CZ200336A3 - Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění - Google Patents
Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200336A3 CZ200336A3 CZ200336A CZ200336A CZ200336A3 CZ 200336 A3 CZ200336 A3 CZ 200336A3 CZ 200336 A CZ200336 A CZ 200336A CZ 200336 A CZ200336 A CZ 200336A CZ 200336 A3 CZ200336 A3 CZ 200336A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- prp
- sample
- pathogenic
- amplification
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 69
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 147
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 82
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101710138751 Major prion protein Proteins 0.000 claims description 183
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 claims description 176
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 42
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 40
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims description 33
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 claims description 32
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 claims description 31
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 claims description 30
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 13
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 230000008876 conformational transition Effects 0.000 claims description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 claims description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 83
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 20
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 18
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 13
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 208000002704 Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 6
- 101001095054 Ovis aries Major prion protein Proteins 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 101001068592 Bos taurus Major prion protein Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 101001095052 Rattus norvegicus Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108700020469 14-3-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 1
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 208000031430 Inherited human prion disease Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 101001090203 Mus musculus Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108700021402 PrP 27-30 Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 208000037957 feline spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000027488 iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000019143 inherited prion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000009251 neurologic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015015 neurological dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000007817 turbidimetric assay Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2828—Prion diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu diagnostiky nebo detekce konformačních onemocnění provedením testu na markér (tj. patogenní konformer) těchto onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje cyklický amplifikační systém pro zvýšení hladin patogenního konformeru. Tato konformační onemocněni mohou být zvláště prionové encefalopatie.
Dosavadní stav techniky
Konformační onemocnění představují skupinu onemocnění, která jsou zdánlivě nepříbuzná, ale která sdílejí překvapivou podobnost v klinických projevech, které odrážejí jejich sdílený molekulární mechanismus iniciace a samouspořádání s následným ukládáním v tkáních a jejich poškozováním.
Význam struktury je důsledkem skutečnosti, že tato rozdílná onemocnění vždy vycházejí z odchylného konformačního přechodu v základním proteinu (underlying protein), což charakteristicky vede k agregaci proteinu a ukládáni v tkáni. Klinicky odráží projevy těchto konformačních onemocnění jejích molekulární mechanismus, typicky s pomalým a zákeřným nástupem, jestliže přechod probíhá u normálního proteinu, ale s rychlejším nástupem, jestliže se vyskytuje u nestabilní varianty proteinu. Dva příklady těchto konformačních onemocnění, které mají zvláštní význam, jsou přenosné spongiformní encefalopatie a Alzheimerova demence, což je onemocnění, které může způsobit ohrožení zdravotních systémů v rozvinutém světě jejich přetížením (přehledný článek viz Carrell a další, 1997).
Přenosné spongiformní encefaiopatie (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) známé také jako prionová onemocnění jsou skupinou neurodegenerativních onemocnění, která postihují člověka i zvířata. Některá z onemocnění TSE jsou Creutzfeldt-Jakobova choroba (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), kuru, GerstmannStraussler-Schenkerova choroba (GSS) a fatální familiální insomníe (FFI) u lidí stejně jako klusavka (skrapie) a bovinní spongiformní encefaiopatie (BSE) u zvířat (Prusiner, 1991).
I když tato onemocnění jsou u lidí poměrně vzácná, riziko přenosu BSE na člověka prostřednictvím potravního řetězce vzbudilo pozornost orgánů veřejného zdraví a vědecké komunity (Cousens a další, 1997, Bruče a datší, 1997).
Tato onemocnění jsou charakterizována extrémně dlouhou Ínkubační dobou, po níž následuje krátké a vždy fatální klinické onemocnění (Roos a další, 1973). Dosud není dostupná žádná terapie.
Klíčovým znakem onemocnění je tvorba abnormálně tvarovaného proteinu označovaného PrPSc, což je posttransiačně modifikovaná verze normálního proteinu označovaného PrPc (Cohen a Prusiner, 1998). Nebyly dosud detekovány chemické rozdíly, které by rozlišily mezi isoformami PrP (Stáhl a další, 1993) a zdá se, že konverze zahrnuje konformační změnu, při které se zmenšuje obsah α-šroubovice normálního proteinu a vzrůstá množství β-listu (Pan a další, 1993). Za strukturními změnami následují změny biochemických vlastností: PrPcje rozpustný v nedenaturujících rozpouštědlech, PrPSc je nerozpustný; PrPc se snadno štěpí proteázami, zatímco PrPSc je částečně rezistentní, což vede ke tvorbě N-koncově zkráceného fragmentu známého jako „PrPres“ (Baldwin a další, 1995; Cohen a Prusiner, 1998), „PrP 27-30“ (27-30 kDa) nebo „PK-resistanť‘ (forma rezistentní k proteináze K).
♦ • · · • * • Φ «φ • · «· ····
V současnosti neexistuje přesná diagnostika TSE (WHO Report, 1998, Budka a další, 1995, Weber a další, 1997). Pokusy vyvinout diagnostický test na prionová onemocnění jsou znesnadňovány zdánlivě nepřítomnou imunitní reakcí vůči PrPSc. Klinická diagnóza CJD je v současnosti založena na kombinaci subakutní progresivní demence (méně než dva roky), myoklonu a multifokální neurologické dysfunkci, spojených s charakteristickým periodickým elektroencefalogramem (EEG) (WHO Report, 1998, Weber a další, 1997). U nové varianty CJD (variantní CJD, vCJD), většiny iatrogenních forem CJD a až u 40 % sporadických případů nedochází k abnormalitám na EEG (Steinhoff a další, 1996). Přesnost klinické diagnózy je pro CJD přibližně 60 %, přičemž pro jiná prionová onemocnění je tato přesnost vysoce variabilní. Klinická diagnóza je přesnější pouze v pozdním stadiu onemocnění, kdy již došlo k vyvinutí zřetelných příznaků (Weber a další, 1997).
Pro diagnostiku dědičných prionových onemocnění je použitelná genetická analýza, ale tato onemocnění představují pouze 15 % případů. Neurologické zobrazování je použitelné pouze pro vyloučení jiných stavů rychlé progresivní demence způsobené strukturními poškozeními mozku (Weber a další, 1997). Nálezy získané zobrazením mozku počítačovou tomografií (CT) a magnetickou rezonancí (MRI) závisí hlavně na stupni onemocnění. CT má mnohem nižší citlivost a v časné fázi se u 80 % případů nedetekuje žádná atrofie (Galvez a Cartier, 1983). Signály MRI se zvýšenou intenzitou byly detekovány v bazálních gangliích vedle atrofie (Onofrji a další, 1993). Podobně jako změny pozorované metodou CT nejsou tyto odchylky v žádném případě specifické.
Nedávno získané údaje vedly k identifikaci několika neuronálních, astrocytárních a gliáiních proteinů, jejichž hladina je u CJD zvýšena (Jimi a další, 1992). V časné fázi onemocnění je podstatně zvýšena koncentrace proteinu S-100, isoenzymu specifického pro neurony a ubikvitinu v cerebrospinální tekutině (CSF), • · · » · · ·«
-4 ···* přičemž v průběhu onemocnění dochází k poklesu koncentrací (Jimi a další, 1992). Jako specifický a citlivý test pro sporadickou CJD byl navrhován markér smrti neuronů, protein 14-3-3 (Hsich a další, 1996). Není však použitelný pro diagnózu vCJD, a má mnohem nižší specificitu v případě genetických forem. Protože protein 14-3-3 může být přítomen v CSF pacientů s jinými onemocněními, test není doporučován WHO pro obecný screening na CJD, a je vyhrazen pro potvrzení klinické diagnózy (WHO Report, 1998).
Kombinací klinických dat s biochemickými markéry se dosahuje vysoké úspěšnosti diagnózy. Podle operační diagnózy v současnosti používané v systému sledování CJD v Evropě (European Surveillance of CJD) je definitivní diagnóza určena pouze neuropatologickým vyšetřením a detekcí PrPSc buď imunohistochemicky, histologickým přenosem nebo westernovým přenosem (Weber a další, 1997, Budka a další, 1995).
Tvorba PrPSc je nejen nejpravděpodobnější příčinou onemocnění, ale je také nejlepším známým markérem. Detekce PrPSc ve tkáních a buňkách široce koreluje s onemocněním a s infekčností TSE a léčení, které inaktivuje nebo eliminuje infekčnost TSE odstraňuje také PrPsc (Prusiner, 1991). Identifikace PrPSc ve zvířecích nebo lidských tkáních je považována pro diagnózu TSE za klíčovou (WHO Report, 1998). Důležitým omezením tohoto přístupu je jeho citlivost, protože množství PrPSc jsou vysoká (dostatečná pro detekci běžnými metodami) pouze v CNS v pozdních stadiích onemocnění. Bylo však ukázáno, že v dřívějších stadiích onemocnění existuje generalizovaná distribuce PrPSc (v nízkých množstvích), zvláště v lymforetikulárním systému (Aguzzi, 1997). Přítomnost PrPSc byla také hlášena ve tkáni patrových mandlí a apendixu u pacientů s vCJD (Hill a další, 1997). I když není známo, jak časně v průběhu onemocnění by mohla být použita tonsilární biopsie nebo biopsie apendixu při diagnóze vCJD, bylo ukázáno, že u ovcí geneticky vnímavých na scrapii, by PrPSc mohl být detekován v tonsilární tkáni • · · >··· ··
S c ještě před projevením příznaků a časně v inkubačním období. PrP však nebyl dosud v těchto tkáních detekován v žádných případech sporadické CJD nebo GSS (Kawashima a další, 1997).
Normální protein je exprimován v bílých krvinkách a destičkách a proto je možné, že některé krvinky postižených jedinců mohou obsahovat PrPSc (Aguzzi, 1997). To zvyšuje možnost vytvoření krevního testu na CJD, ale bylo by zapotřebí testu s mnohem vyšším stupněm citlivosti než u současných testů.
Předpokládá se, že k replikaci prionů dochází, jestliže PrPSc v infikujícím inokulu specificky interaguje s PrPc hostitele, čímž katalyzuje jeho konverzi na patogenní formu proteinu (Cohen a další, 1994). Tento proces probíhá mnoho měsíců až let pro dosažení dostatečné koncentrace PrPSc pro spuštění klinických příznaků.
Zdá se, že infekční jednotkou PrPSc je oligomerní struktura bohatá na β-list, která přeměňuje normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu (obr. 1). Tato konverze byla napodobena in vitro smísením vyčištěného PrPc s padesátínásobným molárním nadbytkem předem denaturovaného PrPSc (Kocisko a další, 1994).
Konverzní systémy in vitro, které byly dosud popsány, mají nízkou účinnost, protože vyžadují nadbytek PrPSc, a proto nejsou použitelné pro diagnostické účely, protože nejsou schopny monitorovat nedetekovatelné množství markéru. Důvodem pro nízkou účinnost je skutečnost, že počet oligomerů PrPSc (konvertující jednotky) zůstává v průběhu testu nezměněn. Konvertující jednotky postupně narůstají na svých koncích a důsledkem je, že se zvětší, ale nezvýší se jejich počet (obr. 1),
Podstata vynálezu
Autoři vynálezu nyní nalezli způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění, kde toto onemocnění je charakterizováno
• · · • ·
-6tt ···· tt • ♦ « tt konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru uvedeného onemocnění ve vzorku, přičemž uvedený způsob zahrnuje následující kroky:
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;
(ii) provede se rozbití agregátů, které se popřípadě vytvořily během kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního konformeru ve vzorku.
