CZ200392A3

CZ200392A3 - Aminoisochinolinové deriváty

Info

Publication number: CZ200392A3
Application number: CZ200392A
Authority: CZ
Inventors: Johannes Bernardus Maria Rewinkel; Cornelis Marius Timmers; Paolo Giovanni Martino Conti
Original assignee: Akzo Nobel N. V.
Priority date: 2000-07-12
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2003-05-14
Also published as: KR20030022270A; CN1441784A; NZ523553A; WO2002004423A1; BR0112338A; EP1303491A1; WO2002004423A8; NO20030145L; HRP20030017A2; IL153611A0; HUP0301258A2; AR029596A1; MXPA03000337A; CA2413035A1; AU2001278476A1; PE20020209A1; ECSP034422A; JP2004502759A; US20030166579A1; NO20030145D0

Description

Oblast techniky

Vynález se týká inhibitorů thrombinu ze skupiny aminoisochinolinových derivátů, použití těchto látek pro výrobu farmaceutického prostředku a farmaceutického prostředku pro léčení a prevenci chorob, vyvolaných působením thrombinu.

Dosavadní stav techniky

V literatuře je popsána celá řada inhibitorů thrombinu. Většina těchto inhibitorů obsahuje bazickou skupinu v tak zvané poloze P_lř jde například o zbytek bazické aminokyseliny argininu a lysinu nebo také o benzamidinovou skupinu a podobně. Taková bazická skupina je považována za nezbytnou pro účinnost proti thrombinu. Na druhé straně může bazická povaha těchto látek nepříznivě ovlivnit vstřebávání uvedených sloučenin střevní sliznicí v případě jejich podání perorálním způsobem. V dokumentu WO 98/47876 se popisuje skupina inhibitorů thrombinu s aminoisochinolinovou skupinou jako bazickou skupinou, tyto látky mají výhodnější vlastnosti při transportu střevní sliznicí. Nyní byly v této velké skupině látek identifikovány některé nové sloučeniny s ještě výhodnějšími farmakologickými vlastnostmi.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří aminoisochinolinové deriváty obecného vzorce I

R,

(I) kde

R_x znamená cyklopentyl, cyklohexyl nebo C3-C4alkyl s rozvětveným řetězcem,

R₂ znamená cyklohexyl nebo fenyl,

R₃ znamená atom vodíku nebo methyl a

A znamená nesubstituovaný nasycený 4,5 nebo 6-členný kruh, jakož i farmaceuticky přijatelné soli těchto látek.

Bylo prokázáno, že většina uvedených látek jsou účinné inhibitory thrombinu s významně prodlouženým poločasem v krevní plazmě. Při většině klinických situací, při nichž je zapotřebí použít antithrombotické účinné látky, se obecně vyžaduje prodloužený poločas, například podle publikace Sixma, J. J. a další, Thromb. Res. 67, 305-311, 1992. Sloučeniny podle vynálezu tedy znamenají významný pokrok ve srovnání se známým stavem techniky.

Sloučeniny podle vynálezu je tedy možno použít pro léčení a prevenci chorob, zprostředkovaných působením thrombinu nebo spojených s tímto působením. Uvedený pojem zahrnuje řadu thrombotických a prothrombotických stavů, u nichž dochází k aktivaci koagulační kaskády. Jde

9 ···· například o hlubokou žilní thrombózu, plicní embolií, thromboflebitidu, uzávěr tepny thrombózou nebo embolií, opětný uzávěr tepny nebo uzávěr po angioplastice nebo po rozpuštění thrombu, může také jít o restenózu po poranění tepny nebo po invazivních srdečních zákrocích o pooperační žilní thrombózu nebo embolii, akutní nebo chronickou atherosklerózu, mrtvici, infarkt mykardu, zhoubné nádory a jejich metastázy a také o některé neurodegenerativní choroby. Sloučeniny podle vynálezu je také možno použít jako antikoagulační látky při použití mimotělního oběhu, například v průběhu dialýzy a některých chirurgických zákroků. Uvedené látky je rovněž možno použít jako antikoagulační látky ín vitro.

Výhodnými inhibitory thrombinu podle vynálezu jsou ty látky, v nichž A znamená 5-členný kruh. R₂ s výhodou znamená cyklohexyl. Dalšími výhodnými látkami jsou ty sloučeniny, v nichž R₃ znamená atom vodíku. Velmi výhodné jsou látky, v nichž R_x znamená cyklohexyl. Nejvýhodnějším inhibitorem thrombinu podle vynálezu je látka, v níž R_xznamená cyklohexyl, R₂ znamená cyklohexyl, R₃ znamená atom vodíku a A znamená 5-členný kruh.

