zell-Rezeptoren oder deren Liganden mit spezifischen Antikörpern zu blockieren. Das therapeutische Potenzial mehrerer dieser Antikörper, darunter Ipilimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, MPDL3280A und MEDI-4736, wird derzeit in NSCLC in klinischen Studien untersucht (Reinmuth et al., 2015).
Eierstockkrebs (OC)
Die chirurgische Resektion ist die Haupttherapie des frühen und fortgeschrittenen Eierstockkarzinoms. Das Ziel ist die vollständige Entfernung der Tumormasse im gesunden umliegenden Gewebe. Nach der chirurgischen Entfernung folgt eine systemische Chemotherapie mit Platinanaloga, mit Ausnahme von sehr niedriggradigen Eierstockkrebserkrankungen (Stadium IA, Grad 1), bei denen eine postoperative Chemotherapie nicht angezeigt ist. In fortgeschrittenem Stadium, Eierstockkrebs, umfasst die Erstlinien-Chemotherapie eine Kombination von Carboplatin mit Paclitaxel, die durch Bevacizumab ergänzt werden kann. Die Standardbehandlung bei platinresistenten Eierstockkrebsarten besteht aus einer Monotherapie mit einem der folgenden Chemotherapeutika: pegyliertes liposomales Doxorubicin, Topotecan, Gemcitabin oder Paclitaxel (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).
Die Immuntherapie scheint eine vielversprechende Strategie zur Verbesserung der Behandlung von Eierstockkrebspatienten zu sein, da das Vorhandensein von proinflammatorischen, tumorinfiltrierenden Lymphozyten, insbesondere CD8-positiven T-Zellen, mit einer guten Prognose korreliert und T-Zellen, die spezifisch für tumorassoziierte Antigene sind, aus Krebsgewebe isoliert werden können.
Daher wird viel wissenschaftlicher Aufwand in die Erforschung verschiedener Immuntherapien bei Eierstockkrebs gesteckt. Eine beträchtliche Anzahl von präklinischen und klinischen Studien wurde bereits durchgeführt, weitere Studien laufen derzeit. Klinische Daten liegen für die Zytokintherapie, die Vakzinierung, die Behandlung mit monoklonalen Antikörpern, den adoptiven Zelltransfer und die Immunmodulation vor.
Die Zytokintherapie mit Interleukin-2, Interferon-alpha, Interferon-gamma oder Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor zielt darauf ab, die eigene Anti-Tumor-Immunantwort des Patienten zu verstärken, und diese Behandlungen haben bereits vielversprechende Ergebnisse in kleinen Studienkohorten gezeigt.
Impfstudien der Phasen I und II mit einzelnen oder mehreren Peptiden, die von mehreren tumorassoziierten Proteinen (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, Wilms tumor-1) stammen, oder ganzen Tumorantigenen, die von autologen Tumorzellen stammen, zeigten gute Sicherheits- und Verträglichkeitsprofile, aber nur geringe bis moderate klinische Effekte.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch tumorassoziierte Proteine erkennen, sollen die immunzellvermittelte Abtötung von Tumorzellen verbessern. Die Anti-CA-125-Antikörper Oregovomab und Abagovomab sowie der Anti-EpCAM-Antikörper Catumaxomab erzielten in Phase-II und III-Studien vielversprechende Ergebnisse. Im Gegensatz dazu konnte der Anti-MUC1-Antikörper HMFG1 in einer Phase-III-Studie das Überleben nicht deutlich verbessern.
Ein alternativer Ansatz verwendet monoklonale Antikörper, um an Wachstumsfaktor- und Überlebensrezeptoren auf Tumorzellen zu zielen und sie zu blockieren. Während die Verabreichung von Trastuzumab (Anti-HER2/neu-Antikörper) und MOv18 und MORAb-003 (Anti-Folatrezeptor-Alpha-Antikörper) den Patienten mit Eierstockkrebs nur einen begrenzten klinischen Nutzen brachte, scheint die Zugabe von Bevacizumab (Anti-VEGF-Antikörper) zur Standardchemotherapie bei fortgeschrittenem Eierstockkrebs vorteilhaft zu sein.
Der adoptive Transfer von Immunzellen erzielte heterogene Ergebnisse in klinischen Studien. Der adoptive Transfer von autologen, in vitro expandierten, tumorinfiltrierenden T-Zellen erwies sich in einer Pilotstudie als vielversprechender Ansatz. Im Gegensatz dazu führte die Übertragung von T-Zellen, die einen für den Folatrezeptor-alpha spezifischen chimären Antigenrezeptor enthalten, in einer Phase-I-Studie nicht zu einer signifikanten klinischen Reaktion. Dendritische Zellen, die mit Tumorzelllysat oder tumorassoziierten Proteinen in vitro gepulst wurden, zeigten eine Verbesserung der antitumoralen T-Zellantwort bei dem Transfer, aber das Ausmaß der T-Zellaktivierung korrelierte nicht mit klinischen Effekten. Der Transfer von natürlichen Killerzellen verursachte in einer Phase-II-Studie signifikante Toxizitäten.
Die intrinsische Anti-Tumor-Immunität sowie die Immuntherapie werden durch eine immunsuppressive Mikroumgebung des Tumors behindert. Um dieses Hindernis zu überwinden, werden immunmodulatorische Medikamente wie Cyclophosphamid, Anti-CD25-Antikörper und pegyliertes liposomales Doxorubicin in Kombination mit Immuntherapie getestet. Die zuverlässigsten Daten liegen derzeit für Ipilimumab vor, einen Anti-CTLA4-Antikörper, der die T-Zell-Aktivität erhöht. Es wurde gezeigt, dass Ipilimumab signifikante Anti-Tumor-Wirkungen bei Patienten mit Eierstockkrebs auslöst (Mantia-Smaldone et al., 2012).
Bauchspeicheldrüsenkrebs (PACA)
Die Therapiemöglichkeiten für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs sind sehr begrenzt. Ein großes Problem für eine effektive Behandlung ist das typischerweise fortgeschrittene Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnose. Darüber hinaus ist Bauchspeicheldrüsenkrebs recht resistent gegen Chemotherapeutika, die durch das dichte und hypovaskuläre desmoplastische Tumorstroma verursacht werden können.
Nach den Richtlinien der Deutschen Krebsgesellschaft, der Deutschen Krebshilfe und der Vereinigung der wissenschaftlichen medizinischen Fachgesellschaften in Deutschland ist die Resektion des Tumors die einzig mögliche kurative Behandlungsoption. Eine Resektion wird empfohlen, wenn der Tumor auf die Bauchspeicheldrüse beschränkt ist oder wenn Metastasen auf benachbarte Organe beschränkt sind. Eine Resektion wird nicht empfohlen, wenn sich der Tumor auf entfernte Stellen ausgebreitet hat. Nach der Resektion folgt eine adjuvante Chemotherapie mit Gemcitabin oder 5-Fluorouracil +/- Leucovorin für sechs Monate (S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
Patienten mit inoperablen Tumoren im fortgeschrittenen Stadium können mit einer Kombination aus Chemotherapie und Strahlenchemotherapie behandelt werden (S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
Das Standardregime für die palliative Chemotherapie ist Gemcitabin, entweder als Monotherapie oder in Kombination mit dem EGF-Rezeptortyrosinkinase-Inhibitor Erlotinib. Alternative Optionen sind eine Kombination aus 5-Fluorouracil, Leucovorin, Irinotecan und Oxaliplatin, auch bekannt als FOLFIRINOX-Protokoll, oder die Kombination von Gemcitabin mit Nab-Paclitaxel, die in der MPACT-Studie eine überlegene Wirkung im Vergleich zur Gemcitabin-Monotherapie gezeigt hat (Von Hoff et al., 2013; S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
Die gezielte Behandlung des Tumorstromas stellt einen Ansatz zur Entwicklung neuer Therapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs dar. Das typischerweise dichte und hypovaskuläre Stroma könnte als Barriere für Chemotherapeutika dienen und lieferte Signale, die die Tumorproliferation und -invasion sowie die Erhaltung der Krebsstammzellen fördern. So wurden verschiedene präklinische und klinische Studien konzipiert, um die Auswirkungen der Stromaldepletion und Inaktivierung zu analysieren (Rucki and Zheng, 2014).
Als weitere innovative und vielversprechende Alternative zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs werden Impfstrategien untersucht. Peptidbasierte Impfstoffe gegen KRAS-Mutationen, reaktive Telomerase, Gastrin, Survivin, CEA und MUC1 wurden bereits in klinischen Studien untersucht, teilweise mit vielversprechenden Ergebnissen. Darüber hinaus zeigten klinische Studien mit dendritischen zellbasierten Impfstoffen, allogenen GM-CSF-sekretierenden Impfstoffen und Algenpantucel-L bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs ebenfalls positive Auswirkungen der Immuntherapie. Weitere klinische Studien zur Untersuchung der Wirksamkeit verschiedener Impfprotokolle laufen derzeit (Salman et al., 2013).
Prostatakrebs (PRCA)
Die therapeutische Strategie bei Prostatakrebs hängt im Wesentlichen vom Stadium des Krebses ab. Bei lokal begrenztem, nicht metastasierendem Prostatakrebs bieten sich Behandlungsmöglichkeiten wie aktive Überwachung (Warten und Beobachten), vollständige chirurgische Resektion der Prostata und lokale hoch dosierte Strahlentherapie mit oder ohne Brachytherapie an. Bei Hochrisikopatienten stellen die hormonelle Ablationstherapie und die postoperative lokale Strahlentherapie weitere Möglichkeiten dar. Standardbehandlungen zur Behandlung von metastasierendem Prostatakrebs umfassen auch die komplette chirurgische Resektion der Prostata, lokale Hochdosisstrahlung und hormonelle Ablationstherapie. Tumore, die nicht auf hormonellen Entzug reagieren, werden als kastrationsresistente Prostatakarzinome (CRPC) bezeichnet. CRPC-Patienten erhalten Docetaxel, Abirateron und den auf dendritischen Zellen basierten Impfstoff Sipuleucel-T. Knochenmetastasen werden mit Radium-223 allein oder einer Kombination aus Radium-223, Docetaxel oder Abiteron mit Bisphosphonaten oder Denosumab behandelt (S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 2014).
Der auf dendritischen Zellen basierte Impfstoff Sipuleucel-T war der erste Krebsimpfstoff, der von der FDA zugelassen wurde. Aufgrund des positiven Einflusses auf das Überleben bei Patienten mit CRPC wird viel Aufwand in die Entwicklung weiterer Immuntherapien gesteckt. Was die Impfstrategien betrifft, so zeigten der Peptidimpfstoff Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-TRICOM, der personalisierte Peptidimpfstoff PPV, der DNA-Impfstoff pTVG-HP und der GM-CSF-exprimierende Ganzzellimpfstoff GVAX vielversprechende Ergebnisse in verschiedenen klinischen Studien. Darüber hinaus zeigten die anderen als Sipuleucel-T, auf dendritischen Zellen basierten Impfstoffe, nämlich BPX-101 und DCVAC/Pa, dass sie bei Prostatakrebspatienten klinische Reaktionen hervorriefen. Immun-Checkpoint-Inhibitoren wie Ipilimumab und Nivolumab werden derzeit in klinischen Studien als Monotherapie sowie in Kombination mit anderen Behandlungen, einschließlich Androgenentzugstherapie, lokaler Strahlentherapie, PSA-TRICOM und GVAX, untersucht. Die immunmodulatorische Substanz Tasquinimod, die in einer Phase-II-Studie die Progression deutlich verlangsamt und das progressionsfreie Überleben erhöht hat, wird derzeit in einer Phase-III-Studie weiter untersucht. Lenalidomid, ein weiterer Immunmodulator, induzierte vielversprechende Effekte in klinischen Studien der frühen Phase, konnte aber das Überleben in einer Phase-III-Studie nicht verbessern. Trotz dieser enttäuschenden Ergebnissen laufen weitere Lenalidomid-Studien (Quinn et al., 2015).
Nierenzellkarzinom (RCC)
Die Erstbehandlung ist in den meisten Fällen eine teilweise oder vollständige Entfernung der betroffenen Niere(n) und bleibt die Hauptstütze der kurativen Behandlung (Rini et al., 2008). Für die Erstlinienbehandlung von Patienten mit schlechtem prognostischem Score empfehlen mehrere Krebsorganisationen und - gesellschaften die Rezeptortyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) Sunitinib und Pazopanib, den monoklonalen Antikörper Bevacizumab in Kombination mit Interferon-α (IFN-α) und den mTOR-Inhibitor Temsirolimus. Basierend auf den vom US-amerikanischen NCCN sowie der europäischen EAU und ESMO ausgearbeiteten Richtlinien werden die TKIs Sorafenib, Pazopanib oder kürzlich - Axitinib als Zweitlinientherapie bei RCC-Patienten empfohlen, bei denen eine vorherige Therapie mit Zytokinen nicht erfolgreich war (IFN-α, IL-2). Die NCCN-Richtlinien empfehlen auch Sunitinib in diesem Zusammenhang (High-Level-Evidenz nach NCCN-Kategorie I).
Everolimus und Axitinib werden als Zweitlinientherapie für diejenigen Patienten empfohlen, die nicht von einer VEGF-gerichteten Therapie mit TKIs nach den festgelegten Richtlinien profitiert haben.
Die bekannte Immunogenität von RCC hat die Grundlage für die Unterstützung der Verwendung von Immuntherapie- und Krebsimpfstoffen in fortgeschrittenem RCC gebildet. Die interessante Korrelation zwischen der Lymphozyten-PD-1-Expression und dem fortgeschrittenen Stadium, dem Grad und der Prognose sowie der selektiven PD-L1-Expression durch RCC-Tumorzellen und ihrer potenziellen Assoziation mit schlechteren klinischen Ergebnissen hat zur Entwicklung neuer Anti-PD-1/PD-L1-Wirkstoffe allein oder in Kombination mit antiangiogenen Medikamenten oder anderen immuntherapeutischen Ansätzen zur Behandlung von RCC geführt (Massari et al., 2015). Im fortgeschrittenen RCC wird in einer Phase-III-Krebsimpfstoffstudie namens TRIST-Studie untersucht, ob TroVax (ein Impfstoff, der das tumorassoziiertes Antigen 5T4 verwendet, mit einem Pockenvirus-Vektor), zusätzlich zur Standardbehandlung der ersten Wahl, das Überleben von Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder mRCC verlängert. Der mediane Überlebenswert war in keiner der beiden Gruppen mit 399 Patienten (54%), die in der Studie verblieben sind, erreicht worden, jedoch bestätigt die Analyse der Daten frühere klinische Ergebnisse, was zeigt, dass TroVax sowohl immunologisch aktiv ist als auch, dass es eine Korrelation zwischen der Stärke der 5T4-spezifischen Antikörperreaktion und einem verbesserten Überleben gibt. Darüber hinaus gibt es mehrere Studien, die nach Peptidvakzinen mit Epitopen suchen, die im RCC überexprimiert sind.
Verschiedene Ansätze von Tumorimpfstoffen wurden untersucht. Studien mit Ganztumoransätzen, einschließlich Tumorzelllysaten, Fusionen von dendritischen Zellen mit Tumorzellen oder Ganztumor-RNA wurden bei RCC-Patienten durchgeführt, und Remissionen von Tumorläsionen wurden in einigen dieser Studien berichtet (Avigan et al., 2004; Holtl et al., 2002; Marten et al., 2002; Su et al., 2003; Wittig et al., 2001).
Kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC)
Die Behandlung und Prognose von SCLC hängt stark vom diagnostizierten Krebsstadium ab. Das Staging von SCLC basierend auf klinischen Ergebnissen ist häufiger als das pathologische Staging. Das klinische Staging nutzt die Ergebnisse der körperlichen Untersuchung, verschiedener bildgebender Tests und Biopsien. Nach den von der American Cancer Society eingeführten Daten beträgt die relative 5-Jahres-Überlebensrate 31% für Stadium I, 19% für Stadium II, 8% für Stadium III und 2% für Stadium IV.
Die Standard-Chemotherapie von SCLC verwendet die Kombination von Etoposid oder Irinotecan mit Cisplatin oder Carboplatin. Die Behandlung erfolgt in 4 bis 6 Zyklen. Jeder Zyklus beginnt mit der Chemotherapie für 1 bis 3 Tage, gefolgt von einer Erholungszeit von 3 bis 4 Wochen.
Die Standard-Strahlentherapie zur Behandlung von SCLC wird als Externe Strahltherapie (EBRT) bezeichnet und in der Regel ein- bis zweimal täglich, 5 Tage die Woche, für 3 bis 7 Wochen durchgeführt. In den letzten Jahren wurden die neuen Strahlungstechniken entwickelt. Die neuen Techniken sind die dreidimensionale konformale Strahlentherapie (3D-CRT) und die intensitätsmodulierte Strahlentherapie (IMRT). Beide ermöglichen eine genauere Ausrichtung der Strahlenbelastung auf den Tumor, indem sie die Strahlenbelastung des umgebenden gesunden Gewebes verringern.
Im Stadium I, in dem SCLC als ein einzelner kleiner Tumor ohne Nachweis einer Ausbreitung von Krebs in Lymphknoten oder anderswo im Allgemeinen (weniger als bei einem von 20 Patienten) gefunden wird, ist eine Operation mit anschließender kombinierter Chemo- und Strahlentherapie eine Standardbehandlung. Dieses Behandlungsverfahren ist nur für Patienten mit relativ guter Gesundheit möglich. Meistens hat sich die SCLC zum Zeitpunkt der Diagnose bereits ausgebreitet. Eine operative Behandlung ist daher unwahrscheinlich (American Cancer Society, 2015b; S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011b).
In dem begrenzten Stadium, in dem sich SCLC auf einer Seite der Brust auf die Lunge oder nahegelegene Lymphknoten ausgebreitet hat (1 von 3 Patienten), ist die kombinierte Chemo- und Strahlentherapie, die sogenannte gleichzeitige Radiochemotherapie, eine Standardbehandlung. In diesem Stadium ist die Operation keine Option. Die Standardchemotherapeutika sind Etoposid (VP-16) zusammen mit Cisplatin oder Carboplatin. Die gleichzeitige Kombination von Chemo- mit Strahlentherapie zeigte therapeutische Vorteile, wird aber auch von schweren Nebenwirkungen im Vergleich zur Chemo- oder Strahlentherapie selbst begleitet. Die Chemotherapie ist eine Standardbehandlung für Patienten, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie die gleichzeitige Radiochemotherapie vertragen. Optional kann der Chemotherapie eine Strahlentherapie folgen (American Cancer Society, 2015b; S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011b).
In dem fortgeschrittenen Stadium, in dem sich SCLC weit über die Lunge, die nahe gelegenen Lymphknoten und andere entfernte Organe (wie Knochenmark) ausgebreitet hat, ist die systematische Chemotherapie meist Etoposid in Kombination mit entweder Cisplatin oder Carboplatin, optional gefolgt von einer Strahlenbehandlung in der Brust, die angewandte Behandlung (American Cancer Society, 2015b; S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011b).
Da bekannt ist, dass sich SCLC auf das Gehirn ausbreitet, erhalten die Patienten mit SCLC unabhängig von dem Stadium eine prophylaktische Strahlentherapie am Kopf, die sogenannte prophylaktische Schädelbestrahlung oder PCI.
Im begrenzten und fortgeschrittenen Stadium wird die Behandlung wahrscheinlich zu einer signifikanten Schrumpfung des Krebses führen, aber in den meisten Fällen wird der Krebs irgendwann zurückkehren. Die Veränderung der Art der Chemotherapie ist in den Fällen zu berücksichtigen, in denen der Krebs trotz angewandter Chemotherapie weiter wächst. Die Wahl der Chemotherapie bei wieder auftretendem Krebs hängt von der Dauer der Krebsremissionsphase ab.
Innovationen gab es bei der Erkennung, Diagnose und Behandlung von SCLC. Es zeigte sich, dass die Verwendung von CT-Scans anstelle von Röntgenaufnahmen zur Krebsfrüherkennung das Todesrisiko durch Lungenkrebs senkt. Die Diagnose von SCLC kann heute durch Fluoreszenz oder virtuelle Bronchoskopie unterstützt werden; das Tumor-Imaging in Echtzeit kann bei der Strahlenbehandlung umgesetzt werden. Die neuartigen Anti-Angiogenese-Medikamente wie Bevacizumab (Avastin), Sunitinib (Sutent) und Nintedanib (BIBF 1120) zeigten therapeutische Wirkungen bei der Behandlung von SCLC (American Cancer Society, 2015b).
Die Immuntherapie stellt ein übermäßig untersuchtes Gebiet der Krebstherapie dar. Für die Behandlung von SCLC werden verschiedene Ansätze verfolgt. Einer der Ansätze zielt auf die Blockade von CTLA-4 ab, einem natürlichen menschlichen Immunsuppressor. Die Hemmung von CTLA-4 soll das Immunsystem stärken, um den Krebs zu bekämpfen. Vor kurzem wurde mit der Entwicklung vielversprechender Immun-Checkpoint-Inhibitoren zur Behandlung von SCLC begonnen. Ein weiterer Ansatz basiert auf Krebsimpfstoffen, die derzeit für die Behandlung von SCLC in klinischen Studien verfügbar sind (American Cancer Society, 2015b; National Cancer Institute (NCI), 2011).
Harnblasenkarzinom (UBC)
Die Standardbehandlung von Blasenkrebs umfasst Operation, Strahlentherapie, Chemotherapie und Immuntherapie.
Folgende Arten von Operationen können bei der Behandlung von Blasenkrebs durchgeführt werden: transurethrale Resektion, radikale oder partielle Zystektomie und Harnableitung. Durch die transurethrale Resektion wird der Krebs von der Blaseninnenwand mechanisch oder durch die Verbrennung des Tumors mit energiereicher Elektrizität entfernt. Durch die Zystektomie wird die Blase zusammen mit den Lymphknoten und anderen krebserkrankten in der Nähe liegenden Organen teilweise oder vollständig entfernt. Die Harnableitung ist eine Art von Operation, bei der die neuen Wege der Speicherung und des Abflusses von Urin beschritten werden. Die Operation wird oft durch die Anwendung einer Chemotherapie ergänzt, die das Risiko eines Wiederauftretens des Krebses senken soll (National Cancer Institute, 2015).
In den Stadien 0 und I wird der Blasenkrebs typischerweise durch transurethrale Resektion behandelt, möglicherweise gefolgt von intravesikaler Chemotherapie und optional kombiniert mit intravesikaler immuntherapeutischer Behandlung mit BCG (Bacillus Calmette-Guérin). Eine partielle oder radikale Zystektomie ist möglich. Blasenkrebs im Stadium II und III wird durch radikale oder partielle Zystektomie, transurethrale Resektion oder externe Bestrahlung mit oder ohne Chemotherapie behandelt. Im Stadium IV hängt die Behandlung von Blasenkrebs davon ab, wie weit sich Krebszellen im Körper ausgebreitet haben. Sind die Blasenkrebszellen noch auf die Blase beschränkt, kann der Krebs durch die Chemotherapie allein, die radikale Zystektomie oder die externe Strahlentherapie mit oder ohne Chemotherapie behandelt werden. Im Falle der Invasion von Blasenkrebs in andere Körperregionen ist die Chemotherapie mit oder ohne Operation oder Strahlentherapie die erste Wahl der Behandlung. In diesem Stadium kann die externe Bestrahlung, die Harnableitung oder die Zystektomie als Palliativtherapie eingesetzt werden. In jedem Stadium von Blasenkrebs haben die Patienten die Möglichkeit, sich für eine klinische Studie anzumelden (National Cancer Institute, 2015).
Ein effektiver immuntherapeutischer Ansatz wird bei der Behandlung von aggressivem, nicht muskelinvasivem Blasenkrebs (NMIBC) etabliert. Dabei wird eine geschwächte Form des Bakteriums Mycobacterium Bovis (Bazillus Calmette-Guérin = BCG) als intravesikale Lösung eingesetzt. Der Haupteffekt der BCG-Behandlung ist ein signifikanter langfristiger (bis zu 10 Jahre) Schutz vor einem Wiederauftreten von Krebs und eine reduzierte Progressionsrate. Im Prinzip löst die Behandlung mit BCG eine lokale Entzündungsreaktion aus, die die zelluläre Immunantwort stimuliert. Die Immunantwort auf BCG basiert auf folgenden Schlüsselschritten: Infektion von Urothel- und Blasenkrebszellen durch BCG, gefolgt von einer erhöhten Expression von antigenpräsentierenden Molekülen, Induktion der Immunantwort durch Zytokinfreisetzung, Induktion der antitumoralen Aktivität durch Beteiligung verschiedener Immunzellen (darunter zytotoxische T-Lymphozyten, Neutrophile, natürliche Killerzellen und Makrophagen) (Fuge et al., 2015; Gandhi et al., 2013).
Die BCG-Behandlung ist im Allgemeinen gut verträglich, kann aber vor allem für die immunsupprimierten Patienten tödlich sein. BCG-Refraktärität wird bei etwa 30-40% der Patienten beobachtet (Fuge et al., 2015; Steinberg et al., 2016a). Die Behandlung von Patienten, bei denen die BCG-Therapie erfolglos war, ist eine Herausforderung. Die Patienten, die die BCG-Behandlung nicht erfolgreich abgeschlossen haben, sind einem hohen Risiko für die Entwicklung einer muskelinvasiven Erkrankung ausgesetzt. Die radikale Zystektomie ist die bevorzugte Behandlungsoption für Non-Responder (Steinberg et al., 2016b; von Rundstedt and Lerner, 2015). Die von der FDA zugelassene Zweitlinientherapie von BCG gescheitertem NMIBC für Patienten, die die Erhaltung der Blase wünschen, ist die chemotherapeutische Behandlung mit Valrubicin. Eine Reihe weiterer Zweitlinientherapien ist verfügbar oder wird derzeit ebenfalls untersucht, darunter immuntherapeutische Ansätze wie kombinierte BCG-Interferon- oder BCG-Check-Point-Inhibitor-Behandlungen, prä-BCG transdermale Impfung, Behandlung mit einem Komplex von Mycobacterium phlei Zellwand und Nukleinsäre (MCNA), Mono- oder Kombinationschemotherapie mit verschiedenen Wirkstoffen wie Mitomycin C, Gemcitabin, Docetaxel, Nab-Paclitaxel, Epirubicin, Mitomycin/Gemcitabin, Gemcitabin/Docetaxel und gerätegestützte Chemotherapien wie Thermochemo-, Radiochemo-, elektromotorische oder photodynamische Therapien (Fuge et al., 2015; Steinberg et al., 2016b; von Rundstedt and Lerner, 2015). Eine weitere Bewertung der verfügbaren Therapien in klinischen Studien ist noch erforderlich.
Im Allgemeinen ist die Behandlung von fortgeschrittenem Blasenkrebs mit Muskelinvasion, bekannt als muskelinvasives Blasenkarzinom (MIBC) oder metastasierendem Blasenkrebs, eine Herausforderung und blieb in den letzten Jahrzehnten weitgehend unverändert. Die heute verfügbaren Möglichkeiten zur Behandlung von fortgeschrittenem Blasenkrebs sind unzureichend effektiv. Neue Trends in der klinischen Behandlung von Blasenkrebs wurden durch das in jüngster Zeit aufkommende Verständnis des genetischen Hintergrunds von Urothelkrebs eröffnet. Insbesondere die jüngste Implementierung von prädiktiven genomischen und molekularen Biomarkern soll der therapeutischen Wirkung zugutekommen (Jones et al., 2016; Rouanne et al., 2016; Grivas et al., 2015; Azevedo et al., 2015; Knollman et al., 2015a).
Vor 2003 wurde die Zystektomie allein als Standardbehandlung von MIBC etabliert. Das Wiederauftreten von Krebs an entfernten Körperstellen nach der Operation zeigte die Notwendigkeit einer neoadjuvanten chemotherapeutischen Behandlung. Die kombinierte Chemotherapie mit hochdosiertem Methotrexat, Vinblastin, Doxorubicin und Cisplatin (beschleunigtes MVAC oder AMVAC) oder Gemcitabin und Cisplatin (GC) zählt derzeit zu einer Standardbehandlung von MIBC in den USA. Die adjuvante Anwendung der Chemotherapie durch die Behandlung von MIBC ist durch die hohe chirurgische Komplikationsrate nach radikaler Zystektomie begrenzt. Dennoch wird die Verwendung von AMVAC, GC oder einer Kombination aus Cisplatin, Methotrexat und Vinblastin (CMV) derzeit als adjuvante Chemotherapie für MIBC-Hochrisikopatienten empfohlen. Die ähnliche systematische Chemotherapie wird bei der Behandlung von metastasierendem Blasenkrebs eingesetzt. Im Allgemeinen sprechen nur 30 bis 40 % der Patienten auf die cisplatinbasierte Chemotherapie an. Darüber hinaus sind Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion nicht für eine Behandlung mit Cisplatin geeignet. Die Zweitlinienbehandlung hängt von der bisherigen Behandlung ab und ist nicht skandalisiert (Knollman et al., 2015b; Rouanne et al., 2016).
Die alternativen Behandlungsmöglichkeiten für fortgeschrittenen Blasenkrebs werden in laufenden klinischen Studien untersucht. Die aktuellen klinischen Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung molekular gezielter Therapien und Immuntherapien. Die zielgerichteten Therapien untersuchen die Auswirkungen von kanzerogenen Pathway-Inhibitoren (z. B. mTOR, vaskuläre Endothelzellen-, Fibroblasten- oder epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren, Anti-Angiogenese- oder Zellzyklus-Inhibitoren) bei der Behandlung von Blasenkrebs. Die Entwicklung molekular gezielter Therapien bleibt aufgrund der hohen genetischen Vielfalt von Blasenkrebs eine Herausforderung. Der Schwerpunkt der aktuellen Immuntherapie liegt in der Entwicklung von Checkpoint-Blockierungsmitteln wie dem monoklonalen Anti-PD1-Antikörper und dem adoptiven T-Zell-Transfer (Knollman et al., 2015b; Grivas et al., 2015; Jones et al., 2016; Rouanne et al., 2016).
Gebärmutterkrebs (UTC)
Die Behandlung von Endometriumkarzinomen ist stadiumabhängig. Die Mehrheit der endometrischen Karzinome besteht aus gut bis mäßig differenzierten endometrioiden Adenokarzinomen, die bei der Diagnose meist auf den Gebärmutterkörper beschränkt sind und durch Hysterektomie geheilt werden können (World Cancer Report, 2014). Um die Fruchtbarkeit bei Patienten mit endometrischen Karzinomen im Frühstadium und Kinderwunsch zu erhalten, kann alternativ eine konservative Therapie mit Megesterolacetat sinnvoll sein. Allerdings muss die hohe Rückfallrate berücksichtigt werden. Bei Patienten mit fortgeschrittenem endometrischem Karzinom kann eine Hysterektomie vor anderen palliativen Ansätzen die Lebensqualität und die Prognose verbessern. Sie wird häufig mit einer adjuvanten Strahlentherapie kombiniert. Inoperable Patienten erhalten eine primäre Strahlentherapie. Sind weder Exzision noch Bestrahlung möglich, werden Progesteron-Rezeptor-positive Karzinome mit Gestagen oder Tamoxifen behandelt. Im Falle einer Progression nach endokriner Therapie oder Progesteron-Rezeptor-negativen Karzinomen erhalten die Patienten Adriamycin, Cisplatin, Carboplatin, Paclitaxel oder Docetaxel (Leitlinie Endometriumkarzinom, 2008). Darüber hinaus ist Megestrol Acetat von der FDA für die palliative Behandlung von fortgeschrittenem Gebärmutterhalskrebs zugelassen (National Cancer Institute, 2015). Patienten, die eine PTEN-Mutation tragen, werden mit PARP-Inhibitoren behandelt (Dedes et al., 2010).
Auch die Therapie von Gebärmutterhalskrebs hängt vom Stadium ab. Im Frühstadium ist die Exzision die Standardtherapie, die mit der Radio-(Chemo-)Therapie kombiniert werden kann. Die primäre Radio-(Chemo-)Therapie wird im Spätstadium (ab Stadium III und höher), bei Lymphknoteninfiltration oder wenn der Tumor nicht entfernt werden kann, gewählt. Die Lokalisation der Strahlung wird an die Lymphknoteninfiltration angepasst und die Bestrahlung wird durch Cisplatin unterstützt (S3-Leitlinie Zervixkarzinom, 2014). Es hat sich gezeigt, dass die kombinierte Radio-(Chemo-)Therapie mit Cisplatin im Hinblick auf das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Überleben (PFS) im Vergleich zur Strahlentherapie allein von Vorteil ist. Bemerkenswert ist, dass Kombinationen mit anderen Medikamenten das OS oder PFS im Vergleich zu Cisplatin allein nicht verbesserten, sondern die Toxizität erhöhten (Green et al., 2005; Wang et al., 2011; Lukka et al., 2002). Bei der Behandlung von lokalen Rezidiven wurden Kombinationen von Cisplatin mit anderen Medikamenten getestet und nur eine Kombination mit Topotecan führte zu einem verbesserten OS im Vergleich zu Cisplatin allein (S3-Leitlinie Zervixkarzinom, 2014).
Es gibt auch einige immuntherapeutische Ansätze, die derzeit getestet werden. In einer klinischen Studie der Phase I/II wurden Patienten mit Gebärmutterkrebs mit autologen dendritischen Zellen (DCs) geimpft, die mit Wilms' Tumorgen 1 (WT1) mRNA elektroporiert wurden. Neben einem Fall einer lokalen allergischen Reaktion auf das Adjuvans wurden keine Nebenwirkungen beobachtet und 3 von 6 Patienten zeigten eine immunologische Reaktion (Coosemans et al., 2013).
Wie bereits erwähnt, verursachen HPV-Infektionen Läsionen, die letztendlich zu Gebärmutterhalskrebs führen können. Daher gelten die HPV-viralen Onkoproteine E6 und E7, die konstitutiv in hochgradigen Läsionen und Krebs exprimiert werden und für den Beginn und die Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps benötigt werden, als vielversprechende Ziele für immuntherapeutische Ansätze (Hung et al., 2008; Vici et al., 2014). Eine Studie führte die adoptive T-Zelltherapie (ACT) bei Patienten mit metastasierendem Gebärmutterhalskrebs durch. Die Patienten erhalten eine Infusion mit E6 und E7 reaktiven tumorinfiltrierenden T-Zellen (TILs), was zu einer vollständigen Regression bei 2 und einer partiellen Reaktion bei 1 von 9 Patienten führt (Stevanovic et al., 2015). Darüber hinaus wurde ein intrazellulärer Antikörper gegen E7 entwickelt, der das Tumorwachstum bei Mäusen blockieren soll (Accardi et al., 2014). Auch Peptid-, DNA- und DC-basierte Impfstoffe gegen HPV E6 und E7 befinden sich in klinischen Studien (Vici et al., 2014).
In Anbetracht der schwerwiegenden Nebenwirkungen und Kosten, die mit der Behandlung von Krebs verbunden sind, müssen Faktoren identifiziert werden, die bei der Behandlung von Krebs im Allgemeinen und AML (akute myeloische Leukämie), BRCA (Brustkrebs), CCC (cholangiozelluläres Karzinom), CLL (chronische lymphatische Leukämie), CRC (Darmkrebs), GBC (Gallenblasenkrebs), GBM (Glioblastom), GC (Magenkrebs), GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs), HCC (hepatozelluläres Karzinom), HNSCC (Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich), MEL (Melanom), NHL (Non-Hodgkin-Lymphom), NSCLC (nicht-kleinzelliger Lungenkrebs), OC (Eierstockkrebs), OSCAR (Speiseröhrenkrebs), PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs), PRCA (Prostatakrebs), RCC (Nierenzellkarzinom), SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs), UBC (Harnblasenkrebs) und UEC (Endometriumkarzinom) eingesetzt werden können. Es besteht auch die Notwendigkeit, Faktoren zu identifizieren, die Biomarker für Krebs im Allgemeinen und akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und insbesondere Endometriumkarzinom, was zu einer besseren Krebsdiagnose, Beurteilung der Prognose und Vorhersage des Behandlungserfolgs führt.
Die Immuntherapie von Krebs stellt eine Möglichkeit dar, Krebszellen gezielt anzusprechen und gleichzeitig Nebenwirkungen zu minimieren. Die Krebsimmuntherapie nutzt die Existenz von tumorassoziierten Antigenen. Zurzeit umfasst die Klassifizierung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) die folgenden großen Gruppen:

a) Cancer-Testis-Antigene: Die ersten jemals identifizierten TAAs, die durch T-Zellen erkannt werden, gehören zu dieser Klasse, die zunächst Cancer-Testis (CT)-Antigene genannt wurden, weil die Expression ihrer Mitglieder in histologisch unterschiedlichen menschlichen Tumoren und - bei Normalgewebe - nur in Spermatozyten/Spermatogonia des Hodens und manchmal in der Placenta vorliegt. Da die Zellen des Hodens keine Klasse-I und II HLA-Moleküle exprimieren, können diese Antigene nicht durch T-Zellen im Normalgewebe erkannt werden und werden deshalb als immunologisch tumorspezifisch betrachtet. Bekannte Beispiele für CT-Antigene sind die MAGE Familienangehörigen und NY-ESO-1.
b) Differenzierungsantigene: Diese TAAs werden zwischen Tumoren und Normalgewebe, aus dem der Tumor entstanden ist, geteilt. Die meisten der bekannten Differenzierungsantigene finden sich in Melanomen und normalen Melanozyten. Viele dieser Melanozyten-Linie-verwandten Proteine sind in der Biosynthese von Melanin involviert und sind deshalb nicht tumorspezifisch, werden aber nichtsdestotrotz umfangreich in der Krebsimmuntherapie eingesetzt. Beispiele enthalten, sind aber nicht beschränkt, auf Tyrosinase und Melan-A/MART-1 für Melanom oder PSA für Prostatakrebs.
c) Überexpremierte TAAs: Gene, die häufig exprimierte TAAs kodieren, wurden in histologisch unterschiedlichen Typen von Tumoren sowie in vielen gesunden Geweben - dort im Allgemeinen mit niedrigeren Expressionsniveaus, gefunden. Es ist möglich, dass viele der Epitope, die von Normalgeweben prozessiert und potentiell präsentiert werden, unter dem Schwellenwert für eine T-Zell-Erkennung sind, während die Überexpression in Tumorzellen durch Aufbrechen der vorher etablierten Toleranz eine Reaktion gegen Krebs auslösen kann. Bekannte Beispiele für diese Klasse von TAAs sind Her-2/neu, Survivin, Telomerase oder WT1.
d) Tumorspezifische Antigene: Diese einzigartigen TAAs entstehen durch Mutationen von normalen Genen (wie z. B. β-Catenin, CDK4, etc.). Einige dieser molekularen Veränderungen werden mit neoplastischen Transformationen und/oder Progression assoziiert. Tumorspezifische Antigene sind in der Regel in der Lage, ohne das Risiko für Autoimmunreaktionen gegen normales Gewebe zu tragen, eine starke Immunreaktion zu induzieren. Andererseits sind diese TAAs in den meisten Fällen nur mit Bezug auf den genauen Tumor, von dem sie identifiziert wurden, relevant und werden in der Regel nicht von vielen Einzeltumoren geteilt. Tumorspezifität (oder - assoziation) eines Peptids kann auch dann auftreten, wenn das Peptid aus einem tumor-(-assoziierten) Exon stammt, wenn es sich um Proteine mit tumorspezifischen (-assoziierten) Isoformen handelt.
e) TAAs, die aus abnormalen posttranslationalen Modifikationen entstehen: Solche TAAs können aus Proteinen entstehen, die weder spezifisch für, noch überexprimiert in Tumoren sind, die aber nichtsdestotrotz durch posttranslationale Prozesse, die primär in Tumoren aktiv sind, tumorassoziiert werden. Beispiele für diese Klasse entstehen aus veränderten Glykosylierungsmustern, die zu neuartigen Epitopen in Tumoren, wie für MUC1, oder Ereignissen, wie dem Proteinsplicing während des Abbaus, die tumorspezifisch oder auch nicht sein können, führen.
f) Onkovirale Proteine: Diese TAAs sind virale Proteine, die in dem onkogenen Prozess eine entscheidende Rolle spielen können, und weil sie fremde (nicht menschlichen Ursprungs) sind, können sie eine T-Zellantwort hervorrufen. Beispiele für derartige Proteine sind die menschlichen Papillomavirus Typ 16 Virusproteine E6 und E7, die in zervikalen Karzinomen (Zervixkrebs) exprimiert werden.

Ein großer Teil des menschlichen Proteoms stammt aus nicht-kanonischen Quellen, wie beispielsweise alternativen offenen Leserahmen (altORF (Vanderperre et al., 2013)), endogenen retroviralen Elementen oder zusätzlicher post-transkriptioneller (alternatives Spleißen von RNAs (Nilsen and Graveley, 2010)) oder post-translationaler Verarbeitung (post-translationale Modifikationen (Khoury et al., 2011), proteasomalen Spleißschritte (Liepe et al., 2016)). Dieser Teil des Proteoms stellt eine reiche Quelle für TAAs dar, da viele der zellulären Prozesse, die an der Erzeugung dieser nicht-kanonischen Proteine und Peptide beteiligt sind, in Krebszellen häufig verändert werden (Laumont and Perreault, 2018).
Viele Messenger-RNAs (mRNAs) enthalten neben einem offenen Leserahmen (ORF) als Referenz unkonventionelle alternative offene Leserahmen (altORF, (de and ’t Hoen, 2015)). Diese zusätzlichen Kodiersequenzen können in der Größe von wenigen, meist unter 100 (kleine Leserahmen; sORFs (Olexiouk et al., 2016)), bis zu mehreren hundert Codons variieren und können upstream, downstream oder sogar überlappend mit der Referenz-ORF angeordnet sein. Die Translation dieser altORFs erfolgt von verschiedenen Translationsinitiierungsstellen und kann in einem anderen Leserahmen als dem Referenz-ORF erfolgen. Das Vorhandensein kleiner offener Leserahmen ist nicht auf mRNA beschränkt, sondern wurde auch für andere regulatorische RNAs beschrieben, die früher als nicht-kodierend galten (ncRNA, (Nam et al., 2016)). Eine Reihe von langen nicht-kodierenden RNAs (IncRNAs) und microRNAs (miRNAs) kodieren und translatieren nachweislich kleine Peptide (Anderson et al., 2015; Aspden et al., 2014).
Menschliche endogene Retroviren (HERVs) machen einen wesentlichen Teil (-8%) des menschlichen Genoms aus. Diese viralen Elemente wurden vor Millionen von Jahren in das Genom integriert und seither über Generationen vertikal übertragen. Die überwiegende Mehrheit der HERVs hat durch Mutation oder Trunkierung an funktioneller Aktivität verloren, aber einige endogene Retroviren, wie die Mitglieder der HERV-K-Klade, kodieren noch funktionelle Gene und bilden nachweislich retrovirusähnliche Partikel. (Subramanian et al., 2011). Die Transkription von HERV-Proviren wird epigenetisch kontrolliert und ist unter normalen physiologischen Bedingungen stillgelegt. Reaktivierung und Überexpression, die zu einer aktiven Translation viraler Proteine führt, wurde jedoch bei bestimmten Krankheiten und insbesondere bei verschiedenen Krebsarten beschrieben (Gonzalez-Cao et al., 2016; Kassiotis and Stoye, 2017). Diese tumorspezifische Expression von HERV-basierten Proteinen kann für verschiedene Arten der Krebsimmuntherapie genutzt werden (Krishnamurthy et al., 2015; Schiavetti et al., 2002).
Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie sind Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Die Antigene, die von den tumorspezifischen T-Lymphozyten erkannt werden, bzw. deren Epitope, können Moleküle aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor hochreguliert sind.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-Il. MHC Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer alpha- schweren Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC Klasse-II-Moleküle bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Die dreidimensionale Konformation resultiert in einer Bindungsfurche, welche für die nichtkovalente Wechselwirkung mit Peptiden benutzt wird.
MHC-Klasse-I Moleküle können auf den meisten Zellen mit einem Zellkern vorkommen. Sie präsentieren Peptide, die aus einer proteolytischen Spaltung vorwiegend endogener Proteine, defekten ribosomalen Produkten (DRIPs) und größerer Peptide entstehen. Jedoch werden Peptide, die von endosomalen Kompartimenten oder exogenen Quellen abgeleitet sind, häufig auf MHC-Klasse-I-Molekülen gefunden. Dieser nicht-klassische Weg der Klasse-I-Präsentation wird in der Literatur als Kreuzpräsentation bezeichnet (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC-Kasse-II-Moleküle können vorwiegend auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorkommen und in erster Linie präsentieren Peptide von exogenen oder transmembranen Proteinen, die von den APCs während des Ablaufes der Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden.
Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-II-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Es ist sicher bekannt, dass der TCR, das Peptid und der MHC in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1:1 vorliegen.
CD4-positive T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Induzierung und dem Aufrechterhalten von effektiven Antworten durch CD8-positive zytotoxische T-Zellen.
Die Identifizierung von CD4-positiven aus tumorassoziierten Antigenen (TAA) abgeleiteten T-Zell-Epitopen ist von großer Bedeutung für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte für die Auslösung antitumoraler Immunantworten (Gnjatic et al., 2003). An dem Tumor unterstützen T-Helferzellen ein zytotoxisch T-Zellen (CTL)-freundliches Zytokinmilieu (Mortara et al., 2006) und ziehen weitere Effektorzellen an, z. B. CTLs, NK-Zellen, Makrophagen und Granulozyten (Hwang et al., 2007).
In Abwesenheit einer Entzündung ist die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, besonders auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Monozyten, von Monozyten abgeleiteten Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen, begrenzt. Bei Krebspatienten wurde festgestellt, dass Tumorzellen MHC-Klasse-Il-Moleküle exprimieren (Dengjel et al., 2006).
Verlängerte (längere) Peptide der Erfindung können als aktive MHC-Klasse-II-Epitope fungieren.
Durch MHC-Klasse-II-Epitope aktiviert T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktion der zytotoxischen T-Zellen (CTL) in der antitumoralen Immunität. T-Helferzell-Epitope, die eine T-Helferzellantwort des TH1-Types auslösen, unterstützen die Effektorfunktionen der CD8-positiven Killer-T-Zellen, welche zytotoxische Funktionen gegen Tumorzellen, die tumorassoziierte Peptid/MHC Komplexe auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, beinhalten. Auf diese Weise können tumorassoziierte T-Helferzellen Peptid-Epitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren.
Es konnte in Tiermodellen an Säugetieren, z. B. bei Mäusen, gezeigt werden, dass auch in Abwesenheit von zCD8-positive T-Lymphozyten, CD4-positive T-Zellen ausreichend sind, die Manifestation von Tumoren durch Inhibition der Angiogenese durch Sekretion von Interferon-Gamma (IFNγ) zu inhibieren (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Es gibt Hinweise auf CD4 T-Zellen als direkte Anti-Tumor-Effektoren (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
Da die konstitutive Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen normalerweise auf Immunzellen beschränkt ist, wurde die Möglichkeit, Klasse-II-Peptide direkt aus primären Tumoren zu isolieren, als unmöglich angesehen. Allerdings konnten Dengjel et al. erfolgreich eine Anzahl von MHC-Klasse-II-Epitopen direkt von Tumoren identifizieren ( WO 2007/028574 , EP 1 760 088 B1 ).
Da beide Arten der Antwort, CD8- und CD4-abhängig, gemeinsam und synergistisch zu dem anti-Tumoreffekt beitragen, ist die Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen, die entweder durch CD8+ T-Zellen (Ligand: MHC-Klasse-I-Molekül + Peptidepitop) oder durch CD4-positive T-Helferzellen (Ligand: MHC-Klasse-II-Molekül + Peptidepitop) erkannt werden, für die Entwicklung von Tumorvakzinen wichtig.
Damit ein MHC-Klasse-I-Peptid eine zelluläre Immunantwort auslösen (initiieren) kann, muss es auch an ein MHC-Molekül binden. Dieser Vorgang ist vom Allel des MHC-Moleküls und von dem spezifischen Polymorphismus der Aminosäuresequenz des Peptids abhängig. MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel 8-12 Aminosäurereste lang und enthalten in ihrer Sequenz gewöhnlich zwei konservierte Reste („Anker“), die mit der entsprechenden Bindungsfurche des MHC-Moleküls interagieren. Auf diesem Weg hat jedes MHC-Allel ein „Bindungsmotiv“, welches bestimmt, welche Peptide spezifisch an die Bindungsfurche binden können.
In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) tragen, erkannt werden.
Damit die Proteine durch die T-Lymphozyten als tumorspezifisches oder -assoziiertes Antigen erkannt werden, und um somit in einer Therapie eingesetzt werden zu können, müssen bestimmte Voraussetzungen erfüllt sein. Das Antigen soll hauptsächlich von Tumorzellen und nicht oder nur in vergleichsweise geringen Mengen von gesunden Normalgeweben exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte das Peptid im Vergleich zu normalem gesundem Gewebe von Tumorzellen überpräsentiert werden. Weiterhin ist wünschenswert, wenn das betreffende Antigen nicht nur in einer Tumorart, sondern auch in hoher Konzentration vorliegt (z. B. Kopienzahl des entsprechenden Peptids pro Zelle). Tumorspezifische und tumorassoziierte Antigene sind oft aus Proteinen abgeleitet, die direkt, aufgrund ihrer Funktion beispielsweise in der Zellzyklus-Steuerung oder der Suppression der Apoptose, in die Transformation einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beteiligt sind. Zusätzlich können nachgeschaltete (downstream) Ziele der Proteine, die direkt für eine Transformation verantwortlich sind, hochreguliert werden und sind somit indirekt tumorassoziiert. Solche indirekt tumorassoziierten Antigene können auch Ziele eines Vakzinierungsansatzes sein (Singh-Jasuja et al., 2004). Es ist auch das Vorliegen von Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens essentiell, damit sichergestellt ist, dass ein solches von einem tumorassoziierten Antigen abgeleitetes Peptid („immunogenes Peptid“) zu einer T-Zellantwort in vitro oder in vivo führt.
Grundsätzlich kann jedes Peptid, das an ein MHC-Molekül binden kann, als T-Zellepitop dienen. Eine Voraussetzung für die Induktion einer in vitro oder in vivo T-Zellantwort ist die Anwesenheit einer T-Zelle mit einem entsprechenden TCR und das Fehlen einer immunologischen Toleranz für dieses bestimmte Epitop.
TAAs stellen somit ein Ausgangspunkt für die Entwicklung einer T-Zell-basierten Immuntherapie, umfassend aber nicht limitiert auf Tumorvakzinen dar. Die Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der TAAs beruhen normalerweise zum einen auf dem Einsatz von T-Zellen, die aus Patienten oder gesunden Individuen isoliert werden können, oder basieren auf der Erstellung differentieller Transkriptionsprofile oder differentieller Peptidexpressionsmuster zwischen Tumoren und Normalgeweben.
Das Auffinden von Genen, die in Tumorgeweben oder humanen Tumor-Zelllinien überexprimiert sind, oder die in derartigen Geweben oder Zelllinien selektiv exprimiert werden, liefert jedoch keine präzise Information für einen Einsatz der von diesen Genen transkribierten Antigene in einer Immuntherapie. Dies beruht darauf, dass nur eine individuelle Subpopulation der Epitope dieser Antigene für eine solche Anwendung geeignet ist, da eine T-Zelle mit einem entsprechenden TCR vorhanden sein muss und die immunologische Toleranz für dieses bestimmte Epitop muss nicht vorhanden oder minimal sein. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es daher wichtig, nur die über- oder selektiv präsentierten Peptide auszuwählen, gegen die eine funktionelle und/oder eine proliferierende T-Zelle gefunden werden kann. Solch eine funktionelle T-Zelle wird als eine T-Zelle definiert, die bei der Stimulation mit einem spezifischen Antigen klonal expandiert werden kann und in der Lage ist, Effektorfunktionen auszuführen („Effektor-T-Zelle“).
Beim Targeting von Peptid-MHC durch spezifische TCRs (z.B. lösliche TCRs) und Antikörper oder andere Bindungsmoleküle (Scaffolds) nach der Erfindung ist die Immunogenität der zugrunde liegenden Peptide sekundär. In diesen Fällen ist die Präsentation der entscheidende Faktor.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 besteht, oder eine Variantensequenz davon, die mindestens zu 77%, vorzugsweise mindestens zu 88%, homolog (vorzugsweise mindestens zu 77% oder mindestens zu 88% identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 ist, wobei die Variante an MHC bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit dem Peptid kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei das Peptid nicht das zugrundeliegende Polypeptid in voller Länge ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid der vorliegenden Erfindung, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 oder einer Variante davon ausgewählt ist, die mindestens zu 77%, vorzugsweise mindestens zu 88%, homolog (vorzugsweise mindestens zu 77% oder mindestens zu 88% identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 ist, wobei das Peptid oder die Variante davon eine Gesamtlänge zwischen 8 und 100, vorzugsweise zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14 Aminosäuren aufweist.
Die folgenden Tabellen zeigen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, ihre jeweiligen SEQ ID NOs und die voraussichtlichen Quell-(Basis-)Gene für diese Peptide. Die Peptide in Tabelle 3 sind Peptide, die von sogenannten „alternativen“ oder „kurzen“ offenen Leserahmen abgeleitet sind. Für jede Peptidsequenz wird ein exemplarisches Quell-Transkript ID (Ensemble (Aken et al., 2016) oder RefSeq (O'Leary et al., 2016) Annotation) dargestellt. Peptide können weiterhin aus anderen zusätzlichen oder alternativen Transkripten stammen, die hier nicht aufgeführt sind.

In Tabelle 3 binden die Peptide mit den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 71 an HLA-A*02. Die Peptide in Tabelle 4 sind Peptide, die von humanen endogenen Retroviren abgeleitet sind. Für jedes Peptid wird eine exemplarische chromosomale Position dargestellt. Peptide können weiteren zusätzlichen oder alternativen chromosomalen Abschnitten zugeordnet werden, die hier nicht aufgeführt sind. In Tabelle 4 binden Peptide mit SEQ ID NO: 72 bis SEQ ID NO: 74 an HLA-A*02, Peptide mit SEQ ID NO: 75 bis SEQ ID NO: 95 an verschiedene HLA-I-Klassen (siehe HLA-Allel). Die Peptide in Tabelle 5 sind Peptide ohne direkte Referenz im menschlichen Genom. In Tabelle 5 binden die Peptide mit den SEQ ID NO: 96 bis SEQ ID NO: 101 an HLA-A*02. Tabelle 3: Peptide gemäß der Erfindung aus alternativen oder kurzen offenen Leserahmen.

SEQ ID Nr.	Sequenz	Peptidcode	Exemplarisches Quell-Transkript ID
1	KLLDFSTRI	NUDCD2-001	ENST00000521797
2	ALLDVLVKL	COLPDG-001	ENST00000225964
3	FLLVPSPIWQL	altORF-001	ENST00000430553
4	YLGDSHVLL	altORF-002	ENST00000356971
5	LVWEVVESV	altORF-003	ENST00000425076
6	ALHDSPVYL	altORF-004	ENST00000584912
7	ALWEEVKATSL	altORF-005	ENST00000361298
8	ILQSLVPAA	altORF-006	ENST00000595125
9	FLQEGDLISV	altORF-007	ENST00000463488
10	SLLDKLSGI	altORF-008	ENST00000374472
11	ALLPHAPEAV	altORF-009	ENST00000621654
12	HLDSMNVSI	altORF-010	ENST00000558088
13	FLDEGSLLRL	altORF-011	ENST00000484411
14	LLIEVSEEL	altORF-012	ENST00000561317
15	NLVMPLLHI	altORF-013	ENST00000326799
16	ALLDAEQSPVAL	altORF-014	ENST00000559705
17	VLWDLRPSSLI	altORF-015	ENST00000503454
18	KMMTFFQGL	altORF-016	ENST00000559195
19	MLLPWLPKL	altORF-017	ENST00000568176
20	VLISLPGKV	altORF-018	ENST00000342308
21	FVFISPSFL	altORF-019	ENST00000579991
22	SLYDVPVGA	altORF-020	ENST00000540839
23	GLEVLDALL	altORF-021	ENST00000344922
24	TLTSLNILL	altORF-022	ENST00000451303
25	ISVLNLSAI	altORF-023	ENST00000490069
26	KLWTSLVNL	altORF-024	ENST00000513284
27	IAAGVPNTDA	altORF-025	ENST00000447802
28	SQLEKPETA	altORF-026	ENST00000412585
29	LLWEFPSMA	altORF-027	ENST00000465527
30	LLRLTLLPL	altORF-028	XM_005265671
31	VVLPIVITL	altORF-029	ENST00000335507
32	VLSVSAVLGA	altORF-030	ENST00000414310
33	FASERPPSV	altORF-031	ENST00000617924
34	LLNVEPAGA	altORF-032	ENST00000525179
35	VLLNSNYPV	altORF-033	ENST00000433310
36	FQVTRTTGV	altORF-034	ENST00000406361
37	KILDEFYNV	altORF-035	ENST00000464456
38	SLSAWLPSL	altORF-036	ENST00000430083
39	YIYEDEVRL	altORF-037	ENST00000603198
40	FTLPFLVNL	altORF-038	ENST00000522371
41	LMASEGIWESSL	altORF-039	ENST00000233242
42	WITPVIPAL	altORF-040	ENST00000421212
43	AIWSTILIA	altORF-041	ENST00000420453
44	WLIPRQLAAA	altORF-042	ENST00000367145
45	ALYHQSPLL	altORF-043	ENST00000555447
46	AMVEIIPKV	altORF-044	ENST00000425544
47	ALLPGVPGL	altORF-045	ENST00000434646
48	MLAEIHPKA	altORF-046	ENST00000558952
49	FLWDPRDVVL	altORF-047	ENST00000491641
50	GLASYLDRV	altORF-048	ENST00000411618
51	GLLTQVHIL	altORF-049	ENST00000521282
52	LAFVSHVLI	altORF-050	ENST00000361835
53	TISISLSSV	altORF-051	ENST00000254627
54	GLSPDQVFL	altORF-052	ENST00000394904
55	MVQQEKLFV	altORF-053	ENST00000611855
56	IITNLIVNI	altORF-054	ENST00000263321
57	YVLMTSLLL	altORF-055	ENST00000414195
58	MIISHRALEL	altORF-056	ENST00000452840
59	LAASTTFLGV	altORF-057	ENST00000605962
60	LLLATLENL	altORF-058	ENST00000484275
61	VLPWQPLLL	altORF-059	ENST00000492470
62	SLLGKPGLTI	altORF-060	ENST00000359318
63	LSFKRSLSI	altORF-061	ENST00000469017
64	LLLALRLSL	altORF-062	ENST00000375105
65	IAISQLTFV	altORF-063	ENST00000473984
66	ILNELLNSI	altORF-064	ENST00000505646
67	ALKELMGPA	altORF-065	ENST00000308370
68	KLLADAFKV	altORF-066	ENST00000569593
69	LLCPVVLQL	altORF-067	ENST00000497492
70	LLLQIEPAA	altORF-068	ENST00000624543
71	WLMPVMPAL	altORF-069	ENST00000473202

Tabelle 4: Zusätzliche Peptide gemäß der Erfindung aus humanen endogenen Retroviren.

SE Q ID Nr.	Sequenz	Peptidco de	HLA-Allele	Beispielhafte chromosomale Position
72	YLSFIKILL	HERVK-001	A*02	GRCh38:3:1:198295559:1 Position: 75551556-75551582
73	STTIINLIL	HERVK-002	A*02	GRCh38:22:1:50818468:1 Position: 18946733-18946759
74	TLLSYSIPL	HERVK-003	A*02	GRCh38:19:1:58617616:1 Position: 58312367-58312399
75	TTQEAEKLLE R	HERVK-004	A68 /A03	GRCh38:19:1:58617616:1 Position: 58312301-58312330
76	TEQGPTGVTM	HERVK-	B40/B44/B*	GRCh38:3:1:198295559:1 Position:
		005	49	101694496-101694528
77	VPAGVDVITE Y	HERVK-006	A29/B35/B* 07	GRCh38:19:1:58617616:1 Position: 58312250-58312276
78	GLLPPVRAM	HERVK-007	B*15	GRCh38:22:1:50818468:1 Position: 23540302-23540328
79	KIQDPGTAF	HERVK-008	A*03	GRCh38:8:1:145138636:1 Position: 42918854-42918828
80	RDQIVTVSV	HERVK-009	B41/B44	GRCh38:7:1:159345973:1 Position: 4587989-4587954
81	SLLGAATVEP PK	HERVK-010	A*03	GRCh38:6:1:170805979:1 Position: 28690343-28690369
82	LAPQMIIAL	HERVK-011	B15/B51	GRCh38:7:1:159345973:1 Position: 141755441-141755418
83	KPRGPTPL	HERVK-012	B*08	GRCh38:20:1:64444167:1 Position: 32723848-32723877
84	RLCPAAPSEK	HERVK-013	A*03	GRCh38:20:1:64444167:1 Position: 32717605-32717631
85	VYLLTFPPL	UNKN-007	A*24	GRCh38:10:1:133797422:1 Position: 6825699-6825676
86	LMIGKRIL	HERVK-014	B*08	GRCh38:4:1:190214555:1 Position: 9130103-9130138
87	LNLVSETEAM VK	HERVK-015	A11 (A03)	GRCh38:1:1:248956422:1 Position: 150635421-150635392
88	DEQETDAFLL	HERVK-016	B18/B44	GRCh38:6:1:170805979:1 Position: 77721912-77721889
89	MIFYVLQK	HERVK-017	A*03	GRCh38:4:1:190214555:1 Position: 190112774-190112748
90	YLRDFKIKR	HERVK-018	A31 (A03)	GRCh38:4:1:190214555:1 Position: 190107560-190107534
91	SSHFILVTF	HERVK-019	A*24	GRCh38:3:1:198295559:1 Position: 75556001-75556027
92	ELVAVTSVL	HERVK-020	B*13	GRCh38:8:1:145138636:1 Position: 145025405-145025379
93	WQKNSMRL	HERVK-021	B*15	GRCh38:20:1:64444167:1 Position: 34135051-34135074
94	MGRRRNLY	HERVK-022	B*15	GRCh38:4:1:190214555:1 Position: 165000827-165000850
95	QVKIVTLL	HERVK-023	B*52	GRCh38:12:1:133275309:1 Position 34627138-34627115

Tabelle 5: Zusätzliche Peptide gemäß der Erfindung ohne direkte Referenz im menschlichen Genom gemäß der vorliegenden Erfindung.

SEQ ID No.	Sequenz	Peptidcode
96	KIIEDLANTV	KRT18-001
97	GLIDDKGTIKL	CDC2-006
98	SLMEVTHDL	LARS-001
99	ALMDGSESRFFV	BSG-001
100	SLGPPPVGV	CIZ1-001
101	KLPEGHLPEV	AHNAK2-003

Tabelle 6: Peptide gemäß der Erfindung, welche beispielsweise für personalisierte Krebstheranien nützlich sind.