Patogenní konformer bude s výhodou markér přítomnosti uvedeného onemocnění.
Krok (i) s výhodou zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer.
Podle výhodného provedení vynálezu tvoří kroky (ia) a (ii) cyklus, který se před provedením kroku (iii) opakuje alespoň dvakrát. Výhodněji se cykly opakují 5 až 40 x a nejvýhodněji 5 až 20 x.
Konformační onemocnění určená k detekci nebo diagnostice jsou onemocnění charakterizovaná konformačním přechodem základního proteinu. Tento „základní protein“ (underlying protein) je protein, kterýje schopen přijmout nepatogenní konformaci a patogenní konformaci. Jedním příkladem takového proteinu je prionový protein, PrP. Dalším příkladem takového proteinu je protein, který se účastní Alzheimerovy choroby, tj. β-amyloidní protein.
Konformační onemocnění, která mají být diagnostikována nebo detekována, jsou s výhodou přenosná konformační onemocnění, jako je TSE (jak je definováno v části Dosavadní stav techniky.
V případě diagnózy TSE a podle výhodného provedení vynálezu Sc je markérem onemocnění stejně jako patogenním konformerem PrP , £ zatímco nepatogenním konformerem sledovaného proteinu je PrP .
• * • ·
-7Množství nepatogenního konformeru, které se používá v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude obecně známé množství, ačkoli tento požadavek nemusí být splněn, jestliže se jedná pouze o zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti patogenního konformeru.
Množství nepatogenního konformeru, které se použije v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude s výhodou nadbytečné množství. Počáteční poměr nepatogenního konformeru k patogennímu konformeru (jestliže je ve vzorku přítomen) bude obecně větší než 100: 1, s výhodou větší než 1000 : 1 a nejvýhodněji větší než 1 000 000 : 1.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je nepatogenní konformer v kroku (i) přítomen v homogenátů mozku zdravého jednotlivce a/nebo může být k němu přidán před provedením kroku (i); v tomto případě se proto v průběhu kroku (i) přidá homogenát mozku obsahující (s výhodou známý) nadbytek nepatogenního konformeru. Mozkový homogenát zdravého jedince s výhodou pochází ze stejného druhu, ze kterého pochází vzorek určený k analýze (například homogenát lidského mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z člověka, homogenát krysího mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z krysy). Nepatogenní konformer je výhodněji přítomen ve specifické frakci homogenátů mozku, například v lipidických raftech (lipid-rafts) homogenátů mozku. Příprava těchto frakcí se může provádět například podle popisu v Sargiacomo M. a další, 1993.
Vynález se tedy dále týká způsobu nebo testu popisovaného v přihlášce, při kterém se k nepatogennímu konformeru v kroku (i) přidá tkáň nebo frakce tkáně. Tkáň je s výhodou mozková tkáň nebo z ní odvozený homogenát nebo frakce pocházející ze zdravého subjektu (tj. subjektu, u kterého není přítomen patogenní konformer).
Bylo již publikováno (Kocisko a další, 1994), že méně glykosylované formy PrPc se preferenčně konvertují na formu PrPSc.
• · · • 0 *· ·· ···* ·· • * •· ♦ ···
Konkrétně PrPc, na který se působilo fosfolipázou C specifickou pro fosfatidylinositol, rutinně přecházel s vyšší účinností na patogenní formu než úplný, více glykosylovaný PrPc Další provedení vynálezu se proto týká způsobu nebo testu popsaného v přihlášce, ve kterém nepatogenním konformerem je PrPc, který má sníženou míru glykosylace (zvláště N-glykosylace) ve srovnání s PrPc standardního typu. S výhodou se při způsobech a testech popisovaných v přihlášce působilo na PrPc při jeho použití jako nepatogenního konformeru pro odstranění některé, veškeré nebo podstatného množství glykosylace; a výhodněji je nepatogenní konformer PrPc, který je v podstatě neglykosylovaný.
V případě diagnózy TSE, jestliže jsou ve vzorku přítomny agregáty patogenní formy, budou tyto formy v průběhu kroku (i) indukovat přechod PrPc->PrPSc a v průběhu kroku (ii) budou tyto agregáty rozbity na menší, stále ještě infekční jednotky, z nichž každá si zachová schopnost indukovat konverzi jiného PrP . Tento druh metody se zde nazývá „cyklická amplifikace“ a je znázorněn na obr. 2. Tento systém vede k exponenciálnímu zvýšení množství PrPSc popřípadě přítomného ve vzorku, které může být snadno detekováno. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je proto možné vypočíst množství PrPSc přítomného ve vzorku na počátku, přičemž se vychází ze známého množství PrPc, zjišťuje se množství PrPSc přítomné ve vzorku na konci testu a v úvahu se bere počet provedených cyklů.
Jestliže naopak ve vzorku nebude přítomen žádný PrPSc (buď
Q jako takový nebo ve formě agregátů), nebude žádná molekula PrP převedena na PrPSc a na konci testu bude tento markér zcela nepřítomný (žádný patogenní konformer nebode ve vzorku detekován).
Bylo ukázáno, že infekční jednotkou PrPSc je oligomer bohatý na strukturu β-listu, který může přeměňovat normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získává vlastnosti spojené s abnormální formou (rezistence na proteázu a nerozpustnost) (Jarrett a
Lansbury, Jr., 1993, Caughey a další, 1997). Po inkubaci těchto dvou forem PrP zvyšují oligomerní molekuly svou velikost přibíráním a transformací molekul PrPc. Tento proces má nízkou účinnost, protože závisí na pevném počtu oligomerů rostoucích na svých koncích. Počet konvertujících jednotek se v průběhu reakce nezvyšuje, jestliže se oligomery pouze zvětšují. Předpokládá se, že tento proces je proces, který probíhá v těle zvířete nebo člověka po infekci; tedy proces, o kterém je známo, že trvá měsíce nebo dokonce několik let. V předkládaném vynálezu popisují autoři postup rozbíjení oligomerů na menší části, z nichž každá je potom schopna konvergovat PrPc.
Tento systém má proto přímá použití pro diagnózu konformačních onemocnění a zvláště přenosných konformačních onemocnění jako je TSE amplifikaci jinak nedekovatelných množství PrPSc v různých tkáních nebo biologických tekutinách. Tento systém může umožnit časnou identifikaci lidí s rizikem vyvinutí TSE, a mohl by být také velmi užitečný pro biochemické sledování účinnosti léků na TSE při klinických pokusech.
Podle výhodného provedení vynálezu se analyzovaný vzorek nejprve vystaví kroku „předběžného zpracování“, jehož účelem je „selektivní zakoncentrování“ detekovaného patogenního konformeru ve vzorku. V případě TSE bylo zjištěno, že PrPc í PrPSc jsou umístěny ve zvláštní oblasti plasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů (jako je ledový Triton X-100) v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (M. Vey a další, 1996). Tyto membránové domény se označují jako lipidické rafty (lipid-rafts) nebo membrány rezistentní na detergenty (detergentresistant membranes, DRM) nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domain, CLD) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny zakotvené na GPI. Autoři vynálezu potvrdili, že 100 % PrPc v mozku je navázáno na tuto frakci, která tvoří méně než 2 % celkových proteinů (viz příklad 6 a obr. 7). Jednoduchým krokem izolace lipidických raftů ze vzorku se tedy umožní podstatné • 9 *
9» • •99
- 10obohacení na PrP . Podobné výsledky byly přihlašovateli získány při izolaci lipidických raftů z homogenátů mozků se scrapií, ve kterých byl PrPSc izolován v raftech.
V jednom provedení tedy vynález zahrnuje krok, ve kterém se analyzovaný vzorek vystaví kroku předběžného zpracování pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku. Patogenní konformer je s výhodou PrPSc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.
Kroky (i) a (ia) se s výhodou provádějí za fyziologických podmínek (pH, teplota a iontová síla) a výhodněji se k roztoku přidávají také inhibitory proteáz a detergenty, Tyto podmínky se budou volit tak, aby umožnily přeměnu nepatogenního konformeru na patogenní konformer působením případného patogenního konformeru, jestliže je ve vzorku přítomen, za vytvoření agregátu nebo oligomerů patogenních konformeru. Vhodné fyziologické podmínky budou odborníkům v oboru zřejmé.
Délka inkubace bude dostatečná pro umožnění konverze veškerého nebo podstatné části nepatogenního konformeru na patogenní konformer za předpokladu, že vzorek nějaký patogenní konformer obsahuje. Tuto dobu může odborník v oboru snadno určit. S výhodou se každá inkubace bude provádět po dobu mezi 1 min až 4 hod, výhodněji 30 min až 1 hod, a zvláště výhodně přibližně 60 min.
Krok inkubace (ia) může také zahrnovat další krok (ib), jehož součástí je přidání dalšího množství nepatogenního konformeru.
Pro rozbití (disagregaci) agregátů při kroku (ii) způsobu podle předkládaného vynálezu mohou být použity různé metody. Patří sem; působení rozpouštědel (jako je dodecylsulfát sodný, dimethylsulfoxid, acetonitril, guanidin, močovina, trifluorethanol, zředěná kyselina trifluroctová, zředěná kyselina mravenčí atd.), modifikace fyzikálněchemických vlastností roztoku jako je pH, teplota, iontová síla, dielektrická konstanta, a fyzikální metody, jako je sonikace, ozáření « ·
Β ·
Β · * · · ·« ··
- 11 «·*«
Β
ΒΒΒΒ laserem, zmrazení/tání, homogenizátor typu French press, inkubace do autoklávu, vysoký tlak, míchání, mírná homogenizace, jiné typy ozáření atd. Výhodným způsobem podle vynálezu je sonikace.
Rozbíjení agregátů se může provádět po dobu, ve které dojde k disagregaci některých, veškerých nebo podstatné části agregátů vytvořených v průběhu kroku (ii). Není nutné, aby se v kterémkoli kroku disagregace rozbily veškeré agregáty. Tímto způsobem se v každém kroku rozbíjení agregátů zvyšuje počet konvertujících jednotek.
Dobu rozbíjení může snadno určit odborník v oboru a může záviset na použité metodě disagregace. rozbíjení se s výhodou provádí po dobu 1 s až 60 min, výhodněji 5 s až 30 min a zvláště výhodně 5 s až 10 min. Jestliže se rozbíjení provádí sonikací, sonikace trvá s výhodou 5 s až 5 min, a nejvýhodněji 5 až 30 s.
Sonikace se dosud používala jako součást několika metod pro čištění PrP s cílem zvýšit rozpustnost velkých agregátů, ale dosud nikdy nebylo popsáno její použití pro amplifikaci konverze PrP in vitro.