C3-C4alkyl s rozvětveným řetězcem znamená alkylovou skupinu o 3 až 4 atomech uhlíku s rozvětveným řetězcem, například isopropyl.

Vynález se dále týká způsobu výroby inhibitorů thrombinu, například vazby vhodně chráněných aminokyselin a aminoisochinolinových derivátů s následným odštěpením ochranné skupiny.

• ·

Sloučeniny obecného vzorce I je. možno připravit způsobem, běžným pro výrobu takových látek. Je možno je získat peptidovou vazbou sloučenin obecného vzorce II se sloučeninami obecného vzorce III, přičemž jako vazné reakční činidlo se použije například

N,N-dicyklohexylkarbodiimid DCCI a 1-hydroxybenzotriazol HOBT nebo 2-(lH-benzotríazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroboritan TBTU, v uvedených látkách mají symboly R_x, R₂, R3 a A svrchu uvedený význam. N-zakončení sloučenin obecného vzorce II může popřípadě nést ochrannou skupinu, jako terč .butyloxykarbonylovou skupinu (Boc) . Aryl aminoskupina ve sloučeninách obecného vzorce III může rovněž nést ochrannou skupinu, například benzoylovou skupinu, kterou je možno odstranit po ukončení vazné reakce.

R_rNH-CH-CO-N—CH-COOH (Π)

Sloučeniny obecného vzorce II je možno připravit ze sloučenin obecného vzorce IV, v nichž Pgl je karboxylátové ochranná skupina, jako benzoylester, postupuje se tak, že se na sloučeniny obecného vzorce IV působí příslušným ketonem, například cyklohexanonem nebo acetonem a reduktivním činidlem, například triacetoxyhydroborátem sodným v kyselém prostředí s následným odstraněním karboxylátové ochranné skupiny.

FU.

H₂N-CH-CÓ-NCH-COOPg1 OY)

AAAA

Sloučenina obecného vzorce III, v němž R₃ = H, to znamená l-amino-6-(aminomethyl) isochinolin byla popsána v dokumentu WO 98/47876. Sloučenina obecného vzorce III, v němž R₃ znamená methyl, to znamená 1-amino-6-(aminomethyl)-3-methylisochinolin může být připravena z l-amino-6-methoxy-3-methylisochinolinu při použití postupu, posaného v dokumentu WO 98/47876 pro transformaci l-amino-6-methoxyisochinolinu na l-amino-7- (aminomethyl) isochinolin. l-amino-6-methoxy-3-methylisochinolin je možno připravit z

3-methoxyfenylacetonu způsobem podle publikace W. Zielinski a M. Mazik, Heterocycles 38, 375, 1994.

Sloučeniny obecného vzorce I je také možno připravit ze sloučenin obecného vzorce V tak, že se na tyto látky působí příslušným ketonem, například cyklohexanonem nebo acetonem a reduktivním činidlem, například triacetoxyhydroborátem sodným v kyselém prostředí. Při této reakci může být aryl aminoskupina ve sloučeninách obecného vzorce V chráněna například benzoylovou skupinou, kterou je pak možno po ukončení reduktivní aminace opět odstranit.

R.

H₂N-CH-CO-N—CH-CO-NH-CH.

CO

Sloučeniny obecného vzorce V je možno připravit peptidovou vazbou dipeptidu, chráněného na N-zakončení pomocí ochranné skupiny, například Boc, se sloučeninami

444 obecného vzorce III při použití svrchu popsaných vazných reakčních činidel.

Aminoskupinu v poloze a je obecné možno chránit urethanovou funkcí, například ve formě terč.butoxykarbonylové skupiny Boc, labilní v kyselém prostředí, benzyloxykarbonylové skupiny Cbz a substituovaných analogů nebo vazbou

9-fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny Fmoc, labilní v bazickém prostředí nebo ftaloylové skupiny Phth.

Z dalších vhodných ochranných skupin pro aminoskupinu je možno uvést Nps, Bpoc, Msc a podobně. Ochranné skupiny je možno odstranit různým způsobem v závislosti na jejich povaze. Obvykle je možno ochrannou skupinu odštěpit v kyselém prostředí v přítomnosti látek, které jsou schopné tuto skupinu vázat. Skupinu Cbz je také možno odstranit katalytickou hydrogenaci. Přehled ochranných skupin na aminoskupině a způsobů jejich odstranění je možno nalézt v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, svazek 3, E. Gross a J. Meienhofer, Eds., Academie Press, New York, 1981.