SEQ ID Nr.	Sequenz	Peptidcode
102	GLDPTQFRV	POLA1-003
103	SLVSYLDKV	KRT16P-001

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner im Allgemeinen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von proliferativen Erkrankungen, wie z. B. akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom.
Besonders bevorzugt sind die Peptide - einzeln oder in Kombination - gemäß der vorliegenden Erfindung, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 ausgewählt sind. Bevorzugter sind die Peptide - einzeln oder in Kombination - ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID Nr. 14, SEQ ID No. 72 bis SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 96 bis SEQ ID No. 101 (siehe Tabelle 3, Tabelle 4 und Tabelle 5), und ihre Verwendung in der Immuntherapie von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom.
Somit ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung für die - vorzugsweise kombiniert - Behandlung von einer proliferativen Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I oder - in längerer Form, wie beispielsweise einer Längenvariante - der Klasse MHC -II zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin erfindungsgemäße Peptide, wobei die Peptide (jedes) aus einer Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 besteht oder im Wesentlichen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid modifiziert ist und/oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, das insbesondere an die N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii) fusioniert oder an (oder in die Sequenz) eines Antikörpers fusioniert ist, wie beispielsweise eines Antikörpers, der spezifisch für dendritische Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure, die die erfindungsgemäßen Peptide kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und/oder sie exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten und in der Medizin, insbesondere bei der Behandlung von Krebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörper, die spezifisch gegen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung oder Komplexe dieser erfindungsgemäßen Peptide mit MHC sind, und Verfahren zu deren Herstellung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner T-Zell-Rezeptoren (TCRs), insbesondere lösliche TCR (sTCRs) und klonierte TCRs, die in die autologen oder allogenen T-Zellen eingesetzt wurden, und Verfahren zu deren Herstellung, sowie auf NK-Zellen oder andere Zellen, die den TCR tragen oder mit den TCRs kreuzreagieren.
Die Antikörper und TCRs sind weitere Ausführungsformen der immuntherapeutischen Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, oder einen Expressionsvektor, wie zuvor beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine antigenpräsentierende Zelle und bevorzugt eine dendritische Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Antigen auf ein MHC-Klasse-I oder Il-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder künstlichen Antigen-präsentierende Zelle durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Antigen-präsentierende Zelle einen Expressionsvektor umfasst, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID No. 1 bis SEQ ID N. 101 , vorzugsweise SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 72 bis SEQ ID Nr. 81, SEQ ID Nr. 96 bis SEQ ID Nr. 101, oder eine variante Aminosäuresequenz enthält, zu exprimieren oder es exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner aktivierte T-Zellen, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die T-Zelle selektiv eine Zelle erkennt, die ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend beliebige erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aberrant exprimieren, wobei das Verfahren die Verabreichung dem Patienten einer effektiven Menge von T-Zellen umfasst, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines beliebigen Peptids wie beschrieben, der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, des Expressionsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, des aktivierten T-Lymphozyten, des T-Zell-Rezeptors oder des Antikörpers oder anderer Peptid- und/oder Peptid-MHC-bindender Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung als Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments. Vorzugsweise ist das Medikament gegen Krebs wirksam.
Vorzugsweise ist das Medikament eine Zelltherapie, ein Impfstoff oder ein Protein auf Basis eines löslichen TCRs oder Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Biomarker auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die im vorliegenden Kontext „Targets“ genannt werden, welche bei der Diagnostik von Krebs, vorzugsweise akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, verwendet werden können. Der Marker kann eine Überpräsentation des(der) Peptids(e) selbst oder eine Überexpression des(der) entsprechenden Gens(e) sein. Die Marker können auch verwendet werden, um die Erfolgswahrscheinlichkeit einer Behandlung, vorzugsweise einer Immuntherapie, vorherzusagen, und am meisten bevorzugt ist eine Immuntherapie, die auf das gleiche Ziel abzielt, das durch den Biomarker identifiziert wird. So kann beispielsweise ein Antikörper oder ein löslicher TCR verwendet werden, um Abschnitte des Tumors zu färben, um das Vorhandensein eines Peptids von Interesse im Komplex mit MHC nachzuweisen.
Optional trägt der Antikörper eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder ein Toxin.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser neuartigen Targets im Rahmen einer Krebsbehandlung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Stimulation einer Immunantwort hängt von der Präsenz von Antigenen ab, die vom Immunsystem des Wirts als fremd erkannt werden. Die Entdeckung der Existenz von tumorassoziierten Antigenen hat die Möglichkeiten erweitert, das Immunsystem des Wirts dafür zu nutzen, um ins Tumorwachstum einzugreifen. Gegenwärtig werden verschiedene Mechanismen zur Einbindung beider, sowohl der humoralen als auch der zellularen Zweige des Immunsystems für die Krebsimmuntherapie, untersucht.
Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
Wie hier verwendet und wenn nicht anders beschrieben, werden alle Begriffe so verwendet, wie weiter unten definiert.
Die Bezeichnung „T-Zell Antwort“ meint die spezifische Proliferation und die Aktivierung von Effektorfunktionen, die durch ein Peptid in vitro oder in vivo induziert wird. Für die MHC-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen können die Effektorfunktionen der Lysis von Peptid-gepulsten, Peptid-Vorläufer-gepulsten oder natürlichen Peptidpräsentierenden Zielzellen, die Sekretion von Zytokinen, bevorzugt Interferon-gamma, TNF-alpha oder IL-2 induziert durch Peptide, die Sekretion von Effektormolekülen, bevorzugt Granzyme oder Perforine induziert durch Peptide oder Degranulation, sein.
Der Begriff „Peptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen. Die Peptide sind vorzugsweise 9 Aminosäuren lang, können aber so kurz wie 8 Aminosäuren lang sein, und so lang wie 10, 11 oder 12 oder länger, und im Falle von MHC Klasse-II-Peptiden (verlängerte Varianten der Peptide der Erfindung) können sie so lang wie 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 oder mehr Aminosäuren lang sein.
Darüber hinaus umfasst der Begriff „Peptid“ Salze einer Reihe von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch akzeptable Salze der Peptide, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Triflurazetat) Salze. Es muss angemerkt werden, dass die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung erheblich von den Peptiden in ihrem Zustand / ihren Zuständen in vivo abweichen, da die Peptide in vivo nicht als Salze vorliegen.
Der Begriff „Peptid“ umfasst auch „Oligopeptid“. Der Begriff „Oligopeptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen. Die Länge des Oligopeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange das korrekte Epitop oder die korrekten Epitope darin beibehalten werden. Die Oligopeptide sind typischerweise weniger als etwa 30 Aminosäurereste in der Länge und mehr als etwa 15 Aminosäuren in der Länge.
Der Begriff „Polypeptid“ kennzeichnet eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind. Die Länge des Polypeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange die korrekten Epitope beibehalten werden. Im Gegensatz zu den Begriffen „Peptid“ oder „Oligopeptid“ soll der Begriff „Polypeptid“ Proteinmoleküle bezeichnen, die mehr als 30 Aminosäureresten enthalten.
Ein Peptid, Oligopeptid, Protein oder Polynukleotid, welches ein solches Molekül kodiert, ist „immunogen“ (und somit ein „Immunogen“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung), wenn es in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen. Im Fall der vorliegenden Erfindung wird „Immunogenität“ spezieller definiert als die Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren. Somit wäre ein „Immunogen“ ein Molekül, welches in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, und im Fall der vorliegenden Erfindung, ein Molekül, welches in der Lage ist, eine T-Zellantwort zu induzieren. In einem weiteren Aspekt kann das Immunogen das Peptid, der Komplex des Peptids mit MHC-Molekül, ein Oligopeptid und/oder Protein, das verwendet wird, um spezifische Antikörper oder TCRs gegen es zu erzeugen, sein.
Ein Klasse-I T-Zell-„Epitop“ benötigt ein kurzes Peptid, das an einen Klasse-I-MHC-Rezeptor gebunden ist und einen tertiären Komplex bildet (MHC-Klasse-I alpha-Kette, beta-2-Microglobulin und Peptid), welcher durch eine T-Zelle erkannt werden kann, die einen passenden T-Zellrezeptor, der an den MHC/Peptid-Komplex mit einer angemessenen Affinität bindet. Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle binden, sind typischerweise 8-14 Aminosäuren lang und besonders typisch 9 Aminosäuren lang.

Bei Menschen gibt es drei verschiedene genetische Loci, die für MHC-Klasse-I-Moleküle kodieren (Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozytenantigene (HLA) bezeichnet): HLA-A, HLA-B und HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 und HLA-B*07 sind Beispiele für MHC-Klasse-I-Allele, die von diesen Loci exprimiert werden. Tabelle 7: Expressionsfrequenzen F für die Serotypen HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 und HLA-B*44. Die Haplotypfrequenzen Gf sind aus einer Studie entnommen, in welcher die HLA-Typisierungsdaten aus einer Datenbank von über 6,5 Millionen freiwilliger Spender in den USA benutzt wurden (Gragert et al., 2013). Die Haplotypfrequenz ist die Frequenz eines speziellen Allels auf einem einzelnen Chromosom. Aufgrund des diploiden Chromosomensatzes in Säugerzellen ist die Frequenz des genotypischen Auftretens dieser Allele höher und kann unter Verwendung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes (F = 1 - (1-Gf)²) berechnet werden.

Allel	Bevölkerung	Aus der Allelfrequenz kalkulierter Phenotyp (F)
A*02	Afrikaner (N=28557)	32,3%
	Europäische Kaukasier (N= 1242890)	49,3%
	Japaner (N=24582)	42,7%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	46,1%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	30,4%
A*01	Afrikaner (N=28557)	10,2%
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	30,2%
	Japaner (N=24582)	1,8%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	14,0%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	21,0%
A*03	Afrikaner (N=28557)	14,8%
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	26,4%
	Japaner (N=24582)	1,8%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	14,4%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	10,6%
A*24	Afrikaner (N=28557)	2,0%
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	8,6%
	Japaner (N=24582)	35,5%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	13,6%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	16,9%
B*07	Afrikaner (N=28557)	14,7%
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	25,0%
	Japaner (N=24582)	11,4%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	12,2%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	10,4%
B*08	Afrikaner (N=28557)	6,0%
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	21,6%
	Japaner (N=24582)	1,0%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	7,6%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	6,2%
B*44	Afrikaner (N=28557)	10,6%
	Europäische Kaukasier (N= 1242890)	26,9%
	Japaner (N=24582)	13,0%
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	18,2%
	Südostliche Asiaten (N=27978)	13,1%

Die Peptide der Erfindung, vorzugsweise wenn sie in einem erfindungsgemäßen Impfstoff beinhaltet sind, wie im vorliegenden Kontext beschrieben ist, binden an A*02. Ein Impfstoff kann auch pan-bindende MHC-Klasse-II-Peptide beinhalten. Daher kann der erfindungsgemäße Impfstoff zur Behandlung von Krebs bei Patienten verwendet werden, die A*02-positiv sind, während aufgrund des pan-bindenden Charakters dieser Peptide keine Auswahl für MHC-Klasse-II-Allotypen erforderlich ist.

Wenn A*02-Peptide der Erfindung mit Peptiden kombiniert werden, die an ein anderes Allel, z. B. A*24, binden, kann ein höherer Prozentsatz jeder Patientenpopulation behandelt werden, als wenn man nur ein MHC-Klasse-I-Allel anspricht. Während in den meisten Populationen weniger als 50% der Patienten mit einem Allel allein behandelt werden könnten, kann ein Impfstoff, der HLA-A*24 und HLA-A*02-Epitope umfasst, mindestens 60% der Patienten in jeder relevanten Population behandeln. Insbesondere die folgenden Prozentsätze von Patienten werden für mindestens eines dieser Allele in verschiedenen Regionen positiv sein: USA 61%, Westeuropa 62%, China 75%, Südkorea 77%, Japan 86% (kalkuliert mit www.allelefrequencies.net). Tabelle 8: Die HLA-Abdeckung der europäischen kaukasischen Bevölkerung (berechnet aus (Gragert et al., 2013)).

	Abdeckung (zumindest ein A-Allel)	kombiniert mit B*07	kombiniert mit B*44	kombiniert mit B07 und B44
A02/ A01	70%	78%	78%	84%
A02 / A03	68%	76%	76%	83%
A02/ A24	61%	71%	71%	80%
A'01 / A03	52%	64%	65%	75%
A01/ A24	44%	58%	59%	71%
A03/ A24	40%	55%	56%	69%
A02/ A01/ A*03	84%	88%	88%	91%
A02/ A01/ A*24	79%	84%	84%	89%
A02 / A03 / A*24	77%	82%	83%	88%
A01/ A03/ A*24	63%	72%	73%	81%
A02/ A01 / A03 / A24	90%	92%	93%	95%

In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Nukleotidsequenz“ auf ein Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden.
Die Nukleotidsequenz, die ein bestimmtes Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, kann natürlich vorkommen oder synthetisch konstruiert sein. Im Allgemeinen werden DNA-Segmente, die die Peptide, Polypeptide und Proteine dieser Erfindung kodieren, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder einer Serie von Oligonukleotidlinkern zusammengeführt, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionsregulationseinheit, die regulatorische Elemente abgeleitet von mikrobiellen oder viralen Operons enthält, exprimiert zu werden.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „ein Nukleotid, das für (oder kodierend) ein Peptid kodiert“ auf eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid kodiert, einschließlich künstlicher (durch Menschen gemacht) Start- und Stoppcodons, die für das biologische System kompatibel sind, wobei die Sequenz beispielsweise durch eine dendritische Zelle oder ein anderes Zellsystem exprimiert werden soll, das für die Herstellung von TCRs geeignet ist.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, umfasst ein Verweis auf eine Nukleinsäuresequenz sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrang-Nukleinsäuresequenzen. So bezieht sich, zum Beispiel für DNA, die spezifische Sequenz, solange der Zusammenhang nichts gegenteiliges besagt, auf die Einzelstrang-DNA einer solchen Sequenz, den Duplex einer solchen Sequenz mit seinem Komplement (Doppelstrang-DNA) und dem Komplement einer solchen Sequenz.
Die Bezeichnung „kodierende Region“ bezieht sich auf den Teil eines Genes, der entweder natürlich oder normal das Expressionsprodukt des Genes in seinem natürlichen genomischen Umfeld kodiert, d. h. die Region, die in vivo das native Expressionsprodukt des Genes kodiert.
Die kodierende Region kann von einem nicht-mutierten („normalen“), mutierten oder geänderten Gen abgeleitet sein, oder kann sogar von einer DNA-Sequenz, oder einem Gen sein, die vollständig im Labor anhand der für den Fachmann bekannten Verfahren auf dem Fachgebiet der DNA-Synthese synthetisiert wurden, abgeleitet sein.
Der Begriff „Expressionsprodukt“ bedeutet das Polypeptid oder Protein, welches das natürliche Translationsprodukt des Genes ist und jeder Nukleinsäuresequenz, die Äquivalente, welche aus einer Degenerierung des genetischen Codes resultieren, und damit die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.
Der Begriff „Fragment“, wenn er sich auf eine kodierende Sequenz bezieht, bedeutet einen Teil DNA, umfassend weniger als die komplette kodierende Region, dessen Expressionsprodukt essentiell die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das Expressionsprodukt der kompletten kodierenden Region behält.
Der Begriff „DNA-Segment“ bezieht sich auf einen DNA-Polymer in der Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren DNA-Konstruktes, welche von DNA erhalten wurde, die zumindest einmal in substantiell reiner Form isoliert wurde, d. h. frei von kontaminierendem endogenen Materialien und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifikation, Manipulation und Recovery des Segmentes und seiner Nukleotidsequenzkomponenten durch biochemische Standardverfahren, zum Beispiel durch Nutzung von Klonvektoren, erlauben. Solche Segmente werden in der Form von offenen Leserastern (Open Reading Frames, ORFs), nicht unterbrochen durch interne nicht-translatierende Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorkommen, bereitgestellt. Die Sequenzen der nicht-translatierenden DNA können nachgeschaltet (downstream) des offenen Leserasters vorkommen, wo diese nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen interferieren.
Der Begriff „Primer“ meint eine kurze Nukleinsäuresequenz, die mit einem DNA-Strang gepaart werden kann und ein freies 3'-OH-Ende bereitstellt, an welchem eine DNA-Polymerase die Synthese einer Desoxyribonukleotidkette beginnt.
Der Begriff „Promoter“ meint eine Region der DNA, die an der Bindung von RNA-Polymerase zur Initialisierung der Transkription beteiligt ist.
Der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Material aus seiner originären Umgebung entfernt wurde (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, welches in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, getrennt von einigen oder allen in dem natürlichen System vorkommenden Materialien, ist isoliert. Solche Polynukleotide können Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynukleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch isoliert sein, indem so ein Vektor oder eine Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung ist.
Die Polynukleotide und die rekombinanten oder immunogenen Polypeptide, offenbart im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, können auch in „aufgereinigter“ Form vorliegen. Der Begriff „aufgereinigt“ verlangt keine absolute Reinheit, vielmehr ist er als relative Definition zu verstehen, und kann Zusammensetzungen enthalten, die hoch aufgereinigt sind, oder Zusammensetzungen, die nur teilweise aufgereinigt sind, da diese Begriffe sehr gut von Fachmännern in dem relevanten Gebiet verstanden werden. Zum Beispiel wurden individuelle Klone, die aus einer cDNA Bibliothek isoliert wurden, in herkömmlicher Weise durch elektrophoretische Homogenität aufgereinigt. Die Aufreinigung von Anfangsmaterialien oder natürlichen Materialien um zumindest eine Größenordnung, bevorzugt zwei oder drei Größenordnungen und weiter bevorzugt vier oder fünf Größenordnungen, ist ausdrücklich beinhaltet. Des Weiteren ist ein beanspruchtes Polypeptid, welches eine Reinheit von bevorzugt 99,999 %, oder zumindest 99,99 % oder 99,9 % und auch noch wünschenswerterweise 99 % per Gewicht oder höher hat, ausdrücklich erfasst.
Die Nukleinsäuren und polypeptidischen Expressionsprodukte, die entsprechend der vorliegenden Erfindung offenbart werden, sowie Expressionsvektoren, die solche Nukleinsäuren und/oder solche Polypeptide enthalten, können in „angereicherter Form“ vorliegen. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „angereichert“, dass die Konzentration des Materials zumindest das 2-, 5-, 10-, 100 oder 1000-fache ihrer natürlichen Konzentration (zum Beispiel) ist, vorteilhafterweise 0,01%, per Gewicht, bevorzugt zumindest um 0,1 % per Gewicht. Angereicherte Abmischungen von etwa 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % und 20 % bei Gewicht werden auch in Betracht gezogen. Die Sequenzen, Konstrukte, Vektoren, Klone und andere Materialien, die die vorliegende Erfindung umfasst, können vorteilhafterweise in einer angereicherten oder isolierten Form vorliegen. Der Begriff das „aktive Fragment“ meint ein Fragment, normalerweise eines Peptids, Polypeptids oder einer Nukleinsäuresequenz, das eine Immunantwort auslöst (d.h. immunogene Aktivität), wenn es alleine oder gegebenenfalls mit einem geeigneten Adjuvans oder Vektor einem Tier, wie zum Beispiel einem Säugetier, zum Beispiel einem Kaninchen oder einer Maus, und auch einem Menschen verabreicht wird, wobei die Immunantwort die Form einer stimulierenden T-Zellantwort innerhalb des behandelten Tieres, wie eines Menschen, annimmt. Alternativ kann das „aktive Fragment“ auch verwendet werden, um eine T-Zellantwort in vitro zu induzieren.
Wie in dieser Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „Teil“, „Segment“ und „Fragment“, wenn sie in Bezug auf Polypeptide verwendet werden, auf eine fortlaufende Sequenz von Resten, so wie Aminosäurereste, die eine Untergruppe einer größeren Sequenz bilden. Zum Beispiel würden die Oligopeptide, die dadurch entstehen, wenn z. B. ein Polypeptid mit einer beliebigen der üblich verwendeten Endopeptidasen, wie beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin, behandelt wird, Teile, Segmente oder Fragmente der Ausgangspolypeptide darstellen. Wenn sie in Bezug auf Polynukleotide verwendet werden, beziehen sich diese Begriffe auf Produkte, die durch die Behandlung von besagten Polynukleotiden mit einer beliebigen Endonuklease erhalten werden.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „prozentuale Identität“ oder „prozentual identisch“ in Bezug auf eine Sequenz, dass eine Sequenz mit einer beanspruchten oder beschriebenen Sequenz nach einem Alignment der zu vergleichenden Sequenz (die „Vergleichssequenz“) mit der beschriebenen oder beanspruchten Sequenz (die „Referenzsequenz“) verglichen wird. Die prozentuale Identität wird dann entsprechend der folgenden Formel bestimmt: $Prozentuale Identität = 100 [I - (C/R)]$
wobei C die Anzahl der Unterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz über die Länge des Alignments zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz ist, wobei

(i) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die keine korrespondierende Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz hat, und
(ii) jeder Gap in der Referenzsequenz und
(iii) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die sich von der alignten Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz unterscheidet und
(iiii) das Alignment muss an Position 1 der alignten Sequenzen beginnen;

und R die Anzahl der Basen oder Aminosäuren in der Referenzsequenz über die Länge des Alignments mit der Vergleichssequenz ist, wobei jeder Gap, der in der Referenzsequenz entstanden ist, auch als eine Base oder Aminosäure gezählt wird.

Wenn ein Alignment zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz besteht, für welches die prozentuale Identität, wie oben berechnet wird, gleich oder größer als eine spezifizierte minimale prozentuale Identität ist, dann besitzt die Vergleichssequenz die spezifizierte minimale prozentuale Identität zu der Referenzsequenz, auch wenn es Alignments geben mag, in denen die oben berechnete prozentuale Identität geringer als die spezifizierte prozentuale Identität ist.

Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung somit ein Peptid bereit, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 oder einer Variante davon ausgewählt ist, die zu 88% homolog zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 ist, oder einer Variante davon, die T-Zellen induzieren wird, mit dem Peptid kreuzzureagieren. Die Peptide der Erfindung weisen die Fähigkeit auf, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder verlängerter Versionen der Peptide zu Klasse-II zu binden.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „homolog“ auf den Grad der Identität (siehe prozentuale Identität oben) zwischen den Sequenzen von zwei Aminosäuresequenzen, d. h. Peptid oder Polypeptid-Sequenzen. Die zuvor erwähnte „Homologie“ wird durch den Vergleich von zwei Sequenzen, die unter optimalen Bedingungen auf die Sequenzen ausgerichtet sind, die verglichen werden müssen. Solch eine Sequenzhomologie kann durch das Bilden eines Alignments unter Benutzung von, zum Beispiel, dem ClustalW-Algorithmus, errechnet werden. Allgemein erhältliche Sequenzanalysesoftware, spezifischer, Vector NTI, GENETYX oder andere Tools werden durch öffentliche Datenbanken zur Verfügung gestellt.

Ein Fachmann wird in der Lage sein, zu beurteilen, ob die T-Zellen, die durch eine Variante eines spezifischen Peptids induziert wurden, in der Lage sind, mit dem Peptid selbst kreuzzureagieren (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Unter einer „Variante“ einer vorgegebenen Aminosäuresequenz verstehen die Erfinder, dass zum Beispiel die Seitenketten von einem oder zwei der Aminosäurereste in einer Weise verändert sind (zum Beispiel durch ihren Austausch durch die Seitenkette des Restes einer anderen natürlich vorkommenden Aminosäure oder einer anderen Seitenkette), so dass das Peptid immer noch in derselben Weise wie das Peptid bestehend aus der vorgegebenen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO: 101 an ein HLA-Molekül binden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid so modifiziert werden, dass es die Fähigkeit, mit der Bindungsfurche eines geeigneten MHC-Moleküls, wie HLA-A*2 oder -DR, zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert, und auf diese Weise die Fähigkeit, mit dem TCR aktivierter T-Zellen zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert.

Diese T-Zellen können anschließend mit den Zellen kreuzreagieren und Zellen töten, die ein Polypeptid exprimieren, welches die natürliche Aminosäuresequenz des verwandten Peptides, wie in den Aspekten der Erfindung definiert, enthält. Wie aus der wissenschaftlichen Literatur und den Datenbanken (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997) entnommen werden kann, sind bestimmte Positionen der HLA-bindenden Peptiden typischerweise Ankerreste, die eine Kernsequenz passend zu dem Bindungsmotiv des HLA-Rezeptors bilden, der durch polare, elektrophysikalische, hydrophobe und räumliche Eigenschaften der Polypeptidketten, die die Bindungsfurche bilden, definiert ist. So wäre ein Fachmann in der Lage, die Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO 101 dargelegt sind, durch Beibehalten der bekannten Ankerreste zu modifizieren, und wäre in der Lage, zu bestimmen, ob solche Varianten die Fähigkeit behalten, an MHC-Klasse-I oder Il-Moleküle zu binden. Die Varianten der vorliegenden Erfindung behalten die Fähigkeit, an den TCR aktivierter T-Zellen zu binden, welches anschließend mit Zellen, die ein Polypeptid mit der natürlichen Aminosäuresequenz des verwandten Peptides exprimieren, kreuzreagieren und sie töten kann, wie in den Aspekten der Erfindung definiert ist.

Die ursprünglichen (nicht-modifizierten) Peptide, wie hier offenbart, können durch Substitution einer oder mehrerer Resten an verschiedenen, möglicherweise selektiven Stellen innerhalb der Peptidkette modifiziert werden, solange es nicht anderweitig beschrieben ist. Vorzugsweise befinden sich diese Substitutionen am Ende der Aminosäurekette. Solche Substitutionen können konservativer Natur sein, zum Beispiel dergestalt, dass eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Struktur und Eigenschaften ersetzt wird, so wie eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure ersetzt wird. Noch konservativer wäre eine Ersetzung von Aminosäuren mit derselben oder ähnlichen Größe und chemischen Natur, wie beispielsweise wenn Leucin durch Isoleucin ersetzt wird. In Studien zu Sequenzvariationen in Familien von natürlich vorkommenden homologen Proteinen werden bestimmte Aminosäuresubstitutionen öfter als andere toleriert, und diese zeigen oftmals eine Korrelation mit Ähnlichkeiten in Größe, Ladung, Polarität und Hydrophobizität zwischen den originalen Aminosäuren und deren Ersetzungen, und dies ist die Basis für die Definition von „konservativen Substitutionen“.

Konservative Substitutionen werden hier als Austausch innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen definiert: Gruppe 1 - kleine aliphatische, nicht polare oder leicht polare Reste (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Gruppe 2 - polare, negativ geladene Reste und deren Amide (Asp, Asn, Glu, Gln); Gruppe 3 - polare, positiv geladene Reste (His, Arg, Lys); Gruppe 4 - große, aliphatische, unpolare Reste (Met, Leu, Ile, Val, Cys); und Gruppe 5 - große, aromatische Reste (Phe, Tyr, Trp).

Weniger konservative Substitutionen können die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere, die ähnliche Eigenschaften, aber gewisse Unterschiede in der Größe hat, beinhalten, solche wie eine Ersetzung eines Alaninrestes durch einen Isoleucinrest. Hoch nicht-konservative Ersetzungen können die Substitutionen einer sauren Aminosäure durch eine polare oder sogar eine basische Säure einschließen. Solche „radikalen“ Substitutionen können jedoch nicht als potentiell nicht effiziente verworfen werden, weil die chemischen Wirkungen nicht vollständig vorhersagbar sind, und die radikalen Substitutionen wohl zufällige Wirkungen verursachen könnten, die sonst nicht ausgehend aus den einfachen Gesetzen der Chemie vorhersagbar sind.

Solche Substitutionen können natürlich andere Strukturen einschließen, die sich von den weit verbreiteten L-Aminosäuren unterscheiden. So können die D-Aminosäuren durch die L-Aminosäuren ersetzt werden, die üblicherweise in den antigenen Peptiden der Erfindung vorkommen, und immer noch von der Offenbarung umfasst werden. Darüber hinaus können Nicht-Standardaminosäuren (d.h. andere als die üblichen natürlich vorkommenden proteinogenen Aminosäuren) auch zu Substitutionszwecken verwendet werden, um Immunogene und immunogene Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.

Wenn Substituierungen auf mehr als einer Position, wie es gefunden wurde, zu einem Peptid mit einer überwiegend äquivalenten oder größerer antigenen Wirksamkeit, wie es unten definiert wird, führen, so werden die Kombinationen von diesen Substituierungen getestet, um zu bestimmen, ob die Kombinationen zur additiven oder synergetischen Wirkung in Bezug auf die Antigenität des Peptides führen. Maximal werden nicht mehr als 4 Positionen innerhalb des Peptids gleichzeitig substituiert.

Ein Peptid, das im Wesentlichen aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, kann eine oder zwei Nicht-Anker-Aminosäuren (siehe unten bezüglich des Ankermotivs) austauschen, ohne dass die Fähigkeit, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klassen-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird. In einer weiteren Ausführungsform, in einem Peptid, das im Wesentlichen aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, können eine oder zwei Aminosäuren mit ihren konservativen Austauschpartnern (siehe den Kontext unten) ausgetauscht werden, ohne dass die Fähigkeit, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht-modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird.

Die Aminosäurereste, die nicht substantiell zu der Wechselwirkung mit dem T-Zellrezeptor beitragen, können durch Substitution mit einer weiteren Aminosäure, deren Aufnahme die T-Zellreaktivität nicht substantiell beeinflusst und die Bindung an das relevante MHC nicht verhindert, modifiziert werden. So kann das Peptid gemäß der Erfindung, abgesehen von der angegebenen Bedingung, jedes Peptid (wobei die Erfinder in diesen Begriff auch Oligopeptide oder Polypeptide einschließen), welches die Aminosäuresequenz oder einen Teil oder eine Variante davon enthält, wie angegeben sein. Tabelle 9: Varianten und Motive der Peptide entsprechend SEQ ID No. 4, 8, 72, 74, 96 und 97

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 4	Y	L	G	D	S	H	V	L	L
Variante									V
									I
									A
		M							V
		M							I
		M
		M							A
		A							V
		A							I
		A
		A							A
		V							V
		V							I
		V
		V							A
		T							V
		T							I
		T
		T							A
		Q							V
		Q							I
		Q
		Q							A

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 8	I	L	Q	S	L	V	P	A	A
Variante									V
									I
									L
		M							V
		M							I
		M							L
		M
		A							V
		A							I
		A							L
		A
		V							V
		V							I
		V							L
		V
		T							V
		T							I
		T							L
		T
		Q							V
		Q							I
		Q							L
		Q

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 72	Y	L	S	F	I	K	I	L	L
Variante									V
									I
									A
		M							V
		M							I
		M
		M							A
		A							V
		A							I
		A
		A							A
		V							V
		V							I
		V
		V							A
		T							V
		T							I
		T
		T							A
		Q							V
		Q							I
		Q
		Q							A

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 74	T	L	L	S	Y	S	I	P	L
Variante									V
									I
									A
		M							V
		M							I
		M
		M							A
		A							V
		A							I
		A
		A							A
		V							V
		V							I
		V
		V							A
		T							V
		T							I
		T
		T							A
		Q							V
		Q							I
		Q

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID No 96	K	I	I	E	D	L	A	N	T	V
Variante		L
		L								I
		L								L
		L								A
		M
		M								I
		M								L
		M								A
		A
		A								I
		A								L
		A								A
		V
		V								I
		V								L
		V								A
		T
		T								I
		T								L
		T								A
		Q
		Q								I
		Q								L
		Q								A

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
SEQ ID No 97	G	L	I	D	D	K	G	T	I	K	L
Variante											V
											I
											A
		M									V
		M									I
		M
		M									A
		A									V
		A									I
		A
		A									A
		V									V
		V									I
		V
		V									A
		T									V
		T									I
		T
		T									A
		Q									V
		Q									I
		Q
		Q									A

Längere (verlängerte) Peptide können auch geeignet sein. Es ist möglich, dass die MHC-Klasse-I-Epitope, obwohl sie in der Regel zwischen 8 und 11 Aminosäuren lang sind, durch Peptidprozessierung von längeren Peptiden oder Proteinen, die das tatsächliche Epitop umfassen, erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass die Reste, die das tatsächliche Epitop flankieren, Reste sind, die die proteolytische Spaltung, die notwendig ist, um das tatsächliche Epitop während der Prozessierung auszusetzen, nicht wesentlich beeinflussen.