Použití tradičních sonikátorů s jednoduchou sondou přináší problém se současnou manipulací s velkým počtem vzorků, jak je nezbytné při diagnostických testech. Na trhu jsou nyní některé sonikátory pro mikrotitrační destičky s 96-jamkovým formátem, které poskytují sonikací všech jamek současně a mohou být naprogramovány pro automatický provoz. Tyto sonikátory mohou být snadno upraveny pro použití při způsobu diagnózy podle předkládaného vynálezu.
V jednom provedení se tedy předkládaný vynález týká použití sonikátorů pro více jamek (vícejamkového sonikátorů) v kroku (ii).
Detekce nové zkonvertovaného patogenního konformeru, např. PrPSc, (iii) po postupu cyklické amplifikace popsaném v krocích (i) až (ii), by se mohla provádět jakýmkoli ze známých způsobů. Specifická
i a ♦
4· ·*
- 12 detekce PrPSc se obvykle (ale ne vždy, viz dále) provádí nejprve separací dvou isoforem PrP (normálního proteinu a patogenního proteinu). Separace se provádí na základě odlišných biochemických vlastností PrPSc, kterými se liší od většiny normálních proteinů v těle, tedy: PrPSc je částečně rezistentní na štěpení proteázami a je nerozpustný i v přítomnosti nedenaturujících detergentů. První krok po amplifikačním postupu je tedy obyčejně odstranění nebo oddělení PrPc ve vzorku, buď působením proteáz nebo centrifugací pro oddělení rozpustného (PrPc) od nerozpustného (PrPSc) proteinu. Potom se může provést detekce PrPSc kterýmkoli z následujících způsobů, mj.:
A) Imunologický přenos (imunobloting) po SDS-PAGE. Tento způsob se provádí rutinním postupem známým odborníkům v oboru s využitím některé z mnoha komerčně dostupných protilátek anti-PrP.
B) Test Elisa. Detekce na pevné fázi se může provádět buď jednoduchým testem, při kterém se vzorek nanese na destičku a potom se detekuje množství PrPSc použitím protilátek anti-PrP nebo výhodněji použitím sendvičové metody Elisa, při které se destička nejprve potáhne protilátkou anti-PrP, která specificky vychytá PrP ze vzorku, a PrP se potom detekuje použitím druhé anti-PrP protilátky. Obě formy Elisa se mohou také použít se značenými (radioaktivita, fluorescence, biotin, atd.) anti-PrP protilátkami pro další zvýšení citlivosti detekce.
C) Testy radioaktivity. Normální PrPc použitý jako substrát pro amplifikaČní postup může být radioaktivně značený (3H, 14C, 35S, 1251, atd.) před zahájením postupu a potom po odstranění nekonvertovaného PrPc se může kvantifikovat radioaktivita nově zkonvertovaného PrPSc. Tento postup je kvantitativnější a není založen na použití protilátek.
D) Testy založené na fluorescenci. Normální PrPc použitý jako substrát pro amplifikaČní postup se může označit fluorescenčními • · * • ·*
-13, · · · · ··«·*» « · tttt* tt* ·**· sondami před zahájením postupu a po odstranění nezkonvertovaného PrPc, a může se kvantifikovat fluorescence nově zkonvertovaného PrPSc. Je možné, že fluorescenční test nemusí vyžadovat odstranění nezkonvertovaného PrPc, protože fluorescenční vlastnosti PrPc a PrPSc by mohly být různé v důsledku odlišné konformace těchto dvou isoforem.
E) Agregační testy. Je dobře známo, že PrPSc (a nikoli PrPc) je schopen agregovat za vytvoření amyloidních fibril nebo struktur tyčinkového typu. Proto by mohla být detekce PrPSc prováděna použitím způsobů používaných pro kvantifikaci tvorby těchto typů agregátů včetně elektronové mikroskopie, barvení specifickými barvivý (Kongo červeň, thioflavin S a T, atd.), a turbidimetrickýmí testy. Testy agregace nevyžadují krok separace dvou isoforem, protože je známo, že normální PrPc neagreguje.
F) Strukturní testy. Nejdůležitější rozdíl mezi normálním a patogenním PrP je rozdíl v sekundární a terciární struktuře. Proto mohou být použity metody, které umožňují strukturní vyhodnocení proteinů, včetně NMR, cirkulárního dichroismu, infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací, Ramanovy spektroskopie, vlastní fluorescence, UV absorpce apod.
Nejrozšířenější používanou monoklonální protilátkou proti PrP je „3F4“ (Kascsak a další, 1987), což je monoklonální protilátka odvozená z myši imunizované křeččím 263K PrPres (konformer rezistentní na proteázu). Tato protilátka je také schopna rozpoznat nepatogenní konformer křečků a lidí, ale nikoli z mozků hovězího dobytka, myší, krys, ovcí nebo králíků; je také schopna vázat se na lidský patogenní konformer, ale pouze po denaturaci proteinu.
Tyto protilátky mohou být označeny, aby byla možná snadná detekce markéru. Například někteří vědci používali fluorescenční měření s časovým rozlišením s protilátkou 3F4 značenou europiem (Safar a další, 1998).
• ···
- 14 • to · · · • to · · toto· · ·· to · toto ···« to · • to toto
Výše uvedené metody detekce mohou být použity po příslušných úparavách pro detekci jiných patogenních konformerů, například patogenní formy β-amyloídního proteinu.
V dalším provedení může být označený a detekovatelný nepatogenní konformer přidávaný v nadbytku, takže množství neagregovaného konformerů na konci testu umožní určení množství patogenního konformerů přítomného ve vzorku na počátku.
Podle dalšího alternativního provedení by mohl být patogenní konformer (markér) přímo detekován proti němu zaměřenou protilátkou.
V širším hledisku může být k patogennímu konformerů, nepatogennímu konformerů nebo protilátce proti některému z konformerů přidána značka nebo značící skupina v závislosti na druhu prováděného testu.
Dalším předmětem vynálezu je test na markér konformačního onemocnění, které je charakterizováno konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, kde tento test zahrnuje následující kroky:
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformerů, (ii) agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i) se rozbíjí, a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformerů ve vzorku.
Patogenní konformer bude obecně markér na přítomnost uvedeného onemocnění.
Krok (i) s výhodou zahrnuje krok (ia) inkubace uvedeného vzorku/nepatogenního konformerů.
- 15 • 9 9 ·
9999 99 • 9 ····
99
Podle výhodného provedení vynálezu tvoří kroky (ia) a (ii) cyklus, který se opakuje před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát. Výhodněji se cykly opakují 5 až 40 x a nejvýhodněji 5 až 20 x.
Další předmět předkládaného vynálezu je diagnostický kit pro použití ve specifikovaném testu, který obsahuje množství nepatogenního konformeru a popřípadě navíc mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.
Použitím způsobu podle vynálezu je možné detekovat 1 až 10 fg patogenního konformeru na počátku přítomného ve vzorku, což je ekvivalentní 3 až 30 χ 10'2° mol.
Vzorek bude obecně biologický vzorek nebo tkáň a způsobem podle předkládaného vynálezu je možno testovat jakýkoli takový biologický vzorek nebo tkáň, V případě tkáně se mohou test a způsob podle předkládaného vynálezu provádět na homogenátech nebo přímo na vzorcích ex vivo. Tyto způsoby a testy se budou obecně provádět na vzorcích ex vivo nebo in vitro. Vzorkem je s výhodou biologická tekutina jako je krev, lymfa, moč nebo mléko; mozková tkáň, míšní tkáň, tonsilární tkáň, tkáň apendixu; vzorek odvozený z krve jako jsou membrány krvinek (blood cell ghosts), povlaky sražených leukocytů; nebo preparát plasmatické membrány jako jsou lipidické rafty, membrány rezistentní na detergent nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domains). Vzorek by mohl alternativně být směs obsahující sloučeninu (zvláště protein) odvozenou z lidského nebo zvířecího zdroje, jako je růstový hormon nebo tkáňový extrakt, jako je hypofyzární extrakt. Takový směsný vzorek by mohl být kontaminován patogenním konformerem.
Vzorek by mohl také obsahovat potravinářský výrobek nebo nápoj, nebo část potravinářského výrobku nebo nápoje (pro použití pro člověka nebo zvířata), aby se zjistila přítomnost nebo nepřítomnost patogenního konformeru v tomto výrobku nebo nápoji.
- 16 Φ Φφφ • · « · φφφφ φφ • φ φ» ··♦* • Φ ··
Nepatogenní konformer přidaný v kroku (i) bude s výhodou od stejného druhu jako je vzorek. Může být například odvozen od zdravé (tj. nepatogenní) formy (například tkáně) biologického vzorku, který se testuje. Alternativně se může nepatogenní konformer vyrábět synteticky nebo rekombinantně použitím v oboru známých prostředků.
• Bude však zřejmé, že nepatogenní konformer nemusí být v čisté formě nebo dokonce ve v podstatě čisté formě. Ve většině případů bude nepatogenní konformer ve formě tkáňového homogenátu nebo jeho frakce, který obsahuje relevantní nepatogenní konformer. Mezi příklady patří mozkové homogenáty a z nich odvozené frakce, např. lípidické rafty.
Vzorek a/nebo nepatogenní konformer budou s výhodou lidského původu nebo budou pocházet z domácího zvířete, například krávy, ovce, kozy nebo kočky.
Další předmět předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu identifikace sloučeniny, která moduluje konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, který zahrnuje následující kroky:
(i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (Íi) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i), (iii) určí se množství patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny.
V případě potřeby může krok (i) zahrnovat krok (ia) inkubace uvedeného vzorku/nepatogenního konformeru a cyklus se může provádět mezi kroky (ia) a (ii) jak bylo popsáno výše pro způsoby a testy podle vynálezu a naopak.
Jestliže je množství patogenního konformeru naměřené v přítomnosti sloučeniny vyšší než množství naměřené v její
- 17 • ·♦♦ · to · · · · ··· · · to ««·* ·«·· ·· to* ··*· ·· ·· nepřítomnosti, znamená to, že sloučenina je faktor, který „katalyzuje konformační změnu; jestliže je toto množství nižší, znamená to, že sloučenina je faktor inhibujicí tento přechod.
Podle výše uvedeného způsobu by měla být „identifikace“ také interpretována ve smyslu „screeningu“ řady sloučenin.
„Značka“ nebo „značící skupina“ může být jakákoli sloučenina použitá jako prostředek pro detekci proteinu. Značka nebo značící skupina může být na protein navázána iontovými nebo kovalentními interakcemi, vodíkovou vazbou, elektrostatickými interakcemi nebo interkalací. Mezi příklady značek a značících skupin patří bez omezení konjugáty fluorescenčních barviv, biotin, digoxigenin, radionukleotidy, chemiluminescenční látky, enzymy a receptory, takže detekce značeného proteinu se provádí fluorescencí, konjugací se streptavidinem a/nebo avidinem, kvantifikací radioaktivity nebo chemiluminiscence, katalytickými interakcemi a/nebo interakcemi ligand-receptor. S výhodou se používá fluorescenční nebo fosforescenční značka.