Karboxylovou skupinu je možno chránit tvorbou esteru, například esterů, labilních v bazickém prostředí, jako methylesteru nebo ethylesteru nebo esterů, labilních v kyselém prostředí, jako je terč.butylester nebo esterů, labilních v hydrogenolytickém prostředí, jako jsou benzylestery.

Sloučeniny podle vynálezu, které mohou být připraveny ve volné formě, je možno izolovat z reakční směsi ve formě jejich farmaceuticky přijatelných solí. Farmaceuticky přijatelné soli je možno připravit také ··· · ·« • · « · · · tak, že se na volnou látku obecného vzorce I působí organickou nebo anorganickou kyselinou, například kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, jodovodíkovou, sírovou, fosforečnou, propionovou, glykolovou, maleinovou, jablečnou, methansulfonovou, fumarovou, jantarovou, vinnou, citrónovou, benzoovou nebo askorbovou.

Sloučeniny podle vynálezu obsahují jeden nebo větší počet chirálních atomů uhlíku a je proto možno je připravit jako šísté enanciomery, čisté diastereomery nebo směsi enanciomerů nebo diastereomerů. Způsoby přípravy čistých enanciomerů jsou známé, jde například o krystalizaci solí připravených s opticky aktivními kyselinami nebo krystalizaci racemických směsí nebo o chromatografií při použití chirálních sloupců. V případě diastereomerů je možno použít chromatografické sloupce s normální nebo reverzní fází.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány perorálně nebo parenterálně, s výhodou v denních dávkách 0,001 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 0,01 až 10 mg/kg. Sloučeniny se obvykle podávají ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, tak jak jsou popsány například ve standardní publikaci Gennaro a další, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Company 1990, zvláště část 8:

Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture. Sloučeniny mohou být například zpracovány lisováním na pevné lékové formy, jako pilulky nebo tablety nebo také kapsle nebo čípky. Při použití farmaceuticky vhodných kapalných materiálů je možno sloučeniny podle vynálezu podávat také ve formě/roztoků, suspenzí, emulzí a «

podobně, například ve formě injekčních prostředků nebo ve formě spreje, například na nosní sliznice.

Při výrobě lékových forem, například tablet, je možno použít běžné přísady, jako jsou plniva, barviva, plymerní pojivá a podobně. Obecně je možno použít jakoukoliv farmaceutickou přísadu, která neínterferuje s funkcí účinné látky. Vhodnými nosiči pro použití v takových prostředcích jsou například laktóza, škrob, deriváty celulózy a podobně nebo směsi těchto látek.

Poločas účinné látky v krevním oběhu a její biologická dostupnost může být stanovena například následujícími testy na psech.

Doba přetrvávání účinné látky v krevní plasmě a biologická dostupnost sloučenin podle vynálezu v procentech se měří například u samic stavěčích psů stanovením účinnosti plasmy proti Ha po nitrožilním nebo perorálním podáním. Vzhledem k selektivně inhibitorů proteázy podle vynálezu je inhibice thrombinu lineárně závislá na koncentraci účinných látek. Po nitrožilním nebo perorálním podání inhibitoru serinproteázy se odebírá krev z jugulární žíly v různých intervalech v průběhu dne. Po odstředění se stanoví účinnost plasmy proti Ha ve vzorcích plasmy na mikrotitrační plotně pomocí barvení a při použití kalibrační křivky zkoumané látky. Získané údaje se analyzují v průběhu času počítačem metodou Simplex. Mimoto se vypočítají poločasy při použití relativní chyby nezávisle na koncentraci, mimoto se stanoví plocha pod křivkou AUC podle trapézového pravidla. Pak se vypočítá biologická dostupnost v procentech tak, že se dělí AUC po perorálním • · · ·

9.........

podání průměrnou očekávanou normalizovanou AUC po nitrožilním podání téže dávky (x 100 %) .

Praktické provedeni vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu ¹H NMR bylo měřeno na spektrofotometru Bruker DRX 400, pracujícím při ¹H frekvenci 400 MHz. Hmotové spektrum MS bylo zaznamenáváno na zařízení Pe-sciex API-165.