Die Peptide der Erfindung können um bis zu vier Aminosäuren verlängert werden, d. h. 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren können an jeweiligem Ende in beliebiger Kombination zwischen 4:0 und 0:4 hinzugefügt werden. Kombinationen der Verlängerungen gemäß der Erfindung sind in Tabelle 10 zu finden. Tabelle 10: Kombinationen der Verlängerungen der erfindungsgemäßen Peptide

C-Terminus	N-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4

N-Terminus	C-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2

C-Terminus	N-Terminus
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4

Die Aminosäuren für die Verlängerung / Erweiterung können die Peptide der ursprünglichen Sequenz des Proteins oder jeder anderen Aminosäure(n) sein. Die Verlängerung kann verwendet werden, um die Stabilität oder Löslichkeit der Peptide zu erhöhen.

So können die Epitope der vorliegenden Erfindung identisch zu den natürlich vorkommenden tumorassoziierten oder tumorspezifischen Epitopen sein, oder sie können Epitope beinhalten, die sich in nicht mehr als vier Resten von dem Referenzpeptid unterscheiden, solange sie eine substanziell identische Aktivität besitzen.

In einer alternativen Ausführungsform wird das Peptid auf einer oder beiden Seiten um mehr als 4 Aminosäuren verlängert, vorzugsweise auf eine Gesamtlänge von bis zu 30 Aminosäuren. Dies kann zu MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden führen. Die Bindung an die MHC-Klasse-II kann mit den in der Technik bekannten Verfahren geprüft werden.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Peptide und Varianten von Epitopen der MHC-Klasse-I zur Verfügung, wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge zwischen 8 und 100, bevorzugt zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14, und zwar 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Aminosäuren, im Falle der verlängerten Klasse II-Bindungspeptide kann die Länge auch 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder 22 Aminosäuren betragen, aufweist.

Natürlich wird das Peptid oder die Variante gemäß der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder II zu binden. Die Bindung eines Peptides oder einer Variante an den MHC-Komplex kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden.

Es wird bevorzugt, wenn die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung spezifischen T-Zellen gegen die substituierten Peptide getestet werden, dass die Konzentration des Peptides, bei der die substituierten Peptide eine Hälfte des maximalen Anstiegs der Lyse in Relation zum Hintergrund erreichen, nicht mehr als ca. 1 mM, bevorzugterweise nicht mehr als ca. 1 µM, bevorzugter nicht mehr als ca. 1 nM und noch bevorzugter nicht mehr als ca. 100 pM und am meisten bevorzugt nicht mehr als ca. 10 pM beträgt. Es wird auch bevorzugt, dass die substituierten Peptide von den T-Zellen von mehr als einem, mindestens von zwei und bevorzugter von drei Individuen, erkannt werden.

Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, in der das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 besteht oder essentiell besteht.

„„Besteht essentiell aus“ soll bedeuten, dass ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zusätzlich zu der Sequenz entsprechend einer der SEQ ID NO: 1 bis zu SEQ ID NO: 101 oder einer Variante davon weitere N- und/oder C-terminal lokalisierte Abschnitte von Aminosäuren enthalten kann, die nicht unbedingt einen Teil des Peptids bilden, welches als Epitop für die MHC-Molekülepitope dient.

Gleichwohl können diese Abschnitte wichtig sein, um eine effiziente Einführung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ein Teil eines Fusionsproteins, welches zum Beispiel die 80 N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten unveränderlichen Kette (p33, im Folgenden „Ii“) umfasst, wie sie von der NCBI, GenBank Zugangsnummer X00497, zu erhalten ist. In anderen Fusionen können die Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem Antikörper, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere mit einer Sequenz eines Antikörpers, fusioniert werden, um von dem Antikörper spezifisch angegriffen zu werden, oder zum Beispiel mit oder in einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist, wie im vorliegenden Kontext beschrieben.

Zusätzlich kann das Peptid oder die Variante weiter modifiziert werden, um die Stabilität und/oder die Bindung an die MHC-Moleküle, um eine verstärkte Immunantwort hervorzurufen, zu verbessern. Methoden für eine solche Optimierung einer Peptidsequenz sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise die Einführung von umgekehrten (reversen) Peptid-Bindungen oder nicht-Peptidbindungen.

In einer reversen Peptidbindung sind die Aminosäurereste nicht über eine peptidische Bindung (-CO-NH-) verbunden, sondern die Peptidbindung ist in umgekehrter Reihenfolge. Solche retro-inverso Peptidomimetika können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel so wie beschrieben in Meziere et al (Meziere et al., 1997), welches durch Referenz eingeschlossen ist. Dieser Ansatz beinhaltet die Herstellung von Pseudopeptiden, die zwar Änderungen im Rückgrat beinhalten, aber nicht in der Orientierung der Seitenketten. Meziere et al. (Meziere et al., 1997) zeigen, dass diese Pseudopeptide für die MHC-Bindung und T-Helferzellantworten nützlich sein können. Retro-inverso-Peptide, die NH-CO-Bindungen anstelle von CO-NH-Peptidbindungen besitzen, sind gegenüber der Proteolyse erheblich resistenter.

Eine nicht-peptidische Bindung kann zum Beispiel, -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, - CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO- sein. US-Patent 4,897,445 stellt ein Verfahren für die Festphasensynthese von nicht-Peptid-Bindungen (-CH₂-NH) in Polypeptid-Ketten bereit, welches die Synthese der Polypeptide durch Standardverfahren und die Synthese der nicht-Peptidbindung durch Reaktion eines Amino-Aldehyds und einer Aminosäure in Gegenwart von NaCNBH₃ umfasst.

Peptide, die die oben beschriebenen Sequenzen umfassen, können mit zusätzlichen chemischen Gruppen an ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini synthetisiert werden, um die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder Affinität der Peptide zu erhöhen.

Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Ebenso kann eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Zusätzlich kann eine hydrophobe Gruppe, t-Butyloxycarbonyl oder eine Amidogruppe an die Carboxytermini der Peptide hinzugefügt werden.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide synthetisiert werden, um ihre sterische Konfiguration zu ändern. Beispielsweise kann das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids verwendet werden, anstatt des üblichen L-Isomers. Noch weiter kann wenigstens eine der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch eine der wohlbekannten nicht-natürlich vorkommenden Aminosäurereste substituiert werden. Änderungen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder die Bindungsverhalten der Peptide der Erfindung zu erhöhen.

In ähnlicher Weise kann ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante durch eine Reaktion spezifischer Aminosäuren entweder vor oder nach der Synthese des Peptids chemisch verändert werden. Beispiele für solche Modifikationen sind in der Technik gut bekannt und werden beispielsweise in der Arbeit von R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004) zusammengefasst, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Chemische Modifikation von Aminosäuren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Modifikationen durch Acylierung, Amidierung, Pyridoxylierung von Lysin, reduktive Alkylierung, Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), Amidmodifikation von Carboxylgruppen und Sulphydrylmodifikationen durch die Oxidation von Cystein zu Cysteinsäure, die Bildung von Quecksilberderivaten, die Bildung von gemischten Disulfiden mit anderen Thiolverbindungen, die Reaktion mit Maleimid, Carboxymethylierung mit lodessigsäure oder lodoacetamid und Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein. In dieser Hinsicht wird der Fachmann für eine weitergehende Methodologie zur chemischen Modifikation von Proteinen auf Kapitel 15 in Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995)verwiesen.

Kurz ausgedrückt, basiert die Modifikation von z. B. Arginylresten in Proteinen häufig auf der Reaktion von vicinalen Dicarbonylverbindungen wie Phenylglyoxal, 2,3-Butandion und 1,2-Cyclohexandion, um ein Addukt zu bilden. Ein anderes Beispiel ist die Umsetzung von Methylglyoxal mit Argininresten. Cystein kann ohne gleichzeitige Modifikation von anderen nukleophilen Stellen wie Lysin und Histidin modifiziert werden. Als Ergebnis ist eine große Anzahl von Reagenzien für die Modifikation von Cystein vorhanden. Die Webseiten von Unternehmen wie Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) stellen Informationen zu spezifischen Reagenzien zu Verfügung.

Die selektive Reduktion von Disulfidbindungen ist ebenso verbreitet. Disulfidbindungen können während der Wärmebehandlung von Biopharmazeutika gebildet und oxidiert werden. Woodward-Reagenz K kann verwendet werden, um spezifische Glutaminsäurereste zu modifizieren. N-(3-(Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid kann verwendet werden, um intramolekulare Vernetzungen zwischen einem Lysinrest und einem Glutaminsäurerest zu bilden. Zum Beispiel ist Diethylpyrocarbonat ein Reagenz für die Modifizierung von Histidylresten in Proteinen. Histidin kann auch unter Verwendung von 4-Hydroxy-2-Nonenal modifiziert werden. Die Reaktion der Lysinreste und anderer α-Amino-Gruppen ist beispielsweise für die Bindung von Peptiden an Oberflächen oder die Vernetzung (cross-linking) von Proteinen / Peptiden nützlich. Lysin ist die Stelle der Bindung von Poly(ethylen)glykol und die bedeutendste Stelle der Modifikation bei der Glykosylierung von Proteinen. Methioninreste in Proteinen können zum Beispiel mit lodacetamid, Bromethylamin und Chloramine T modifiziert werden.

Tetranitromethan und N-Acetylimidazol können für die Modifikation von Tyrosylresten verwendet werden. Eine Vernetzung durch die Bildung von Dityrosin kann mit Wasserstoffperoxid / Kupferionen erreicht werden.

Neuere Studien zur Modifizierung von Tryptophan haben N-Bromsuccinimid, 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenylmercapto)-3H-indol (BPNs-Skatol) verwendet.

Erfolgreiche Modifizierung von therapeutischen Proteinen und Peptiden mit PEG wird oft mit einer Verlängerung der Kreislaufhalbwertszeit assoziiert, während die Vernetzung von Proteinen mit Glutaraldehyd, Polyethylenglykoldiacrylat und Formaldehyd zur Herstellung von Hydrogelen verwendet wird. Eine chemische Modifizierung von Allergenen für die Immuntherapie wird oft durch Carbamylierung mit Kaliumcyanat erreicht.

Ein Peptid oder eine Variante, wobei das Peptid ist modifiziert oder enthält nicht-peptidische Bindungen, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein nicht natürlich vorkommendes Peptid, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 besteht oder im Wesentlichen besteht und synthetisch hergestellt (z. B. synthetisiert) als pharmazeutisch akzeptables Salz ist. Verfahren für die synthetische Herstellung von Peptiden sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich erheblich von den Peptide in ihrem Zustand/ihren Zuständen in vivo, da die Peptide, die erzeugt werden, in vivo nicht als Salze vorliegen. Die nicht-natürliche Salzform des Peptids vermittelt die Löslichkeit des Peptids, insbesondere im Zusammenhang mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Peptide umfassen, z. B. die im vorliegenden Kontext offenbarten Peptidimpfstoffe. Eine ausreichende und zumindest wesentliche Löslichkeit des/der Peptide(s) ist erforderlich, um die Peptide dem zu behandelnden Patienten effizient einzuführen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch annehmbare Salze der Peptide. Diese Salze gemäß der Erfindung umfassen Alkali- und Erdalkalisalze, wie zum Beispiel Salze der Hofmeister-Reihe, welche folgende Anionen: PO₄ ^3-, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^- und folgende Kationen NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li+, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ und Ba²⁺ umfassen. Im Besonderen werden Salze ausgewählt aus (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH₄CH₃COO, NH₄Cl, NH₄Br, NH₄NO₃, NH₄ClO₄, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄ClO₄, Rb₄I, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, Kl, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCl, NaBr, NaNO_s, NaClO₄, NaI, NaSCN, ZnCl₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO₄, Cs₂SO₄, CsCH₃COO, CsCI, CsBr, CsNO₃, CsClO₄, CsI, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCI, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, Lil, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, MgI₂, Mg(SCN)₂, MnCl₂, Ca₃(PO₄),, Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCl₂, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, BaI₂ und Ba(SCN)₂. Insbesondere bevorzugt sind NH-Azetat, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCl, NaCl und CaCl₂, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat-(Triflurazetat) Salze.

Im Allgemeinen können Peptide und Varianten (zumindest die, die zwischen den Aminosäureresten Peptidbindungen besitzen) durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasenpeptidsynthese, wie durch Lukas et al. (Lukas et al., 1981) und den dort aufgeführten Referenzen offenbart, synthetisiert werden. Die N-amino-Gruppen werden zwischenzeitlich durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) geschützt. Wiederholte Abspaltung dieser höchst basenlabilen Schutzgruppe wird mit einer 20%-igen Lösung von Piperidin in N, N-Dimethylformamid durchgeführt. Seitenkettenfunktionalitäten können als ihre Butylether geschützt werden (im Fall von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (im Fall von Glutaminsäure und Aspartamsäure), Butyloxycarbonylderivat (im Fall von Lysin und Histidin), Tritylderivat (im Fall von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-Trimethylbenzenesulphonylderivat (im Fall von Arginin). Wenn Glutamin oder Asparagin die C-terminalen Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-Gruppe als Schutzgruppe für die Seitenkettenfunktionalitäten verwendet. Die Festphase basiert auf einem Polydimethyl-Acrylamid-Polymer, der aus den drei Monomeren besteht: Dimethylacrylamid (Rückgrat-Monomer), Bisacryloylethylendiamin (cross linker, Quervernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungsmittel). Als abspaltbarer Linker zwischen Peptid und Harz wird ein säurelabiles 4-Hydroxymethyl-phenoxyessigsäurederivat benutzt. Alle Aminosäurederivate, mit der Ausnahme von Asparagin und Glutamin, die über eine reverse N, N-Dicyclohexyl-carbodiimid/1-hydroxybenzotriazol vermittelte Kupplung eingesetzt werden, werden als vorgeformtes symmetrisches Anhydridderivat eingesetzt. Alle Kupplungs- und Entschützungsschritte werden mit Ninhydrin, Trinitrobenzensulfonsäure oder Isotin überwacht. Nach der Fertigstellung der Synthese werden die Peptide bei gleichzeitiger Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten durch Verwendung von 95% Trifluoressigsäure, die eine 50% Mischung aus Radikalfängern enthält, vom Harz abgespalten. Die normalerweise verwendeten Radikalfänger enthalten Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die genaue Wahl von der Zusammensetzung der Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptides abhängt. Es können weiterhin auch Kombinationen von Festphasensynthese und Verfahren für die Synthese von Peptiden in Lösung verwendet werden (siehe, zum Beispiel, (Bruckdorfer et al., 2004) und die dort zitierten Referenzen).

Trifluoressigsäure wird durch Vakuumdestillation entfernt, das rohe Peptid wird durch anschließende Ausfällung mit Diethylether erhalten. Alle vorhandenen Radikalfänger werden durch einfache Extraktion entfernt, die nach Lyophlisierung der wässrigen Phase die rohen Peptide in radikalfängerfreier Form liefert. Die Reagenzien für die Peptidsynthese sind im Allgemeinen z. B. von Calbiochem-Novabiochem (Nottingham Großbritannien), zu erhalten.

Die Aufreinigung kann durch Anwendung einer Technik oder einer Kombination mehrerer Techniken, wie zum Beispiel Rückkristallisation, Gelpermeationschromatographie (GPC), lonenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie (Hydrophobie Interaction Chromatography, HIC) und (normalerweise) Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Acetonitril/Wassergradienten durchgeführt werden.

Die Analyse der Peptide kann durch Dünnschichtchromatographie, Elektrophorese, im Besonderen Kapillarelektrophorese, Festphasenextraktion (CSPE), Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse und durch Fast-Atom-Bombardment (FAB) Massenspektrometrie sowie durch MALDI und ESI-Q-TOF massenspektrometrische Analyse erfolgen.

Um überpräsentierte Peptide zu selektieren, wird ein Präsentationsprofil berechnet, das die Medianprobenpräsentation sowie die Replikationsvariation zeigt. Das Profil stellt Proben der interessierenden Tumorentität einer Basislinie von normalen Gewebeproben gegenüber. Jedes dieser Profile kann durch die Berechnung des p-Wertes eines linearen gemischten Models (Pinheiro et al., 2015), das für mehrere Tests mit False Discovery Rate (Benjamini and Hochberg, 1995) (vgl. Beispiel 1, ) angepasst wurde, zu einem Überpräsentationswert zusammengezogen werden.

Für die Identifizierung und relative Quantifizierung von HLA-Liganden mittels Massenspektrometrie wurden HLA-Moleküle aus schockgefrorenen Gewebeproben gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert. Die isolierten Peptide wurden getrennt und die Sequenzen wurden durch Online-Nano-Elektrosprüh-Ionisation (nanoESI) Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Experimente identifiziert. Die resultierenden Peptidsequenzen wurden durch den Vergleich des Fragmentierungsmusters natürlicher tumorassoziierter Peptide (TUMAPs), die aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinomproben (N = 490 Proben) stammen mit den Fragmentierungsmustern entsprechender synthetischer Referenzpeptide gleicher Sequenz verifiziert. Da die Peptide direkt als Liganden von HLA-Molekülen von Primärtumoren identifiziert wurden, liefern diese Ergebnisse direkte Hinweise auf die natürliche Verarbeitung und Präsentation der identifizierten Peptide auf primärem Krebsgewebe, das aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom gewonnen wurde.

Die Discovery-Pipeline XPRESIDENT® v2.1 (siehe z. B. US 2013-0096016 , die hiermit als Referenz in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird) ermöglicht die Identifizierung und Auswahl relevanter überpräsentierter Peptidimpfstoffkandidaten auf der Grundlage der direkten relativen Quantifizierung von HLA-beschränkten Peptidwerten auf Krebsgewebe im Vergleich zu mehreren verschiedenen nicht-kanzerösen Geweben und Organen. Dies wurde durch die Entwicklung einer markierungsfreien differentiellen Quantifizierung unter Verwendung der gewonnenen LC-MS-Daten erreicht, die von einer proprietären Datenanalysepipeline verarbeitet werden, die Algorithmen zur Sequenzidentifikation, Spektralclusterung, lonenzählung, Retentionszeitausrichtung, Ladezustandsdekonvolution und Normalisierung kombiniert.

Zusätzliche Sequenzinformationen aus öffentlichen Quellen (Olexiouk et al., 2016; Subramanian et al., 2011) wurden in die XPRESIDENT® Discovery-Pipeline integriert, um die Identifizierung von TUMAPs nicht-kanonischer Herkunft zu ermöglichen. Die Denovo-Sequenzierung wurde in einer orthogonalen Datenbank-unabhängigen Suchstrategie eingesetzt, um die von XPRESIDENT® bestimmte Peptidsequenz tumorspezifischer Spektralcluster zu identifizieren. Dadurch konnten neue TUMAPs ohne direkte Referenz in humangenomischen oder proteomischen Datenbanken identifiziert werden. Es wurden Präsentationsebenen mit Fehlerschätzungen für jedes Peptid und jede Probe ermittelt. Es wurden Peptide identifiziert, die ausschließlich auf Tumorgewebe präsentiert werden und Peptide, die im Tumor im Vergleich zu nichtkrebsartigen Geweben und Organen überpräsentiert werden.

HLA-Peptidkomplexe aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom wurden Gewebeproben gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert und mit LC-MS analysiert (siehe Beispiel 1). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom sind.

TUMAPs, die bei multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom und im Normalgewebe identifiziert wurden, wurden durch lonenzählung von markierungsfreien LC-MS-Daten quantifiziert. Das Verfahren geht davon aus, dass LC-MS-Signalbereiche eines Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korrelieren. Alle quantitativen Signale eines Peptids in verschiedenen LC-MS-Experimenten wurden basierend auf der zentralen Tendenz normiert, pro Probe gemittelt und zu einem Balkendiagramm, dem sogenannten Präsentationsprofil, zusammengeführt. Das Präsentationsprofil konsolidiert verschiedene Analysemethoden wie Proteindatenbank-Suche, Spektral-Clustering, Ladezustandsdekonvolution (Decharging) und Retentionszeitausrichtung und Normalisierung.

Neben der Überpräsentation des Peptids wurde auch die mRNA-Expression des zugrunde liegenden Gens getestet. mRNA-Daten wurden durch RNASeq-Analysen von normalem Gewebe und Krebsgewebe gewonnen (vgl. Beispiel 2, ). Eine weitere Quelle für Normalgewebedaten war eine Datenbank mit öffentlich zugänglichen RNA-Expressionsdaten von rund 3000 Normalgewebeproben (Lonsdale, 2013). Peptide, welche von Proteinen ableitet sind, deren kodierende mRNA im Krebsgewebe stark exprimiert wird, aber in lebenswichtigen normalen Geweben sehr niedrig oder nicht vorhanden ist, wurden vorzugsweise in die vorliegende Erfindung aufgenommen.

Die vorliegende Erfindung stellt Peptide zur Verfügung, die bei der Behandlung von Krebs/Tumoren nützlich sind, vorzugsweise multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, die die Peptide der Erfindung überpräsentieren oder ausschließlich präsentieren. Zu diesen Peptiden wurde durch Massenspektrometrie nachgewiesen, dass sie von HLA-Molekülen auf natürliche Weise an primärer menschlicher akuter myeloischen Leukämien, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom präsentiert werden.

Viele der Ausgangsgene/Proteine (auch als „Volllängenproteine“ oder „zugrunde liegende Proteine“ bezeichnet), aus denen die Peptide gewonnen werden, erwiesen sich bei Krebs im Vergleich zu normalen Geweben als stark überexprimiert - „Normalgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet entweder gesundes Blut, Gehirn, Herz, Leber, Lunge, Fettgewebe, Nebenniere, Gallenweg, Blase, Knochenmark, Speiseröhre, Auge, Gallenblase, Kopf-Hals-Bereich, Dickdarm, Dünndarm, Niere, Lymphknoten, Zentralnerv, peripherer Nerv, Bauchspeicheldrüse, Nebenschilddrüse, Peritoneum, Hypophyse, Pleura, Skelettmuskel, Haut, Rückenmark, Milz, Magen, Schilddrüse, Luftröhre und Harnleiterzellen oder andere normale Gewebezellen, die einen hohen Grad an Tumorassoziation der Quellgene aufweisen (siehe Beispiel 2). Darüber hinaus sind die Peptide selbst stark überrepräsentiert auf Tumorgewebe - „Tumorgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet eine Probe eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, aber nicht auf normalen Geweben (siehe Beispiel 1).

HLA-gebundene Peptide können durch das Immunsystem, spezifisch durch T-Lymphozyten erkannt werden. T-Zellen können die Zellen zerstören, die den erkannten HLA/Peptidkomplex präsentieren, z. B. die Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, welche die abgeleiteten Peptide präsentieren.

Es wurde gezeigt, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, T-Zell-Antworten zu stimulieren und/oder überrepräsentiert sind und können daher für die Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, wie beispielsweise lösliche TCRs, nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe Beispiel 3). Darüber hinaus können die Peptide, wenn sie mit dem jeweiligen MHC einen Komplex bilden, auch für die Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, insbesondere sTCRs, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und können auch in der entsprechenden Literatur (siehe auch unten) gefunden werden. Somit sind die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung einer Immunantwort in einem Patienten nützlich, durch welche Tumorzellen zerstört werden können. Eine Immunantwort in einem Patienten kann durch eine direkte Verabreichung der beschriebenen Peptide oder durch geeignete Vorläufersubstanzen (z. B. verlängerte Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren, die diese Peptide kodieren) an den Patienten, im Idealfall in Kombination mit einem Stoff, welcher die Immunogenität erhöht (d. h. eine Adjuvans) induziert werden. Es kann erwartet werden, dass die Immunantwort, die von einer solchen therapeutischen Vakzinierung ausgeht, sehr spezifisch gegen Tumorzellen ist, da die Ziel-Peptide der vorliegenden Erfindung nicht auf normalen Geweben in vergleichbaren Kopienzahl präsentiert werden, was der Gefahr einer unerwünschten Autoimmunreaktion gegen normale Zellen in dem Patienten vorbeugt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner T-Zellrezeptoren (TCRs) umfassend eine alpha-Kette und eine beta-Kette („alpha/beta-TCRs“). Ebenfalls bereitgestellt werden Peptide gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an TCRs und Antikörper zu binden, wenn sie von einem MHC-Molekül präsentiert werden.

Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Fragmente der TCRs gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an ein Peptidantigen gemäß der vorliegenden Erfindung zu binden, wenn sie von einem HLA-Molekül präsentiert werden. Der Begriff bezieht sich insbesondere auf lösliche TCR-Fragmente, z. B. TCRs, welchen die Transmembranteile und/oder konstanten Bereiche fehlen, einkettige TCRs und deren Fusionen, z. B. mit Ig. Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen zur Expression von TCRs und Peptiden der vorliegenden Beschreibung; und Verfahren zu deren Verwendung.

Der Begriff „T-Zell-Rezeptor“ (abgekürzt TCR) bezieht sich auf ein heterodimeres Molekül, das eine alpha-Polypeptidkette (alpha-Kette) und eine beta-Polypeptidkette (beta-Kette) umfasst, worin der heterodimere Rezeptor in der Lage ist, an ein Peptidantigen zu binden, das durch ein HLA-Molekül präsentiert wird. Der Begriff umfasst auch sogenannte Gamma/Delta-TCRs.

In einer Ausführungsform stellt die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorliegend beschriebenen TCRs bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle umfasst, die in der Lage ist, die TCRs unter Bedingungen zu exprimieren, die dafür geeignet sind, die Expression dieser TCRs zu fördern.

Die Beschreibung betrifft in einem weiteren Aspekt Verfahren gemäß der Beschreibung, wobei das Antigen auf MHC-Moleküle der Klasse I oder II geladen wird, die auf der Oberfläche einer geeigneten antigenpräsentierenden Zelle oder einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle exprimiert werden, indem eine ausreichende Menge des Antigens mit einer antigenpräsentierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, oder das Antigen auf Tetramere der MHC-Klasse-I oder II durch Tetramerisierung von Monomeren der Antigen/Klasse I oder II MHC-Komplexe geladen wird.

Die alpha- und beta-Ketten von alpha/beta-TCRs und die gamma- und delta-Ketten von gamma/delta-TCRs werden im Allgemeinen als jeweils zwei „Domänen“ angesehen, nämlich variable und konstante Domänen. Die variable Domäne besteht aus einer Verkettung von variabler Region (V) und Verbindungsregion (J). Die variable Domäne kann auch eine Signalsequenz (L, leader) beinhalten. Beta- und delta-Ketten können auch eine Diversitätsregion (D) beinhalten. Die alpha- und beta-konstante Domänen können auch C-terminale Transmembrandomänen (TM) beinhalten, die die alpha- und beta-Ketten an der Zellmembran verankern.

In Bezug auf gamma/delta-TCRs bezieht sich der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „TCR-gamma-variable-Domäne“ auf die Verkettung der TCR-gamma-V-(TRGV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-gamma-J-(TRGJ)-Region, und der Begriff TCR-gamma-konstante-Domäne bezieht sich auf die extrazelluläre TRGC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRGC-Sequenz. Ebenso bezieht sich der Begriff „TCR-delta-variable Domäne“ auf die Verkettung der TCR-delta-V (TRDV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-delta-D/J (TRDDATRDJ)-Region, und der Begriff „TCR-delta-konstante Domäne“ bezieht sich auf die extrazelluläre TRDC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRDC-Sequenz.

TCRs der vorliegenden Beschreibung binden bevorzugt an einen Peptid-HLA-Molekülkomplex mit einer Bindungsaffinität (KD) von ungefähr 100 µM oder weniger, ungefähr 50 µM oder weniger, ungefähr 25 µM oder weniger, oder ungefähr 10 µM oder weniger. Noch bevorzugter sind TCRs mit hoher Affinität, die Bindungsaffinitäten von ungefähr 1 µM oder weniger, ungefähr 100 nM oder weniger, ungefähr 50 nM oder weniger, ungefähr 25 nM oder weniger aufweisen. Rein beispielhaft liegen die bevorzugten Bereiche der Bindungsaffinität von TCRs der vorliegenden Erfindung bei ungefähr 1 nM bis ungefähr 10 nM; ungefähr 10 nM bis ungefähr 20 nM; ungefähr 20 nM bis ungefähr 30 nM; ungefähr 30 nM bis ungefähr 40 nM; ungefähr 40 nM bis ungefähr 50 nM; ungefähr 50 nM bis ungefähr 60 nM; ungefähr 60 nM bis ungefähr 70 nM; ungefähr 70 nM bis ungefähr 80 nM; ungefähr 80 nM bis ungefähr 90 nM; and ungefähr 90 nM bis ungefähr 100 nM.

Wie vorliegend in Verbindung mit TCRs der vorliegenden Beschreibung verwendet, werden die Begriffe „spezifische Bindung“ und grammatikalische Varianten davon mit der Bedeutung verwendet, dass sie ein TCR bezeichnen, der eine Bindungsaffinität (KD) für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex von 100 µM oder weniger aufweist.

Alpha/beta heterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung können eine eingeführte Disulfidbindung zwischen ihren konstanten Domänen aufweisen. Bevorzugte TCRs dieses Typs sind solche, die eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, mit der Ausnahme, dass Thr 48 von TRAC und Ser 57 von TRBC1 oder TRBC2 durch Cysteinreste ersetzt sind, wobei die Cysteine eine Disulfidbindung zwischen der TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und der TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR bilden.

Mit oder ohne die oben erwähnte eingeführte Zwischenkettenbindung können alpha/beta-heterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, und die TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und die TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR können durch die native Disulfidbindung zwischen Cys4 des Exons 2 des TRAC und Cys2 des Exons 2 des TRBC1 oder TRBC2 verbunden sein.

TCRs der vorliegenden Beschreibung können einen nachweisbaren Marker umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radionuklid, einem Fluorophor und Biotin. TCRs der vorliegenden Beschreibung können mit einem therapeutisch wirksamen Mittel, wie beispielsweise einem Radionuklid, einem Chemotherapeutikum oder einem Toxin, konjugiert werden.

In einer Ausführungsform weist ein TCR der vorliegenden Beschreibung mit mindestens einer Mutation in der alpha-Kette und/oder mit mindestens einer Mutation in der beta-Kette eine modifizierte Glykosylierung im Vergleich zum nicht mutierten TCR auf.

In einer Ausführungsform weist ein TCR, der mindestens eine Mutation in der TCR-alpha Kette und/oder die TCR-beta Kette umfasst, eine Bindungsaffinität für und/oder eine Bindungshalbwertszeit für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex auf, die mindestens das Doppelte derer eines TCRs, der die nicht mutierte TCR-alpha-Kette und/oder die nicht mutierte TCR-beta-Kette umfasst, ist. Die Affinitätsverbesserung tumorspezifischer TCRs und ihre Nutzung beruht auf der Existenz eines Fensters für optimale TCR-Affinitäten. Das Vorhandensein eines solchen Fensters basiert auf Beobachtungen, dass TCRs, die spezifisch für z. B. HLA-A2-restringierte Krankheitserreger sind, KD-Werte aufweisen, die im Allgemeinen etwa 10-mal niedriger sind, als TCRs, die spezifisch für z. B. HLA-A2-restringierte tumorassoziierte Selbstantigene sind. Inzwischen ist bekannt, dass Tumorantigene zwar das Potenzial haben, immunogen zu sein, da Tumore aus den eigenen Zellen entstehen, nur mutierte Proteine oder Proteine mit veränderter translationaler Prozessierung vom Immunsystem als fremd angesehen werden. Hochregulierte oder überexprimierte Antigene (sogenannte Selbstantigene) lösen nicht unbedingt eine funktionelle Immunantwort gegen den Tumor aus: T-Zellen, die TCRs exprimieren, die gegenüber diesen Antigenen hochreaktiv sind, wurden im Thymus in einem Prozess, der als zentrale Toleranz bekannt ist, negativ ausgewählt, so dass nur T-Zellen mit niedrigaffinen TCRs für Selbstantigene übrig bleiben. Daher kann die Affinität von TCRs oder Varianten der vorliegenden Beschreibung zu Peptiden durch in der Technik bekannte Verfahren erhöht werden.