Termín „konformační onemocnění“ označuje skupinu onemocnění pocházejících z pomnožení přechodu základního proteinu do odlišné konformace, což vede k agregaci proteinu a uložení ve tkáni. Tato onemocnění mohou být také přenášena indukovanou konformační změnou, šířena z patogenního konformerů na svůj normální nebo nepatogenní konformer a v tomto případě se zde také nazývají „přenosná konformační onemocnění“. Příklady takových druhů onemocnění jsou prionové encefalopatie včetně bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a jejího lidského ekvivalentu Creutzfeld-Jakobovy choroby (CJD), ve kterých je základním proteinem PrP.
Termín „sporadická CJD“ zkracovaný jako „sCJD“ označuje nejběžnější projev Creutzfeldt-Jakobovy choroby (CJD). Toto onemocnění se vyskytuje spontánně u jednotlivců se středním věkem • ···
- 18• · · · ···· ·· »· ··· · *· ·· přibližně 60 let a počtem případů celosvětově 1 na milion jednotlivců za rok.
Termín „iatrogenní CJD“ zkracovaná jako „iCJD“ označuje onemocnění pocházející z náhodné infekce člověka lidskými priony. Nejvýznamnějším příkladem tohoto onemocnění je náhodná infekce dětí lidskými priony z kontaminovaných preparátů lidského růstového hormonu.
Termín „familiální CJD označuje formu CJD, ke které zřídka dochází v rodinách a je nevyhnutelně způsobena mutacemi genu lidského prionového proteinu. Tato nemoc je výsledkem autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí tyto mutace, trpí CJD.
Termín „Gerstmann-Stráussler-Scheínkerova choroba“ zkracovaná jako „GSS“ označuje formu dědičného lidského prionového onemocnění. Toto onemocnění pochází z autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí mutantní gen, trpí GSS.
Termín „prion“ znamená částici schopnou přenosu, o které je známo, že způsobuje skupinu těchto přenosných konformačních onemocnění (spongiformních encefalopatií) u lidí a zvířat. Termín „prion“ je zkratka slov „protein“ a „infekce“ a částice jsou složeny zvětší části, pokud ne výlučně, z molekul PrPSc.
Priony se liší od bakterií, virů a viroidů. Mezi známé priony patří priony infikující zvířata za vzniku klusavky (scrapie), což je přenosné degenerativní onemocnění nervové soustavy ovcí a koz, stejně jako bovinních spongiformních encefalopatií (BSE) nebo nemoci šílených krav a kočičích spongiformních encefalopatií postihujících kočky. Jsou známa čtyři prionová onemocnění postihující člověka: (1) kuru, (2) Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), (3) Gerstmann-StráusslerScheinkerova choroba (GSS), a (4) fatální familiální insomnie (FFI). Jak se zde používá, prion zahrnuje všechny formy prionů způsobující všechna nebo některá z těchto onemocnění nebo jiná onemocnění
9 99 • 9
- 19 9 9 9 9
9999 99 • 9
9« 9999
9 9
99 u jakýchkoli živočichů a zvláště u lidí a domestikovaných hospodářských zvířat.
Termíny „gen PrP“ a „gen prionového proteinu“ se zde používají zaměnitelně pro popis genetického materiálu, který exprimuje prionové proteiny a polymorfismy a mutace uvedené zde pod názvem „Patogenní mutace a polymorfismy“. Gen PrP může pocházet z jakéhokoli živočicha včetně „hostitelských a „pokusných“ zvířat popisovaných v přihlášce a všech jejich polymorfismů a mutací, přičemž je zřejmé, že tyto termíny zahrnují jiné takové geny PrP, které dosud nebyly objeveny.
Termín „gen PrP“ označuje obecně jakýkoli gen jakéhokoli druhu, který kóduje kteroukoli formu aminokyselinových sekvencí PrP včetně kteréhokoli prionového proteinu. Některé běžně známé sekvence PrP se popisují v článku Gabriel a další, 1992, který se zde zařazuje odkazem pro zveřejnění a popis těchto sekvencí.
Používají se následující zkratky:
CNS pro centrální nervový systém;
BSE pro bovinní spongiformní encefalopatii;
CJD pro Creutzfeldt-Jakobovu chorobu;
FFI pro fatální familiální insomnii;
GSS pro Gerstmann-Stráussler-Scheinkerovu chorobu;
PrP pro prionový protein;
PrPc pro normální, nepatogenní konformer PrP;
PrPSc pro patogenní nebo „scrapiovou“ isoformu PrP (která je také markérem pro prionová onemocnění).
-20 • 00 0 00
0
00*0
Patogenní mutace a polymorfismy
Je známa řada patogenních mutací lidského genu PrP. Existují také známé polymorfismy u lidských, ovčích a hovězích genů PrP.
Dále je uveden neomezující seznam těchto mutací a polymorfismů;
Tabulka mutací
| Patogenní mutace člověka | Lidské polymorfismy | Polymorfismy ovcí | Bovinní polymorfismy |
| 2 inzerty oktarepeticí | Kodon 129 | Kodon 171 | 5 nebo 6 |
| 4 inzerty oktarepeticí | Met/Val | Arg/Glu | oktarepeticí |
| 5 inzertů oktarepeticí | Kodon 219 | Kodon 136 | |
| 6 inzertů oktarepeticí 7 inzertů oktarepeticí 8 inzertů oktarepeticí 9 inzertů oktarepeticí Kodon 102 Pro-Leu Kodon 105 Pro-Leu Kodon 117 Ala-Val Kodon 145 Stop Kodon 178 Asp-Asn Kodon 180 Val-lle Kodon 198 Phe-Ser Kodon 200 Glu-Lys Kodon 210 Val-íie Kodon 217 Asn-Arg Kodon 232 Met-Ala | Glu/Lys | Ala/Val |
| • AAA • A | A A · * A A • · A A AAAA | ||
| 21 - | ···· AA | AA AAAA AA AA | |
| Normální aminokyselinová | sekvence, | která | se vyskytuje |
| u převážné většiny jedinců, se | označuje | jako | sekvence PrP |
standardního typu. Tato sekvence standardního typu podléhá některým charakteristickým polymorfním variacím. V případě lidského PrP se dvě polymorfní aminokyseliny vyskytují na zbytcích 129 (Met/Val) a 219 (Glu/Lys). Ovčí PrP má dva aminokyselinové polymorfismy na zbytcích 171 a 136, zatímco bovinní PrP má buď pět nebo šest opakování sekvence motivu osmi aminokyselin v aminokoncové oblasti zralého prionového proteinu. I když žádné z těchto polymorfismů nejsou samy o sobě patogenní, zdá se, že mají vliv na prionová onemocnění. Na rozdíl od těchto normálních variací prionových proteinů standardního typu byly identifikovány některé mutace genu lidského PrP, které mění buď specifické aminokyselinové zbytky PrP nebo počet oktarepeticí a které se segregovaly u zděděných lidských prionových onemocnění.
Pro získání dalších významů výše uvedené tabulky demonstrující mutace a polymorfismy je možno odkázat na zveřejněné sekvence genů PrP. Například geny kuřecí, bovinní, ovčí, krysí a myší PrP jsou popsány a publikovány v článku Gabriel a další, 1992. Sekvence pro syrského křečka je zveřejněna v článku Baslet a další, 1986. Gen PrP ovcí je publikován v Goldmann a další, 1990. Genová sekvence hovězího PrP je publikována v Goldmann a další, 1991. Sekvence kuřecího genu PrP je publikována v Harris a další, 1991. Genová sekvence PrP norka je zveřejněna v Kretzschmar a další, 1992. Genová sekvence lidského PrP je publikována v Kretzschmar a další, 1986. Genová sekvence PrP myši je publikována v Locht a další, 1986. Ovčí genová sekvence PrP je zveřejněna ve Westaway a další, 1994. Tyto publikace jsou všechny zařazeny odkazem pro zveřejnění a popis genu PrP a aminokyselinové sekvence PrP.
Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:
φ Φ·Φ φ φ • · φ · φ φ φ φ φφφφ
- 22 - ...... ·· ........
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;
(ia) provede se inkubace vzorku/nepatogenního prionového proteinu;
(ii) provede se rozbití jakýchkoli agregátů vytvořených v průběhu kroku (ia);
dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.
Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostiky CJD u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek z pacienta (s výhodou vzorek krve nebo mozku);
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím proteinu PrPc;
(ia) inkubuje se vzorek/protein PrPc;
(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakuji kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství PrPSc ve vzorku.
Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy β-amyloidního proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;
(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;
(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.
• «·· « ·
-234 · 4
4444 44 • *
4444 • * 4
44
Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostiky Alzheimrovy choroby u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek (s výhodou vzorek krve nebo mozku) z pacienta;
(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;
(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;
(ti) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);
dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.
Vynález dále poskytuje zařízení pro použití při způsobech popsaných výše, zvláště zařízeni zahrnující mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.
Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostické detekce konformačního onemocnění, které se vyznačuje konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru uvedeného onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:
(i) uvedený vzorek se přivede do styku se známým množstvím nepatogenního konformeru, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i), a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku.
Kroky (i) a (íí) s výhodou tvoří cyklus, který se alespoň dvakrát opakuje před provedením kroku (iii), nejvýhodněji tvoří kroky (i) a (ii) cyklus, který se opakuje 5 až 40 x před provedením kroku (iii).
Vynález také poskytuje test na markér konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního • «·· • ·
- 24 • · · · tttttttt tttt • · • tt tttttttt tt tttt · tttt tttt proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, kde tento test zahrnuje následující kroky:
(i) uvedený vzorek se přivede do styku se známým množstvím nepatogenního konformeru, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku.
Kroky (i) a (ii) s výhodou tvoří cyklus, který se opakuje před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát.
Vynález dále poskytuje způsob identifikace sloučeniny, která moduluje konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a který zahrnuje následující kroky:
(i) známé množství nepatogenního konformeru se přivede do styku se známým množstvím patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), (iii) zjistí se množství patogenního konformeru v přítomnosti a nepřítomnosti uvedené sloučeniny.
Předkládaný vynález byl popsán na konkrétních provedeních, ale obsah popisu zahrnuje všechny modifikace a substituce, které může provést odborník v oboru, aniž by zašel za rámec významu a účelu nároků.
Vynález bude nyní popsán na následujících příkladech, které by v žádném případě neměly být považovány za omezující předkládaný vynález. Příklady budou odkazovat na dále uvedené obrázky.
• ·9· • ·
- 25 9 9 9
999· 99 • · •9 9999
9 9 9
9» 99
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Schematické znázornění konverze PrPc->PrPSc. Infekční jednotka PrPSc je olígomer bohatý na β-list, který převádí PrPc jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získá vlastnosti spojené s PrPSc.
Obr. 2. Schematické znázornění cyklického amplifikačního postupu. Systém je založen na cyklech inkubace PrPSc v přítomnosti nadbytku PrPc následovaných cykly sonikace. V průběhu inkubačních period se oligomerní PrPSc zvětšuje inkorporací PrPc do rostoucího agregátu, zatímco při sonikaci se agregáty rozbíjejí s cílem rozmnožit konvertující jednotky. V tomto obrázku jsou ukázány dva cykly sonikace/inkubace.