Příklad 1

N-cyklohexyl-3-cyklohexyl-D-alanyl-N-[(l-amino-6-isochinolinyl)methyl]-L-prolinamidhydrogenchlorid (N-cyklohexyl)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl

Reakční směs, obsahující 0,91 g fenylmethylesteru 3-cyklohexyl-Ν-[(1,1-dimethylethoxy)karbonyl]-D-alanyl-L-prolinu (Boc-D-Cha-Pro-OBzl), 2,5 ml dichlormethanu a

2,5 ml kyseliny trifluoroctové se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti a pak se odpaří ve vakuu, čímž se získá 0,94 g olejovitého materiálu. Tento olej se rozpustí v 10 ml Ν,N-dimethylformamidu s obsahem 1 % objemové kyseliny octové a 0,26 ml cyklohexanonu a přidá se 0,64 g triacetoxyhydroborátu sodného. Směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti, pak se k reakční směsi přidá voda a směs se extrahuje dichlormethanem. Organický extrakt se vysuší síranem hořečnatým a odpaří, čímž se získá 0,90 g oleje (TLC na silikagelu při použití dichlormethanu a methanolu v ob j emovém -.poměru 95:5, Rf = 0,8). Tento olej ••99 ·« • 9 9 · • · · 9 • · · 9 * ••99 « se rozpustí v 50 ml ethylacetátu, Ph roztoku se upraví na hodnotu 5 přidáním kyseliny octové, pak se přidá 0,10 g 10% paladia na aktivním uhlí a suspenze se hydrogenuje za atmosferického tlaku při teplotě místnosti 1 hodinu. Katalyzátor se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v toluenu a toluen se odpaří za sníženého tlaku, čímž se získá 0,56 g N-cyklohexyl-D-Cha-Pro-OH. 0,35 g této kyseliny se rozpustí v 10 ml N,N-dimethylformamidu a přidá se 0,19 mg

1- amino-6-aminomethylisochinolinu (WO 98/47876) a 0,4 g

2- (lH-benzotriazol-l-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroboritanu TBTU. Pak se pH reakční směsi upraví na 8 přidáním Ν,Ν-diisopropylethylaminu DIPEA. Pak se směs míchá ještě 24 hodin při teplotě místnosti, načež se přidá ještě 0,1 g TBTU a reakční směs se míchá při teplotě místnosti ještě 18 hodin. Pak se reakční směs odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí v 50 ml dichlormethanu, 2krát se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří do sucha. Odparek se rozpustí ve vodě a nanese se na sloupec preparativni HPLC DeltaPak RP-C_1S pří použití gradientu elučního systému 20 % A/80 % B až 20 % A/30 % B/50 % C v průběhu 50 minut při rychlosti průtoku 40 ml/min. A: 0,5M fosfátový pufr pH 2,1, B: voda, C: směs acetonitrilu a vody v objemovém poměru 6:4. Získá se 0,25 g výsledného produktu.

’Ή NMR 400 MHz (CD₃OD) δ: 0,84-2,41 (27 H, m), 2,91-3,01 (IH, m) , 3,57-3,65 (IH, m) , 3,81-3,88 (IH, m) , 4,30 (IH, t, J = 7 Hz), 4,49-4,77 (3H, m), 7,26 (IH, d, J = 7 Hz), 7,57 (IH, d, J = 7 Hz) , 7,73 (IH, dd, J = 2 Hz a J =

Hz), 7,92 (IH, d, J = 2 Hz), 8,38 (IH, d, J = 9 Hz).

·♦·· 9« • * • ttt • 9 • 9 9

9 · • · • · · · ·* «f

Příklad 2

N-cyklohexyl-3-cyklohexyl-D-alanyl-N- [ (l-amino-3-methyl-6-isochinolinyl)methyl] -L-prolinamídhydrogenchlorid (N-cyklohexyl)-D-Cha-Pro-6(3Me)Aiq.HCl

2a. l-amino-6-methoxy-3-methylisochinolin

Roztok 2,12 g 3-methoxyfenylacetonu a 1,26 ml fosforylchloridu ve 45 ml bezvodého toluenu se vaří pod zpětným chladičem. Po 30 minutách se směs zchladí na 0 °C a po kapkách se přidá roztok 0,57 g kyanoamidu ve 23 ml bezvodého etheru. Reakční směs se nechá zteplat na teplotu místnosti a při této teplotě se 1 hodinu míchá. Pak se míchaná směs zchladí na 0 °C a po kapkách se přidá