Die vorliegende Beschreibung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Inkubieren von PBMCs aus HLA-A*02-negativen gesunden Spendern mit A2/Peptidmonomeren, das Inkubieren der PBMCs mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und das Isolieren der hochaviden T-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Calibur-Analyse umfasst.

Die vorliegende Beschreibung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Isolieren eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Erhalten einer transgenen Maus mit dem gesamten menschlichen TCRαβ Genlocus (1,1 und 0,7 Mb) umfasst, deren T-Zellen ein vielfältiges humanes TCR-Repertoire exprimieren, das den Maus-TCR-Mangel kompensiert, Immunisieren der Maus mit einem Peptid , Inkubieren des PBMCs aus den transgenen Mäusen mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und Isolieren der hochaviden T-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Calibur-Analyse.

In einem Aspekt werden zur Gewinnung von T-Zellen, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, Nukleinsäuren, die für TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung kodieren, in Expressionsvektoren wie gamma-Retrovirus oder -Lentivirus kloniert. Die rekombinanten Viren werden generiert und anschließend auf ihre Funktionalität wie Antigenspezifität und funktionelle Avidität getestet. Ein Aliquot des Endprodukts wird dann verwendet, um die Ziel-T-Zellpopulation (im Allgemeinen aus PBMCs von Patienten gereinigt) zu transformieren, die vor der Infusion in den Patienten expandiert wird.

In einem weiteren Aspekt, um T-Zellen zu erhalten, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, werden TCR-RNAs durch in der Technik bekannte Techniken synthetisiert, z. B. in vitro Transkriptionssysteme. Die in vitro-synthetisierten TCR-RNAs werden dann in primäre CD8+ T-Zellen eingebracht, die von gesunden Spendern durch Elektroporation gewonnen werden, um tumorspezifische TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten erneut zu exprimieren.

Um die Expression zu steigern, können Nukleinsäuren-kodierende TCRs der vorliegenden Beschreibung operativ mit starken Promotern verlinkt werden, wie zum Beispiel retroviralen langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs), Zytomegalovirus (CMV), Mausstammzellvirus (MSCV) U3, Phosphoglyzeratkinase (PGK), β-Aktin, Ubiquitin, und einem zusammengesetzten Promoter des Affenvirus 40 (SV40) / CD43, Elongationsfaktor (EF)-1a und dem Promoter von Spleen [Milz] Focus-Forming Virus (SFFV). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor für die exprimierte Nukleinsäure heterolog.

Zusätzlich zu starken Promotern können TCR-Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung zusätzliche Elemente enthalten, welche die Expression von Transgenen verstärken können, einschließlich einem zentralen Polypurintrakt (cPPT), welcher die nukleäre Translokation von lentiviralen Konstrukten fördert (Follenzi et al., 2000) und dem posttranskriptionalen regulatorischen Element des Woodchuck Hepatitis Virus (wPRE), welches das Niveau der transgenen Expression erhöht, indem es die RNA-Stabilität erhöht (Zufferey et al., 1999).

Die alpha- und beta-Ketten eines TCRs der vorliegenden Erfindung können durch Nukleinsäuren kodiert werden, die sich in separaten Vektoren befinden oder können durch Polynukleotide kodiert werden, die sich im selben Vektor befinden.

Um eine hochgradige TCR-Oberflächenexpression zu erreichen, müssen sowohl die TCR-alpha- als auch die TCR-beta-Ketten des eingeführten TCRs auf hohem Niveau transkribiert werden. Dazu können die TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung in einem einzigen Vektor in bi-cistronische Konstrukte kloniert werden, der nachweislich in der Lage ist, dieses Hindernis zu überwinden. Die Verwendung einer viralen intraribosomalen Eintrittsstelle (IRES) zwischen den Ketten TCR-alpha und TCR-beta führt zur koordinierten Expression beider Ketten, da die Ketten TCR-alpha und TCR-beta aus einem einzigen Transkript erzeugt werden, das während der Translation in zwei Proteine zerlegt wird, wodurch sichergestellt wird, dass ein gleiches Molverhältnis von TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten erzeugt wird (Schmitt et al., 2009).

Nukleinsäuren, die für TCRs der vorliegenden Beschreibung kodieren, können mit Codon optimiert werden, um die Expression aus einer Wirtszelle zu erhöhen. Eine Redundanz im genetischen Code ermöglicht es, dass einige Aminosäuren durch mehr als ein Kodon kodiert werden, aber bestimmte Kodons sind aufgrund der relativen Verfügbarkeit von passenden tRNAs sowie anderen Faktoren weniger „optimal“ als andere (Gustafsson et al., 2004). Die Modifikation der TCR-alpha und TCR-beta, Gensequenzen, so dass jede Aminosäure durch das optimale Codon für die Genexpression von Säugetieren kodiert wird, sowie die Beseitigung von mRNA-Instabilitätsmotiven oder kryptischen Spleißstellen, hat sich als signifikante Verbesserung der Genexpression von TCR-alpha und TCR-beta erwiesen (Scholten et al., 2006).

Darüber hinaus kann ein Mispairing zwischen der eingeführten und der endogenen TCR-Kette zum Erwerb von Spezifitäten führen, die ein erhebliches Risiko für die Autoimmunität darstellen. So kann beispielsweise die Bildung von gemischten TCR-Dimeren die Anzahl der CD3-Moleküle reduzieren, die für die Bildung von richtig gekoppelten TCR-Komplexen zur Verfügung stehen, und somit die funktionelle Avidität der Zellen, die das eingeführte TCR exprimieren, deutlich verringern (Kuball et al., 2007).

Um Mispairing zu reduzieren, kann die C-Terminus-Domäne der eingeführten TCR-Ketten der vorliegenden Beschreibung modifiziert werden, um die Affinität zwischen den Ketten zu fördern und gleichzeitig die Fähigkeit der eingeführten Ketten zur Kopplung mit dem endogenen TCR zu verringern. Diese Strategien können das Ersetzen der humanen TCR-alpha- und TCR-beta-C-Terminus-Domänen durch ihre murinen Gegenstücke (murinisierte C-Terminus-Domäne) beinhalten; das Erzeugen einer zweiten Interchain-Disulfidbindung in der C-Terminus-Domäne durch Einbringen eines zweiten Cysteinrestes sowohl in die TCR-alpha- als auch in die TCR-beta-Ketten der eingeführten TCR (Cysteinmodifikation); Vertauschen von interagierenden Resten in den C-Terminus-Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Kette („knob-in-hole“); und Verschmelzen der variablen Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten direkt zu CD3ζ (CD3ζ Fusion) (Schmitt et al., 2009).

In einer Ausführungsform ist eine Wirtszelle dafür konstruiert worden, einen TCR der vorliegenden Beschreibung zu exprimieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine menschliche T-Zelle oder ein T-Zell-Vorläufer. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem Krebspatienten gewonnen. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem gesunden Spender gewonnen. Wirtszellen der vorliegenden Beschreibung können im Hinblick auf einen zu behandelnden Patienten allogen oder autolog sein. In einer Ausführungsform ist der Wirt eine gamma/delta-T-Zelle, die transformiert wurde, um ein alpha/beta-TCR zu exprimieren.

Eine „pharmazeutische Zusammensetzung“ ist eine Zusammensetzung, die sich zur Verabreichung an einen Menschen in einem medizinischen Zusammenhang eignet. Vorzugsweise ist eine pharmazeutische Zusammensetzung steril und wird nach GMP-Richtlinien hergestellt.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen die Peptide entweder in der freien Form oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes (siehe auch oben). Wie hier verwendet, bezieht sich „ein pharmazeutisch akzeptables Salz“ auf ein Derivat der offenbarten Peptide, wobei das Peptid durch Herstellung von Säure- oder Basensalzen des Agents modifiziert ist. Zum Beispiel werden Säuresalze aus der freien Base (typischerweise, wenn die neutrale Form des Wirkstoffes eine neutrale -NH2-Gruppe aufweist) unter der Einbeziehung der Reaktion mit einer geeigneten Säure hergestellt. Geeignete Säuren zur Herstellung von Säuresalzen schließen sowohl organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche Säuren, als auch anorganische Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnliche, ein. Umgekehrt, werden Präparationen basischer Salze der sauren Reste, die in einem Peptid vorhanden sein können, unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Trimethylamin oder ähnlichen, hergestellt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Peptide als Salze der Essigsäure (Acetate), Trifluoracete oder der Salzsäure (Chloride).

Bevorzugt ist das Medikament der vorliegenden Erfindung ein Immuntherapeutikum, so wie ein Vakzin. Es kann dem Patienten direkt in das betroffene Organ oder systemisch i.d., i.m., s.c., i.p. und i.v. verabreicht werden oder auch ex vivo an Zellen angewandt werden, die vom Patienten oder einer menschlichen Zelllinie abstammen und dem Patienten anschließend verabreicht werden, oder es wird in vitro benutzt, um eine Subpopulation der Immunzellen, die aus dem Patienten gewonnen wurden, auszuwählen, die dem Patienten dann rückverabreicht werden. Wenn die Nukleinsäure den Zellen in vitro verabreicht wird, kann es für die Zellen nützlich sein, transfiziert zu sein, damit sie immunstimulierende Zytokine, wie zum Beispiel Interleukin-2, coexprimieren. Das Peptid kann im Wesentlichen rein sein oder es wird mit einem immunstimuliernden Adjuvans (siehe unten) kombiniert oder es wird in Kombination mit immunstimulierenden Zytokinen verwendet oder es wird mit einem geeigneten Abgabesystem, wie zum Beispiel Liposomen, eingesetzt. Das Peptid kann auch an einen geeigneten Träger befestigt werden, beispielsweise an Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Mannan (siehe WO 95/18145 und (Longenecker et al., 1993)). Das Peptid kann auch markiert sein, ein Fusionsprotein oder ein Hybridmolekül sein. Von den Peptiden, deren Sequenz in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, wird erwartet, dass sie CD4 oder CD8 T-Zellen stimulieren. Jedoch ist die Stimulierung von CD8 T-Zellen in Anwesenheit von Hilfe durch CD4 T-Helferzellen effektiver. Somit stellen für MHC-Klasse-I-Epitope, die CD8 T-Zellen stimulieren, die Fusionspartner oder Teile eines geeigneten Hybridmoleküls Epitope bereit, die CD4-positive T-Zellen stimulieren. Die CD4- und CD8-stimulierende Epitope sind im Stand der Technik wohl bekannt und beinhalten diejenigen, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.

Bei einem Aspekt umfasst das Vakzin mindestens ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 aufgeführt ist, aufweist und zumindest ein weiteres Peptid, bevorzugt zwei bis 50, weiter bevorzugt zwei bis 25, noch weiter bevorzugt 2 bis 20 und am meisten bevorzugt zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn oder achtzehn Peptide enthält. Das Peptid /die Peptide können von einem oder mehreren spezifischen TAAs erhalten werden und können an MHC Klasse-I-Moleküle binden.

Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt eine Nukleinsäure (beispielsweise ein Polynukleotid), welche ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante des Peptides kodiert. Die Nukleinsäure kann, zum Beispiel, DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon, entweder einzel- und/oder doppelsträngig oder native oder stabilisierte Formen von Polynukleotiden, so wie, zum Beispiel, Polynukleotide mit einem Phosphorothioat-Rückgrat sein, und sie kann oder kann keine Introne enthalten, solange sie das Peptid kodiert. Natürlich können nur Peptide, die natürlich vorkommende Aminosäurereste enthalten, die wiederum über natürliche Peptidbindungen verbunden sind, durch ein Polynukleotid kodiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.

Eine Vielzahl von Verfahren wurde entwickelt, um Polynukleotide, speziell DNA, zum Beispiel durch komplementäre klebrige Enden (complementary cohesive termini) an Vektoren zu binden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Abschnitte an das DNA-Segment hinzugefügt werden, um in die Vektor-DNA eingefügt zu werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären homopolymerischen Enden zusammengehalten und formen so rekombinante DNA-Moleküle.

Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, stellen ein alternatives Verfahren zum Verknüpfen des DNA-Segmentes und Vektoren dar. Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Endonukleaserestriktionsstellen enthalten, sind aus einer Anzahl von Quellen einschließlich der International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA, kommerziell erhältlich.

Ein wünschenswertes Verfahren, die DNA, die das Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, zu modifizieren, ist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion, wie sie von Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988)) offenbart wurde. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, die DNA in einen geeigneten Vektor einzuführen, zum Beispiel durch gentechnische Veränderung an geeigneten Restriktionsstellen, oder es kann dazu verwendet werden, die DNA auf andere nützliche Arten zu modifizieren, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Falls virale Vektoren verwendet werden, so sind Pocken- oder Adenovirusvektoren bevorzugt.

Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA) kann dann in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, um ein Polypeptid enthaltend ein Peptid oder ein Variante gemäß der Erfindung zu produzieren. Somit kann die DNA, die das Peptid oder eine Variante gemäß der Erfindung kodiert, entsprechend den bekannten Techniken verwendet werden, in Hinblick auf die hier enthaltene Lehre entsprechend modifiziert, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dazu verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren und zu produzieren. Solche Techniken umfassen zum Beispiel die Offenbarten in den US-Patenten mit den Nummern: 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 und 4,810,648.

Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA), die das Polypeptid, welches eine Verbindung gemäß der Erfindung darstellt, kodiert, kann an eine Vielzahl verschiedener anderer DNA-Sequenzen gebunden werden, um in einen geeigneten Wirt eingeführt zu werden. Die Begleit-DNA ist von der Art des Wirts, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon, ob episomale Erhaltung oder Integration erwünscht ist, abhängig.

Im Allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, in der richtigen Orientierung und dem korrekten Leseraster für die Expression insertiert. Wenn notwendig, kann die DNA an eine geeignete nukleotidische Transkriptions- und Translationsregulierungssequenz gebunden werden, die durch den gewünschten Wirt erkannt wird, auch wenn solche Regulierungen im Allgemeinen in dem Expressionsvektor vorhanden sind. Der Vektor wird dann mit Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, die transformierten Wirtszellen auszuwählen. Eine Selektionstechnik beinhaltet den Einbau in den Expressionsvektor einer DNA-Sequenz, die die notwendigen regulatorischen Elemente enthält und die das genetische Merkmal in der transformierten Zelle, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenz, kodiert.

Alternativ kann das Gen für solch eine auswählbare Eigenschaft ein anderer Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle gleichzeitig zu transformieren.

Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, in Hinblick auf die Lehre der vorliegenden Offenbarung kultiviert, um die Expression des Polypeptides zu ermöglichen, welches dann gewonnen werden kann.

Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (zum Beispiel E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (zum Beispiel Aspergillus spec.), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen. Vorzugsweise kann das System aus Säugetierzellen wie z. B. CHO-Zellen bestehen, die bei der ATCC Cell Biology Collection erhältlich sind.

Ein typisches Säugetierzellvektorplasmid für die konstitutive Expression umfasst die CMV oder SV40 Promoter mit einem geeigneten Poly-A-Schwanz und einem Resistenzmarker, so wie Neomycin. Ein Beispiel ist pSVL, welches über Pharmacia, Piscataway, NJ, USA erhältlich ist. Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, welcher auch über Pharmacia erhältlich ist. Nützliche Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416 und sind grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe-integrierende Plasmide (Yeast Integrating Plasmids = Ylps) und schließen die Hefe-selektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 ein. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefezentromerplasmide (Yeast Centromere plasmids = YCps). CMV-Promotor-basierende Vektoren (zum Beispiel von Sigma-Aldrich) stellen transiente oder stabile Expression, zytoplasmatische Expression oder Sekretion und N-terminale oder C-terminale Markierung in verschiedenen Kombinationen von FLAG, 3xFLAG, c-myc oder MAT bereit. Diese Fusionsproteine erlauben einen Nachweis, eine Aufreinigung und Analyse des rekombinanten Proteins. Dual-markierte Fusionen sorgen für Flexibilität bei der Erkennung

Die starke humane Cytomegalovirus (CMV)-Promotor-Regulationsregion verstärkt die konstitutiven Niveaus der Proteinexpressions bis auf 1 mg/L in COS-Zellen. Bei weniger potenten Zelllinien beträgt das Proteinniveau typischerweise -0,1 mg/L. Die Gegenwart des SV40-Replikationsursprungs führt zu hohen Konzentrationen in der DNA-Replikation von SV40 replikationspermissiven COS-Zellen. CMV-Vektoren können zum Beispiel pMB1 (Derivat von pBR322) Ursprung für die Replikation in Bakterienzellen enthalten, das b-Lactamase-Gen für die Selektion der Ampicillinresistenz in Bakterien, hGH-PolyA und den f1-Ursprung. Vektoren, die die Preprotrypsinleader (PPT)-Sequenz enthalten, können die Sekretion der FLAG-Fusionsproteine in das Kulturmedium für die Aufreinigung unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern, Harzen und Platten steuern. Andere Vektoren und Expressionssysteme sind für den Gebrauch mit einer Vielzahl von Wirtszellen aus dem Stand der Technik gut bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform werden zwei oder mehr Peptide oder Peptidvarianten der Erfindung kodiert und damit in einer aufeinanderfolgenden Reihenfolge exprimiert (ähnlich den Konstrukten „Beads on a string“). Dabei können die Peptide oder Peptidvarianten durch Abschnitte von Linker-Aminosäuren, wie z. B. LLLLLL, miteinander verknüpft oder fusioniert werden oder ohne zusätzliche Peptide zwischen ihnen verknüpft werden. Diese Konstrukte können auch für die Krebstherapie eingesetzt werden und können Immunantworten auslösen, die sowohl MHC-I als auch MHC-II betreffen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine mit einem Polynukleotidvektorkonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen können unter bestimmten Umständen die bevorzugten prokaryotischen Wirtszellen sein und sind typischerweise ein Stamm von E. coli, wie zum Beispiel der E. Coli Stamm DH5, erhältlich über Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RR1, erhältlich über die American Type Culture Collection (ATCC) aus Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen beinhalten Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, bevorzugt Wirbeltierzellen, wie zum Beispiel die der Maus, Ratte, Affe oder menschliche Fibroblasten- und Darmzelllinien. Hefewirtszellen schließen YPH499, YPH500 und YPH501 ein, die grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Bevorzugte Säugetierzellen enthalten Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), zu erhalten über das ATCC als CCL61, NIH Embryozellen der Swiss-Mäuse NIH/3T3, zu erhalten über das ATCC als CRL 1658, von Affennieren erhaltene COS-1 Zellen, zu erhalten über das ATCC als CRL 1650, und 293-Zellen, welche embryonale menschliche Nierenzellen sind. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Expressionsvektoren des Baculovirus transfiziert werden können. Eine Übersicht über die Wahl einer geeigneten Wirtszelle für die Expression kann zum Beispiel in dem Buch von Paulina Balbás und Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,“ Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, und anderer, dem Fachmann bekannten Literatur, entnommen werden.

Die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt wird typischerweise durch sehr gut bekannte Verfahren, die üblicherweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen, erreicht. Bezüglich der Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe z. B. Cohen et al. (Cohen et al., 1972) und (Green and Sambrook, 2012). Die Transformation von Hefezellen wird in Sherman et al. (Sherman et al., 1986) beschrieben. Das Verfahren von Beggs (Beggs, 1978) ist auch nützlich. In Bezug auf Wirbeltierzellen gibt es einige für die Transfektion solcher Zellen nützliche Reagenzien, wie zum Beispiel Kalziumphosphat und DEAE-Dextran oder liposomale Formulierungen, die über Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA zu erhalten sind. Elektroporation ist auch nützlich, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren, und ist im Stand der Technik für die Transformation von Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen gut bekannt.

Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken, wie beispielsweise PCR, identifiziert werden. Alternativ kann die Anwesenheit des Proteins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden.

Dem Fachmann ist es selbstverständlich, dass bestimmte erfindungsgemäße Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefe, und Insektenzellen für die Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden nützlich sind. Jedoch können auch andere Wirtszellen für bestimmte therapeutische Verfahren nützlich sein. Zum Beispiel können Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, nützlich dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen Peptide so zu exprimieren, dass sie in geeignete MHC-Moleküle beladen werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor entsprechend der Erfindung bereit.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle oder eine Antigen-präsentierende Zelle. APCs, die mit einem rekombinanten Fusionsprotein beladen sind, das Prostata-Säure-Phosphatase (PAP) enthält, wurden am 29. April 2010 von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung des asymptomatischen oder minimal symptomatischen metastatischen HRPC (Sipuleucel-T) zugelassen (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines tumorassoziierten Peptids oder seiner Varianten bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle und das Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform wird das Peptid, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor der Erfindung in der Medizin verwendet. Zum Beispiel kann das Peptid oder seine Variante für eine intravenöse Injektion (i.v.), eine subkutane Injektion (s.c.), eine intradermale Injektion (i.d.), eine intraperitoneale Injektion (i.p.) oder eine intramuskuläre Injektion (i.m.) bereitgestellt werden. Bevorzugte Verfahren, die Peptide zu injizieren, umfassen s.c., i.d., i.p., i.m. und i.v. Bevorzugte Verfahren, die DNA zu injizieren, umfassen i.d., i.m., s.c., i.p. und i.v. Dosen von beispielsweise zwischen 50 µg und 1,5 mg, bevorzugt 125 µg bis 500 µg, des Peptides oder der DNA können verabreicht werden und hängen von dem jeweiligen Peptid oder der DNA ab. Dosen aus diesem Bereich wurden erfolgreich in früheren Studien verwendet (Walter et al., 2012).

Das Polynukleotid kann für die aktive Immunisierung im Wesentlichen rein oder enthaltend in einem geeigneten Vektor oder Abgabesystem verwendet werden. Die Nukleinsäure kann DNA, cDNA, PNA, RNA oder eine Kombination davon sein. Verfahren für das Design und die Einführung solcher Nukleinsäuren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Eine Übersicht wird z. B. durch Teufel et al. (Teufel et al., 2005) bereitgestellt. Polynukleotidimpfstoffe sind leicht herzustellen, allerdings ist die Wirkungsweise dieser Vektoren zur Induzierung einer Immunantwort nicht vollkommen verstanden. Geeignete Vektoren und Zufuhrsysteme beinhalten virale DNA und/oder RNA, solche Systeme basieren auf Adenovirus, Vacciniavirus, Retroviren, Herpesvirus, Adeno-assoziiertem Virus oder Hybriden, die Elemente von mehr als einem Virus enthalten. Nicht virale Zufuhrsysteme beinhalten kationische Lipide und kationische Polymere, wie sie im Stand der Technik für die Beförderung von DNA bekannt sind. Eine physikalische Verabreichung, wie zum Beispiel durch eine „Genkanone“ (genegun), kann auch verwendet werden. Das Peptid oder Peptide, die durch eine Nukleinsäure kodiert sind, können ein Fusionsprotein mit einem Epitop sein, das T-Zellen für das entgegengesetzte CDR, wie oben beschrieben, stimuliert.

Das Medikament der Erfindung kann auch eines oder mehrere Adjuvantien enthalten. Adjuvantien sind Substanzen, die unspezifisch die Immunantwort verstärken oder potenzieren (zum Beispiel durch CD8-positive T-Zellen, und T-Helferzellen (TH) vermittelte Immunantworten gegen ein Antigen) und werden somit als nützlich in einem Medikament der vorliegenden Erfindung angesehen. Geeignete Adjuvantien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 1018 ISS, Aluminiumsalze, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, Flagellin oder TLR5-Liganden erhalten von Flagellin, FLT3-Ligand, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), Resiquimod, ImuFact IMP321, Interleukine wie IL-2, IL-13, IL-21, Interferon-alpha oder -beta, oder pegylierte Derivate davon, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, Monophosphoryl-Lipid A, Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, Wasser-in-ÖI- und ÖI-in-Wasser-Emulsionen, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® Vectorsystem, Poly(lactid co-glycolid) [PLG]-basierende und Dextran-Mikropartikel, Talactoferrin, SRL172, Virosome und andere Virus-ähnliche Partikel, YF-17D, VEGF trap, R848, Beta-Glucan, Pam3Cys, Aquila's QS21 Stimulon, welches aus Saponin erhalten wird, Extrakte aus Mykobakterien und synthetische bakterielle Zellwandmimetika und urheberrechtlich geschützte Adjuvantien wie Ribi's Detox, Quil oder Superfos. Adjuvantien wie Freund's oder GM-CSF sind bevorzugt. Verschiedene immunologische Adjuvantien (zum Beispiel MF59), die spezifisch für dendritische Zellen sind, und deren Erzeugung wurden früher beschrieben (Allison and Krummel, 1995). Auch Zytokine können verwendet werden. Verschiedene Zytokine wurden direkt mit der Beeinflussung der Migration von dendritischen Zellen zu Lymphgeweben (zum Beispiel TNF-D), der Beschleunigung der Reifung von dendritischen Zellen in effiziente Antigen-präsentierende Zellen für T-Lymphozyten (zum Beispiel GM-CSF, IL-1 und IL-4) ( U.S. Pat. Nr. 5.849.589 ausdrücklich durch Referenz in seiner Gesamtheit aufgenommen) und der Funktion als Immunoadjuvans (beispielsweise IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alpha, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996) in Verbindung gebracht.

Es wurde auch beschrieben, dass CpG immunostimulatorische Oligonukleotide den Effekt von Adjuvantien in einer Impfstoffzusammensetzung verstärken. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, agieren CpG-Oligonukleotide durch Aktivierung des angeborenen (nicht adaptivem) Immunsystems via Toll-like Rezeptoren (TLR), vor allem TLR9. CpG-getriggerte TLR9-Aktivierung verstärkt die Antigen-spezifischen humoralen und zellulären Antworten auf eine große Vielfalt von Antigenen, enthaltend Peptid- oder Proteinantigene, lebende oder abgetötete Viren, dendritische Zellimpfstoffe, autologe Zellimpfstoffe und Polysaccharid-Konjugate sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Impfstoffen. Noch wichtiger ist, dass es die Reifung und Differenzierung der dendritischen Zellen verstärkt, was zu einer verstärkten Aktivierung der TH1-Zellen und starker Generierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), auch in der Abwesenheit von CD4 T-Zellhilfe, führt. Die durch TLR9-Stimulation induzierte TH1-Prägung wird sogar in der Anwesenheit von Impfstoffadjuvantien, wie Alum oder nicht vollständigem Freundschem Adjuvans (IFA), welches normalerweise eine TH2-Prägung fördert, erhalten. CpG-Oligonukleotide zeigen eine noch größere Aktivität als Adjuvans, wenn sie mit anderen Adjuvantien formuliert oder in Formulierungen, wie Micropartikel, Nanopartikel, Lipidemulsionen oder ähnlichen Formulierungen zusammen verabreicht werden, welche besonders notwendig sind, um eine starke Antwort zu induzieren, wenn die Antigene relativ schwach sind. Sie beschleunigen auch die Immunantwort und ermöglichen es, die Dosierung des Antigens um ungefähr zwei Größenordnungen zu senken, die Antikörperantworten zu dem Volldosisimpfstoff ohne CpG sind dabei in manchen Experimenten vergleichbar ((Krieg, 2006)). Im US-Patent Nr. 6 406 705 B1 wird die kombinierte Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, nicht-Nukleinsäure-Adjuvantien und einem Antigen beschrieben, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu erzeugen. Ein CpG TLR9 Antagonist ist dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) von Mologen (Berlin, Deutschland), welches ein bevorzugter Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist. Andere TLRbindende Moleküle, wie beispielsweise RNA-bindende TLR 7, TLR 8 und/oder TLR 9 können auch verwendet werden.

Andere Beispiele von nützlichen Adjuvantien enthalten, sind aber nicht limitiert auf modifizierte CpGs (beispielsweise CpR, Idera), dsRNA-Analoge wie Poly(I:C) und Derivate davon (z. B. AmpliGen®, Hiltonol®, poly(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U)), nicht-CpG bakterielle DNA oder RNA sowie immunoaktive kleine Moleküle und Antikörper wie Cyclophosphamid, Sunitinib, Bevacizumab®, Celebrex, NCX-4016, Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil, Sorafenib, Temozolomid, Temsirolimus, XL-999, CP-547632, Pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, andere Antikörper, die auf Schlüsselstrukturen des Immunsystems (z. B. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalpha Rezeptor) zielen, und SC58175, welche therapeutisch und/oder als ein Adjuvans wirken können. Die Mengen und Konzentrationen der Adjuvantien und Zusatzstoffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch den Fachmann einfach ohne unverhältnismäßige Experimente bestimmt werden.

Bevorzugte Adjuvantien sind anti-CD40, Imiquimod, Resiquimod, GM-CSF, Cyclophosphamid, Sunitinib, Bevacizumab, Interferon-alpha, CpG-Oligonucleotide und Derivate, poly-(I:C) und Derivate, RNA, Sildenafil und partikuläre Formulierungen mit PLG oder Virusomen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das Adjuvans aus einer Gruppe bestehend aus koloniestimulierenden Faktoren, wie den Granulocyten-Macrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF, Sagramostim), Cyclophosphamid, Imiquimod, Resiquimod und Interferon-alpha, ausgewählt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das Adjuvans aus einer Gruppe bestehend aus koloniestimulierenden Faktoren, wie den Granulocyten-Macrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF, Sagramostim), Cyclophosphamid, Imiquimod und Resiquimod, ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Adjuvans Cyclophosphamid, Imiquimod oder Resiquimod. Noch bevorzugtere Adjuvantien sind Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) und anti-CD40 mAB oder Kombinationen davon.

Diese Zusammensetzung dient der parenteralen Verabreichung, bspw. als subkutane, intradermale oder intramuskuläre oder orale Verabreichung. Dabei sind die Peptide und optional weitere Moleküle in einem pharmazeutisch akzeptablen, vorzugsweise wässrigen, Träger gelöst oder suspendiert. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung Hilfsstoffe, wie bspw. Puffer, Bindemittel, Sprengmittel, Verdünnungsmittel, Aromas, Gleitmittel etc. enthalten. Die Peptide können auch zusammen mit immunstimulierenden Substanzen, z. B. Zytokinen, verabreicht werden. Eine umfassende Darstellung von Hilfsstoffen, wie sie bei einer derartigen Zusammensetzung verwendet werden können, ist bspw. in A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000), aufgeführt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei zur Prävention, Prophylaxe und/oder Therapie von adenomatöser Erkrankungen oder Tumorerkrankungen eingesetzt werden. Beispielhafte Formulierungen können zum Beispiel in EP2113253 gefunden werden.