Obr. 3. Amplifikace PrPSc sonikačními cykly. Malé množství homogenátů mozku se scrapií obsahujícího PrPSc bylo inkubováno s homogenátem zdravého krysího mozku (dráha 1, kontrolní experiment) nebo s homogenátem zdravého mozku křečka (dráha 2 a 3). Poslední vzorek byl rozdělen na dvě skupiny, z nichž jedna byla vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace (dráha 3). Polovina výše uvedených vzorků byla nanášena přímo na gel a barvena na celkové proteiny Coomasie (část A). Druhá polovina byla zpracována působením PK a byl proveden imunologický přenos s použitím protilátky anti-PrP 3F4 (část B). Část C ukazuje některé kontroly, ve kterých byl homogenát zdravého mozku inkubován samostatně (dráhy 1 a 2) nebo v přítomnosti zředěného homogenátů mozku se scrapií (dráhy 3 a 4). Polovina vzorků (dráhy 2 a 4) byla vystavena pěti cyklům sonikace/inkubace. Dráhy 2, 3 a 4 byly zpracovány působením proteinázy K.
Obr. 4. Citlivost systému cyklické amplifikace. Minimální koncentrace PrPSc, která může být použita pro detekci po amplifikaci, byla studována sériovým ředěním homogenátů v mozku se scrapií a inkubací s homogenátem zdravého mozku křečka s nebo bez cyklů sonikace. Část A ukazuje kontrolní experiment, ve kterém byl mozek • ««· ♦ «
-26·····* φ φφφφ φφ ·Φ φφφφ φφ φφ křečka se scrapií sériově ředěn v homogenátu krysího mozku. Část B odpovídá experimentu, ve kterém byla sériová ředění mozku křečka se scrapií inkubována se zdravým mozkem křečka a vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace. Densitometrické vyhodnocení imunologických přenosů v částech A a B je ukázáno v části C. Ředění byla prováděna s mozkem jako výchozím materiálem a byla následující: 100 {dráha 1), 200 (dráha 2), 400 (dráha 3), 800 (dráha 4), 1600 (dráha 5) a 3200 (dráha 6).
Obr. 5. Vztah mezi signálem PrPres a počtem cyklů amplifikace. Zředěný homogenát mozku se scrapií byl inkubován s nadbytkem homogenátu mozku zdravého křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocen imunologickým přenosem.
Obr. 6. Amplifikace PrPSc ve vzorcích krve. Do heparinizované krysí krve byl přidán homogenát mozku křečka se scrapií pro dosažení konečného ředění 10 : 1. Tato směs byl inkubována 15 min při laboratorní teplotě. Byla provedena desetinásobná sériová ředění tohoto materiálu s použitím heparinizované krysí krve. Vzorky byly vystaveny jedenácti cyklům inkubace/sonikace a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem.
Obr. 7. Prionový protein je přítomný v lipidických raftech. Lípidické rafty (nazývané také membránová frakce rezistentní na detergenty nebo DRM) byly izolovány použitím modifikace dříve popsaných protokolů. 100 mg mozkové tkáně bylo homogenizováno v 1 ml PBS s obsahem 1% triton X-100 a 1 x kompletního koktejlu inhibitorů proteáz (Boehringer). Tkáň byla homogenizována deseti průchody přes jehlu stříkačky 22G a inkubována 30 min při 4 °C na rotační třepačce. Vzorek byl zředěn v poměru 1 : 2 v 60% sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. Přes vzorek bylo opatrně převrstveno 7 ml 35% sacharózy. Na horní část gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15% sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při • 000 • 0 • v
-27 0
0 0 0#· 0 · * 0 0000 ·0 ·0 «000 00 00
150 000 g 18 hod při 4 °C. Lípidické rafty plavou na rozhraní 15% a 35% sacharózy (část A). Byly odebírány různé frakce, které byly analyzovány barvením celkových proteinů dusičnanem stříbrným (část
B) a byl proveden imunologický přenos pro detekci PrP (část C). Pro odstranění sacharózy ze vzorku byla izolována frakce lipidických raftů, která byla promyta v PBS a centrifugována při 28 000 ot/min 1 hod při 4 °C. Centrifugán byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteáz. Veškerý PrPC byl obsažen v této frakci (část D).
Obr. 8: Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomné v lipidických raftech. Lípidické rafty byly izolovány z mozku zdravého křečka, jak je popsáno na obr. 2, a smíchány s vysoce čištěným PrPSc z mozku křečka se scrapií v 700násobném zředění. Vzorky byly bud zamraženy (dráha 3) nebo amplifikovány 20 hod (dráha 4). Dráhy 1 a 2 reprezentují stejné postupy, ale s použitím celkového mozkového homogenátu pro amplifikaci.
Obr. 9: Předsymptomatická detekce PrPSc v mozku křečka. Křečci byli zaočkováni intracerebrálně (i.c.) fyziologickým roztokem (kontrolní skupina) nebo homogenátem mozku se scrapií ve stonásobném zředění. Každý týden byli usmrceni čtyři křečci ve skupině a byly extrahovány a homogenizovány mozky. Polovina vzorků byla ihned zamražena (bílé pruhy) a druhá polovina vystavena 20 cyklům inkubace/sonikace (černé pruhy). Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a byl proveden imunologický přenos. Intenzita pruhů byla vyhodnocována denzitometricky. Každý pruh znázorňuje průměr vzorků od čtyř zvířat. Detekce nebyla pozorována v žádném z kontrolních mozků ať s amplifikaci nebo bez ní; tyto výsledky nejsou v obrázku ukázány.
Obr. 10. Amplifikace lidského PrPSc. Tyto studie byly prováděny použitím vzorků mozků 11 různých potvrzených případů sporadické CJD a 5 případů familiální CJD spolu se čtyřmi kontrolami shodného • ···
- 28 • 9 · 9 9 · >··· • •94 ·♦ »9 ···· 94 ·· věku, které zahrnovaly pacienty postižené jinými neurologickými onemocněními. Mozek byl homogenizován a vystaven dvaceti cyklům amplifikace. Reprezentativní výsledky kontroly (A) a tří různých případů (1,2, 3) sporadické CJD (B) jsou ukázány na obrázku.
Obr. 11: Detekce PrPSc v krvi po přípravě prázdných krevních buněk. Prázdné krvinky z 0,5 ml heparinizované krve pocházející ze zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Sc) byly připraveny podle popisu v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.
Obr. 12: Detekce PrPSc v krvi po extrakci sarkosylem. 0,5 ml heparinizované krve pocházející od zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Sc) bylo vystaveno extrakci sarkosylem, jak se popisuje v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní vzorek kontrolních zvířat a dva vzorky zvířat postižených scrapií.
Obr. 13: Detekce PrPSc v krvi po purifikaci lipidických raftů. Lipidické rafty byly extrahovány jak je popsáno v textu z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní přiklad kontrolního zvířete a dvou zvířat postižených scrapií.
tttttttt
- 29 ······ tttttttt · • tt* ··· tttttttt tttttttt tttt tttt ···· tttt tttt
Obr. 14: Detekce PrPSc v krvi po přípravě povlaků sražených leukocytů. Frakce sražených leukocytů z krve byla oddělena centrífugací z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla amplifikována a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy.
Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Amplifikace PK-resistentního PrP cyklickou konverzí in vitro
Homogenát mozku křečka extrahovaný ze zvířat postižených scrapií byl ředěn, dokud byl signál PrPSc ještě stěží detekovatelný imunologickým přenosem po působení proteinázy K (PK) (obr. 3B, dráha 1). Zpracování PK se provádí v oboru rutinně pro rozlišení mezi normální a abnormální formou PrP, které se odlišují svou citlivostí na degradaci proteázou (PrPSc je částečně rezistentní a PrPc se degraduje) (Prusiner, 1991). Forma PrP, která je rezistentní vůči štěpení PK, se bude označovat jako PrPres. Inkubace vzorku zředěného homogenátu mozku se scrapií s homogenátem mozku zdravého křečka obsahujícím nadbytek PrPc vedla ke zvýšení signálu PrPres (obr. 3B, dráha 2).
To ukazuje, že inkubace těchto dvou mozkových homogenátů vedla ke konverzi PrPc na PrPSc. Když byly vzorky inkubovány za stejných podmínek, ale vystaveny pěti cyklům inkubace/sonikace, došlo k dramatickému zvýšení množství PrPres (obr. 3B, dráha 3). Densitometrická analýza imunologického přenosu ukazuje, že signál PrPres byl cyklickou amplifikaci zvýšen 84 x ve srovnání se signálem • · • ···
- 30 »··♦ ·« • · ·· ««··
PrPres přítomným ve zředěném homogenátu mozku se scrapií (dráha 1).
Tato konverze je závislá na přítomnosti PrPSc, protože žádný PrPres nebyl pozorován, jestliže byl homogenát normálního křeččího mozku inkubován za stejných podmínek samostatně, ať už se sonikací nebo bez ní (obr. 3C, dráha 2). Pro vyloučení artefaktů přenosu bylo celkové množství proteinu naneseného na gel udržováno konstantní (obr. 3A) přidáním homogenátu krysího mozku ke zředěnému mozku se scrapií, přičemž se využívá toho, že krysí PrP není protilátkou používanou pro imunologický přenos detekován.
Příklad 2
Citlivost detekce využívající cyklické amplifikace
Pro vyhodnocení minimální koncentrace PrPSc, který může být použit pro detekci po amplifikaci byl homogenát mozku se scrapií sériově ředěn přímo v homogenátu zdravého mozku křečka. Bez inkubace se signál PrPres progresivně zmenšuje, přičemž v osmisetnásobném zředění je již zcela nedetekovatelný (obr. 4A, C). Naopak jestliže se stejné zředění inkubovalo s homogenátem zdravého mozku křečka a vystavilo pěti cyklům inkubace/sonikace, došlo k dramatickému snížení meze detekce PrPres. Jasný signál bylo možno snadno detekovat i při ředění 3200 (obr. 4B, C).
Příklad 3
Exponenciální zvýšení PrPres s počtem cyklů
Pro studium, zda intenzita signálu PrPres po cyklické amplifikaci závisí na počtu provedených cyklů inkubace/sonikace byl zředěný homogenát mozku se scrapií inkubován s nadbytkem homogenátu zdravého mozku křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem.
• ···
- 31 • · to to to to • •toto·· · · · to • to·· ·· ·· ···· ·· toto
Hladina PrPres exponenciálně stoupala s počtem cyklů inkubace/sonikace {obr. 5). Tento výsledek ukazuje, že zvýšení počtu cyklů by mohlo dále snížit detekční limity.
Příklad 4
Experimenty se sonikací vzorků krve s přídavkem PrPSc
K heparinizované krysí krvi byf přidán homogenát mozku křečka se scrapií pro získání konečného ředění 10 : 1. Tato směs byla inkubována 15 min při laboratorní teplotě.