1.5 ml chloridu titaničitého. Reakční směs se pak vaří

2.5 hodiny pod zpětným chladičem, zchladí se, přidá se 34 ml vody, směs se zfiltruje a filtrační koláč se promyje ethylacetátem. Filtrát se alkalizuje přidáním 2N vodného roztoku hydroxidu sodného a pak se extrahuje ethylacetátem. Organické extrakty se promyji nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří. Odparek se čistí chromatografíí na oxidu křemičitém při použití směsi dichlormethanu a methanolu 95:5, čímž se získá 0,42 g výsledného produktu. ²H NMR 400 MHz (CDC1₃) 6: 2,45 (3H, s) , 3,91 (3H, s) , 5,0 (2H, br. s), 6,81 (IH, s), 6,90 (IH, d, J = 3 Hz) , 7,02 (IH, dd, J = 3 Hz a J = 9 Hz), 7,65 (IH, d, J = 9 Hz).

b. 1-amino-6-hydroxy-3-methylisochinolin ml bromidu boritého v 6 ml dichlormethanu se pomalu přidají za míchání k roztoku 2 g 1-amino-6-

• ♦•A «Α •A A • « A • A A • · · A • · a ·

-methoxy-3-methylisochinolinu v 10 ml dichlormethanu při teplotě 0 °C. Směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti, pak se vlije do ledu, organická vrstva se oddělí a pH vodné vrstvy se upraví na 9 přidáním koncentrovaného vodného amoniaku. Vysrážený materiál se oddělí filtrací a pak se suší ve vakuu, čímž se získá 1/6 g výsledného produktu. ESI-MS: 175 (MH⁺) .

2c. l-amino-3-methylisochinolin-6-ylester kyseliny trifluormethansulfonové

Směs 1,4 g 1-amino-6-hydroxy-3-methylisochinolinu a

4.3 g N-fenyl-bis(trifluormethansulfonimidu) v 19,5 ml dichlormethanu a 19,5 ml dioxanu se zchladí na ledové lázni a po kapkách se přidá 2,8 ml

N,N-diisopropylethylaminu. Výsledná směs se zahřívá 24 hodin na 70 °C, po této době se těkavé materiály odpaří ve vakuu. Získaný odparek se rozpustí v ethylacetátu, postupně se promyje 2N vodným roztokem hydroxidu sodného, vodou a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného a pak se vysuší síranem sodným. Po filtraci a odpaření se získá bezbarvý olej který se rozetře s toluenem, čímž se získá

1.3 g pevné látky. Toluenový roztok se čistí chromatografií na oxidu křemičitém při použití směsi toluenu a ethanolu 95:5, čímž se získá ještě 0,6 g výsledného produktu. Celkový výtěžek je

1,9 g. ESI-MS: 307 (MH⁺) .

2d. 1-amino-6-kyano-3-methylisochinolin

0,28 g octanu paladnatého se přidá k zahřívané směsi 1,9 g l-amino-3-methylisochinolin-6-ylesteru kyseliny trifluormethansulfonové, 0,74 g kyanidu zinečnatého a ···· *« • · «

• · · ·

• · · ♦ « · * · · « • · · ·· ··

0,33 g trifenylfosfinu ve 24 ml N-methylpyrrolidonu při teplotě 190 °C, reakce je exothermní. Pak se směs míchá ještě 2 hodiny pří teplotě 190 °C. Po zchlazení na teplotu místnosti se přidá ethylacetát, organická směs se promyje 2N vodným roztokem amoniaku, vodou a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného a pak se vysuší síranem horečnatým. Po filtraci a odpaření roztoku se získá hnědavý olej, který se čistí chromatografií na oxidu křemičitém při použití směsi dichlormethanu a methanolu 98:2, čímž se získá 0,68 g výsledného produktu.

ESI-MS: 184 (MH⁺) .

2e. l-amino-6- (aminomethyl) -3-methylisochinolin

K míchanému roztoku 0,68 g l-amino-6-kyano-3-methylisochinolinu v 15 ml tetrahydrofuranu se při teplotě místnosti a v dusíkové atmosféře přidá 8,4 ml 2M komplexu boranu a methylsulfidu v tetrahydrofuranu a pak se směs zahřívá 50 minut na 60 °C. Pak se reakční směs zchladí na ledové lázni a pomalu se přidá 7,5 ml methanolu. Po 15 minutách se přidá ještě 18,8 ml 1M chlorovodíku v etheru. Pak se reakční směs nechá zteplat na teplotu místnosti a při této teplotě se míchá ještě dalších 16 hodin. Pevný podíl se pak izoluje, čímž se získá 0,34 g l-amino-6-(aminomethyl)-3-methylisochinolinhydrogenchloridu. Filtrát se čistí chromatografií na sloupci při použití silikagelu a směsi methanolu a amoniaku 98:2, čímž se získá dalších 0,15 g l-amino-6-(aminomethyl)-3-methylisochinolinu. ESI-MS: 188 (MH⁺) .