Es ist wichtig zu verstehen, dass die durch den Impfstoff nach der Erfindung ausgelöste Immunantwort den Krebs in verschiedenen Zellstadien und Entwicklungsstadien angreift. Darüber hinaus werden verschiedene krebsassoziierte Signalwege angegriffen. Dies ist ein Vorteil gegenüber Impfstoffen, die nur ein oder wenige Ziele ansprechen, was dazu führen kann, dass sich der Tumor leicht an den Angriff anpasst (Tumor-Escape). Außerdem zeigen nicht alle einzelnen Tumore das gleiche Muster von Antigenen. Eine Kombination mehrerer tumorassoziierter Peptide stellt daher sicher, dass jeder einzelne Tumor mindestens einen Teil der Ziele ausweist. Die Zusammensetzung ist so konzipiert, dass von jedem Tumor erwartet wird, dass er mehrere der Antigene exprimiert und mehrere unabhängige Wege abdeckt, die für das Wachstum und die Aufrechterhaltung des Tumors notwendig sind. So kann der Impfstoff problemlos „von der Stange“ für eine größere Patientenpopulation verwendet werden. Das bedeutet, dass eine Vorauswahl der mit dem Impfstoff zu behandelnden Patienten auf die HLA-Typisierung beschränkt werden kann, keine zusätzlichen Biomarker-Bewertungen für die Antigenexpression erforderlich sind, aber es ist dennoch sichergestellt, dass mehrere Ziele gleichzeitig durch die induzierte Immunantwort angegriffen werden, die für die Wirksamkeit wichtig ist (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Scaffold“ auf ein Molekül, das spezifisch an eine (z. B. antigene) Determinante bindet. In einer Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Einheit, an die es gebunden ist (z. B. eine (zweite) Antigenbindungseinheit), an einen Zielort, z. B. an einen bestimmten Typ von Tumorzelle oder Tumorstroma mit der antigenen Determinante (z. B. den Komplex eines Peptids mit MHC, je nach Anwendung) zu leiten. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Signalisierung durch sein Zielantigen zu aktivieren, zum Beispiel ein komplexes T-Zell-Rezeptor-Antigen. Scaffolds beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper und Fragmente davon, Antigenbindungsdomänen eines Antikörpers, die eine variable Region der schweren Kette des Antikörpers und eine variable Region der leichten Kette des Antikörpers umfassen, Bindungsproteine, die mindestens ein sich wiederholendes Ankyrinmotiv und SDAB-Moleküle (Single Domain Antigen Binding), Aptamere, (lösliche) TCRs und (modifizierte) Zellen wie allogene oder autologe T-Zellen umfassen. Um zu beurteilen, ob ein Molekül ein Scaffold ist, das an ein Ziel bindet, können Bindungsassays durchgeführt werden.

„Spezifische“ Bindung bedeutet, dass das Scaffold den interessierenden Peptid-MHC-Komplex besser bindet als andere natürlich vorkommende Peptid-MHC-Komplexe, so dass ein Scaffold, das mit einem aktiven Molekül bewaffnet ist, das in der Lage ist, eine Zelle mit dem spezifischen Ziel zu töten, nicht in der Lage ist, eine andere Zelle ohne das spezifische Ziel, aber welche einen anderen(andere) Peptid-MHC-Komplex(e) präsentiert, zu töten. Die Bindung an andere Peptid-MHC-Komplexe ist irrelevant, wenn das Peptid des kreuzreaktiven Peptid-MHC nicht natürlich vorkommt, d.h. nicht aus dem menschlichen HLA-Peptidom stammt. Tests zur Beurteilung der Zielzelltötung sind in der Technik gut bekannt. Sie sollten mit Zielzellen (Primärzellen oder Zelllinien) mit unveränderter Peptid-MHC-Präsentation oder mit Peptiden beladenen Zellen durchgeführt werden, so dass natürlich vorkommende Protein-MHC-Niveaus erreicht werden.

Jedes Scaffold kann eine Markierung umfassen, die vorsieht, dass das gebundene Scaffold durch Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens eines Signals der Markierung erkannt werden kann. So kann beispielsweise der Scaffold mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen geeigneten zellulären Markermolekül markiert werden. Solche Markermoleküle sind in der Technik wohlbekannt. So kann beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, beispielsweise durch einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Visualisierung des gebundenen Aptamers durch Fluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglichen.

Jedes Scaffold kann mit einem zweiten aktiven Molekül wie z. B. IL-21, Anti-CD3 und Anti-CD28 konjugiert werden.

Weitere Informationen zu Polypeptidscaffolds finden sich z. B. im Hintergrundabschnitt der WO 2014/071978A1 und den darin zitierten Referenzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Aptamere. Aptamere (siehe z. B. WO 2014/191359 und die darin zitierte Literatur) sind kurze einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die sich zu definierten dreidimensionalen Strukturen falten und spezifische Zielstrukturen erkennen können. Sie haben sich als geeignete Alternativen für die Entwicklung gezielter Therapien erwiesen. Es hat sich gezeigt, dass Aptamere selektiv an eine Vielzahl von komplexen Targets mit hoher Affinität und Spezifität binden.

Aptamere, die Zelloberflächenmoleküle erkennen, wurden in den letzten zehn Jahren identifiziert und bieten Mittel zur Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ansätze. Da Aptamere nachweislich nahezu keine Toxizität und Immunogenität besitzen, sind sie vielversprechende Kandidaten für biomedizinische Anwendungen. Tatsächlich wurden Aptamere, wie z. B. prostata-spezifische Membran-Antigene, die Aptamere erkennen, erfolgreich für gezielte Therapien eingesetzt und haben sich in Xenograft-in-vivo-Modellen als funktionell erwiesen. Darüber hinaus wurden Aptamere identifiziert, die spezifische Tumorzelllinien erkennen.

DNA-Aptamere können so ausgewählt werden, dass sie Breitspektrum-Erkennungseigenschaften für verschiedene Krebszellen, insbesondere solche, die von soliden Tumoren abgeleitet sind, offenlegen, während nicht-tumorigene und primär gesunde Zellen nicht erkannt werden. Erkennen die identifizierten Aptamere nicht nur einen bestimmten Tumorsubtyp, sondern interagieren mit einer Reihe von Tumoren, so sind die Aptamere als sogenannte Breitbanddiagnostika und Therapeutika einsetzbar.

Weiterhin zeigte die Untersuchung des zellbindenden Verhaltens mit der Durchflusszytometrie, dass die Aptamere sehr gute scheinbare Affinitäten zeigten, die im nanomolaren Bereich liegen.

Aptamere sind für diagnostische und therapeutische Zwecke nützlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einige der Aptamere von Tumorzellen aufgenommen werden und so als molekulare Vehikel für die gezielte Abgabe von Krebsmedikamenten wie siRNA an Tumorzellen funktionieren können.

Aptamere können gegen komplexe Ziele wie Zellen und Gewebe und Komplexe der Peptide ausgewählt werden, die vorzugsweise aus einer Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 101 gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit dem MHC-Molekül vorliegt, unter Verwendung der Cell-SELEX-Technik (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) bestehen.

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung und Entwicklung von spezifischen Antikörpern gegen MHC / Peptid-Komplexe verwendet werden. Diese können in der Therapie dazu verwendet werden, Toxine oder radioaktive Substanzen zu dem erkrankten Gewebe zu führen. Eine weitere Verwendung dieser Antikörper kann es sein, zu Abbildungszwecken, wie PET, Radionuklide an das erkrankte Gewebe zu führen. Diese Verwendung kann dazu beitragen, kleine Metastasen zu erkennen oder um die Größe und genaue Lokalisierung von erkrankten Geweben zu bestimmen.

Daher ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers bereitzustellen, der spezifisch an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder II bindet, der mit einem HLA-restringierten Antigen (vorzugsweise einem Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung) komplexiert ist, wobei das Verfahren umfasst: Immunisierung eines genetisch modifizierten nicht-menschlichen Säugetiers umfassend Zellen, die den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder -II mit einer löslichen Form eines MHC-Klasse-I oder -Il-Moleküls, welches mit einem HLA-restringierten Antigen komplexiert ist, exprimieren; Isolierung von mRNA-Molekülen der antikörperproduzierenden Zellen von dem nicht-menschlichen Säugetier; Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek, die Proteinmoleküle, die von den mRNA-Molekülen kodiert werden, zeigen; und Isolierung von zumindest einem Phagen aus der Phagen-Display-Bibliothek, wobei der zumindest ein Phage den Antikörper zeigt, der spezifisch an den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder -II bindet, welcher mit dem HLA-beschränkten Antigen komplexiert ist.

Es ist somit ein weiterer Aspekt der Erfindung, einen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder II bindet, der mit einem HLA-restringierten Antigen komplexiert ist, wobei der Antikörper vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein bi-spezifischer Antikörper und/oder ein chimärer Antikörper ist.

Entsprechende Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und einkettiger Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexe sowie andere Werkzeuge zur Herstellung dieser Antikörper sind in WO 03/068201 , WO 2004/084798 , WO 01/72768 , WO 03/070752 und in Veröffentlichungen (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) offenbart, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle ausdrücklich durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.

Vorzugsweise bindet ein Antikörper mit einer Bindungsaffinität von unter 20 nanomolar, vorzugsweise von unter 10 nanomolar an den Komplex, was auch als „spezifisch“ im Kontext der vorliegenden Erfindung angesehen wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, das eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101, oder eine Variante davon, die mindestens zu 88% homolog (vorzugsweise identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 oder einer Variante davon ist, die T-Zellen induziert, die mit dem Peptid kreuzreagieren, wobei das Peptid nicht das zugrunde liegende Volllängen-Polypeptid ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid, das eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 oder einer Variante davon, die mindestens zu 88% homolog (vorzugsweise identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 ist, wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge von zwischen 8 und 100, vorzugsweise zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14 Aminosäuren aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, die die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder-II zu binden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 besteht, oder im Wesentlichen besteht.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid (chemisch) modifiziert ist und/oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii), oder wobei das Peptid an (oder in) einen Antikörper fusioniert ist, wie zum Beispiel einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure, die die erfindungsgemäßen Peptide kodiert, unter der Voraussetzung, dass das Peptid nicht das komplette (vollständige) menschliche Protein ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleinsäure der Erfindung, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu exprimieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Medizin, insbesondere bei der Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom, Endometriumkarzinom.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine antigenpräsentierende Zelle und bevorzugt eine dendritische Zelle ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Antigen auf ein MHC-Klasse-I oder Il-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die antigenpräsentierende Zelle einen Expressionsvektor umfasst, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 oder die Aminosäuresequenz der Variante enthält, zu exprimieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner aktivierte T-Zellen, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die T-Zellen selektiv eine Zelle erkennen, die ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend jede erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aberrant exprimieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge von T-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines beschriebenen Peptids, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Zelle oder eines erfindungsgemäßen aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten als Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Medikament gegen Krebs wirksam ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Medikament ein Impfstoff ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der Erfindung, wobei das Medikament gegen Krebs wirksam ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner bestimmte Markerproteine und Biomarker, die auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung basieren, im vorliegenden Kontext als „Targets“ bezeichnet, die zur Diagnose und/oder Prognose von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser neuartigen Targets zur Krebsbehandlung.

Der Begriff „Antikörper“ oder „die Antikörper“ wird hier in einem weiten Sinn verwendet und schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper ein. Zusätzlich zu intakten oder „vollen“ Immunglobulinmolekülen sind unter dem Begriff „Antikörper“ auch Fragmente (z. B. CDRs, Fv-, Fab- und Fc-Fragmente) oder Polymere dieser Immunglobulinmoleküle und humanisierte Versionen von Immunglobulinmolekülen enthalten, sofern sie eine der gewünschten Eigenschaften aufweisen (z. B spezifische Bindung an einem Marker(poly)peptid von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom, Abgabe eines Toxins an eine Zelle von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom, die ein Krebsmarkergen auf erhöhtem Niveau exprimiert und/oder die Aktivität eines Markerpolypeptids von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom inhibiert) gemäß der Erfindung.

Wann immer möglich, können die Antikörper der Erfindung aus kommerziellen Quellen erworben werden. Die Antikörper der Erfindung können auch unter Verwendung bekannter Verfahren erzeugt werden. Der Fachmann wird verstehen, dass entweder Volllängen-Markerpolypeptide von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom oder deren Fragmente können zur Erzeugung der Antikörper der Erfindung verwendet werden. Ein Polypeptid, das zur Erzeugung eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt wird, kann teilweise oder vollständig aus einer natürlichen Quelle gereinigt werden oder kann unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.

So kann beispielsweise eine cDNA, die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, wie beispielsweise ein Peptid gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 Polypeptid, oder eine Variante oder ein Fragment davon, in prokaryotischen Zellen (z. B. Bakterien) oder eukaryontischen Zellen (z. B., Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen) exprimiert werden, woraufhin das rekombinante Protein gereinigt und zur Erzeugung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörperpräparats verwendet werden kann, das spezifisch an den Markerpolypeptid von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom, das zur Erzeugung des Antikörpers gemäß der Erfindung verwendet wird.

Ein Fachmann auf dem Gebiet wird feststellen, dass die Erzeugung von zwei oder mehr unterschiedlichen Gruppen von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern die Wahrscheinlichkeit, einen Antikörper mit der Spezifität und Affinität für die beabsichtigte Verwendung (bspw. ELISA, Immunohistochemie und in vivo-Bildgebung, Immuntoxin-Therapie) zu erhalten, maximiert. Die Antikörper werden auf ihre gewünschte Aktivität durch bekannte Verfahren entsprechend dem Zweck, zu dem die Antikörper verwendet werden, getestet (bspw. ELISA, Immunohistochemie, Immuntherapie usw.; für weitere Informationen zu der Erzeugung und Prüfung von Antikörpern siehe z. B. Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Beispielsweise können die Antikörper in ELISA-Assays oder Western-Blots, immunhistochemischer Färbung von formalinfixierten Krebserkrankungen oder gefrorenen Gewebeschnitten untersucht werden. Nach ihrer anfänglichen in vitro Charakterisierung werden für therapeutische Benutzung oder die in vivo Diagnostik bestimmte Antikörper nach bekannten klinischen Testverfahren untersucht.

Der Begriff „monoklonaler Antikörper“, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhaltenen Antikörper, d. h. einzelne Antikörper, die die Population umfassen, sind mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere „chimäre“ Antikörper, in denen ein Teil der schweren und / oder leichten Kette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern sind, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die erwünschte antagonistische Wirkung aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 , welches hiermit in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird).

Monoklonale Antikörper der Erfindung können unter Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren, oder die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.

Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie sie in dem US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind, hergestellt werden. DNA, die die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwendung von Oligonukleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene, die die schweren und leichten Ketten muriner Antikörper kodieren, zu binden).

In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung monovalenter Antikörper geeignet. Die Verdauung von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, herzustellen, kann unter Verwendung von Routinetechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, erreicht werden. Zum Beispiel kann die Verdauung unter Verwendung von Papain durchgeführt werden. Beispiele für die Papain-Verdauung sind in der WO 94/29348 und in dem US-Patent Nr. 4.342.566 beschrieben. Die Papain-Verdauung von Antikörpern produziert typischerweise zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt Fab-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigenbindungsstelle, und einem Rest-Fc-Fragment. Die Pepsin-Behandlung erzeugt ein F(ab')2-Fragment und ein pFc'-Fragment.

Die Antikörperfragmente, ob an andere Sequenzen gebunden oder nicht, können auch Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen bestimmter Regionen oder spezifische Aminosäurereste umfassen, sofern die Aktivität des Fragments nicht wesentlich im Vergleich zu dem nicht modifizierten Antikörper oder Antikörperfragment verändert oder verschlechtert ist. Diese Modifikationen können einige zusätzliche Eigenschaften bieten, wie zum Beispiel um Aminosäuren, die zu einer Disulfidbindung fähig sind, zu entfernen / hinzufügen, um seine bio-Langlebigkeit zu erhöhen, um seine sekretorischen Eigenschaften zu ändern usw. In jedem Fall muss das Antikörperfragment eine bioaktive Eigenschaft besitzen, wie zum Beispiel eine Bindungsaktivität, die Regulierung der Bindung an die Bindungsdomäne, usw. Funktionelle oder aktive Regionen des Antikörpers können durch Mutagenese einer spezifischen Region des Proteins identifiziert werden, gefolgt von der Expression und Testen des exprimierten Polypeptids. Solche Verfahren sind leicht ersichtlich für einen Fachmann auf dem technischen Gebiet und können die ortsspezifische Mutagenese der Nukleinsäure, die das Antikörperfragment kodiert, enthalten.

Die Antikörper der Erfindung können weiterhin humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper sein. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab' oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz von nicht-menschlichem Immunglobulin enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in welchen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR eines nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüst (FR-)-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in welchen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen sind jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz, umfassen. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch mindestens einem Abschnitt von einer konstanten Immunoglobulinregion (Fc), typischerweise den Abschnitt von einem humanen Immunglobulin.

Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer Quelle, die nicht menschlich ist, in ihn eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import“-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import“-Domäne entnommen sind. Humanisierung kann im Wesentlichen durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten“ Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in welchen manche CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen der Nager-Antikörper substituiert sind.

Transgene Tiere (z. B. Mäuse), die fähig sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit einer endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren, können verwendet werden. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-Gens in chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solchen Keimlinien-mutierten Mäusen wird die Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen-Exposition zur Folge haben. Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Bibliotheken hergestellt werden.

Antikörper der Erfindung werden vorzugsweise einem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele für den pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen isotonische Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der pH-Wert der Lösung ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8 und weiter bevorzugt von etwa 7 bis etwa 7,5 Weitere Träger umfassen Retardpräparate, wie semipermeable Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizes in Form von Formkörpern, beispielsweise Folien, Liposomen oder Mikropartikel, sind. Es wird dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass bestimmte Träger bevorzugter sein können, beispielsweise abhängig von dem Verabreichungsweg und der Konzentration des Antikörpers, der verabreicht wird.

Die Antikörper können dem Individuum, Patienten oder Zellen durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder durch andere Verfahren, wie Infusion, die die Abgabe an den Blutstrom in einer wirksamen Form sicherstellen, verabreicht werden. Die Antikörper können auch auf intratumoralen oder peritumoralen Wege, zur Ausübung lokaler sowie systemischer therapeutischer Wirkungen verabreicht werden. Lokale oder intravenöse Injektion wird bevorzugt.

Wirksame Dosierungen und Zeitpläne für die Verabreichung der Antikörper können empirisch bestimmt werden und die Durchführung dieser Bestimmung liegt innerhalb des Fachwissens in der Technik. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass die Dosierung von Antikörpern, die verabreicht werden müssen, beispielsweise abhängig von dem Individuum, das den Antikörper erhalten wird, dem Weg der Verabreichung, der speziellen Art des verwendeten Antikörpers und anderer Medikamente, die verabreicht werden, variiert. Eine typische tägliche Dosis eines allein verwendeten Antikörpers könnte von etwa 1 µg/kg bis zu 100 mg/kg des Körpergewichts oder mehr pro Tag erreichen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Nach Verabreichung eines Antikörpers, vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, kann die Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers auf verschiedene Weise beurteilt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Zum Beispiel kann die Größe, Anzahl und/oder Verteilung von Krebs bei einem Patienten, der die Behandlung erhält, unter Verwendung von Standardtechniken zur Tumorvisualisierung überwacht werden. Ein therapeutisch verabreichter Antikörper, der das Tumorwachstum anhält, resultiert in einer Schrumpfung des Tumors, und/oder verhindert die Entwicklung von neuen Tumoren, verglichen mit dem Krankheitsverlauf, der in Abwesenheit der Antikörperverabreichung erfolgt wäre, ist ein wirksamer Antikörper zur Behandlung von Krebs.

Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen T-Zell-Rezeptors (sTCR) bereitzustellen, der einen spezifischen Peptid-MHC-Komplex erkennt. Solche löslichen T-Zell-Rezeptoren können aus spezifischen T-Zell-Klonen erzeugt werden, und ihre Affinität kann durch Mutagenese erhöht werden, die auf die komplementaritätsbestimmenden Regionen abzielt. Für die Auswahl der T-Zell-Rezeptoren kann der Phagen-Display verwendet werden ( US 2010/0113300 ) (Liddy et al., 2012)). Zur Stabilisierung von T-Zell-Rezeptoren während des Phagen-Displays und bei praktischer Anwendung als Medikament kann die alpha- und beta-Kette z. B. durch nicht-native Disulfidbindungen, andere kovalente Bindungen (einkettiger T-Zell-Rezeptor) oder durch Dimerisationsdomänen verknüpft werden (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Der T-Zell-Rezeptor kann mit Toxinen, Medikamenten, Zytokinen (siehe z.B. US 2013/0115191 ) und Domänen, die Effektorzellen wie eine Anti-CD3-Domäne usw. rekrutieren, verknüpft werden, um bestimmte Funktionen gegen Zielzellen auszuführen. Darüber hinaus könnte es in T-Zellen exprimiert werden, die für den adoptiven Transfer verwendet werden. Weitere Informationen können in WO 2004/033685A1 und WO 2004/074322A1 gefunden werden. Eine Kombination von sTCRs ist in WO 2012/056407A1 beschrieben. Weitere Verfahren für die Produktion sind in WO 2013/057586A1 offenbart.

Darüber hinaus können die Peptide und/oder die TCRs oder Antikörper oder andere Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, um die Diagnose „Krebs“ eines Pathologen anhand einer Biopsieprobe zu überprüfen.

Die Antikörper oder TCRs können auch für Diagnosetests in vivo verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Antikörper mit einem Radionuklid (wie ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P oder ³⁵S) markiert, so dass der Tumor unter Verwendung von Immunszintigrafie lokalisiert werden kann. In einer Ausführungsform binden Antikörper oder Fragmente davon an die extrazellulären Domänen von zwei oder mehreren Targets eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben genannten Proteinen, und der Affinitätswert (Kd) ist kleiner als 1 × 10µM.

Antikörper für diagnostische Zwecke können mit Sonden zur Detektion durch verschiedene bildgebende Verfahren markiert werden. Verfahren zum Nachweis von Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluoreszenz, Licht, konfokale und Elektronenmikroskopie; Magnetresonanztomographie und Spektroskopie; Fluoroskopie, Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie. Geeignete Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluorescein, Rhodamin, Eosin und andere Fluorophore, Radioisotope, Gold, Gadolinium und andere Lanthanide, paramagnetisches Eisen, Fluor-18 und andere Positronen-emittierende Radionuklide. Zusätzlich können Sonden bi- oder multi-funktional sein und können durch mehr als eins der aufgeführten Verfahren nachgewiesen werden. Diese Antikörper können direkt oder indirekt mit den besagten Sonden markiert werden. Die Befestigung der Sonden an die Antikörper umfasst, unter anderem, die in der Technik gut anerkannt sind, die kovalente Bindung der Sonde, Einbau der Sonde in den Antikörper und die kovalente Bindung einer chelatbildenden Verbindung zur Bindung von Sonden. Für die Immunohistochemie kann die Probe des erkrankten Gewebes frisch oder gefroren sein oder sie kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel wie Formalin fixiert sein. Die feste oder eingebettete Sektion der Probe wird mit einem markierten primären Antikörper und sekundären Antikörper in Kontakt gebracht, wobei der Antikörper verwendet wird, um die Expression der Proteine in situ nachzuweisen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein in vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T-Zellen, wobei das Verfahren umfasst in vitro in Kontakt bringen von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen MHC-Molekülen, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert werden, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die T-Zellen auf eine Antigen-spezifische Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid gemäß der Erfindung ist. Vorzugsweise wird eine ausreichende Menge des Antigens mit einer Antigen-präsentierenden Zelle benutzt.

Bevorzugterweise fehlt der Säugetierzelle oder sie besitzt ein reduziertes Niveau oder eine reduzierte Funktion des Peptid-Transporters TAP. Geeignete Zellen, in welchen TAP Peptid-Transporter fehlt, beinhalten T2, RMA-S und Drosophila-Zellen. TAP ist der mit der Antigenprozessierung assoziierte Transporter.

Die menschliche Peptid-Iadungsdefiziente Zelllinie T2 ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA mit der Katalognummer CRL 1992 erhältlich; die Drosophilazelllinie Schneider Line 2 ist von der ATCC mit der Katalognummer CRL 19863 erhältlich; die Maus RMA-S-Zelllinie ist in Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985) beschrieben.

Bevorzugterweise exprimiert die Wirtszelle vor der Transfektion substantiell keine MHC-Klasse-I-Moleküle. Es ist auch bevorzugt, dass eine Stimulatorzelle ein Molekül, das für die Bereitstellung einer Ko-Stimulation für T-Zellen wichtig ist, wie eines der folgenden: B7.1, B7.2, ICAM-1 und LFA 3, exprimiert. Die Nukleinsäuresequenz zahlreicher MHC-Klasse-I-Moleküle und der Kostimulatormoleküle sind öffentlich über die GenBank und EMBL-Datenbanken erhältlich.

Wenn ein MHC-Klasse-I-Epitop als ein Antigen verwendet wird, sind die T-Zellen - CD8-positive T-Zellen.

Wenn eine Antigen-präsentierende Zelle transfiziert wird, um ein solches Epitop zu exprimieren, bevorzugt umfasst die Zelle einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Peptid enthaltend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 oder eine Variante einer Aminosäuresequenz davon zu exprimieren.

Verschiedene andere Verfahren können zur Erzeugung von T-Zellen in vitro verwendet werden. So können beispielsweise autologe tumorinfiltrierende Lymphozyten zur Erzeugung von CTL eingesetzt werden. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) benutzen autologe periphere Blutlymphozyten (PLBs) für die Erzeugung von T-Zellen. Des Weiteren ist die Erzeugung von autologen T-Zellen durch Pulsen von dendritischen Zellen mit einem Peptid oder einem Polypeptid oder über eine Infektion mit einem rekombinanten Virus möglich. Außerdem können B-Zellen für die Produktion von autologen T-Zellen verwendet werden. Des Weiteren können mit einem Peptid oder Polypeptid gepulste oder mit einem rekombinanten Virus infizierte Makrophagen für die Erzeugung von autologen T-Zellen benutzt werden. S. Walter et al. (Walter et al., 2003)beschreiben das in vitro Priming von T-Zellen durch künstliche Antigenpräsentierende Zellen (aAPCs), was auch ein geeigneter Weg zur Erzeugung von T-Zellen gegen ein Peptid der Wahl ist. In der vorliegenden Erfindung wurden aAPCs durch Kopplung von vorgeformten MHC-Peptid Komplexen auf der Oberfläche von Polystyrenpartikeln (Microbeads) durch Biotin-Streptavidin-Biochemie generiert. Dieses System ermöglicht die genaue Steuerung der Dichte von MHC auf aAPCs, welche es möglich macht, selektive hoch- oder niedrig avide antigenspezifische T-Zellantworten mit hoher Effizienz aus Blutproben auszulösen. Abgesehen von den MHC-Peptid Komplexen sollten aAPCs andere Proteine mit kostimulierender Aktivität, wie anti-CD28 Antikörper, an ihre Oberfläche gekoppelt, tragen. Des Weiteren benötigen solche auf aAPC-basierende Systeme oft die Zugabe von geeigneten löslichen Faktoren, z. B. Zytokinen wie Interleukin-12.

Allogene Zellen können auch für die Erzeugung von T-Zellen verwendet werden und eine Methode ist in der Patentanmeldung WO 97/26328 ausführlich beschrieben, die hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Zum Beispiel können, um Antigene zu präsentieren, zusätzlich zu Drosophila-und T2-Zellen, andere Zellen verwendet werden, wie zum Beispiel CHO-Zellen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen, Bakterien, Hefe und Vaccinia-infizierte Zielzellen. Weiterhin können auch Pflanzenviren benutzt werden (siehe zum Beispiel Porta et al. (Porta et al., 1994)), welche die Entwicklung des Cowpea Mosaic Virus als ein System für die Präsentation von fremden Peptiden mit hohen Ausbeuten beschreiben.

Die aktivierten T-Zellen, die gegen das erfindungsgemäße Peptid gerichtet sind, sind für die Therapie nützlich. Somit betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung aktivierte T-Zellen, die nach den vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Methoden zu erhalten sind.

Aktivierte T-Zellen, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden, werden selektiv eine Zelle erkennen, die aberrant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 101 exprimiert.

Bevorzugt erkennt die T-Zelle die Zelle beim Interagieren durch ihren TCR mit dem HLA/Peptid-Komplex (zum Beispiel durch das Binden). Die T-Zellen sind in einem Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten nützlich, dessen Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, wobei dem Patienten eine effektive Menge aktivierter T-Zellen verabreicht wird. Die T-Zellen, die dem Patienten verabreicht werden, können von dem Patienten erhalten und, wie oben beschrieben, aktiviert werden (d. h. sie sind autologe T-Zellen). Alternativ werden die T-Zellen nicht von dem Patienten, sondern von einem anderen Individuum erhalten. Natürlich ist es bevorzugt, dass es sich hierbei um ein gesundes Individuum handelt. Mit „gesundem Individuum“ meinen die Erfinder, dass das Individuum im Allgemeinen bei guter Gesundheit ist, bevorzugt ein kompetentes Immunsystem besitzt und, weiter bevorzugt, unter keiner Krankheit leidet, auf die einfach getestet und die einfach entdeckt werden kann.

In vivo können die Zielzellen für die CD8-positiven T-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen eines Tumors (die manchmal MHC-Klasse-II exprimieren) und/oder Stromazellen in der Umgebung des Tumors (Tumorzellen) (die manchmal auch MHC-Klasse-II exprimieren (Dengjel et al., 2006)) sein.

Die T-Zellen der vorliegenden Erfindung können als aktive Wirkstoffe in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten zur Verfügung, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge von T-Zellen, wie oben definiert.

Mit „aberrant exprimiert“ meinen die Erfinder auch die Bedeutung, dass das Polypeptid im Vergleich zu Werten der Expression auf Normalgewebe überexprimiert ist oder dass das Gen in dem Gewebe, aus dem der Tumor erhalten wurde, still ist, aber im Tumor exprimiert wird. Mit „überexprimiert“ meinen die Erfinder dass das Polypeptid in einem Niveau vorkommt, das mindestens dem 1,2-fachen Niveau in normalem Gewebe entspricht; bevorzugt mindestens dem 2-fachen und bevorzugter mindestens 5-fachem oder 10-fachem Niveau in normalem Gewebe entspricht.

Die T-Zellen können durch die aus der Literatur bekannten, z. B. die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden.

Protokolle für den sogenannten adoptiven Transfer von T-Zellen sind im Fachgebiet sehr gut bekannt. Rezensionen finden sich unter: Gattioni et al. and Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Verwendung der mit MHC-komplexierten Peptide zur Erzeugung eines T-Zell-Rezeptors, dessen Nukleinsäure kloniert und in eine Wirtszelle, vorzugsweise eine T-Zelle, eingebracht wird. Diese modifizierte T-Zelle kann dann auf einen Patienten zur Therapie von Krebs übertragen werden.

Jedes Molekül der Erfindung, d. h. das Peptid, die Nukleinsäure, der Antikörper, der Expressionsvektor, Zelle, aktivierte T-Zelle, T-Zellrezeptor oder die Nukleinsäure, die es kodiert, ist für die Behandlung von Erkrankungen, charakterisiert durch Zellen, die der Immunantwort entkommen, geeignet. Deshalb kann jedes Molekül der vorliegenden Erfindung als Medikament oder zur Herstellung eines Medikamentes verwendet werden. Das Molekül kann einzeln oder in Kombination mit (einem) anderen Molekül der Erfindung oder (einem) bekannten Molekül(en) verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Kit umfassend:

(a) einen Behälter, welcher die oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält;
(b) optional einen zweiten Behälter, der ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung enthält; und
(c) gegebenenfalls, Anweisungen zur (i) Verwendung der Lösung oder (ii) der Rekonstitution und/oder der Verwendung der lyophilisierten Formulierung.

Der Kit kann weiterhin ein oder mehr von (iii) einem Puffer, (iv) einem Verdünnungsmittel, (v) einem Filter, (vi) einer Nadel oder (vii) einer Spritze enthalten. Das Gefäß ist bevorzugt eine Flasche, eine Phiole, eine Spritze oder ein Reagenzglas; und es kann ein Gefäß für die mehrfache Verwendung sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt lyophilisiert.