Použitím heparinizované krve krysy byla z tohoto materiálu připravena desetinásobná sériová ředění. 50 μΐ každého ředění bylo centrifugováno při 3000 ot/min 10 min. Od centrifugátu byla oddělena plasma. 10 μΙ plasmy bylo smíseno s 50 μΙ homogenátu zdravého mozku křečka s obsahem substrátu PrPc pro konverzní reakci. Vzorky byly vystaveny 11 cyklům inkubace/sonikace. Pro získání kontroly byly některé vzorky smíchány v 50 μΙ homogenátu zdravého mozku křečka a udržovány při -20 °C až do použití. 15 μΙ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrPSc byl detekován jak je popsáno v části Metody.
Výsledky jsou ukázány na obr. 6. Je ukázáno jasné zvýšeni detekce proteinu po amplifikačnim postupu, které je zvláště zřejmé při nižší koncentraci PrPSc (například při ředění 1280). Jestliže porovnáme tyto výsledky s výsledky získanými na infikovaných mozkových tkáních, je potvrzeno, že proces amplifikace pracuje podobně i v krvi.
- 32 ·· · · · · · * · ««·· ·· ·· ···· ·· ··
Příklad 5
Cyklická amplifikace prováděná u velkého počtu vzorků
Použití tradičního sonikátoru s jednou sondou přináší problém se současnou manipulací s mnoha vzorky, jak je vyžadováno při diagnostickém testu. Cyklický amplifikační systém byl upraven pro formát 96-jamkového sonikátoru pro mikrodestičky (Misonix 431 MP 20 kHz), který umožňuje sonikaci ve všech jamkách současně a může být naprogramován pro automatický provoz. Toto zlepšení nejen sníží dobu zpracování, ale zabrání také ztrátě materiálu v porovnání s použitím jediné sondy. Je odstraněna možnost křížové kontaminace, protože nedochází k přímému ponoření sondy do vzorku. Tato skutečnost je nezbytná pro manipulaci s infekčními vzorky a minimalizaci falešně pozitivních výsledků. Dvacet cyklů inkubace v trvání 1 hod s následnými pulsy sonikace 15 s nebo 30 s poskytne významnou amplifikaci signálu PrPres, podobnou jako bylo pozorováno dříve použitím tradičního sonikátoru.
Příklad 6
Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomny v membránové frakci rezistentní na detergenty
Subcelulární umístění, kde dochází ke konverzi PrP v průběhu patogeneze onemocnění, ještě není zjištěno. Bylo však uváděno, že jak PrPc, tak i PrPSc jsou umístěny ve zvláštní oblasti piasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (Vey a další, 1996; Harmey a další, 1995). Tyto membránové domény jsou označovány jako lipidické rafty nebo membrány rezistentní na detergenty (DRM) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny ukotvené na GPI. Autoři předkládaného vynálezu potvrdili, že 100 % PrPc v mozku je navázán na tuto frakci, která tvoří méně než % celkových proteinů (obr. 7). Proto umožní jednoduchý krok izolace lipidíckých raftů dramatické obohacení PrPc Podobné výsledky byly získány při izolaci lipidíckých raftů z homogenátu mozku se scrapií, ve kterých byl v raftech izolován PrPSc.
Pro vyhodnocení, zda faktory potřebné pro amplifikaci PrP jsou obsaženy v lipidíckých raftech, byly tyto rafty čištěny z mozku zdravých zvířat a byla přidávána menší množství vysoce čištěného PrP extrahovaného z mozku nemocných zvířat. Amplifikace lipidíckých raftů byla ekvivalentní k amplifikaci získané s použitím celkového mozkového extraktu (obr. 8), protože množství PrPres vyprodukovaného po amplifikaci bylo za obou podmínek podobné. Tento výsledek ukazuje, že všechny prvky nezbytné pro konverzi a amplifikaci PrP (včetně tzv. „faktoru X“ (Telling a další, 1995)) jsou obsaženy v této specializované membránové doméně. Proto by identifikace a izolace faktorů nezbytných pro konverzi PrP měla být možná další separací proteinů z lipidíckých raftů a monitorováním jejich aktivity cyklickou amplifikaci. Navíc představují lipidické rafty možnou náhradu použití celkových mozkových homogenátů při procesu cyklické amplifikace jako zdroje substrátu PrPc a jiných endogenních faktorů s předpokládanou účastí na konverzi.
Příklad 7
Předsymptomatická diagnóza u experimentálních zvířat
Pro studium předsymptomatické diagnózy u křečků experimentálně infikovaných scrapií byl proveden screening 88 vzorků mozku v různých stadiích v průběhu předklinické fáze, z nichž polovina byly neínfikované kontroly. Mozky byly odebírány každý týden (čtyři v každé skupině) a vystaveny 20 cyklům amplifikace. Výsledky ukázaly, že tato metoda je schopná detekovat abnormální protein v mozku již ve druhém týdnu po zaočkování, což je daleko před vyvinutím jakýchkoli příznaků u zvířat (obr. 9). Bez cyklické amplifikace byl PrPSc
-34• ·«· · · · · 9 · • ·· · · · · · · ···* *· ·· ···· ·· ·· detekován v mozku v šestém týdnu po infekci, pouze čtyři týdny před prvním výskytem klinického onemocnění. U žádného z kontrolních zvířat, která nebyla infikován scrapii, nebyla pozorována žádná amplifikace.
Příklad 8
Použití cyklické amplifikace na vzorky lidského mozku
Pro analýzu použití postupu cyklické amplifikace na vzorcích mozků mrtvých lidí postižených Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (CJD) byly inkubovány mozkové homogenáty několika pacientů s CJD (nebo normálních kontrol) s homogenátem zdravého lidského mozku a byt proveden postup cyklické amplifikace. Výsledky ukazují, že došlo k významné amplifikaci u vzorků analyzovaného mozku se sporadickou CJD a u žádného ze čtyř kontrolních vzorků (obr. 10). Je zajímavé, že amplifikace byla získána pouze ve vzorcích, které se ukázaly jako infekční a tedy schopné konvertovat nemutovaný PrPc, zatímco nefungovala v případě, kdy mutantní protein není schopen konvergovat protein standardního typu. Tyto údaje podporují závěr, že metoda pracuje v lidských vzorcích podobně jako bylo ukázáno výše pro vzorky zvířat.
Příklad 9
Diagnóza v krvi s použitím cyklické amplifikace
Studie infekčností ukázaly, že alespoň u experimentálních zvířat je PrPSc přítomen u zvířat v pozdním stadiu onemocnění v krvi (Brown a další, 2001). Aby bylo možno provádět detekci PrPSc v krvi cyklickou amplifikaci, nejprve bylo provedeno selektivní zakoncentrování vzorku na detekovaný protein a odstranění velkého objemu krevních proteinů přítomných v nadbytku, jako je albumin nebo hemoglobin. Pro tento účel se ukázaly jako účinné následující čtyři odlišné protokoly.
• ··«
- 35 • · · · ·· · ·· * · ·· ···· • · · • · · *· ··
1, Příprava prázdných krvinek (cell ghosts)
Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. Plasma a buněčná frakce byly odděleny a zamraženy při -80 °C až do použití. 0,5 ml centrifugátu krvinek bylo třikrát promyto ve 12 až 15 objemech čerstvého chladného PBS, pH 7,6. Buňky byly resuspendovány ve 12 až 15 objemech 20 mOsM pufru s fosforečnanem sodným, pH 7,6, a míchány mírně na ledu 20 min, potom centrifugovány při 30 000 ot/min 10 min při 4 °C. Supernatant byl odlit, centrifugát byl promyt třikrát 20 mOsM pufrem s fosforečnanem sodným. Získaný centrifugát byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smícháno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΙ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem, přičemž PrPSc byl detekován jak je popsáno
Λ _ v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 11). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikaci žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrPSc detekovat (obr. 11).
2. Extrakce sarkosylem
Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml zcentrifugovaných buněk bylo zředěno ve stejném objemu 20% sarkosylu a inkubováno 30 min. Vzorek byl centrifugován v ultracentrifuze Beckman TL100 při 85 000 ot/min 2 hod při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΙ • ··· • φ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteínázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrPSc byl detekován jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrPSc po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 12). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikací žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrPSc detekovat (obr. 12).
3. Extrakce lipidických raftů
Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml stočených buněk bylo zředěno ve stejném objemu PBS 1% TritonX-100 a inkubováno 30 min při 4 °C. Vzorek byl zředěn 1 : 2 v 60% sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. 7 ml 35% sacharózy bylo opatrně navrstveno přes vzorek. Na horní povrch gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15% sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při 150 000 ot/min 18 hod při 4 °C. Lípidické rafty byly izolovány promytím v PBS a centrifugovány při 28 000 ot/min 1 hod při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΙ sonikovaného a kontrolního vzorku bylo štěpeno proteínázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP byl detekován jak bylo popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrPSc po amplifikací ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 13). Ve vzorcích krve neinfekčních zvířat se nevyskytuje po amplifikací žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrPSc detekovat (obr. 13).
- 37, ·*·· ·· ........
4. Příprava povlaku ze sražených leukocytů
Heparlnizovaná krev křečka byla centrifugována při 1500 ot/min při 4 °C 10 min. Povlak sražených leukocytů byl opatrně izolován standardními postupy a udržován při -80 °C až do použití. Zmrazený povlak sražených leukocytů byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objejem 10% homogenátů zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΙ soníkovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a detekce PrPSc byla provedena jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrPSc po postupu amplifikace ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 14). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není po amplifikaci přítomen žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrPSc detekovat (obr. 14).
Metody
Příprava mozkových homogenátů
Mozky syrských zlatých křečků, zdravých nebo infikovaných upraveným kmenem klusavky 263 K byly získány po usmrcení a okamžitě zamraženy v suchém ledu a udržovány při -80 °C až do použití. Mozky byly homogenizovány v PBS s inhibitory proteázy na koncentraci 10 % hmotn./obj. Byly přidány detergenty (0,5% Triton X100, 0,05% SDS) a směs byla vyčeřena centrifugací při nízké rychlosti (10 000 ot/min) 1 min.
Příprava vzorků a cyklická amplifikace
Sériová ředění homogenátů mozku se scrapií byla prováděna přímo v homogenátů zdravých mozků. 30 μΙ těchto ředění bylo inkubováno za míchání při 37 °C. Každou hodinu byl proveden cyklus * ·· *«· · · · · · · ·
- 38 - ...... ...... ·· ·· sonikace (5 pulsů po 1 s) použitím mikrosonikátoru s jehlou ponořenou ve vzorku. Tyto cykly byly několikrát opakovány (5 až 20).
Detekce PrPSc
Vzorky byly štěpeny PK 100 pg/ml 90 min při 37 °C. Reakce byla ukončena PMSF 50mM. Vzorky byly děleny SDS-PAGE (za denaturujících podmínek) a elektricky přenášeny na nitrocelulózovou membránu v pufru CAPS nebo tris-glycinovém přenášecím pufru s 10% methanolem po dobu 45 min při 400 mA. Před blokováním membrány 5% odtučněným mlékem bylo provedeno reverzibilnt barvení na celkové proteiny. Potom byla membrána inkubována 2 hod s monoklonální protilátkou 3F4 (1 : 50 000). Byla provedena čtyři promytí po 5 min pufrem PBS, 0,3% Tween 20 před inkubací se sekundární protimyší protilátkou značenou křenovou peroxidázou (1 : 5000) 1 hod. Po promytí byla vyvíjena reaktivita v membráně pomocí soupravy ECL chemiluminiscence Kit (Amersham) podle instrukcí výrobce.