2f. N-cyklohexyl-3-cyklohexyl-D-alanyl-N-[(l-amino-3-methyl- 6 -isochinolinyl)methyl]-L-prolinamidhydrogenchlorid (N-cyklohexyl) -,D-Cha-Pro-6 (3Me)Aiq.HCl ···· ·· • · · • · · • · ♦ • · 9 9 ♦*

9

K míchané směsi 0,17 g 1-amino-6-(aminomethyl)-3-methylisochinolinhydrogenchloridu, 0,30 g N-cyklohexyl-D-Cha-Pro-OH, 0,5 ml acetonitrilu a 0,37 ml N,N-diisopropylmethylaminu ve 3 ml N, N-dimethylf ormamidu se při teplotě místnosti v průběhu 1 hodiny přidá roztok 0,35 g bromtripyrrolidonof osf oniumhexaf luorf osf átu PyBroP v 1,3 ml N, N-dimethylf ormamidu. Směs se míchá 24 hodin při teplotě místnosti a pak se reakční směs odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí v ethylacetátu, promyje se vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a pak se odpaří. Odparek se čistí chromatografií na oxidu křemičitém při použití směsi dichlormethanu a methanolu 9:1, lyofilizací ze směsi terč.butanolu a kyseliny chlorovodíkové se pak získá 0,13 g výsledného produktu.

^XH NMR 400 MHz (CD₃OD) δ: 0,85-2,40 (27 H, m), 2,50 (0,3

H, S), 2,51 (2,7 H, S), 2,92-3,00 (IH, m), 3,54-3,68 (IH, m) , 3,81-3,88 (IH, m) , 4,30 (IH, t, J = 7 Hz), 4,46-4,74 (3H, m) , 7,02 (IH, s) , 7,64 (IH, dd, J = 2 Hz a J =

Hz), 7,80 (IH, d, J = 2 Hz) , 8,32 (IH, d, J = 9 Hz) .

Příklad 3

N-cyklohexyl-D-fenylalanyl-N-[(l-amino-6-isochinolinyl) methyl] -L-prolinamidhydrogenchlorid (N-cyklohexyl)-D-Phe-Pro-6Aiq.HCl

Použije se způsob podle příkladu 1 pro výrobu N-cyklohexyl-D-Cha-Pro-OH a vychází se z 0,85 g N-[(l,l-dimethylethoxy) karbonyl] -D-fenylalanyl-L-prolinfenylmethylesteru, Boc-D-Phe-Pro-OBzl, čímž se získá 0,82 g N-cyklohexyl-D-feny-lal-anyl-L-prolinu, N-cyklohexyl-D-Phe···· ·« • · 1 » · · , ♦ · ·«

-Pro-OH. 0,82 g N-cyklohexyl-D-Phe-Pro-OH se rozpustí v 10 ml N,N-dimethylformamidu, přidá se 0,33 mg l-amino-6-amínomethylisochinolinu a 1,1 g O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-Ν,Ν,Ν', N' -tetramethyluroniumhexafluorofosfátu, HATU a pH se upraví na 8 přidáním N,N-diisopropylethylaminu DIPEA. Směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti a pak se odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí v 50 ml dichlormethanu a 2krát se promyje vodou a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří. Odparek se čistí chromatografií na oxidu křemičitém při použití směsi dichlormethanu a methanolu s obsahem 2 % amoniaku v poměru 9:1, produkt se lyofilizuje ze směsi terč.butanolu kyseliny chlorovodíkové, čímž se získá 1,19 g výsledného produktu. ^XH NMR 400 MHz (CD₃OD) δ: 0,87-2,13 (14H, m) , 2,38-2,45

(IH,	m) ,	2,94-3,03	(IH,	m), 3,06-3,13 (IH, m),	3,25-3,38
(2H,	m) ,	4,33-4,73	(4H,	m), 7,25-7,40 (6H, m),	7,58 (IH,
d, J	= 7	Hz), 7,71	(IH,	dd, J = 2 Hz a J =
9 Hz)	, 7,	92 (IH, d,	J =	2 Hz), 8,35 (IH, d, J	= 9 Hz) .