Kits der vorliegenden Erfindung umfassen bevorzugt eine lyophilisierte Formulierung der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Gefäß und Anweisungen für deren Rekonstitution und/oder Verwendung. Geeignete Gefäße schließen, beispielsweise, Flaschen, Phiolen (zum Beispiel Zweikammerphiolen), Spritzen (solche wie Zweikammerspritzen) und Reagenzgläser ein. Das Gefäß kann aus einer Vielzahl von Materialien wie Glas oder Plastik hergestellt werden. Bevorzugt enthält/enthalten der Kit und/oder das Gefäß Anweisungen über den oder die mit dem Gefäß assoziiert sind, die die Anleitungen für die Rekonstitution und/oder Verwendung beinhalten. Die Etikette kann beispielsweise aufzeigen, dass die lyophilisierten Formulierungen zu Peptidkonzentrationen wie oben beschrieben rekonstituiert werden. Die Etikette kann weiterhin anzeigen, dass die Formulierung für eine subkutane Verabreichung nützlich oder vorgesehen ist.

Das Gefäß, welches die Formulierung enthält, kann eine Mehrweg-Phiole sein, welche wiederholte Verabreichungen (z. B. 2 bis 6 Verabreichungen) der rekonstituierten Formulierung ermöglicht. Der Kit kann weiterhin ein zweites Gefäß, welches ein geeignetes Verdünnungsmittel (z.B. Natriumbicarbonatlösung) umfasst, umfassen.

Die endgültige Peptidkonzentration der rekonstituierten Formulierung nach der Mischung des Verdünnungsmittels und der lyophilisierten Formulierung beträgt vorzugsweise mindestens 0,15 mg/mL/Peptid (=75 µg) und bevorzugt nicht mehr als 3 mg/mL/Peptid (=1500 µg). Der Kit kann weiterhin andere Materialien, die ausgehend von einem kommerziellen oder Benutzerstandpunkt erstrebenswert sind, einschließend andere Puffer, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anweisungen für die Verwendung enthalten.

Kits der vorliegenden Erfindung können ein einzelnes Gefäß aufweisen, welches die Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung mit oder ohne andere Komponenten (z. B. andere Verbindungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen dieser anderen Verbindungen) enthält, oder können verschiedene Gefäße für jeden Komponenten haben.

Bevorzugt enthalten die Kits der Erfindung eine Formulierung der Erfindung, die für die Benutzung in Kombination mit der Co-Verabreichung einer zweiten Verbindung (wie beispielsweise Adjuvantien (z. B. GM-CSF, ein chemotherapeutisches Mittel, ein Naturprodukt, ein Hormon oder einen Antagonisten, ein anti-Angiogenmittel oder ein Inhibitor, ein Apoptose-induzierendes Mittel oder ein Chelator) gepackt ist, oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon. Die Komponenten des Kits können prekomplexiert sein oder jede Komponente kann vor der Gabe an einen Patienten in einem separaten getrennten Gefäß sein. Die Komponenten des Kits können in einer oder mehreren flüssigen Lösungen, bevorzugt einer wässrigen Lösung, bevorzugter in einer sterilen wässrigen Lösung zur Verfügung gestellt werden. Die Komponenten des Kits können auch als Feststoffe, die durch die Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln, welche bevorzugt in einem anderen getrennten Gefäß zur Verfügung gestellt werden, in Flüssigkeiten überführt werden, zur Verfügung gestellt werden.

Das Gefäß eines therapeutischen Kits kann eine Phiole, ein Reagenzglas, ein Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder ein anderes Mittel zum Aufbewahren einer Flüssigkeit oder eines Feststoffes sein. Wenn es mehr als eine Komponente gibt, enthält der Kit normalerweise eine zweite Phiole oder ein anderes Gefäß, was eine separate Dosierung erlaubt. Der Kit kann außerdem ein weiteres Gefäß für eine pharmazeutisch akzeptable Flüssigkeit enthalten. Bevorzugt enthält ein therapeutischer Kit ein Gerät (z. B., eine oder mehrere Nadeln, Spritzen, Augentropfer, Pipetten, etc.), welches die Verabreichung der Stoffe der Erfindung, welche Teile des vorliegenden Kits sind, ermöglicht.

Die vorliegende Formulierung ist für die Verabreichung der Peptide auf jedem akzeptablen Weg, wie oral (enteral), nasal, ophthal, subkutan, intradermal, intramuskulär, intravenös oder transdermal, geeignet. Bevorzugt erfolgt die Verabreichung s.c. und am meisten bevorzugt i.d. Die Verabreichung kann mit einer Infusionspumpe erfolgen.

Da die Peptide der Erfindung aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom isoliert wurden, wird das erfindungsgemäße Medikament vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelliger Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines personalisierten pharmazeutischen Produkts für einen einzelnen Patienten, umfassend die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Peptid, ausgewählt aus einem Warehouse an vorab gescreenten TUMAPs, wobei das mindestens ein in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete Peptid für die Eignung in dem einzelnen Patienten ausgewählt ist. In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Impfstoff. Das Verfahren könnte auch angepasst werden, um T-Zellklone für Downstream-Anwendungen wie TCR-Isolationen oder lösliche Antikörper und andere Behandlungsmöglichkeiten herzustellen.

Ein „personalisiertes pharmazeutisches Produkt“ bezeichnet für einen einzelnen Patienten spezifisch zugeschnittene Therapien, die nur für die Therapie bei diesem einzelnen Patienten verwendet werden, einschließlich aktiv personalisierter Krebsimpfstoffe und adoptiver zellulärer Therapien mit autologem Patientengewebe.

Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Warehouse“ auf eine Gruppe oder einen Satz von Peptiden, die auf Immunogenität und/oder Überpräsentation in einem bestimmten Tumortyp vorab geprüft wurden. Der Begriff „ Warehouse“ soll nicht implizieren, dass die einzelnen Peptide, die in dem Impfstoff enthalten sind, vorproduziert und in einer physischen Einrichtung gelagert wurden, obwohl diese Möglichkeit in Betracht gezogen wird. Es ist ausdrücklich vorgesehen, dass die Peptide de novo für jeden hergestellten individualisierten Impfstoff hergestellt oder vorproduziert und gelagert werden können. Das Warehouse (z. B. in Form einer Datenbank) besteht aus tumorassoziierten Peptiden, die im Tumorgewebe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom bei Patienten mit verschiedenen HLA-A HLA-B und HLA-C-Allelen hoch überexprimiert wurden. Es kann MHC-Klasse-I und MHC Klasse-II-Peptide oder verlängerte MHC-Klasse-I Peptide enthalten. Zusätzlich zu den tumorassoziierten Peptiden, die aus den Geweben von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom gewonnen wurden, kann das Warehouse HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 und HLA-B*44 Markerpeptide enthalten. Diese Peptide ermöglichen den quantitativen Vergleich des Ausmaßes der durch TUMAPS induzierten T-Zell-Immunität und ermöglichen somit wichtige Rückschlüsse auf die Fähigkeit des Impfstoffs, Antitumorreaktionen auszulösen. Zweitens fungieren sie als wichtige positive Kontrollpeptide, die von einem „nicht-Selbst-“ Antigen abgeleitet sind, für den Fall, dass keine durch Impfstoffe induzierten T-Zell-Reaktionen auf TUMAPs, die von „selbst“-Antigenen abgeleitet sind, bei einem Patienten beobachtet werden. Drittens kann es Rückschlüsse auf den Status der Immunkompetenz des Patienten erlauben.

TUMAPs für das Warehouse werden unter Verwendung eines integrierten funktionellen genomischen Ansatzes identifiziert, der Genexpressionsanalyse, Massenspektrometrie und T-Zell-Immunologie kombiniert (XPresident^®). Der Ansatz stellt sicher, dass nur TUMAPs, die bei einem hohen Prozentsatz von Tumoren tatsächlich vorhanden sind, aber nicht oder nur minimal im Normalgewebe exprimiert werden, für eine weitere Analyse ausgewählt werden. Für die anfängliche Auswahl der Peptide wurden Proben von Patienten mit multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom und Blutproben gesunder Spender in einem schrittweisen Ansatz analysiert:

1. HLA-Liganden aus dem malignen Material wurden durch Massenspektrometrie identifiziert.
2. Die genomweite Expressionsanalyse der Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die im bösartigen Gewebe (akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelliger Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom) im Vergleich zu einer Reihe von normalen Organen und Geweben überexprimiert wurden.
3. Die identifizierten HLA-Liganden wurden mit den Genexpressionsdaten verglichen. Überpräsentierte oder selektiv auf Tumoren präsentierte TUMAPs, die bevorzugt durch selektiv exprimierte oder überexprimierte Gene, wie in Schritt 2 festgestellt, kodiert werden, wurden als geeignete TUMAP-Kandidaten für einen Multipeptidimpfstoff betrachtet.
4. Es wurde eine Literaturrecherche durchgeführt, um weitere Nachweise für die Relevanz der identifizierten Peptide als TUMAPs zu identifizieren.
5. Die Relevanz der Überexpression auf mRNA-Ebene wurde durch die Wiedererkennung ausgewählter TUMAPs aus Schritt 3 auf Tumorgewebe und den fehlenden (oder seltenen) Nachweis an gesunden Geweben bestätigt.
6. Um zu beurteilen, ob eine Induktion von in vivo T-Zell-Antworten durch die ausgewählten Peptide möglich ist, wurden in vitro Immunogenitätstests mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern sowie Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom durchgeführt.

In einem Aspekt werden die Peptide vorab auf Immunogenität getestet, bevor sie in das Warehouse aufgenommen werden. Als Beispiel und nicht als Einschränkung wird die Immunogenität der im Warehouse enthaltenen Peptide durch ein Verfahren bestimmt, das in vitro T-Zell-Priming durch wiederholte Stimulationen von CD8+ T-Zellen von gesunden Spendern mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen, die mit Peptid/MHC-Komplexen und Anti-CD28-Antikörper beladen sind, umfasst.

Dieses Verfahren wird bevorzugt bei seltenen Krebsarten und Patienten mit einem seltenen Expressionsprofil eingesetzt. Im Gegensatz zu Multi-Peptid-Cocktails mit einer festen Zusammensetzung, wie sie derzeit entwickelt werden, ermöglicht das Warehouse eine deutlich höhere Übereinstimmung der tatsächlichen Expression von Antigenen im Tumor mit dem Impfstoff. Ausgewählte Einzel- oder Kombinationen mehrerer „von der Stange“-Peptide werden für jeden Patienten in einem Multitarget-Ansatz verwendet. In der Theorie würde ein Ansatz, der auf der Auswahl von z. B. 5 verschiedenen antigenen Peptiden aus einer Bibliothek von 50 Peptiden basiert, bereits zu etwa 17 Millionen möglichen Zusammensetzungen des Arzneimittels (DP) führen.

In einem Aspekt werden die Peptide für die Aufnahme in den Impfstoff basierend auf ihrer Eignung für den einzelnen Patienten basierend auf dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorliegend oder wie unten beschrieben, ausgewählt.

Die HLA-Phänotyp-, transkriptomischen und peptidomischen Daten werden aus dem Tumormaterial des Patienten und Blutproben gesammelt, um die am besten geeigneten Peptide für jeden Patienten zu identifizieren, die „Warehouse“ und patientenindividuelle (d.h. mutierte) TUMAPs enthalten. Es werden diejenigen Peptide ausgewählt, die im Tumor des Patienten selektiv oder überexprimiert werden und, wenn möglich, eine starke in-vitro-Immunogenität aufweisen, wenn sie mit den individuellen PBMCs der Patienten getestet werden.

Vorzugsweise werden die in dem Impfstoff enthaltenen Peptide durch ein Verfahren identifiziert, das umfasst: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; (b) Vergleichen der in (a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse (Datenbank) von Peptiden, wie vorstehend beschrieben; und (c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse (Datenbank), das mit einem tumorassoziierten Peptid korreliert, das im Patienten identifiziert wird. So werden beispielsweise die TUMAPs, die von der Tumorprobe präsentiert werden, identifiziert durch: (a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von normalem Gewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechen, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und (a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die durch den Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden. Vorzugsweise werden die Sequenzen von MHC-Liganden identifiziert, indem gebundene Peptide aus MHC-Molekülen, die aus der Tumorprobe isoliert wurden, eluiert und die eluierten Liganden sequenziert werden. Vorzugsweise werden die Tumorprobe und das Normalgewebe vom gleichen Patienten erhalten.

Zusätzlich oder alternativ zur Auswahl von Peptiden unter Verwendung eines Warehouse (Datenbank)-Modells können TUMAPs beim Patienten de novo identifiziert und dann in den Impfstoff aufgenommen werden. Als ein Beispiel können TUMAP-Kandidaten bei dem Patienten durch (a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von normalem Gewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechen, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und (a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die durch den Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden, identifiziert werden. Als weiteres Beispiel können Proteine identifiziert werden, die Mutationen enthalten, die für die Tumorprobe im Vergleich zu normalem korrespondierendem Gewebe des einzelnen Patienten einzigartig sind, und es können TUMAPs identifiziert werden, die speziell auf die Mutation abzielen. So kann beispielsweise das Genom des Tumors und des entsprechenden Normalgewebes durch vollständige Genomsequenzierung sequenziert werden: Zur Entdeckung nicht-synonymer Mutationen in den proteinkodierenden Regionen von Genen werden genomische DNA und RNA aus Tumorgeweben extrahiert und normale nicht-mutierte genomische Keimbahn-DNA aus mononukleären peripheren Blutzellen (PBMCs) extrahiert. Der angewandte NGS-Ansatz beschränkt sich auf die Re-Sequenzierung von proteinkodierenden Regionen (exome Re-Sequenzierung). Zu diesem Zweck wird exonische DNA aus menschlichen Proben mit vom Hersteller bereitgestellten Target Enrichment-Kits erfasst, gefolgt von der Sequenzierung mit z. B. einem HiSeq2000 (Illumina). Zusätzlich wird die Tumor mRNA sequenziert, um die Genexpression direkt zu quantifizieren und um zu validieren, dass mutierte Gene in den Tumoren der Patienten exprimiert werden. Die daraus resultierenden Millionen von Sequenzreads werden durch Softwarealgorithmen verarbeitet. Die Output-Liste enthält Mutationen und Expression von Genen. Tumorspezifische somatische Mutationen werden durch Vergleich mit den PBMC-basierten Keimbahnvariationen bestimmt und priorisiert. Die de novo identifizierten Peptide können dann auf Immunogenität getestet werden, wie vorstehend für das Warehouse beschrieben, und die Kandidaten-TUMAPs mit geeigneter Immunogenität werden für die Aufnahme in den Impfstoff ausgewählt.

In einer exemplarischen Ausführungsform werden die im Impfstoff enthaltenen Peptide identifiziert durch: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren präsentiert werden; (b) Vergleichen der in a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse von Peptiden, die im Vergleich zu entsprechendem Normalgewebe auf Immunogenität und Überpräsentation in Tumoren vorab geprüft wurden; (c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse, das mit einem tumorassoziierten Peptid korreliert, das im Patienten identifiziert wurde; und (d) optional Auswählen mindestens eines Peptids, das de novo in (a) identifiziert wurde, um seine Immunogenität zu bestätigen.

In einer exemplarischen Ausführungsform werden die im Impfstoff enthaltenen Peptide identifiziert durch: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; und (b) Auswählen mindestens eines de novo in (a) identifizierten Peptids und Bestätigen seiner Immunogenität.

Sobald die Peptide für einen personalisierten peptidbasierten Impfstoff ausgewählt sind, wird der Impfstoff hergestellt. Der Impfstoff ist vorzugsweise eine flüssige Formulierung, die aus den einzelnen Peptiden besteht, die in zwischen 20-40% DMSO, vorzugsweise in etwa 30-35% DMSO, wie etwa 33% DMSO, gelöst sind.

Jedes Peptid, das in ein Produkt aufgenommen werden soll, wird in DMSO gelöst. Die Konzentration der einzelnen Peptidlösungen ist in Abhängigkeit von der Anzahl der Peptide, die in das Produkt aufgenommen werden sollen, zu wählen. Die einzelnen Peptid-DMSO-Lösungen werden zu gleichen Teilen gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die alle in das Produkt aufzunehmenden Peptide mit einer Konzentration von -2,5 mg/ml pro Peptid enthält. Die gemischte Lösung wird dann 1:3 mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt, um eine Konzentration von 0,826 mg/ml pro Peptid in 33% DMSO zu erreichen. Die verdünnte Lösung wird durch einen 0,22 µm Sterilfilter gefiltert. Die endgültige Bulklösung wird erhalten.

Die endgültige Bulklösung wird in Vials gefüllt und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Ein Vial enthält 700 µL Lösung, die 0,578 mg jedes Peptids enthält. Davon werden 500 µL (ca. 400 µg pro Peptid) für die intradermale Injektion eingesetzt.

Zusätzlich dazu, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Krebs nützlich sind, sind sie auch als Diagnostika nützlich. Da die Peptide aus Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom gewonnen wurden und da festgestellt wurde, dass diese Peptide nicht oder auf einem niedrigeren Niveau im normalen Gewebe vorhanden sind, können diese Peptide zur Diagnose des Vorhandenseins eines Krebserkrankung verwendet werden.

Das Vorhandensein der beanspruchten Peptide in Gewebebiopsien in Blutproben kann einem Pathologen bei der Diagnose von Krebs hilfreich sein. Der Nachweis bestimmter Peptide mittels Antikörpern, Massenspektrometrie oder anderen in der Technik bekannten Methoden kann dem Pathologen bestätigen, dass die Gewebeprobe bösartig oder entzündet oder allgemein krankhaft ist, oder als Biomarker für akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom verwendet werden kann. Das Vorkommen von Gruppen der Peptide kann die Klassifizierung oder Subklassifizierung der erkrankten Gewebe ermöglichen.

Der Nachweis von Peptiden auf einer erkrankten Gewebeprobe kann die Entscheidung über den Nutzen von Therapien, die das Immunsystem betreffen, vor allem wenn bekannt ist oder erwartet wird, dass T-Lymphozyten an dem Wirkmechanismus beteiligt sind oder sein können, ermöglichen. Der Verlust der MHC-Expression ist ein gut beschriebener Mechanismus, mit dem infizierte oder maligne Zellen der Immunüberwachung entkommen können. Somit zeigt das Vorhandensein der Peptide, dass dieser Mechanismus von den analysierten Zellen nicht ausgenutzt wird.

Die erfindungsgemäßen Peptide können dazu verwendet werden, um Lymphozytenantworten gegen diese Peptide, wie T-Zellantworten oder Antikörperantworten gegen das Peptid oder den Peptid-Komplex mit dem MHC-Molekül, zu analysieren. Diese Lymphozytenantworten können als prognostischer Marker für die Entscheidung über die weitere Therapieschritte verwendet werden. Diese Antworten können auch als Ersatzantwortmarker in immunotherapeutischen Ansätzen verwendet werden, die darauf abzielen, Lymphozytenantworten durch unterschiedliche Methoden, z. B. Impfung des Proteins, der Nukleinsäuren, autologen Materialien, den adoptiven Transfer von Lymphozyten, zu induzieren. In gentherapeutischen Rahmen, können Lymphozytenantworten gegen Peptide bei der Beurteilung der Nebenwirkungen berücksichtigt werden. Die Überwachung der Lymphozytenreaktionen könnte auch ein wertvolles Werkzeug für die Nachsorgeuntersuchungen von Transplantationstherapien, z. B. für den Nachweis von Transplantat-gegen-Wirt und Wirt-gegen-Transplantat (graft versus host und host versus graft) Krankheiten sein.

Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen beschrieben, die bevorzugte Ausführungsformen darstellen, und unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen.

ABBILDUNGEN

Die 1A bis F zeigen die Überpräsentation verschiedener Peptide in verschiedenen Krebsgeweben (schwarze Punkte). Oberer Teil: Mediane MS-Signalintensitäten aus technischen Replikationsmessungen werden als Punkte für einzelne HLA-A*02-positive Normalwerte (graue Punkte, linker Teil der Abbildung) und Tumorproben (schwarze Punkte, rechter Teil der Abbildung), auf denen das Peptid nachgewiesen wurde, dargestellt. Die Kästen zeigen den Median, den 25. und 75. Perzentilanteil der normierten Signalintensitäten an, während sich die Whisker auf den niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartils liegt, und den höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Normale Organe werden nach Risikokategorien geordnet (Blutzellen, Blutgefäße, Gehirn, Leber, Lunge: hohes Risiko, graue Punkte; Fortpflanzungsorgane, Brust, Prostata: geringes Risiko, graue Punkte; alle anderen Organe: mittleres Risiko; graue Punkte). Unterer Teil: Die relative Peptiddetektionsfrequenz in jedem Organ wird als Spine-Plot dargestellt. Die Zahlen unter dem Panel geben die Anzahl der Proben an, in denen das Peptid aus der Gesamtzahl der für jedes Organ analysierten Proben ermittelt wurde (N = 440 für normale Proben, N = 490 für Tumorproben). Wenn das Peptid in einer Probe nachgewiesen wurde, aber aus technischen Gründen nicht quantifiziert werden konnte, wird die Probe in diese Darstellung in der Nachweisfrequenz einbezogen, aber im oberen Teil der Abbildung ist kein Punkt dargestellt. Gewebe (von links nach rechts): Normale Proben: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Monozyten; T-Zellen; Fett (Fettgewebe); Nebenniere; Gallengang; Blase; Knochenmark; Speiseröhre; Auge; Gallenbl. (Gallenblase); Kopf/Hals; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Lymphkn. (Lymphknoten); Zentr. Nerv (Zentralnerv); periph. Nerv (peripherer Nerv); Pankreas (Bauchspeicheldrüse); Parathyr (Nebenschilddrüse); Perit (Peritoneum); Hypoph. (Hypophyse); Pleura; Skel. Musk. (Skelettmuskel); Haut; Rückenmark; Milz; Magen; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter; Brust; Eierstock; Plazenta; Prostata; Hoden; Thymus; Uterus. Tumorpoben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom). Peptid: KLLDFSTRI (SEQ ID NO.: 1), Peptid: ALLDVLVKL (SEQ ID NO.: 2), ) Peptid: FLLVPSPIWQL (SEQ ID NO.: 3), ) Peptid: LVWEVVESV (SEQ ID NO.: 5), Peptid: SLLDKLSGI (SEQ ID NO.: 10). Die 1F zeigt die Überpräsentation verschiedener Peptide in verschiedenen Krebsgeweben (schwarze Punkte). Oberer Teil: Mediane MS-Signalintensitäten aus technischen Replikationsmessungen werden als Punkte für einzelne HLA-A*03-positive Normalwerte (graue Punkte, linker Teil der Abbildung) und Tumorproben (schwarze Punkte, rechter Teil der Abbildung), auf denen das Peptid nachgewiesen wurde, dargestellt. Die Kästen zeigen den Median, den 25. und 75. Perzentilanteil der normierten Signalintensitäten an, während sich die Whisker auf den niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartils liegt, und den höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Normale Organe werden nach Risikokategorien geordnet (Blutzellen, Blutgefäße, Gehirn, Leber, Lunge: hohes Risiko, graue Punkte; Fortpflanzungsorgane, Brust, Prostata: geringes Risiko, graue Punkte; alle anderen Organe: mittleres Risiko; graue Punkte). Unterer Teil: Die relative Peptiddetektionsfrequenz in jedem Organ wird als Spine-Plot dargestellt. Die Zahlen unter dem Panel geben die Anzahl der Proben an, in denen das Peptid aus der Gesamtzahl der für jedes Organ analysierten Proben ermittelt wurde (N = 36 für normale Proben, N = 107 für Tumorproben). Wenn das Peptid in einer Probe nachgewiesen wurde, aber aus technischen Gründen nicht quantifiziert werden konnte, wird die Probe in diese Darstellung in der Nachweisfrequenz einbezogen, aber im oberen Teil der Abbildung ist kein Punkt dargestellt. Gewebe (von links nach rechts) Normale Proben: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Nebenniere; Blase; Gallenblase; Dünndarm; Lymphkn. (Lymphknoten); Pankreas (Bauchspeicheldrüse); Haut; Milz; Luftröhre. Tumorpoben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphatische Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom der Gebärmutter) Peptid: SLLGAATVEPPK (SEQ ID NO.: 81; A*03).

Die bis zeigen ein exemplarisches Expressionsprofil von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die in verschiedenen Krebsproben überexprimiert sind. Tumor (schwarze Punkte) und normale (graue Punkte) Proben werden entsprechend dem Ursprungsorgan gruppiert. Box-and-whisker-Diagramme stellen den Median-FPKM-Wert, das 25. und 75. Perzentil (Box) plus Whisker dar, die sich bis zum niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartils liegt, und dem höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Normale Organe werden nach Risikokategorien geordnet. FPKM: Fragmente pro Kilobase pro Million gemappter Reads. Gewebe (von links nach rechts) Normale Proben: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Fett (Fettgewebe); Nebenniere; Gallengang; Blase; Knochenmark; Speiseröhre; Auge; Gallenbl. (Gallenblase); Kopf/Hals; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Lymphkn. (Lymphknoten); periph. Nerv (peripherer Nerv); Pankreas (Bauchspeicheldrüse); Parathyr (Nebenschilddrüse); Perit (Peritoneum); Hypoph. (Hypophyse); Pleura; Skel. Musk. (Skelettmuskel); Haut; Milz; Magen; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter; Brust; Eierstock; Plazenta; Prostata; Hoden; Thymus; Uterus. Tumorpoben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphatische Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom der Gebärmutter). Ensembl ID: ENST00000225964, Peptid: ALLDVLVKL (SEQ ID No.: 2), Ensembl ID: ENST00000374472, Peptid: SLLDKLSGI (SEQ ID No 10), ) Ensembl ID: ENST00000617924, Peptid: FASERPPSV (SEQ ID No.: 33), ) Ensembl ID: ENST00000603198, Peptid: YIYEDEVRL (SEQ ID No.: 39), Ensembl ID: ENST00000420453, Peptid: AIWSTILIA (SEQ ID No.: 43), Ensembl ID: ENST00000473984, Peptid: IAISQLTFV (SEQ ID No.: 65).

zeigt exemplarische Ergebnisse von peptidspezifischen in vitro CD8+ T-Zell-Antworten eines gesunden HLA-A*02+-Spenders. CD8+ T-Zellen wurden mit künstlichen APCs geprimt, die mit Anti-CD28 mAb und HLA-A*02 im Komplex mit Peptid mit SeqlD No 102 (GLDPTQFRV, Peptidcode: POLA1-003) (A, linke Platte) und Peptid mit SeqlD No 103 (SLVSYLDKV, Peptidcode: KRT16P-001) (B, linke Platte) beschichtet sind. Nach drei Stimulationszyklen wurde der Nachweis von peptidreaktiven Zellen durch 2D-Multimerfärbung mit A*02/SeqID No 102 (A) und A*02/SeqID No 103 (B) durchgeführt. Das rechte Feld (A und B) zeigt die Kontrollfärbung von Zellen, die mit irrelevanten A*02/Peptidkomplexen stimuliert wurden. Lebensfähige Singletzellen wurden für CD8+ Lymphozyten gegated. Boolesche Gates halfen, falsch-positive Ereignisse auszuschließen, die mit Multimeren entdeckt wurden, die für verschiedene Peptide spezifisch sind. Es werden Frequenzen spezifischer Multimer+ Zellen unter den CD8+ Lymphozyten angegeben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Identifizierung und Quantifizierung von tumorassoziierten Peptiden, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden

Gewebeproben

Das Tumorgewebe der Patienten wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien); Universitätsklinikum München (München, Deutschland). Normales Gewebe wurde von Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien; Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); BioServe (Beltsville, MD, USA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, USA); Zentrum für klinische Transfusionsmedizin Tübingen (Tübingen, Deutschland); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Kyoto Prefectural University of Medicine (KPUM) (Kyoto, Japan); Osaka City University (OCU) (Osaka, Japan); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien); Universitätsklinikum Geneva (Geneva, Schweiz); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland); Universitätsklinikum Tübingen (Tübingen, Deutschland); Universitätsklinikum München (München, Deutschland) erhalten.

Schriftliche informierte Einwilligungen wurden von allen Patienten vor der Operation oder der Autopsie erhalten. Die Geweben wurden direkt nach der Entnahme schockgefroren und bis zur Isolierung der TUMAPs bei -70°C gelagert.

Isolierung von HLA Peptiden aus Gewebeproben

HLA-Peptid-Pools von schockgefrorenen Gewebeproben wurden durch Immunfällung von festen Geweben nach einem leicht modifizierten Protokoll ((Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)) unter Benutzung eines HLA-A*02-spezifischen Antikörpers BB7.2, eines HLA-A, -B, -C-spezifischen Antikörpers W6/32, eines HLA-2-spezifischen Antikörpers L243 und eines HLA-DP-spezifischen Antikörpers B7/21, DRCNBraktivierter Sepharose, Säurebehandlung und Ultrafiltration, erhalten.

Massenspektroskopieanalysen

Die erhaltenen HLA-Peptidpools wurden gemäß ihrer Hydrophobizität durch Umkehrphasen-Chromatographie (nanoAcquity UPLC System, Waters) getrennt und die eluierten Peptide in einem LTQ- Velos und Fusions-Hybridmassenspektrometern (Thermoelectron), das mit einer ESI-Quelle ausgestattet ist, analysiert. Die Peptidpools wurden direkt auf die analytische Quarzglasmikrokapillarsäule (75 µm i.d. × 250 mm) gepackt mit 1,7 µm C18 Umkehrphasenmaterial (Waters) und einer Flussrate von 400 nL pro Minute, geladen. Anschließend wurden die Peptide unter Benutzung eines zweistufigen 180 Minuten-binären Gradienten von 10% bis 33% B bei einer Flußrate von 300 nL pro Minute getrennt. Der Gradient war aus Lösemittel A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) und Lösemittel B (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril) zusammengesetzt. Eine mit Gold beschichtete Glaskapillare (PicoTip, New Objective) wurde für die Einführung in die Nano-ESI-Quelle verwendet. Die LTQ-Orbitrap Massenspektrometer wurden in dem datenabhängigen Modus unter Verwendung einer TOP5-Strategie betrieben. Zusammenfassend wurde ein Zyklus mit einem vollständigen Scan von hoher Massengenauigkeit in der Orbitrap (R = 30 000) initiiert, dem ein MS / MS Scan auch in der Orbitrap (R = 7500) auf den 5 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen mit dynamischen Ausschluss zuvor ausgewählter Ionen folgte. Tandem-Massenspektren wurden von SEQUEST mit einer festen Falscherkennungsrate (q≤0.05) und zusätzlicher manuellen Kontrolle interpretiert. In Fällen, in denen die identifizierte Peptidsequenz unsicher war, wurde sie zusätzlich durch Vergleich des erzeugten natürlichen Peptidfragmentierungsmusters mit dem Fragmentierungsmuster eines synthetischen Sequenz-identischen Referenzpeptids validiert.

Die markierungsfreie relative LC-MS-Quantifizierung erfolgte durch lonenzählung, d.h. durch Extraktion und Analyse der LC-MS-Merkmale (Mueller et al., 2007). Das Verfahren geht davon aus, dass der LC-MS-Signalbereich des Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korreliert. Extrahierte Merkmale wurden durch Ladezustandsentfaltung und Retentionszeitausrichtung weiterverarbeitet (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Schließlich wurden alle LC-MS-Funktionen mit den Ergebnissen der Sequenzidentifikation verglichen, um quantitative Daten verschiedener Proben und Gewebe zu Peptid-Präsentationsprofilen zu kombinieren. Die quantitativen Daten wurden entsprechend der zentralen Tendenz zweistufig normiert, um Abweichungen innerhalb technischer und biologischer Replikate zu berücksichtigen. So kann jedes identifizierte Peptid mit quantitativen Daten assoziiert werden, die eine relative Quantifizierung zwischen Proben und Gewebe erlauben. Darüber hinaus wurden alle quantitativen Daten, die für Peptidkandidaten erfasst wurden, manuell überprüft, um die Datenkonsistenz zu gewährleisten und die Genauigkeit der automatisierten Analyse zu überprüfen. Für jedes Peptid wurde ein Präsentationsprofil berechnet, das die mittlere Probenpräsentation sowie die Replikatvariationen zeigt. Das Profil stellt Proben von multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom einer Basislinie von normalen Gewebeproben gegenüber. Präsentationsprofile von exemplarisch überpräsentierten Peptiden sind in dargestellt. Die Peptidpräsentation auf Tumoren für exemplarische Peptide ist in Tabelle 11 dargestellt.

Tabelle 11 zeigt die Präsentation von ausgewählten Peptiden auf verschiedenen Krebsentitäten und damit die besondere Relevanz der genannten Peptide für die Diagnose und/oder Behandlung der Krebserkrankungen wie angegeben (z. B. Peptid SEQ ID No. 1 für akute myeloische Leukämie, Darmkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom, Endometriumkarzinom, Peptid SEQ ID No. 2 für Brustkrebs, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, kleinzelligen Lungenkrebs, Endometriumkarzinom). Tabelle 11: Übersicht über die Präsentation ausgewählter tumorassoziierter Peptide der vorliegenden Erfindung über Entitäten hinweg

Krebsarten: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nichtkleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom)

SEQ ID Nr.	Sequenz	Peptidpräsentation auf verschiedenen Krebsarten
1	KLLDFSTRI	AML, CRC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
2	ALLDVLVKL	BRCA, CRC, GBC, GEJC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, SCLC, UEC
3	FLLVPSPIWQL	AML, CLL, CRC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, RCC, SCLC, UEC
4	YLGDSHVLL	AML, BRCA, CLL, CEC, GBM, HCC, MEL, NHL, NSCLC, OSCAR, RCC, SCLC, UBC
5	LVWEVVESV	HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR
6	ALHDSPVYL	AML, BRCA, CCC, CRC, GBM, GC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, RCC, SCLC, UBC, UEC
7	ALWEEVKATS L	GBM, HCC, MEL, NSCLC, OC, SCLC, UEC
8	ILQSLVPAA	CRC, NHL, NSCLC, OC, RCC
9	FLQEGDLISV	CLL, CRC, NHL, NSCLC, OSCAR, SCLC
10	SLLDKLSGI	CLL, CRC, NHL
11	ALLPHAPEAV	BRCA, HCC, HNSCC, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, SCLC, UBC
12	HLDSMNVSI	AML, CLL, GC, MEL, NHL, PACA, PRCA
13	FLDEGSLLRL	GC, HCC, HNSCC, MEL, OC, PACA, SCLC, UBC
14	LLIEVSEEL	BRCA, CRC, GBM, HCC, OSCAR, MEL, NHL, NSCLC, PACA, SCLC
15	NLVMPLLHI	AML, CLL, CRC, MEL, NSCLC, OC, PACA, UEC
16	ALLDAEQSPV AL	AML, CLL, HCC, MEL, NHL, NSCLC, RCC
17	VLWDLRPSSLI	CLL, HNSCC,NHL, NSCLC, PACA, SCLC
18	KMMTFFQGL	HCC, NSCLC, NHL, OSCAR, PRCA, UBC
19	MLLPWLPKL	CLL, GBM, HCC, HNSCC, NHL, NSCLC
20	VLISLPGKV	HCC, MEL, NSCLC
21	FVFISPSFL	AML, BRCA, CCC, CRC, GC, HCC, HNSCC, NHL, NSCLC, OC, PACA, PRCA
22	SLYDVPVGA	CLL, CRC, GBM, HCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, RCC, UBC
23	GLEVLDALL	BRCA, CRC, GC, HCC, MEL, NHL, NSCLC, RCC, UEC
24	TLTSLNILL	AML, CRC, GBM, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, SCLC, UEC
25	ISVLNLSAI	CCC, HCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, PRCA, SCLC
26	KLWTSLVNL	AML, CLL, CRC, GC, HNSCC, MEL, NSCLC, PACA, SCLC
27	IAAGVPNTDA	BRCA, CLL, HCC, MEL, NSCLC, OC, RCC
28	SQLEKPETA	HCC, HNSCC, NHL, NSCLC, SCLC, UEC
29	LLWEFPSMA	AML, CLL, GBM, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, UEC
30	LLRLTLLPL	CLL, HCC, NHL, NSCLC, OC, UEC
31	VVLPIVITL	GC, HCC, NHL, NSCLC, RCC, PACA
32	VLSVSAVLGA	CLL, GBM, GC, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, RCC
33	FASERPPSV	BRCA, CRC, GC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, SCLC, UBC
34	LLNVEPAGA	AML, BRCA, CLL, GBM, HCC, MEL, NHL, UEC
35	VLLNSNYPV	NSCLC, PRCA, UBC
36	FQVTRTTGV	GBC, HCC, NHL, NSCLC, RCC
37	KILDEFYNV	CRC, GC, HCC, NSCLC
38	SLSAWLPSL	GC, HCC, HNSCC, NSCLC, OC, OSCAR, RCC, UBC, UEC
39	YIYEDEVRL	BRCA, CRC, HCC, HNSCC, NSCLC, OC, OSCAR, SCLC, UEC
40	FTLPFLVNL	AML, CLL, CRC, GC, NHL, HCC, HNSCC, NSCLC, OC, UBC
41	LMASEGIWES SL	CRC, GC, NSCLC, PRCA
42	WITPVIPAL	AML, CLL, CRC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, OC, PACA, RCC, SCLC, UBC, UEC
43	AIWSTILIA	BRCA, CRC, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, SCLC
44	WLIPRQLAAA	PRCA
45	ALYHQSPLL	HNSCC, NSCLC, OSCAR, OC
46	AMVEIIPKV	NSCLC, SCLC, UBC
47	ALLPGVPGL	CRC, GBC, HNSCC, NSCLC, OC, RCC
48	MLAEIHPKA	AML, BRCA, GBM, MEL, NSCLC
49	FLWDPRDVVL	GBM, OC
50	GLASYLDRV	BRCA, CRC, HCC, RCC, OC, OSCAR, SCLC, UBC
51	GLLTQVHIL	AML, BRCA, CRC, GBM, HCC, NSCLC, PACA, UBC
52	LAFVSHVLI	CRC, GC
53	TISISLSSV	AML, CLL, CRC, GBM, GC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
54	GLSPDQVFL	GBM, HNSCC, MEL, NHL
55	MVQQEKLFV	AML, BRCA, CRC, GBM, GC, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, OSCAR, PACA, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
56	IITNLIVNI	AML, CRC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, RCC, SCLC, UEC
57	YVLMTSLLL	BRCA, CRC, GBM, GC, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, OSCAR, PRCA, SCLC
58	MIISHRALEL	CLL, CRC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, OC, PRCA, UBC
59	LAASTTFLGV	HNSCC, NHL, NSCLC, OSCAR, PACA, UBC
60	LLLATLENL	AML, CRC, GBM, MEL, NSCLC, SCLC, UBC, UEC
61	VLPWQPLLL	AML, GC, HCC, HNSCC, NSCLC, OC, PACA
62	SLLGKPGLTI	BRCA, CLL, CRC, GBC, HCC, NHL, NSCLC, OSCAR, RCC, PRCA, UBC, UEC
63	LSFKRSLSI	AML, BRCA, CRC, GBM, HCC, NSCLC, PRCA, RCC, UBC
64	LLLALRLSL	GBC, HCC, NHL, MEL, NSCLC, OSCAR, PACA
65	IAISQLTFV	CLL, HCC, NHL, NSCLC, OSCAR, PRCA, SCLC, UEC
66	ILNELLNSI	GBC, GC, HCC, MEL, NHL, PRCA, SCLC
67	ALKELMGPA	NHL, NSCLC, RCC
68	KLLADAFKV	AML, HCC, HNSCC, NSCLC, RCC, UBC, UEC
69	LLCPVVLQL	AML, CLL, CRC, NSCLC, RCC, UBC, UEC
70	LLLQIEPAA	GBM, HNSCC, NHL, NSCLC, UBC
71	WLMPVMPAL	CLL, GBM, GC, MEL
72	YLSFIKILL	MEL, PRCA
73	STTIINLIL	AML, BRCA, CRC, HNSCC, HCC, NSCLC, OC, PACA
74	TLLSYSIPL	CRC, GC, MEL, PACA, PRCA, UEC
75	TTQEAEKLLER	BRCA, GBC, GC, HCC, HNSCC, NSCLC, OC, PACA, PRCA, SCLC, UBC, UEC
76	TEQGPTGVTM	AML, CLL, CRC, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, OSCAR, OC, RCC, UEC
77	VPAGVDVITEY	PRCA
78	GLLPPVRAM	GBC, NHL, OSCAR
79	KIQDPGTAF	PRCA
80	RDQIVTVSV	AML, BRCA, NHL, SCLC, UBC, UEC
81	SLLGAATVEPP K	AML, BRCA, CC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC,, OC, OSCAR, PACA, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
82	LAPQMIIAL	CLL, GBC, GC, HCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, UBC, SCLC
83	KPRGPTPL	BRCA, GC, HCC, HNSCC, MEL, NSCLC, PACA, RCC, SCLC, UBC
84	RLCPAAPSEK	BRCA, CCC, CRC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, RCC, UBC, UEC
85	VYLLTFPPL	BRCA, GC,HCC, HNSCC, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, UBC, UEC
86	LMIGKRIL	HCC, HNSCC, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, SCLC, UEC
87	LNLVSETEAM VK	CRC, UEC
88	DEQETDAFLL	NSCLC
89	MIFYVLQK	AML, BRCA, CCC, CRC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, PRCA, RCC SCLC, UBC, UEC
90	YLRDFKIKR	AML, BRCA, GBM, GC, HCC, HNSCC, NSCLC, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
91	SSHFILVTF	CCC, GC, HCC, RCC
92	ELVAVTSVL	CLL, NHL, PACA, SCLC, UEC
93	WQKNSMRL	NSCLC
94	MGRRRNLY	CCC, GBM, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PACA, PRCA, SCLC, UBC, UEC
95	QVKIVTLL	GC, NSCLC, OC, PACA, PRCA, RCC
96	KIIEDLANTV	CCC, CRC, HCC, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, SCLC, UBC, UEC
97	GLIDDKGTIKL	AML, BRCA, CRC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, SCLC, UBC, UEC
98	SLMEVTHDL	BRCA, GBM, HCC, HNSCC, NHL, NSCLC, OC, OSCAR, PRCA, UBC, UEC
99	ALMDGSESRF FV	BRCA, CLL, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLC, OC, UEC
100	SLGPPPVGV	AML, GBM, OC, UBC
101	KLPEGHLPEV	HNSCC, MEL, NSCLC, OSCAR, PACA, RCC

BEISPIEL 2

Expressionsprofile von Genen, die die Peptide der Erfindung kodieren

Eine Überpräsentation oder spezifische Präsentation eines Peptids auf Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen ist ausreichend für seinen Nutzen in der Immuntherapie, und einige Peptide sind tumorspezifisch, obwohl ihr Ausgangsprotein auch im normalen Gewebe vorkommt. Dennoch bietet das mRNA-Expressionsprofiling ein zusätzliches Maß an Sicherheit bei der Auswahl von Peptid-Targets für Immuntherapien. Insbesondere für Therapieoptionen mit hohen Sicherheitsrisiken, wie z. B. affinitätsgereifte TCRs, wird das ideale Zielpeptid aus einem Protein gewonnen, das einzigartig für den Tumor ist und nicht im normalen Gewebe vorkommt.

RNA-Quellen und Herstellung

Operativ entfernte Gewebeproben wurden wie oben verdeutlicht zur Verfügung gestellt, (siehe Beispiel 1), nachdem von jedem Patienten eine informierte, schriftliche Einwilligung erhalten worden war. Tumorgewebeproben wurden unmittelbar nach der Operation schockgefroren und später mit Mörser und Stößel unter Flüssigstickstoff homogenisiert. Die gesamte RNA wurde aus diesen Proben unter Benutzung von TRI-Reagent (Ambion, Darmstadt, Deutschland) gefolgt von einer Aufreinigung mit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Deutschland) hergestellt; beide Verfahren wurden nach den Protokollen der Hersteller durchgeführt.

Die gesamte RNA aus gesundem menschlichem Gewebe für RNASeq-Experimente wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien).

Die gesamte RNA aus Tumorgeweben für RNASeq-Experimente wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien); BioCat GmbH (Heidelberg, Deutschland); BioServe (Beltsville, MD, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Neapel, Italien); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland).

Die Qualität und die Quantität aller RNA-Proben wurde an einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Deutschland) unter Benutzung des RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent) bewertet.

RNAseg Experimente

Die Genexpressionsanalyse von RNA-Proben aus Tumor- und Normalgewebe wurde durch Next Generation Sequenzierung (RNAseq) von CeGaT (Tübingen, Deutschland) durchgeführt. Zusammenfassend, werden Sequenzierungsbibliotheken mit dem Illumina HiSeq v4 Reagenzienkit gemäß dem Protokoll des Anbieters (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) erstellt, das RNA-Fragmentierung, cDNA-Konvertierung und Hinzufügen von Sequenzierungsadaptern beinhaltet. Bibliotheken, die aus mehreren Proben gewonnen werden, werden äquimolar gemischt und auf dem Illumina HiSeq 2500 Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert, wobei 50 bp Single End Reads erzeugt werden. Die prozessierten Reads werden mit der STAR-Software auf das menschliche Genom (GRCh38) gemappt. Expressionsdaten werden auf Transkriptionsebene als RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped Reads, erzeugt durch die Software Cufflinks) und auf Exon-Ebene (Total Reads, erzeugt durch die Software Bedtools), basierend auf der Anleitung aus der Ensembl-Sequenzdatenbank (Ensembl77), bereitgestellt. Exon-Werte werden auf Exon-Länge und Ausrichtungsgröße normiert, um RPKM-Werte zu erhalten.

Exemplarische Expressionsprofile von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die in akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom stark überexprimiert oder ausschließlich exprimiert sind, werden in gezeigt. Expressionswerte für weitere exemplarische Gene sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Expressionswerte Die Tabelle listet Peptide von Genen auf, die in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben sehr stark (+++) überexprimiert sind, in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben stark (++) überexprimiert sind oder in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben überexprimiert (+) sind.Die Basislinie für diesen Wert wurde aus Messungen der folgenden relevanten Normalgewebe berechnet: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Fettgewebe; Nebenniere; Gallenweg; Blase; Knochenmark; Knorpel; Speiseröhre; Auge; Gallenblase; Kopf/Hals; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Lymphknoten; Zentralnerv; peripherer Nerv; Pankreas; Nebenschilddrüse; Peritoneum; Hypophyse; Pleura; Skelettmuskel; Haut; Rückenmark; Milz; Magen; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter.

Falls Expressionsdaten für mehrere Proben desselben Gewebetyps vorliegen, wurde für die Berechnung das arithmetische Mittel aller entsprechenden Proben verwendet.

SEQ ID No	Sequenz	Genexpression
3	FLLVPSPIWQL	+
5	LVWEVVESV	+
9	FLQEGDLISV	+
10	SLLDKLSGI	++
14	LLIEVSEEL	++
17	VLWDLRPSSLI	++
18	KMMTFFQGL	+
19	MLLPWLPKL	+
24	TLTSLNILL	+
31	VVLPIVITL	+
32	VLSVSAVLGA	++
33	FASERPPSV	+++
34	LLNVEPAGA	++
35	VLLNSNYPV	+++
36	FQVTRTTGV	+++
37	KILDEFYNV	++
38	SLSAWLPSL	+++
39	YIYEDEVRL	+++
40	FTLPFLVNL	++
41	LMASEGIWESSL	++
42	WITPVIPAL	+
43	AIWSTILIA	++++
44	WLIPRQLAAA	++++
46	AMVEIIPKV	+
47	ALLPGVPGL	++
48	MLAEIHPKA	++
49	FLWDPRDVVL	++
51	GLLTQVHIL	++
52	LAFVSHVLI	+++
53	TISISLSSV	++
54	GLSPDQVFL	++
56	IITNLIVNI	++++
57	YVLMTSLLL	+++
59	LAASTTFLGV	++
60	LLLATLENL	+
62	SLLGKPGLTI	++
63	LSFKRSLSI	++
64	LLLALRLSL	+++
65	IAISQLTFV	++++
66	ILNELLNSI	+
67	ALKELMGPA	++
68	KLLADAFKV	+++
69	LLCPVVLQL	+++
70	LLLQIEPAA	+++
71	WLMPVMPAL	++

BEISPIEL 3

In vitro Immunogenität von MHC Klasse I-präsentierten Peptiden

Um Informationen über die Immunogenität der TUMAPs der vorliegenden Erfindung zu erhalten, führten die Erfinder Untersuchungen mit einem in vitro T-Zell-Priming-Assay durch, der auf wiederholten Stimulationen von CD8+ T-Zellen mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs) basiert, die mit Peptid/MHC-Komplexen und Anti-CD28-Antikörpern beladen sind. Auf diesem Weg zeigten die Erfinder die Immunogenität der HLA-A*0201-restringierten TUMAPs der Erfindung, was veranschaulicht, dass diese Peptide T-Zell-Epitope sind, gegen die in Menschen CD8+ Vorläufer-T-Zellen existieren (Tabelle 13).

In vitro Priming von CD8+ T-Zellen

Um in vitro Stimulationen mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPC), beladen mit einem Peptid-MHC-Komplex (pMHC) und einem Anti-CD28-Antikörper, durchzuführen, haben die Erfinder zuerst CD8+ T-Zellen aus frischen HLA-A*02 Leukaphereseprodukten, durch Positivselektion mit CD8-Mikroperlen (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) von gesunden Spendern, erhalten von den Universitätskliniken Mannheim, Deutschland, nach Einverständniserklärung, isoliert.

PBMCs und isolierte CD8+-Lymphozyte wurden bis zur Benutzung in einem T-Zellmedium (TCM) bestehend aus RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland), 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin (Cambrex, Köln, Deutschland), 1 mM Natriumpyruvat (CCPro, Neustadt, Deutschland) und 20 µg/ml Gentamycin (Cambrex) inkubiert. 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) und 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Deutschland) wurden auch dem TCM auf diesem Schritt zugegeben.

Die Erzeugung von pMHC/anti-CD28 beschichteten Beads, T-Zell-Stimulationen und Auslesen erfolgte in einem hoch definierten in vitro System mit vier verschiedenen pMHC-Molekülen pro Stimulationsbedingung und 8 verschiedenen pMHC-Molekülen pro Auslesezustand.

Das aufgereinigte kostimulatorische Maus-IgG2a anti human CD28 Ab 9.3 (Jung et al., 1987) wurde unter Verwendung von Sulfo-N-Hydroxysuccinimidobiotin entsprechend der Empfehlung des Herstellers (Perbio, Bonn, Deutschland) chemisch biotinyliert. Die benutzen Beads waren Streptavidin-beschichtete Polystyrol-Partikel mit einem Durchmesser von 5,60 µm (Bangs Laboratories, Illinois/USA).

Die für die positive und negative Kontrollstimulationen benutzten pMHCs waren jeweils A*0201/MLA-001 (Peptid ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 104) aus modifiziertem Melan-A/MART-1) und A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI aus DDX5, SEQ ID NO. 105).

800.000 Beads / 200 µl wurden in 96-Well-Platten in Gegenwart von 4 × 12,5 ng verschiedenen Biotin-pMHC beschichtet, gewaschen und 600 ng Biotin anti-CD28 anschließend in einem Volumen von 200 µl zugegeben. Die Stimulationen wurden in 96-Well-Platten durch Koinkubierung von 1×10⁶ CD8+ T-Zellen mit 2×10⁵ gewaschenen, beschichteten Beads in 200 µl TCM ergänzt mit 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) für 3 Tage bei 37°C initiiert. Die Hälfte des Mediums wurde dann mit frischem TCM, ergänzt mit 80 U/ml IL-2, ausgetauscht und die Inkubation wurde für 4 Tage bei 37°C weitergeführt. Dieser Stimulationszyklus wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Für die pMHC-Multimerauslesung unter Verwendung von 8 verschiedenen pMHC-Molekülen pro Testbedingung wurde, wie zuvor beschrieben (Andersen et al., 2012), ein zweidimensionaler kombinatorischer Kodierungsansatz verwendet, wobei kleinere Modifikationen die Kopplung an 5 verschiedene Fluorochrome umfassen. Schließlich wurden Multimeranalysen durch das Färben der Zellen mit Live/Dead-nah IR-Farbstoff (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), CD8-FITC-Antikörper Klon SKI (BD, Heidelberg, Deutschland) und fluoreszierenden pMHC-Multimeren durchgeführt. Für die Analyse wurde ein BD LSRII SORP-Zytometer, ausgestattet mit geeigneten Lasern und Filtern, verwendet. Die peptidspezifischen Zellen wurden als Prozentsatz der Gesamt-CD8+ Zellen berechnet. Die Auswertung der Multimeranalyse wurde unter Verwendung von FlowJo Software (Tree Star, Oregon, USA) durchgeführt. Das in-vitro-Priming von spezifischen Multimer+ CD8+ Lymphozyten wurde durch Vergleich mit negativen Kontrollstimulationen nachgewiesen. Die Immunogenität für ein vorgegebenes Antigen wurde gemessen, wenn festgestellt wurde, dass zumindest ein evaluierbares in vitro stimuliertes Well eines gesunden Spenders eine spezifische CD8+ T-Zelllinie nach der in vitro Stimulierung enthält (d. h. dieses Well enthielt zumindest 1 % der spezifischen Multimer+ unter den CD8+ T-Zellen und der Prozentsatz der spezifischen Multimer+ Zellen war zumindest das 10-fache des Medians der negativen Kontrollstimulierungen).

In vitro Immunogenität von Peptiden von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom

Für getestete HLA-Klasse-I-Peptide konnte die in vitro Immunogenität durch die Erzeugung von Peptid-spezifischen T-Zelllinien nachgewiesen werden. Beispiele für die Ergebnisse der Durchflusszytometrie nach TUMAP-spezifischer Multimer-Färbung für zwei Peptide der Erfindung werden in und zusammen mit einer entsprechenden Negativkontrolle gezeigt. Die Ergebnisse für 2 der Peptide werden in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13: In vitro Immunogenität von HLA-Klasse-I-Peptiden

Exemplarische Ergebnisse von in vitro-Immunogenitätsexperimenten, die vom Anmelder für die Peptide der Erfindung durchgeführt wurden. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

SEQ ID No	Sequenz	Positive Wells [%]
102	GLDPTQFRV	++++
103	SLVSYLDKV	+

BEISPIEL 4

Synthese der Peptide

Alle Peptide wurden unter Verwendung von Standard- und gut etablierter Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung der Fmoc-Strategie synthetisiert. Die Identität und Reinheit jedes einzelnen Peptids wurde durch Massenspektrometrie und analytische RP-HPLC bestimmt. Die Peptide wurden als weiße bis gebrochen weiße Lyophilisate (Trifluoracetatsalze) in Reinheiten >50% erhalten. Alle TUMAPs werden bevorzugt als Trifluoracetatsalze oder Acetatsalze verabreicht, es sind auch andere Salzformen möglich.

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Claims

Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 und Variantensequenzen davon, die mindestens zu 88% homolog zu SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 sind, und wobei die Variante an Molekül(e) des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit dem Variantenpeptid kreuzreagieren; und ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei das Peptid kein Polypeptid voller Länge ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Fähigkeit aufweist, an ein MHC-Klasse-I- oder -Il-Molekül zu binden, und wobei das Peptid, wenn es an das MHC gebunden ist, von CD4 und/oder CD8 T-Zellen erkannt werden kann.
Peptid oder Variante davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz davon einen kontinuierlichen Abschnitt von Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 umfasst.
Peptid oder Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid oder die Variante davon eine Gesamtlänge von 8 bis 100, vorzugsweise von 8 bis 30, und mehr bevorzugt von 8 bis 16 Aminosäuren aufweist, und am meisten bevorzugt wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 besteht oder im Wesentlichen besteht.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid modifiziert ist und / oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii).
Antikörper, insbesondere löslicher oder membrangebundener Antikörper, vorzugsweise monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon, der das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, vorzugsweise das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 spezifisch erkennt, wenn er an ein MHC-Molekül gebunden ist.
T-Zell-Rezeptor, vorzugsweise löslich oder membrangebunden, oder ein Fragment davon, der mit einem HLA-Liganden reagiert, wobei der Ligand das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, vorzugsweise das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wenn es an ein MHC-Molekül gebunden ist.
T-Zell-Rezeptor nach Anspruch 8, wobei die Liganden-Aminosäuresequenz mindestens zu 88% einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 identisch ist, oder wobei die Liganden-Aminosäuresequenz aus einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 besteht.
T-Zell-Rezeptor nach Anspruch 8 oder 9, wobei der T-Zell-Rezeptor als lösliches Molekül bereitgestellt wird und optional eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder Toxin trägt.
Aptamer, der das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 spezifisch erkennt, vorzugsweise das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das an ein MHC-Molekül gebunden ist.
Nukleinsäure, die für ein Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einen Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 7, einen T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, gegebenenfalls verbunden mit einer heterologen Promotorsequenz, oder einen Expressionsvektor, der die Nukleinsäure exprimiert, kodiert.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, den T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9 oder die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle vorzugsweise aus einer antigenpräsentierenden Zelle, wie beispielsweise einer dendritischen Zelle, einer T-Zelle oder einer NK-Zelle, ausgewählt ist.
In vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T Lymphozyten, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen in vitro von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-I oder II MHC-Molekülen umfasst, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder eines künstlichen Konstrukts, das eine Antigen-präsentierende Zelle nachahmt, exprimiert werden, für eine Zeitdauer die ausreichend ist, um die T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Aktivierte T-Lymphozyten, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14, welche selektiv eine Zelle erkennen, die ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 präsentiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 7, dem T-Zell-Rezeptor oder Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, dem Aptamer nach Anspruch 11, der Nukleinsäure oder dem Expressionsvektor nach Anspruch 12, der Wirtszelle nach Anspruch 13 oder den aktivierten T-Lymphozyten nach Anspruch 15 oder einen konjugierten oder markierten Wirkstoff und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und gegebenenfalls pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe und/oder Stabilisatoren.
Verfahren zur Herstellung des Peptids oder einer Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6, des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 7 oder des T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 13 und das Isolieren des Peptids oder der Variante davon, des Antikörpers oder des Fragments davon oder des T-Zell-Rezeptors oder des Fragments davon aus der Wirtszelle und/oder seinem Kulturmedium umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, der T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 zur Verwendung in der Medizin.
Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, festgelegt in einem der Ansprüche 1 bis 4, präsentieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge von aktivierter T-Zellen, wie es im Anspruch 15 definiert ist, umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, der T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 zur Verwendung in der Diagnose und/oder Behandlung von Krebs oder zur Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes gegen Krebs.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Krebs aus einer Gruppe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs, Endometriumkarzinom und anderen Tumoren ausgewählt wird, die eine Überexpression eines Proteins, von dem ein Peptid gemäß SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 101 abgeleitet ist, aufweisen.
Kit umfassend: (a) einen Behälter umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das/die Peptid/e nach einem der Ansprüche 1 bis 6, den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, den T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder den aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält; (b) gegebenenfalls, einen zweiten Behälter enthaltend ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung; (c) gegebenenfalls, mindestens ein weiteres Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 103, und (d) gegebenenfalls, Anweisungen zur (i) Verwendung der Lösung oder (ii) der Rekonstitution und/oder der Verwendung der lyophilisierten Formulierung.
Der Kit gemäß Anspruch 22 weiterhin umfassend ein oder mehr von (iii) einem Puffer, (iv) einem Verdünnungsmittel, (v) einem Filter, (vi) einer Nadel oder (v) einer Spritze.
Verfahren zur Herstellung eines personalisierten Krebsimpfstoffs oder einer verbindungsbasierten und/oder zellulären Therapie für einen einzelnen Patienten, wobei das Verfahren umfasst: a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die auf einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; b) Vergleichen der in a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse von Peptiden, die im Vergleich zu normalem Gewebe auf Immunogenität und/oder Überpräsentation in Tumoren vorab gescreent wurden; c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse, das einem im Patienten identifizierten TUMAP entspricht; und d) Herstellen und/oder Formulieren des personalisierten Impfstoffs oder der verbindungsbasierten oder zellulären Therapie basierend auf Schritt c).
Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei die TUMAPs identifiziert werden durch: a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von Normalgewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entspricht, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I- und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die vom Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Sequenzen von MHC-Liganden durch Eluieren gebundener Peptide aus MHC-Molekülen, die aus der Tumorprobe isoliert sind, und Sequenzieren der eluierten Liganden identifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechende Normalgewebe vom gleichen Patienten erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die im Warehouse enthaltenen Peptide basierend auf den folgenden Schritten identifiziert werden: aa. Durchführung der genomweiten Expressionsanalyse von Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) durch hochparallele Methoden, wie Microarrays oder sequenzbasiertes Expressionsprofiling, umfassend die Identifizierung von Genen, die in einem malignen Gewebe im Vergleich zu einem normalen Gewebe oder normalen Geweben überexprimiert sind; ab. Auswählen von Peptiden, die von selektiv exprimierten oder überexprimierten Genen kodiert werden, wie in Schritt aa nachgewiesen, und ac. Bestimmen einer Induktion von in vivo T-Zellreaktionen durch die Peptide, wie ausgewählt, umfassend in vitro Immunogenitätsassays mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern oder dem Patienten; oder ba. Identifizierung von HLA-Liganden aus der Tumorprobe mittels Massenspektrometrie; bb. Durchführung der genomweiten Expressionsanalyse von Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) durch hochparallele Methoden, wie Microarrays oder sequenzbasiertes Expressionsprofiling, umfassend die Identifizierung von Genen, die in einem malignen Gewebe im Vergleich zu einem normalen Gewebe oder normalen Geweben überexprimiert sind; bc. Vergleichen der identifizierten HLA-Liganden mit den Genexpressionsdaten; bd. Auswählen von Peptiden, die von selektiv exprimierten oder überexprimierten Genen kodiert werden, wie in Schritt bc nachgewiesen; be. Wiederholtes Nachweisen ausgewählter TUMAPs aus Schritt bd auf Tumorgewebe und fehlender oder seltener Nachweis an gesunden Geweben und Bestätigung der Relevanz der Überexpression auf mRNA-Ebene; und bf. Bestimmen einer Induktion von in vivo T-Zellreaktionen durch die Peptide, wie ausgewählt, umfassend in vitro Immunogenitätsassays mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern oder dem Patienten; oder
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die Immunogenität der im Warehouse enthaltenen Peptide durch ein Verfahren bestimmt wird, das in-vitro-Immunogenitätsassays, Patientenimmunmonitoring zur individuellen HLA-Bindung, MHC-Multimerfärbung, ELISPOT-Tests und/oder intrazelluläre Zytokinfärbung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Warehouse eine Vielzahl von Peptiden umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 103.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, ferner umfassend das Identifizieren mindestens einer Mutation, die für die Tumorprobe im Verhältnis zu normalem entsprechendem Gewebe des einzelnen Patienten einzigartig ist, und das Auswählen eines Peptids, das mit der Mutation korreliert, zur Aufnahme in den Impfstoff oder zur Erzeugung von Zelltherapien.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die mindestens eine Mutation durch vollständige Genomsequenzierung identifiziert wird.