Odkazy
Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742 - 744.
Baldwin, M. A., Cohen, F. E., a Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 270, 19197 - 19200.
Baslet a další, Cell 46: 417 - 428 (1986)
Brown, P., Cervenakova, L., a Diriger, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in CreutzfeldtJakob disease. J. Lab. Clin. Invest. 137, 5 - 13.
444
- 39 9 9 9 9 •949 ·· • » ·* »99· • 9 9·
Bruče, Μ. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., a Suttie, A. (1997). Transmissions to míče indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nátuře 389, 498 - 501.
Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J. M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J.J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi J., a Weller, R. O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459 -466.
Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350, 134 - 138.
Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., a Lansbury, P. T,, Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107 - 4110.
Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R.J., a Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530 - 531.
Cohen, F. E. a Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793 - 819.
Cousens, S. N., Vynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., a Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemie in humans. Nátuře 385, 197 - 198.
Gabriel a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9097 - 9101 (1992).
Galvez, S. a Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244,
-40*«···· · · · 9999 99 99 9999 99 99
Goldmann a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87: 2476 - 2480 (1990).
Goldmann a další, J. Gen, Virol. 72: 201 - 204 (1991).
Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., a Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouše neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753 - 759.
Harris a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7664 - 7668 (1991).
Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. W., a Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99 - 100.
Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., a Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a markér for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.
Jarrett, J. T. a Lansbury, Ρ. T., Jr. (1993). Seeding „on-dimensional crystallization“ of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer’s disease and scrapie? Cell 73, 1055 - 1058.
Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., a další (1992). High levels of nervous systém specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with eariy stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211, 37.
Kawashima, T., Furukawa, R., Dohura, K., a Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68 - 69.
Kascsak, R. J., Rubenstein, R., Merz, P. A., Tonna-DeMasi, M., Fersko, R., Carp, R. I., Wisnieswski, Η. M., Diringer, H., (1987). Mouše polycional and monoclonal antibody to scrapieassociated fibril proteins. J. Virol., 61, 3688 - 3693.
-41 * ··· • · « · · · · · · · tttt·· tttt tttt tttttttt ·· tttt
Kocisko, D. A., Come, J. H., Prioia, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., a Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nátuře 370, 471 - 474.
Kocisko, D. A., Prioia, S, A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., a Caughey, B. (1995). Species specificity in the cellfree conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3923 - 3927.
Kretzschmar a další, DNA 5: 315 - 324 (1986).
Kretzschmar a další, J. Gen. Virol. 73: 2757 - 2761 (1992).
Locht a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 6372 - 6376 (1986).
Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., a Macchi, G. (1993). Early MRÍ findings in Creutzfeld-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423.
Pan, K. M., Baldwin, M., Njuyen J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I,, a Prusiner, S. B. (1993). Conversion of alphahelices into β-sheets features in the formation of scrapie prion proteins. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 90, 10962 - 10966.
Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515 - 1522.
Roos, R., Gajdusek, D. C., a Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1 - 20.
Saborio, G. P., Soto, C., Kascsak, R. J., Levý, E., Kascsak, R., Harris, D. A., a Frangion, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470 - 475.
Safar, J., Wille, H., Itri, V., Groth, D., Serban, H., Torchia, M., Cohen, F. E., Prusiner, S. B., (1998). Eight prion strains háve PrP(Sc) • ·
-42• «·· ····*· ·*·· · ·· ··· · · · · ««·· ·· ·· ···· *· · molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157 1165.
Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z., Lisanti, Μ. P. (1993). Signál transducing molecules and glycosyl-fosfatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol., srpen; 122(4); 789 - 807.
Stáhl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L., Gibson, B. W., Buriingame, A. L., a Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991 - 2002.
Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., a další (1996). Accuracy and reliability of periodic Sharp wave complexes in CreutzfeldtJakob disease. Arch. Neurol. 53, 162.
Telling, G. C., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., a Prusiner, S. B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 7990.
Martin Vey a další (1996). Pro. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 14945 - 9.
Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., a Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381 - 387.
Westaway a další, Genes Dev. 8: 959 - 969 (1994).
WHO/EMC/ZDI/98,9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Ženeva, Švýcarsko 9. -11. února 1998, WHO.
Zastupuje:
• 000 • 0 <•0 000 φ··· _ _ ···· ·· ·· ··*· ·· ··
Í>V 4663 - 36'
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru tohoto onemocnění ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;(ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e cyklus se opakuje před provedením kroku (iii) pětkrát až čtyřicetkrát.• φφφ • φ • · * φφφ φ··· φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ
- 5. Způsob podie některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že krok (i) se provádí za fyziologických podmínek,
- 6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že množství nepatogenního konformeru v kroku (i) je nadbytečné množství.
- 7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že konformační onemocnění je přenosné konformační onemocnění.
- 8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že analyzovaný vzorek se předběžně zpracuje pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, ž e patogenní konformer je PrPSc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.
- 10. Test na markér konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, vyznačující se tím, že tento test zahrnuje následující kroky:(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;• ··· * · · · · · ««···· · · · · · « · · ♦ · · » · ♦ · «··· ·* ·· ···· ·· ·*-45(ií) rozbíjí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění.
- 11. Test podle nároku 10, vyznačující se tím, ž e krok (i) zahrnuje krok (ia, při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenni konformer.
- 12. Test podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se opakuje před provedením kroku (iii) aiespoň dvakrát.
- 13. Diagnostický kit pro použití v testu podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje známé množství nepatogenního konformeru, vícejamkovou mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.
- 14. Způsob identifikace sloučeniny modulující konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru (a) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (b) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny;(ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a-46 • 444 «4444 · · 4·· <444 «444 «· 44 4444 4* 44 (iii) zjistí se množství patogenního konformeru (a) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (b) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny.
- 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 9 nebo 14, nebo test podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že patogenním konformerem je PrPSc, nepatogenním konformerem je PrPc a základním proteinem je prionový protein.
- 16. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní prionový protein;(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) - (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.
- 17. Způsob diagnózy Creutzfeldt-Jakobovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:odebere se vzorek z pacienta;(i) vzorek se přivede do styku s množstvím proteinu PrPc;(ia) inkubuje se vzorek/protein PrPc;(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);• ··· • · • ·-47 «*»*'· ♦ · · · *··· »r *· ···· ·· ·· kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potomQ Λ (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství PrP ve vzorku.
- 18. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy β-amyloidního proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky;(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;(íi) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního βamyloidního proteinu ve vzorku.
- 19. Způsob diagnózy Alzheimerovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:odebere se vzorek z pacienta;(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního βamyloidního proteinu ve vzorku.* · 0 00 0-48 0000 0*0 0 »0 «··· • ♦ 0 0 • 0 «0
- 20. Zařízení pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 9 nebo 14, nebo při testu podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.Zastupuje:• 999999 9 991/13 ?(/ - 3íObr. 1.Schematické znázornění konverze PrPc->PrPExogenní PrPScVazbaInterakce PrPc-PrPScKonverzeNový a starý PrpScObr. 2.Schematické znázornění cyklického amplifikačního postupu • 9 • 9 9 9 9 9 ♦ · 9··· *9 993/13 _O <Li_ cO >« >.oObr. 3.Amplifikace PrPSc sonikačními cyklyCQCN +iΦ '</)W raE ooOΦ orao.E ra >.O ···CO ··· ·4/13 ·· · ··' ·♦··JJjX> 3<řCitlivost systému cyklické amplifikaceCOO <o o o o o oLO σ LO r- co cmŘedění nijnjd e)izueiu|5/13 ?|r ύ; · - 3é ·*··Obr. 5.Vztah mezi signálem PrPres a počtem cyklů amplifikaceHomogenát mozku se scrapií v ředění 10‘2 v homogenátu mozku zdravého křečkaCykly amplifikaceObr. 6.Amplifikace PrPSc ve vzorcích krveAmplifikace + + - + + • «·Φ • » • φ • · φ φ φ φ φ*·· φφφφ φφ ·φφ ··· * ·· ?Ι/ &Q3 - 3έ6 /13 «•(ϋ »ϋΈ οοΙΛΠ3 >Ο £2ΟΟ)4—·Μ— σι ο>, οΤ3Ω.>XL—X }>|ejpo Αλο>|ιθ0 . r, 4:: - < ί ί 1! ί - sy % ον BA)SJA leBnjkijuaoAA0UBJqiU9!/\]Q7 Τ'CC αφ οφ 'ra cω σι οΕ οX σ>•π >οC οQ ϋ15%-35% Vrstva vzorku rozhraní7/13 •*»· · * » * * ···«· ···· • · · —·. ·- · · · ···· ·· ·· ··· ·· IObr. 8:Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomné v lipidických raftech Čistý PrPSc inkubovaný sAmplifikace extraktem mozku DRM • · · · » ·· ···· ·· · + ty ££¢3 »·*· ··8/13
'Φ 'CD C CO c — Φ o >N co ú- ι- Ε Q. CO E N < □ Předsymptomatická diagnóza v mozcích se scrapiiIntenzita PrPres9/13 • i « * .· · · · · t · · · « ···· ·« ·· ···· ·♦ «♦Cyklická amplifikace lidského PrPE * < 0- + +1 +I IO O roLD O ~CO co CLE < 0• ··· • 4 • 4 *444 ·· • ·10/134 ·4 4 44 4 ••44 44 44Obr. 11Detekce PrPSc v krvi po přípravě prázdných krevních buněkBez amplifikace S amplifikaci11/13Íi63 - 36Obr. 12Detekce PrPSc v krvi po extrakci sarkosylemBez amplifikace S amplifikaci-HC Sc C Sc Sc12/13 • ··· * 9 99 9 9 <>·· «Obr. 13Detekce PrPSc v krvi po purifikaci lipidických raftůBez amplifikace S amplifikaci-1(-13/13 • ··♦ • · · · * · _ · ···· o • · • « · • · ·♦ ···· řv £C'C· 3 • · » • » » • · « 999 99 tObr. 14Detekce PrPSc v krvi po přípravě povlaků sražených leukocytůBez amplifikace S amplifikaciI II IC Sc C Sc
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00114650 | 2000-07-07 | ||
| EP00127892 | 2000-12-20 | ||
| EP01102732 | 2001-02-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ200336A3 true CZ200336A3 (cs) | 2003-06-18 |
| CZ304365B6 CZ304365B6 (cs) | 2014-04-02 |
Family
ID=27223071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-36A CZ304365B6 (cs) | 2000-07-07 | 2001-06-13 | Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7351526B2 (cs) |
| EP (2) | EP1712920B1 (cs) |
| JP (1) | JP4790966B2 (cs) |
| KR (1) | KR100764981B1 (cs) |
| CN (1) | CN1221807C (cs) |
| AR (1) | AR029583A1 (cs) |
| AT (2) | ATE426816T1 (cs) |
| AU (2) | AU6408901A (cs) |
| BG (1) | BG66272B1 (cs) |
| BR (1) | BRPI0112262B8 (cs) |
| CA (1) | CA2413078C (cs) |
| CY (1) | CY1109106T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ304365B6 (cs) |
| DE (2) | DE60121958T2 (cs) |
| DK (2) | DK1712920T3 (cs) |
| EA (1) | EA007391B1 (cs) |
| EE (1) | EE05675B1 (cs) |
| ES (2) | ES2264691T3 (cs) |
| HK (1) | HK1058065A1 (cs) |
| HR (1) | HRP20030033B1 (cs) |
| HU (1) | HU228813B1 (cs) |
| IL (2) | IL153824A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03000226A (cs) |
| NO (1) | NO331624B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ523213A (cs) |
| PL (1) | PL211154B1 (cs) |
| PT (2) | PT1712920E (cs) |
| RS (1) | RS51523B (cs) |
| SI (2) | SI1299729T1 (cs) |
| SK (1) | SK287768B6 (cs) |
| WO (1) | WO2002004954A2 (cs) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002073210A1 (de) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Manfred Eigen | Verfahren zur verstärkung der bildung von aggregaten aus proteinuntereinheiten |
| EP1395833B1 (en) | 2001-05-31 | 2013-02-27 | Adlyfe, Inc. | Misfolded protein sensor method |
| US20050026165A1 (en) | 2001-05-31 | 2005-02-03 | Cindy Orser | Detection of conformationally altered proteins and prions |
| ES2401645T3 (es) | 2003-06-19 | 2013-04-23 | Merck Serono Sa | Uso de agentes moduladores de la conversión de priones |
| DE10328125A1 (de) * | 2003-06-23 | 2005-01-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach spontaner Transformationsreaktion |
| DE10328830A1 (de) * | 2003-06-26 | 2005-01-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach asymmetrischer Interaktion |
| US20070054322A1 (en) * | 2003-07-31 | 2007-03-08 | Hadasit Medical Research Services & Development Lt | Methods and kits for the detection of prion diseases |
| JP4709149B2 (ja) | 2003-08-13 | 2011-06-22 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | プリオン特異的ペプチド試薬 |
| US20060057671A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Orser Cindy S | Immobilized probes and methods of detecting conformationally altered prion proteins |
| JP4568840B2 (ja) * | 2004-12-28 | 2010-10-27 | 国立大学法人金沢大学 | アルツハイマー病の検査方法 |
| MX2007009819A (es) * | 2005-02-15 | 2007-11-07 | Adlyfe Inc | Metodo para detectar proteinas y priones desplegados. |
| CN101218510A (zh) * | 2005-04-20 | 2008-07-09 | 得克萨斯系统大学评议会 | 通过自动化的蛋白质错折叠循环扩增超灵敏检测朊病毒 |
| EP1731911A1 (fr) * | 2005-06-07 | 2006-12-13 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Procédé utile pour la détection d'encéphalopathies |
| DE102005031429A1 (de) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Verfahren zur selektiven Bestimmung pathologischer Proteinablagerungen |
| EP2383281A3 (en) | 2005-09-09 | 2012-01-04 | Novartis AG | Prion-specific peptoid reagents |
| US20070281367A1 (en) | 2006-05-03 | 2007-12-06 | Applera Corporation | Methods, Compositions, and Kits for Quantitating Antibodies |
| CA2657503C (en) * | 2006-07-28 | 2014-10-21 | Adlyfe, Inc. | Peptide probes for diagnostics and therapeutics |
| CA2662863A1 (en) * | 2006-09-06 | 2008-03-13 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for the detection of protein folding disorders |
| EP2179293B1 (en) | 2007-07-20 | 2014-09-03 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Detection of infectious prion protein by seeded conversion of recombinant prion protein |
| FR2929290B1 (fr) * | 2008-03-27 | 2010-05-07 | Lfb Biotechnologies | Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel |
| CA2725100C (en) | 2008-05-28 | 2014-02-18 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization | Method for efficiently amplifying abnormal prion protein derived from bse |
| EP2280028B1 (en) | 2008-05-28 | 2013-03-27 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization | Method for efficiently amplifying abnormal prion protein derived from sheep scrapie |
| ITMI20081052A1 (it) * | 2008-06-10 | 2009-12-11 | Univ Milano Bicocca | Liposomi in grado di legare efficacemente il peptide beta-amiloide |
| FR2935711A1 (fr) * | 2008-09-05 | 2010-03-12 | Lfb Biotechnologies | Clone cellulaire stable exprimant un prion |
| CA2779846A1 (en) * | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Novartis Ag | Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers |
| US10989718B2 (en) | 2014-09-11 | 2021-04-27 | Amprion, Inc. | Detection of misfolded alpha synuclein protein |
| US10215763B2 (en) * | 2010-05-18 | 2019-02-26 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for estimating prion concentration in fluids and tissue by quantitative PMCA |
| IT1405762B1 (it) | 2010-11-25 | 2014-01-24 | Icgeb | Proteine ricombinanti con attivita' di inattivazione selettiva di proteine bersaglio |
| AU2012207454B2 (en) * | 2011-01-18 | 2016-11-17 | Prionics Ag | Methods for amplification and detection of prions |
| FR2973114A1 (fr) | 2011-03-21 | 2012-09-28 | Ets Francais Du Sang | Nanobilles recouvertes de plasminogene comme support direct d'amplification cyclique de la proteine prion prpsc |
| WO2013056841A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Inra (Institut National De La Recherche Agronomique) | A method for diagnosing tse |
| WO2015160007A1 (ko) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | 한림대학교 산학협력단 | 극미량 병원성 프리온 단백질 검출방법 및 장치 |
| WO2016040903A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection of misfolded amyloid beta protein |
| EP3191599B1 (en) | 2014-09-11 | 2023-08-02 | Board Of Regents Of the University Of Texas System | Detection of misfolded proteins |
| US10359434B2 (en) | 2014-10-22 | 2019-07-23 | Colorado State University Research Foundation | In vitro detection of prions in blood |
| WO2016149537A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Bank vole prion protein as a broad-spectrum substrate for rt-quic-based detection and discrimination of prion strains |
| CA3062876A1 (en) | 2017-05-16 | 2018-11-22 | Amprion, Inc. | Detection of misfolded tau protein |
| US20190353669A1 (en) * | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Amprion, Inc. | Detection of Brain Injury or Neurological Disease using Tau Protein |
| US11598783B1 (en) | 2019-10-23 | 2023-03-07 | Colorado State University Research Foundation | In vitro detection of prions |
| WO2021198098A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Universität Zürich | Improved method of detecting biomarkers in a biological sample |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262332A (en) * | 1989-04-05 | 1993-11-16 | Brigham And Women's Hospital | Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue |
| US5616871A (en) * | 1995-09-28 | 1997-04-01 | Drummond Scientific Company | Pipet gun assembly |
| US5750361A (en) * | 1995-11-02 | 1998-05-12 | The Regents Of The University Of California | Formation and use of prion protein (PRP) complexes |
| CA2268904A1 (en) * | 1996-10-15 | 1998-04-23 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Diagnosis of spongiform encephalopathy |
| CA2376914A1 (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Mcgill University | Prion protein binding proteins and uses thereof |
| CA2393607A1 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-28 | Ronald R. Manna | Ultrasonic horn assembly |
| CN101218510A (zh) * | 2005-04-20 | 2008-07-09 | 得克萨斯系统大学评议会 | 通过自动化的蛋白质错折叠循环扩增超灵敏检测朊病毒 |
-
2001
- 2001-06-13 WO PCT/GB2001/002584 patent/WO2002004954A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-13 ES ES01938411T patent/ES2264691T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EP EP06015975A patent/EP1712920B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 DE DE60121958T patent/DE60121958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 PT PT06015975T patent/PT1712920E/pt unknown
- 2001-06-13 PL PL360397A patent/PL211154B1/pl unknown
- 2001-06-13 SK SK1858-2002A patent/SK287768B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 BR BRPI0112262A patent/BRPI0112262B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 NZ NZ523213A patent/NZ523213A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 MX MXPA03000226A patent/MXPA03000226A/es active IP Right Grant
- 2001-06-13 IL IL15382401A patent/IL153824A0/xx unknown
- 2001-06-13 AT AT06015975T patent/ATE426816T1/de active
- 2001-06-13 ES ES06015975T patent/ES2322660T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 DK DK06015975T patent/DK1712920T3/da active
- 2001-06-13 SI SI200130612T patent/SI1299729T1/sl unknown
- 2001-06-13 CA CA2413078A patent/CA2413078C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 CN CNB018149200A patent/CN1221807C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 SI SI200130918T patent/SI1712920T1/sl unknown
- 2001-06-13 PT PT01938411T patent/PT1299729E/pt unknown
- 2001-06-13 CZ CZ2003-36A patent/CZ304365B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 DK DK01938411T patent/DK1299729T3/da active
- 2001-06-13 AT AT01938411T patent/ATE335204T1/de active
- 2001-06-13 DE DE60138146T patent/DE60138146D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 RS YUP-1012/02A patent/RS51523B/sr unknown
- 2001-06-13 US US10/332,370 patent/US7351526B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EE EEP200300005A patent/EE05675B1/xx unknown
- 2001-06-13 EP EP01938411A patent/EP1299729B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 JP JP2002509773A patent/JP4790966B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 AU AU6408901A patent/AU6408901A/xx active Pending
- 2001-06-13 AU AU2001264089A patent/AU2001264089B2/en not_active Expired
- 2001-06-13 HU HU0301020A patent/HU228813B1/hu unknown
- 2001-06-13 KR KR1020027018065A patent/KR100764981B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EA EA200300126A patent/EA007391B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-07-06 AR ARP010103239A patent/AR029583A1/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-01-06 NO NO20030059A patent/NO331624B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-01-07 IL IL153824A patent/IL153824A/en active IP Right Grant
- 2003-01-20 HR HR20030033A patent/HRP20030033B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-01-24 BG BG107498A patent/BG66272B1/bg unknown
-
2004
- 2004-02-09 HK HK04100841A patent/HK1058065A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-05-28 CY CY20091100569T patent/CY1109106T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ200336A3 (cs) | Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění | |
| AU2001264089A1 (en) | Early diagnosis of conformational diseases | |
| US9638702B2 (en) | Detection of conformationally altered proteins | |
| Das et al. | Prions: beyond a single protein | |
| US7566543B2 (en) | Prion test | |
| US20060057671A1 (en) | Immobilized probes and methods of detecting conformationally altered prion proteins | |
| Soto-Jara | Early diagnosis of conformational diseases | |
| US20070117088A1 (en) | Methods and kits for detection of prion diseases | |
| ZA200300878B (en) | Early diagnosis of conformational diseases. | |
| EP1512973A1 (en) | Methods and kits for detection of prion diseases | |
| CA2518372A1 (en) | Peptides for discrimination of prions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210613 |