Příklad 4

N-cyklopentyl-3-cyklohexyl-D-alanyl-N-[(l-amino-6-isochinolinyl)methyl]-L-prolinamidhydrogenchlorid(N-cyklopentyl)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCI

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 a vychází se z 0,30 g Boc-D-Cha-Pro-OBzl při použití cyklopentanonu místo cyklohexanonu, čímž se získá surový N-cyklopentyl-D-Cha-Pro-6Aiq, který se čistí při použití chromatografií na sloupci silikagelu a směsi dichlormethanu a methanolu při gradientu 10:1 až 5:1. Lyofilizací ze směsi terč.butanolu a kyseliny chlorovodíkové se získá 0,16 g výsledného produktu. ^XH ···♦ ·· ·· *·«· (IH, t, J

7,57 ) ,

NMR 400 MHz (CD₃OD) δ: 0,85-2,41 (25H, m) , 3,43-3,52

m) , 3,59-3,65 (IH, m) , 3,80-3,86 (IH, m) , 4,20 (IH, = 7 Hz) , 4,51-4,73 (3H, m) , 7,25 (IH, d, J = 7 Hz) , (IH, d, J = 7 Hz), 7,73 (IH, dd, J = 2 Hz a J = 9 Hz

7,90 (IH, d, J = 2 Hz), 8,38 (IH, d, J = 9 Hz).

Příklad 5

N- (1-methylethyl) -3-cyklohexyl-D-alanyl-N- [ (l-amino-6-isochinolinyl) methyl] -L-prolinamidhydrogenchlorid (N-1-methylethyl)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 a vychází se z 0,92 g Boc-D-Cha-Pro-OBzl při použití acetonu místo cyklohexanonu, čímž se získá 0,04 g Ν-(1-methylethyl)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl. ^XH NMR 400 MHz (CD₃OD) δ: 0,85-2,41

(23H, m)	, 3,27	-3,35 (IH, m)	, 3,	59-3,65 (IH,	m) ,	3,82	-3,89
(IH, m) ,	4,27	(IH, t, J = 7	Hz)	, 4,51-4,74	(3H,	m) ,	7,26
(IH, d,	J = 7	Hz), 7,57 (IH	, d,	J = 7 Hz),	7,72	(IH,	dd,
J = 2 Hz	a J =	9 Hz), 7,91	(IH,	d, J = 2 Hz	) , 8,	,38 (	IH,
d, J = 9	Hz) .

Zkouška na účinnost proti thrombinu

Zkouška na účinnnost sloučeniny podle vynálezu proti thrombinu se provádí tak, že se spektrofotometricky měří hydrolýza chromogenního substrátu s-2238, hydrolyzovaného thrombinem. Tato zkouška na účinnost v systému pufru byla použita ke zjištění hodnoty IC₅₀ pro zkoumanou látku.

Prostředí k provedení zkoušky: pufr se složením tromethamin-NaCl-polyethylenglykol 6000 (TNP) φφ φφ ··»· • ·

Φ Φ * Φ • Φ

Φ Φ

ΦΦ

Referenční sloučnina: 12581 (Kabi)

Nosné prostředí: pufr TNP. Rozpuštění je možno usnadnit přidáním dimethylsulfoxidu, methanolu, ethanolu, acetonitrilu nebo terč.butylalkoholu, které nemají nepříznivý účinek až do koncentrace 2,5 % ve výsledné reakční směsi.

Reakční činidla*

1. Pufr s obsahem tromethamin-NaCl (TN), složení pufru: tromethamin (tris) 6,057 g (50 mmol), NaCl 5,844 g (10 0 mmol) , voda do 1 litru. Roztok se upraví na pH 7,4 při 37 °C přidáním HCI (10 mmol/1).

2. Pufr TNP: polyethylenglykol 6000 se rozpustí v pufru TN na koncentraci 3 g/1.

3. Roztok S-2238: 1 lahvička S-2238 s obsahem 25 mg této látky (Kabi Diagnostica, Švédsko) se rozpustí ve 20 ml pufru TN na koncentraci 1,25 mg/ml (2 mmol/1) .

4. Roztok thrombinu: lidský thrombin 16000 nKat/lahvička (Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusien, Amsterdam,

Nizozemí) se rozpustí v pufru TNP na zásobní roztok s obsahem 835 nKat/ml. Těsně před použitím se tento roztok zředí pufrem TNP na koncentraci 3,34 nKat/ml.

* Všechna reakční činidla jsou analyticky čistá.

Pro přípravu vodných roztoků se užije ultračistá voda s kvalitou Milli-Q.

Příprava zkoumaných a referenčních roztoků

Zkoumané látky a referenční látky se rozpustí ve vodě Milli-Q na zásobní roztoky s koncentrací

4444 4*

• 4 4 • · 4 • · · 4 • · 4 • 44 ·· 4

10'² mol/litr. Každá z koncentrací se postupně ředí nosným prostředím, čímž se připraví koncentrace ΙΟ'³, 10'⁴ a 10'⁵ mol/1. Materiály se ředí na následující konečné koncentrace v reakční směsi: 3.10'³, ΙΟ'³, 3.10'⁴, 10'⁴,

3.10⁵, ΙΟ'⁵, 3.10'⁶ a 10’⁶ mol/1.

Provedení zkoušky

Při teplotě místnosti se 0,075 ml a 0,025 ml zkoumané látky nebo referenční látky v roztoku nebo nosné prostředí pipetují do vyhloubení mikrotitrační plotny a roztoky se zředí 0,115 ml nebo 0,0165 ml pufru TNP. Pak se do každého vyhloubení přidá 0,030 ml roztoku S-2238 a plotna se předehřeje a předběžně inkubuje za protřepávání 10 minut při teplotě 37 °C v inkubátoru (Amersham). Po předběžné inkubaci se zahájí hydrolýza S-2238 přidáním 0,030 ml roztoku thrombinu do každého vyhloubení. Plotna se inkubuje za protřepání po dobu 30 sekund při teplotě 37 °C. Po jedné minutě inkubace se každé 2 minuty měří absorbance každého vzorku při 405 nm celkem po dobu 90 minut při použití kinetického odečítacího zařízení pro mikrotitrační plotny (Twinreader plus, Flow

Laboratories).

Všechny údaje se shromáždí v počítači IBM při použití LOTUS-MEASURE. Pro každou koncentraci zkoumané látky, vyjádřenou v mol/1 reakční směsi, a pro slepou zkoušku se absorbance vyjádří graficky v závislosti na reakční době v minutách.

«to to · • to to·to · ···· «« • · 4 • · 4 • · · • · · · ·· ·«

Vyhodnocení výsledků

Pro každou konečnou koncentraci se ze získaných křivek vypočítá maximální absorbance. Hodnota IC₅₀ jako konečná koncentrace v μιηοΐ/l, která vyvolá 50% inhibici maximální absorbance slepé zkoušky, se vypočítá analýzou podle publikace Hafner a další, Arzneim. Forsch. Drug Res. 1977, 27 (II) , 1871-3 .

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:

Antithrombinová účinnost

Sloučenina z příkladu	IC₅₀ (mol/1)
1	0,03
2	0,14
3	0,13
4	0,12
5	0,29

Zastupuj e:

**· ·**· »“· ·! ···· • · · ·· »·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Aminoisochinolinově deriváty obecného vzorce I kde

R₂ znamená cyklohexyl nebo fenyl,

R₃ znamená atom vodíku nebo methyl a

2. Aminoisochinolinově deriváty podle nároku 1, obecného vzorce I, v němž A znamená 5-členný kruh.

3. Aminoisochinolinově deriváty podle nároku 1, obecného vzorce I, v němž R₂ znamená cyklohexyl.

4. Aminoisochinolinově deriváty podle nároku 1, obecného vzorce I, v němž R₃ znamená atom vodíku.

5. Aminoisochinolinově deriváty podle nároku 1, obecného vzorce I, v němž R_x znamená cyklohexyl.

• 999 9· • 9 «

9·»9 • · a ·· ·«

9

9 » ·

9 9 • 9

β.

Aminoisochinolinové deriváty podle nároku 5, obecného vzorce I, v němž R_x znamená cyklohexyl, R₂znamená cyklohexyl, R₃ znamená atom vodíku a A znamená 5-členný kruh.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že jako svou účinnou složku obsahuje aminoisochinolinový derivát obecného vzorce I podle nároku 1 spolu s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami.

8. Aminoisochinolinové deriváty podle nároků 1 až 6, obecného vzorce I pro použití k léčebným účelům.

9. Použití aminoisochinolinového derivátu obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci chorob, zprostředkovaných působením thrombinu.

Zastupuj e: