CN1652743A

CN1652743A - 毛发生长补剂

Info

Publication number: CN1652743A
Application number: CNA038113252A
Authority: CN
Inventors: 池田明子; 筱永英树; 藤本奈津子; 葛西阳子
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2005-08-10
Also published as: US20050182129A1; CA2482940A1; JPWO2003086334A1; AU2003227410A1; RU2004133555A; WO2003086334A1; EP1498104A4; EP1498104A1; RU2312863C2

Abstract

一种毛乳头细胞生长促进剂、毛发生长刺激剂和毛发生长补剂，其含有一种具有抑制WNT－5A功能之活性的化合物。

Description

毛发生长补剂

技术领域

本发明涉及一种真皮乳头细胞生长促进剂、一种毛发生长刺激剂和一种毛发生长补剂。更具体而言，涉及含有WNT-5A功能抑制剂作为活性成分的一种真皮乳头细胞生长促进剂、一种毛发生长刺激剂和一种毛发生长补剂。而且，本发明也涉及一种根据抑制WNT-5A功能的效果筛选真皮乳头细胞生长促进剂的方法。

背景技术

人的毛囊由上皮和间充质真皮细胞(如角质细胞、真皮乳头细胞、成纤维细胞和皮脂细胞)组成，毛发生长周期(毛发周期)通过这些细胞之间的相互作用控制。毛囊角质细胞的增殖/分化(角质化)形成毛干。真皮乳头调节这些毛囊角质细胞的增殖、分化和凋亡，在毛发周期的控制中起关键作用。因此在开发毛发生长刺激剂/毛发生长补剂的过程中，重要的是研究对真皮乳头细胞的作用。然而，调节真皮乳头细胞的增殖能力和毛发周期控制能力的分子机制迄今为止还几乎没有阐明。

WNT-5A是一种分泌型糖蛋白，属于WNT家族。WNT家族包括约20种分子，从线虫到哺乳动物它们都是保守的。众所周知，这些WNT是重要的细胞间信号分子，它们调节胎儿期的体轴形成和器官形成(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.， 14，59-88(1998)；Genes & Dev. 11，3286-3305(1997))。人类有10种WNT受体，它们是Frizzled七通道(seven-pass)跨膜受体(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.， 14，59-88(1998)，Genes & Dev.， 11，3286-3305(1997))。根据WNT-Frizzled键的组合，存在3种信号传导途径(即WNT/β-连环蛋白途径、PCP途径和WNT/Ca²⁺途径)(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.， 14，59-88(1998))。

近年来，已经阐明WNT/β-连环蛋白途径是形成毛囊的基础(Genes & Dev.， 8，2691-2703(1994)；Cell， 95，605-614(1998)；Dev.Biol.， 207，133-149(1999)；Genes & Dev.， 14，1181-1185(2000)；Cell，105，533-545(2001))。1988年，构建了一种在皮肤中具有稳定的β-连环蛋白转基因小鼠。据报道，该小鼠显示新生毛囊形态发生增强，并且导致多毛症(Cell， 95，605-614(1998))。2000年报道，WNT/β-连环蛋白信号在保持真皮乳头的毛发诱导活性中起重要作用(Genes &Dev.， 14，1181-1185(2000))。

然而，已经阐明，来自WNT-5A的信号传导不是由WNT/β-连环蛋白途径介导，而是由Ca²⁺途径介导(Dev.Biol.， 182，114-120(1997)；Curr.Biol.， 9，695-698(1999))，迄今为止还没有关于WNT-5A与毛囊形态发生之间的关系的报道。

另外也有报道，向早期非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎内注射非洲爪蟾WNT-5A mRNA以及人Frizzled 5 mRNA可诱导胚轴的复制(Science， 275，1652-1654(1997))，而注射WNT-1或WNT-8 mRNA诱导的轴复制被WNT-5A抑制(J.Cell Biol.， 133，1123-1137(1996))，非洲爪蟾WNT-5A与大鼠Frizzled 2结合，并且通过Ca²⁺途径激活CamK II(Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II)和PKC(蛋白激酶II)(Curr.Biol.， 9，695-698(1999))。然而，它们的生理学意义还不清楚，迄今为止还没有关于WNT-5A与毛发生长刺激/毛发生长促进之间的关系的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种使用调节真皮乳头细胞增殖的分子的筛选方法，基于新功能的一种真皮乳头细胞生长促进剂和一种毛发生长刺激剂和一种毛发生长补剂。

为了达到这些目的，本发明人进行了深入的研究。结果发现，WNT-5A在真皮乳头细胞中高表达，并且WNT-5A与真皮乳头细胞的增殖能力有关。基于这些发现的随后研究进一步发现，抑制WNT-5A的功能能够显著促进真皮乳头细胞的生长，并且能够增大毛囊的毛球部分，从而完成本发明。

在一个实施方案中，本发明提供一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有一种具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有一种具有抑制WNT-5A生成之活性的化合物。

在另一个实施方案中，本发明提供由下列通式(I)代表的化合物：

其中R¹和R²相同或不同，各自代表氢原子、C_1-6烷基或C_2-6烷酰基；

X代表氢原子或卤素原子；

R^3a和R^3b相同或不同，各代表氢原子或羟基；和

R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹相同或不同，各自代表氢原子、羟基、卤素原子或C_2-6烷酰氧基，或者其相邻基团一起形成π键或醚键，或者R⁵和R⁸或R⁵和R⁹一起形成醚键。

在另一个实施方案中，本发明提供一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有由下列通式(II)代表的化合物：

X代表氢原子或卤素原子；

R^3c和R^3d相同或不同，各自代表氢原子、羟基或C_1-6烷氧基，或者R^3c和R^3d一起形成氧代基、肟基或C_1-6烷氧基亚氨基；和

在另一个实施方案中，本发明提供一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有由下列通式(IX)代表的化合物：

其中R^1a和R^2a相同或不同，各自代表氢原子、C_1-6烷基或C_2-6烷酰基、

(CH₂)_pCO-Y-R¹⁰代表的基团(其中Y代表氧原子或硫原子；R¹⁰代表氢原子、C_1-6烷基或取代的或未取代的芳基；p＝0或1)，

(CH₂)_qR¹¹代表的基团(其中R¹¹代表取代的或未取代的环烷基，或取代的或未取代的C_2-10杂环；q＝0或1)，或

COR¹²代表的基团(其中R¹²代表取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的C_2-10杂环)；

X代表氢原子或卤素原子；

R^3e和R^3f相同或不同，各自代表氢原子、羟基、C_1-6烷氧基或C_1-6烷酰氧基，或者R^3e和R^3f一起形成氧代基、肟基或C_1-6烷氧基亚氨基；和

R^4a、R^5a、R^6a、R^7a、R^8a和R^9a相同或不同，各自代表氢原子、羟基、卤素原子或

Z-R¹³代表的基团(其中Z代表氧原子或硫原子；R¹³代表C_1-6烷基、C_1-6烷酰基或取代的或未取代的芳基)，或

其相邻基团一起形成π键或醚键，或

R^5a和R^8a或R^5a和R^9a一起形成醚键；和

R^6b代表氢原子，或者与R^3e或R^3f一起形成醚键。

在另一个实施方案中，本发明提供一种毛发生长刺激剂或毛发生长补剂，其含有上述真皮乳头细胞生长促进剂作为活性成分。

在另一个实施方案中，本发明提供一种筛选真皮乳头细胞生长促进剂的方法，包括选择抑制WNT-5A功能的物质。

在另一个实施方案中，本发明提供一种选择抑制WNT-5A功能的物质的方法，即筛选真皮乳头细胞生长促进剂的方法，该方法包括下列步骤(a)-(c)：

(a)在已经添加待测化合物的培养基中培养表达人WNT-5A的细胞的步骤；

(b)裂解步骤(a)中培养的表达人WNT-5A的细胞，提取RNA，并且测定WNT-5A mRNA含量的步骤；和

(c)比较步骤(b)中测定的WNT-5A mRNA含量的步骤。

附图简述

图1是显示WNT-5A mRNA在真皮乳头细胞中表达的电泳图。

图2是显示待测化合物致使真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA含量减少的电泳图。

图3显示待测化合物具有促进真皮乳头细胞生长的活性。

图4是显示猴皮肤器官培养物中WNT-5A mRNA含量减少的电泳图。

图5显示猴皮肤器官培养物中毛发生长终期和初期毛囊的PCNA染色结果。

图6是显示化合物7增大猴皮肤器官培养物中毛球直径的直方图。

图7是显示化合物3增大猴皮肤器官培养物中毛球直径的直方图。

图8显示在残尾猕猴毛发生长试验中施用待测化合物之前及6个月之后的皮肤照片。

本发明最佳实施方式

以下更详细地描述本发明。

<抑制WNT-5A功能的化合物>

本发明使用的术语“抑制WNT-5A功能的化合物”(下文有时称为“WNT-5A功能抑制剂”)指抑制WNT-5A与WNT-5A受体结合的化合物，或抑制WNT-5A生成的化合物，优选抑制WNT-5A生成的化合物。

已经证实，WNT-5A是属于WNT家族的一种分泌型糖蛋白，在人、小鼠、大鼠、非洲爪蟾等中表达。出于用作药物的考虑，优选抑制人WNT-5A(SEQ ID NO：1)功能的化合物。

抑制WNT-5A与WNT-5A受体结合的化合物指作用于WNT-5A或WNT-5A受体，抑制WNT-5A与WNT-5A受体的结合，从而调节WNT-5A的信号传导，优选调节Ca²⁺途径信号传导的化合物。其实例包括WNT-5A受体拮抗剂。WNT-5A受体的具体实例包括人Frizzled 5(SEQ ID NO：4)和大鼠Frizzled 2(SEQ ID NO：6)。尽管这种化合物可以是肽或非肽，但是优选非肽抑制剂，因为它具有作用时间较长的优点。该化合物可以用标记的WNT-5A和WNT-5A受体筛选系统选择，优选IC₅₀值为30μM或更低，更优选IC₅₀值为10μM或更低。

抑制WNT-5A生成的化合物指抑制WNT-5A基因表达的化合物。尽管这种化合物可以是肽或非肽的，但是优选非肽抑制剂，因为它具有作用时间较长的优点。该化合物可以用WNT-5A蛋白(SEQID NO：1)含量或WNT-5A mRNA(SEQ ID NO：2)含量的减少作为指标进行选择，根据Hartley等人(Drug Metabolism and Disposition， 28(5)，608-616(2000)；下述试验实施例4)的方法，通过核酸探针测定的该化合物IC₅₀值优选为30μM或更低，更优选IC₅₀值为10μM或更低。

特别优选通式(I)、(II)和(IX)代表的化合物。

在通式(I)、(II)和(IX)代表的化合物中，C_1-6烷基指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、2-乙基丙基、己基等。

C_1-6烷酰基指含有1-6个碳原子的直链或支链烷酰基，其实例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、叔丁酰基等。

C_1-6烷氧基指含有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，其实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新异戊氧基、叔戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、1，2-二甲基丙氧基、己氧基、异己氧基等。

C_1-6烷氧基亚氨基指含有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基亚氨基，其实例包括N-甲氧基亚氨酸、N-乙氧基亚氨基、N-丙氧基亚氨基、N-异丙氧基亚氨基、N-丁氧基亚氨基、N-异丁氧基亚氨基、N-戊氧基亚氨基、N-己氧基亚氨基等。

C_1-6烷酰氧基指含有1-6个碳原子的直链或支链烷酰氧基，其实例包括乙酰氧基、丙酰氧基、新戊酰氧基等。

C_3-10环烷基指含有3-10个碳原子的环烷基，其实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基等。

取代的C_3-10环烷基的实例包括氢原子被至少一个选自下列的基团取代的环烷基：卤素原子、取代的或未取代的C_1-10烷基、羟基、C_1-5羟烷基、羧基、巯基、吲哚基、C_1-5烷硫基、氨基、酰氨基和C_1-5烷氧基。

芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基等。

取代芳基的实例包括氢原子被至少一个选自下列的基团取代的芳基：取代的或未取代的C_1-10烷基、羟基、C_1-5羟烷基、羧基、巯基、吲唑基、吲哚基、C_1-5烷硫基、氰基、硝基、氨基、酰胺基(amido)、乙酰氨基和C_1-5烷氧基。

C_2-10杂环的实例包括呋喃、吡咯、噻吩、噁唑、异噁唑、噻唑、咪唑、吡唑、吡喃、吡啶、哌啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、喹啉等。

取代的C_2-10杂环的实例包括氢原子被至少一个选自下列的基团取代的杂环：卤素原子、取代或未取代的C_1-10烷基、羟基、C_1-5羟烷基、羧基、巯基、吲唑基、吲哚基、C_1-5烷硫基、氰基、硝基、氨基、酰胺基(amido)和C_1-5烷氧基。

醚键指-O-，通式-(CH₂)_m-O-(CH₂)_n-(其中m和n均代表一个1-3的整数，通式中的亚烷基可以被烷基取代)，或者通式-O-(CH₂)_m-O-(其中m是一个1-3的整数，通式中的亚烷基可以被烷基取代)。

形成π键或醚键的相邻基团组合的实例包括(R⁴与R⁵)、(R⁵与R⁶)、(R⁶与R⁷)、(R⁷与R⁸)和(R⁸与R⁹)(同样适用于通式(IX)中的R^4a-R^9a)。

在通式(IX)代表的化合物中，优选通式(I)代表的化合物，更优选如R^3a是氢原子、R^3b是羟基的化合物。出于化合物稳定性的考虑，优选通式(IIa)、(IIb)和(IIc)代表的化合物。

其中(R⁴和R⁵)和(R⁶和R⁷)均形成一个π键的通式(II)化合物：

(其中R¹、R²、R^3c、R^3d、R⁸、R⁹和X具有与上述相同的含义)。

其中(R⁴和R⁵)形成一个π键、R⁶和R⁷各代表一个氢原子的通式(II)化合物：

其中R⁴、R⁵、R⁶和R⁷各代表一个氢原子的通式(II)化合物：

在通式(IX)代表的化合物中，优选R^3e和R^6b一起形成醚键且(R^3f和R^4a)和(R^5a和R^6a)均形成一个π键的化合物(例如化合物77等)，因为它们有效抑制真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的表达，并且促进真皮乳头细胞的生长。

在通式(IX)代表的化合物中，优选R^1a和R^2a均代表(CH₂)_pCO-Y-R¹⁰(其中Y代表氧原子或硫原子；R¹⁰代表氢原子、C_1-6烷基或取代或未取代的芳基；p为0或1)的化合物(例如化合物52等)，以及R^1a和R^2a均代表COR¹²(其中R¹²代表取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂环)的化合物(例如化合物58等)，因为它们有效抑制真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的表达，并且促进真皮乳头细胞的生长。

也优选R^7a代表Z-R¹³(其中Z代表氧原子或硫原子；R¹³代表C_2-6烷酰基或取代或未取代的芳基)的化合物(例如化合物53等)，因为它们有效抑制真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的表达，并且促进真皮乳头细胞的生长。

通式(II)代表的化合物能够通过例如下列生产方法组合生产。

反应式1

在催化剂(如披钯碳)存在下，通式(III)代表的化合物在有机溶剂(例如乙酸乙酯、四氢呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中进行氢化反应，产生通式(IV)或(IV′)代表的化合物或这些化合物的混合物。通式(IV)和(IV′)的化合物能够用常规分离方法(如柱层析法)分离纯化。

反应式2

(其中R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和X具有与上述相同的含义)。

在-20-100℃、优选0-20℃下，在有机溶剂(例如四氢呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中，通式(V)代表的化合物与还原剂(如硼氢化钾、硼氢化钠或硼氢化锂，必要时同时存在一种盐，如LiCl、MgCl₂、CeCl₃、CaCl₂或NiCl)反应，产生通式(VI)代表的化合物。通式(VI)代表的化合物可以用常用分离方法(如柱层析法)分离纯化。

反应式3

(其中R¹、R²、R^3c、R^3d、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和X具有与上述相同的含义)。

通式(VII)代表的化合物用酸或碱在适当的有机溶剂(例如四氢呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中处理，产生通式(VIII)代表的化合物。

通式(IX)代表的化合物(1、60-78)的生产基本按照生产发酵产品常用的方法，在含有各种养分的培养基中培养Pochoniachalamydosporia var.chlamydosporia TF-0480株。

主要使用液体培养基作为培养基，该培养基含有碳源、氮源和无机盐，任选地还有维生素、前体和消泡剂，pH调节为7左右。碳源包括葡萄糖、糊精、甘油、淀粉等，它们可以单独使用或者混合使用。氮源包括肉膏、燕麦粉、酵母提取物、豆粉、聚胨、玉米浆、尿素、铵盐等，它们可以单独使用或者混合使用。无机盐包括磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙等，它们可以单独使用或者混合使用。能够使用的消泡剂包括Adekanol或硅氧烷化合物。需氧培养法适于作为培养方法，如振荡培养和通气搅拌培养。培养在pH4-10和25-35℃下进行2-5天，优选在25-28℃下进行3天。

这样培养产生的化合物1和60-78可以用收集发酵产物常用的方法分离。例如，使用下列方法是有效的。即，在培养完成后，通过离心或过滤获得培养滤液。然后用聚苯乙烯树脂如DIAION HP-20(商品名，Mitsubishi Chemical生产)吸附，用有机溶剂(如低级醇或丙酮)洗脱。细胞用有机溶剂(如低级醇或丙酮)抽提。然后将细胞提取物和来自吸附树脂的洗脱物合并在一起，在减压下浓缩。为了抽提，向剩余的水相中加入有机溶剂如乙酸乙酯、氯仿或正丁醇，将提取物浓缩。将获得的残余物再溶解于有机溶剂如苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇或氯仿中，然后进行硅胶柱层析、凝胶过滤柱层析、填充ODS的反相分配柱层析以及高效液相层析，从而纯化并分离本发明的化合物。

产生本发明活性成分的菌株是由本发明人从土壤中新分离的一种新菌株。该微生物被命名为“Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480”，已被独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏中心保藏，保藏号为“FERM BP-8332”。

该菌株的微生物特性如下。

1)在培养基上的生长

该微生物在各种琼脂平板培养基中生长良好，在检测的培养基中良好或适当地形成孢子。表1总结了在各种培养基上26℃培养2周后形成的菌落的特征。颜色用A.Kornerup等人，Dizionario deicolori，Musterschmidt(1978)提出的色码表示。

表1

培养基	菌落的肉眼观察结果
培养基	菌落的肉眼观察结果	PDA^*-1	显示相对较好的生长和孢子形成。菌落直径：23-28mm。菌落呈绵状和略微圆顶状，中心呈毡毛状，具有轻微放射状褶皱。边缘略微不规则(菌落顶端)。向培养基中分泌一种淡黄色[3A6]色素。菌落表面颜色：边缘为白色[1A1]，中心为浅黄色[4A3]。背面颜色：边缘为红黄色[4A6]，中心为黄褐色[5D8]。琼脂培养基不规则或放射状断裂。
OMA^*-2	显示良好的生长和孢子形成。菌落直径：48-50mm。菌落略薄且呈绵状，中心和中间部分呈圆顶状。边缘形状相对规则。无色素分泌。菌落表面颜色：边缘为白色[1A1]，中心为淡黄色[3A4]。背面颜色：类似于表面的淡黄色[3A4]。	PDA^*-1
OMA^*-2		CMA^*-3	显示良好的生长和适度孢子形成。菌落直径：47-51mm。菌落薄且呈毡毛状。边缘形状相对规则。不向培养基中分泌色素。菌落表面/背面颜色：均为白色[1A1]到黄白色[1A2]。
MA^*-4	显示相对较好的生长和孢子形成。菌落直径：26-27mm。菌落厚且呈绵状，中心呈圆顶状。边缘形状相对规则。向培养基内分泌浅红黄色[4A7]色素。菌落表面颜色：边缘为白色[1A1]，中心为淡黄色[4A3]。背面颜色：边缘为淡橙色[5A4]，中心为褐色[7E8]，中间部分为橙色[6B7]。	CMA^*-3
MA^*-4		SA^*-5	显示相对较好的生长和孢子形成。菌落直径：23-28mm。菌落厚且呈绵状，中心呈圆顶状。边缘略不规则，具有轻微放射状褶皱。向培养基内分泌红黄色[4A7]色素。菌落表面颜色：边缘为白色[1A1]，其它部分为橙白色[5A2]。背面颜色：边缘和中心为淡橙色[5A4]，中间部分为褐色[7E8]。琼脂培养基不规则或放射状断裂。
LCA^*-6	显示良好的生长和适度的孢子形成。菌落直径：42-44mm。菌落呈薄毡毛状到轻微绵状。边缘形状相对规则。不向培养基内分泌色素。菌落表面/背面颜色：均为白色[1A1]。	SA^*-5

^*-1：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(E-MF21，Eiken Chemical Co.，Ltd.生产)。

^*-2：1/2稀释的燕麦粉琼脂培养基(Difco生产，用1/2稀释的Bacto燕麦粉琼脂制成，添加琼脂使琼脂终浓度为2％)。

^*-3：玉米粉琼脂培养基(Difco生产，玉米粉琼脂)。

^*-4：麦芽膏琼脂培养基(Nakase，T.，第六版，第617页，JapanCollection of Microorganisms，the Institute of Physical and ChemicalResearch，Saitama，1995)

^*-5：Sabouraud琼脂培养基(Eiken Chemical Co.，Ltd.生产，E-MF03)

^*-6：Miura琼脂培养基(Miura，K.和M.Kudo，Trans.Mycol.Soc.Japan，11，116-118(1970))

2)形态学

在光学显微镜下观察该菌株在玉米粉琼脂平板上26℃培养14天后形成的菌落。结果观察到瓶梗分生孢子(phialo-conidia)的形成。形成分生孢子的单细胞(瓶梗)或2-4个轮生瓶梗直接在菌丝上形成。分生孢子梗与营养菌丝没有明显区别。在瓶梗的前沿形成大量分生孢子，形成粘性物质。瓶梗呈逐渐变细的圆柱形，表面光滑、无色。其长度为13-15μm，在基底处厚0.8-1.7μm，在末端厚0.5-0.8μm。分生孢子呈椭圆形或半球形(极少)，大部分都有略微突出的基底。分生孢子的表面光滑、无色，大小为2.2-5.0×1.8-2.8μm。在培养基表面或者在培养基上萌发的短菌丝末端形成具有网状壁的单个淡黄色多细胞厚垣孢子(砖格厚垣孢子)。在培养基中也形成少量砖格厚垣孢子。这些砖格厚垣孢子的大小为14-20×12-22μm。将培养时间延长到一个月或更长后，未见有性型。

3)生理学性质

(1)生长温度范围和最佳温度

在pH6.0的Sabouraud液体培养基中，该菌株在15-31℃下生长，最佳温度为25-27℃。

(2)生长pH范围和最佳pH值

在26℃的YpSs液体培养基中，该菌株在pH3-10下生长，最佳pH为5-7。

4)需氧/厌氧：需氧

根据上述形态学特征和培养特性，将该菌株的特征与下列文献报道的各种已知的种相比较：(1)K.H.Domsch等人，《土壤真菌概述》(Compendium of soil fungi)，第一卷，IHW-Verlag(1980)，(2)G.L.Barron，《来自土壤的丝孢菌属》(The Genera ofHyphoomycetes from soil)，Williams & Wilkins(1968)等。结果，该菌株非常类似于已知分类名为Verticillium chlamydosporia或Diheterospora chlamydosporia的不完全种，因此似乎属于同一个种。在(3)R.Zare，W.Gams和H.C.Evans，A revision of Verticilliumsection Prostrata.V.The genus Pochonia，with notes on Rotiferophthora，73，1-2，p51-86(2001)中，对这个种进行了分子系统的重新检查，认为它属于Pochonia属，该属是合适的属。而且，提出形成非连接轮枝孢菌属型分生孢子的种(本发明的菌株形成这种分生孢子)称为变种Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia。

根据这些事实，该菌株被命名为“Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480”。

<真皮乳头细胞生长促进剂>

本发明使用的术语“真皮乳头细胞生长促进剂”指具有增加真皮乳头细胞数量作用的药物或试剂。

根据抑制WNT-5A功能的作用来表征本发明真皮乳头细胞生长促进剂。由于WNT-5A抑制作为WNT/β-连环蛋白途径激活剂的WNT-1类分子(WNT-1、WNT-8等)的功能，所以通过调节WNT-5A的功能或调节WNT-5A的表达可以控制真皮乳头细胞的生长。因此，只要具有极佳的抑制WNT-5A功能的作用，甚至结构完全不同的化合物(例如化合物24、化合物79、化合物7等)都有极佳的促进真皮乳头细胞生长的作用。

化合物24

化合物79

化合物7

细胞的生长可以用本领域技术人员公知的方法测量。测量方法的实例包括使用适当的显色底物计数活细胞和[³H]-胸苷摄入法。优选使用四唑盐作为显色底物，如MTT、MTS和XTT和AlamarBlue。

<毛发生长刺激剂/毛发生长补剂>

本发明使用的术语“毛发生长刺激剂或毛发生长补剂”指诱导毛发生长、促进毛发生长、预防脱毛症等的产品。如果使用本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂作为药物，使用目的包括改善或预防斑秃和男性型脱毛症。

通过抑制WNT-5A功能促进真皮乳头细胞生长来实现本发明毛发生长刺激剂和毛发生长补剂的作用。根据这种作用机制，在脱毛部位的真皮乳头中受到抑制的细胞生长能力得到提高，形成发育良好的真皮乳头组织。因此，对于现有毛发生长刺激剂和毛发生长补剂几乎没有效果的症状，预计本发明的毛发生长刺激剂/毛发生长补剂有效。

而且也预计，将本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂与具有不同功能的其它毛发生长刺激剂和毛发生长补剂组合能够获得协同作用。

本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂可以根据单个化合物以各种剂量和各种剂型施用。

如果通过敷剂(洗剂、软膏剂、凝胶等)施用通式(IX)代表的化合物，例如，可以以0.0001-10％重量、优选0.001-5％重量、更优选0.001-1％重量的剂量施用，但是剂量根据毛发生长补剂的类型和剂型而不同。如果成年男性口服(粉剂、片剂或胶囊剂)通式(IX)代表的化合物，每日剂量优选为1-100mg/kg。

尽管对本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂的剂型没有具体限制，但是在外敷的情况下，优选以水溶性组合物的形式提供含有WNT-5A生成抑制剂(例如通式(IX)代表的化合物)作为活性成分的毛发生长刺激剂/毛发生长补剂。只要不损害本发明的效果，这种水溶性组合物能够用生产药品、准药品或化妆品中常用的各种添加剂(湿润剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂、着色剂等)生产。本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂可以是护发组合物，如生发油、发油、摩丝(hair moose)或凝胶或软膏。

如果以液体制剂使用本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂，这种制剂可以是将WNT-5A生成抑制剂(例如通式(IX)代表的化合物)溶解于纯水、适当缓冲液(如磷酸缓冲液)、生理盐溶液(如生理盐水、林格氏溶液或无蛋白质人工血清)、与常用表面活性剂等适当组合的乙醇或甘油中制成的水溶液、非水溶液、悬液、脂质体或乳状剂，随后灭菌。它作为液体制剂对头皮局部施用。该液体制剂局部直接施用于头皮。此外，也可以用喷嘴施用，如喷雾。

如果以半固体制剂使用本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂，将WNT-5A生成抑制剂(例如通式(IX)代表的化合物)与脂肪、油、羊毛脂、凡士林、石蜡、蜡、石膏、树脂、塑料、丙三醇、高级醇、甘油、水、乳化剂、悬浮剂等混合，制成能够局部施用的外用制剂(软膏、乳膏等)。

如果以固体制剂使用本发明的毛发生长刺激剂和毛发生长补剂，将WNT-5A生成抑制剂(例如通式(IX)代表的化合物)与适当的添加剂混合，制成外用制剂，如粉剂或粉末。此外，也可以制备固体制剂，在使用前将其溶解或悬浮于溶剂中，施用于头皮。

如果口服使用，优选将WNT-5A生成抑制剂(例如通式(IX)代表的化合物)与药物可接受载体(填充剂、粘合剂、崩解剂、香料、矫正剂、乳化剂等)、稀释剂、溶解助剂等混合，获得的药用组合物用常规方法加工，制成片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、悬液、溶液等。

这些制剂能够用常用的配制技术生产。

<筛选方法>

本发明还涉及一种筛选真皮乳头细胞生长促进剂的方法，包括选择抑制WNT-5A功能的化合物。

选择抑制WNT-5A功能的化合物(在下文中有时被称为“WNT-5A功能抑制剂”)指，例如，选择(即筛选)WNT-5A生成抑制剂，或者选择WNT-5A受体拮抗剂。

任何材料都可以作为本发明筛选方法的试验材料。也就是说，对试验材料的种类没有限制，它们可以是低分子量化合物、天然提取物中所含的化合物或合成肽。也可以是化合物文库或组合文库。化合物文库可以用本领域技术人员公知的方法构建。此外，也可以使用商品化化合物文库。出于用作药物的考虑，进行筛选的化合物优选分子量为3000或更低。出于能够敷用/口服的考虑，优选分子量为600或更低的低分子量化合物。

(1)筛选WNT-5A受体拮抗剂的方法

在筛选WNT-5A受体拮抗剂的方法中，通过使用标记的WNT-5A蛋白质和WNT-5A受体，检测或测量该标记物，能够检查WNT-5A蛋白质与WNT-5A受体之间是否成键。标记物的实例包括放射性同位素(³²P、³³P、¹³¹I、¹²⁵I、³H、¹⁴C、³⁵S等)、酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)、荧光物质(异硫氰酸荧光素等)等。它们可以作为商品获得，也可以用已知的方法进行标记。

体外测定系统的一个具体实例是在无细胞系统中进行。更具体而言，WNT-5A蛋白质和WNT-5A受体之一与支持体连接，添加二者中未连接的另一种蛋白质和试验材料。在温育后，洗涤反应混合物，检测或测量另一种蛋白质与支持体连接蛋白质的结合。

连接蛋白质的支持体的实例包括不可溶多糖，如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷；等等。更具体而言，可以使用商品化的珠子和用这些材料制成的平板。

(2)筛选抑制WNT-5A生成的化合物的方法

可以用WNT-5A mRNA的量或WNT-5A蛋白质的量作为指标，筛选抑制WNT-5A生成的化合物。也可以将一种报道基因与WNT-5A基因的启动区结合，并检测其表达量。优选使用SEQ ID NO：3代表的序列作为WNT-5A基因的启动子。

报道基因的实例包括GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因、LUC(萤光素酶)基因和CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因。

当用WNT-5A mRNA的表达量作为指标时，使用表达人WNT-5A的细胞，并加入试验材料。在孵箱中37℃、5％CO₂-95％空气下培养数小时后，裂解细胞，提取RNA。然后通过例如RT-PCR测定WNT-5A mRNA的量。这样能够找到具有减少WNT-5A mRNA量之活性的材料。对PCR中使用的引物没有具体限制，只要它们是WNT-5A mRNA特异的，可以根据WNT-5A mRNA序列设计。优选的实例包括正向引物AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO：8)和反向引物GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQID NO：9)。

当使用WNT-5A蛋白质含量作为指标时，可以使用表达人WNT-5A的细胞，并向其中加入试验材料。在孵箱中37℃、5％CO₂-95％空气下培养数小时后，利用培养基裂解细胞，提取蛋白质。然后通过ELISA(酶联免疫吸附测定)等方法测定WNT-5A蛋白质的含量。这样能够找到具有减少WNT-5A mRNA表达量之活性的物质。

下面，参照试验实施例详细描述本发明；但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1(化合物3和4)

将根赤壳菌素(化合物1：10.8g)溶解于乙酸乙酯(140ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(255mg)，随后进行氢置换(1atm)，在室温下搅拌3小时。过滤披钯碳后，在减压下馏出滤液。获得的残余物通过硅胶层析法纯化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脱，获得目的化合物4(3.43g)，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脱，产生目的化合物3(4.14g)。

实施例2(化合物7和8)

将化合物3(602.5mg)溶解于甲醇(13ml)中，加入七水合氯化铈(III)(2.14g)，随后在室温下搅拌30分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(180mg)，随后在室温下搅拌5分钟。向反应溶液中加入饱和磷酸氢二钠(40ml)后，用水(40ml)稀释混合物，在减压下馏出有机溶剂。残留的水层用乙酸乙酯抽提(300ml×2)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备的薄层层析(20cm×20cm，厚度为1.0mm，用氯仿∶甲醇＝93∶7展开，用乙酸乙酯洗脱)粗纯化残余物。然后将获得的粗纯化产物通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脱)纯化，产生目的化合物(化合物7：144.9mg，化合物8：13.8mg)。

实施例3(化合物9和10)

将化合物4(26.5mg)溶解于甲醇(5ml)中，加入七水合氯化铈(III)(100mg)，随后在室温下搅拌30分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(60mg)，随后在室温下搅拌30分钟。向反应溶液中加入饱和磷酸氢二钠(12ml)后，用水(20ml)稀释混合物，在减压下馏出有机溶剂。残留的水层用乙酸乙酯抽提(30ml×2)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备的薄层层析(20cm×20cm，厚度为0.25mm，用氯仿∶甲醇＝94∶6展开，用乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，产生目的化合物(化合物9：5.7mg，化合物10：8.8mg)。

实施例4(化合物5)

将根赤壳菌素(91.5mg)溶解于甲醇(5ml)中，加入七水合氯化铈(III)(88mg)，随后在室温下搅拌10分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(60mg)，随后在室温下搅拌30分钟。向反应溶液中加入饱和磷酸氢二钠(20ml)后，用水(20ml)稀释混合物，在减压下馏出有机溶剂。残留的水层用乙酸乙酯抽提(50ml×3)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备的薄层层析(20cm×20cm，厚度为0.5mm，用氯仿∶甲醇＝9∶1展开，用乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，产生目的化合物5(27.2mg)。

实施例5(化合物2)

将根赤壳菌素(15.3mg)溶解于吡啶(1.5ml)中，加入乙酸酐(4ml)，随后在室温下搅拌6.5小时。向反应溶液中加入冰水(20ml)后，用乙酸乙酯(20ml)抽提混合物。乙酸乙酯层用水洗涤(20ml×2)，在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备的薄层层析(20cm×20cm，厚度为0.5mm，用氯仿∶甲醇＝95∶5展开，用乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，产生目的化合物2(18.5mg)。

实施例6(化合物11)

将根赤壳菌素(19.0mg)溶解于二甲基亚砜(1ml)中，加入碳酸钾(3mg)和甲基碘(4ml)，随后在室温下搅拌6.5小时。向反应溶液中加水(20ml)后，用乙酸乙酯(20ml)抽提混合物。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备的薄层层析(20cm×20cm，厚度为0.5mm，用氯仿∶甲醇＝95∶5展开，用乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，产生目的化合物11(15.3mg)。

实施例7(化合物16、17、19和23)

将根赤壳菌素(930mg)溶解于1，4-二噁烷(14ml)中，加入1N盐酸(12ml)，随后在室温下搅拌2小时。用水(40ml)稀释后，用乙酸乙酯(100ml)抽提混合物。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备性薄层层析(20cm×20cm，厚度为1.0mm，用氯仿∶甲醇∶正已烷＝5∶1∶5展开，用乙酸乙酯洗脱)粗纯化残余物。获得的粗纯化产物然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝70∶30-40∶60进行梯度洗脱)纯化，产生目的化合物(化合物16：11.4mg，化合物17：19.4mg，化合物19：32.6mg，化合物23：103.7mg)。

实施例8(化合物12和13)

将根赤壳菌素(232.6mg)溶解于1，4-二噁烷(4ml)中，加入1N盐酸(1ml)，随后在室温下搅拌30分钟。用1N氢氧化钠中和后，在减压下馏出溶剂。然后用20ml甲醇溶解该浓缩物。获得的溶液通过棉塞过滤，在减压下馏出甲醇。获得的残余物然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶3洗脱)纯化，产生目的化合物(化合物12：42.6mg，化合物13：10.4mg)。

实施例9(化合物18)

在冰冷却下向5ml二甲基甲酰胺中滴入1ml磷酰氯，在室温下搅拌混合物30分钟。在冰冷却下将获得的溶液缓慢加入根赤壳菌素(98.5mg)的二甲基甲酰胺溶液(4ml)中，随后在室温下搅拌24小时。然后用乙酸乙酯(100ml)稀释反应溶液，用水洗涤(100ml×3)。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，在减压下馏出乙酸乙酯。然后，通过硅胶制备性薄层层析(20cm×20cm，厚度为0.5mm，用氯仿∶甲醇＝94∶6展开，用乙酸乙酯洗脱)纯化获得的残余物，产生目的化合物(化合物18：61.8mg)。

实施例10(化合物14和15)

将根赤壳菌素(378mg)溶解于1，4-二噁烷(4ml)中，加入1N盐酸(1ml)，随后在室温下搅拌20分钟。用1N氢氧化钠中和后，在减压下馏出溶剂。然后用20ml甲醇溶解该浓缩物。获得的溶液通过棉塞过滤，在减压下馏出甲醇。然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝70∶30洗脱)纯化获得的残余物，同时产生目的化合物(化合物14：10.7mg，化合物15：9.9mg)以及化合物12(40.6mg)。

实施例11(化合物20、21和22)

将化合物3(96.3mg)溶解于1，4-二噁烷(2ml)中，加入1N盐酸(2.5ml)，随后在室温下搅拌16小时。用1N氢氧化钠中和后，在减压下馏出溶剂。然后用20ml甲醇溶解该浓缩物。获得的溶液通过棉塞过滤，在减压下馏出甲醇。然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝45∶55洗脱)纯化获得的残余物，产生目的化合物(化合物20：9.3mg，化合物21：22.0mg，化合物22：26.2mg)。

实施例12(化合物25和26)

将化合物7(34mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中，加入氢氧化钾(3mg)和碘甲烷(500μl)，随后在室温下搅拌4.5小时。向反应溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(20ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物25(6.4mg，39min)和化合物26(14.5mg，29min)。

实施例13(化合物27)

将化合物7(55mg)溶解于吡啶(1ml)中，加入乙酸酐(3ml)，随后在室温下搅拌17小时。向反应溶液中加水(50ml)后，混合物用乙酸乙酯(50ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(60∶40)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物27(64.7mg，18min)。

实施例14(化合物28和29)

将化合物8(131mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中，加入氢氧化钾(3mg)和碘甲烷(2ml)，随后在室温下搅拌7小时。向反应溶液中加水(40ml)后，混合物用乙酸乙酯(40ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。获得两个级分，分别在减压下浓缩，产生化合物28(14.2mg，52min)和化合物29(31.7mg，37min)。

实施例15(化合物30)

将化合物8(72mg)溶解于吡啶(2ml)中，加入乙酸酐(2ml)，随后在室温下搅拌17小时。向反应溶液中加水(50ml)后，混合物用乙酸乙酯(50ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(53∶47)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物30(45.5mg，30min)。

实施例16(化合物31)

将根赤壳菌素(10.8g)溶解于乙酸乙酯(140ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(255mg)，随后进行氢置换(1atm)，在室温下搅拌3小时。在过滤披钯碳后，将滤液在减压下浓缩。获得的残余物通过硅胶层析[硅胶60(商品名，Merck生产)]纯化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脱，获得化合物4(3.43g)，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脱，产生化合物3(4.14g)。将化合物3与化合物4之间级分(3.08g)的一部分(500mg)溶解于少量N，N-二甲基甲酰胺中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。获得2个级分，分别在减压下浓缩，产生化合物3(177.8mg)以及化合物31(20.7mg，23min)。

实施例17(化合物32、33和34)

将根赤壳菌素(11.9g)溶解于乙酸乙酯(160ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(300mg)。用氢清洗(1atm)后，在室温下搅拌混合物3小时。在过滤披钯碳后，将滤液在减压下浓缩。获得的残余物通过硅胶层析[硅胶60(商品名，Merck生产)]纯化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脱，获得化合物4，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脱，产生化合物3。此外，用正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)洗脱的级分也在减压下浓缩，产生粗纯化的产物(936mg)。将获得的粗纯化产物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(34∶66)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得3个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物32(17.4mg，17min)、化合物33(49.4mg，18min)和化合物34(347.4mg，21min)。

实施例18(化合物35)

将根赤壳菌素(210mg)溶解于吡啶(4ml)中，在室温下加入盐酸羟胺(180mg)，随后加热至40℃，搅拌2.5小时。冷却至室温后，加水(100ml)，混合物用乙酸乙酯(80ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。使用氯仿-甲醇(90∶10)作为展开剂，通过制备性硅胶层析[硅胶60 F254(商品名，Merck生产)，厚0.5mm]纯化所得残余物。收集Rf值为0.65的级分，用乙酸乙酯抽提，然后在减压下浓缩，产生化合物35(40.0mg)。

实施例19(化合物36、37、38和39)

将根赤壳菌素(11.9g)溶解于乙酸乙酯(160ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(300mg)，随后进行氢置换(1atm)，在室温下搅拌3小时。在过滤披钯碳后，滤液在减压下浓缩。获得的残余物通过硅胶层析[硅胶60(商品名，Merck生产)]纯化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脱。将获得的级分在减压下浓缩，产生含有化合物4为主要成分的级分(1537mg)。将该级分溶解于甲醇(21ml)/四氢呋喃(7ml)中，加入七水合氯化铈(III)(2130mg)，随后在室温下搅拌30分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(790mg)，随后在室温下搅拌10分钟。反应溶液用水(30ml)稀释，通过添加1N盐酸水溶液将pH值调节为中性，随后进一步用水(30ml)稀释。水层用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯，产生一种胶状物质(1.46g)。将获得的物质溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，用正己烷湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(400ml)吸附。然后用正己烷-乙酸乙酯的溶剂混合物连续洗脱。用正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱化合物4后，残余物用正己烷-乙酸乙酯(3∶2)洗脱，通过在减压下浓缩产生级分(1)(190mg)和级分(2)(398mg)。将级分(1)溶解于少量四氢呋喃中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(35∶65)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得三个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物9(87.2mg)以及化合物36(11.3mg，20min)和化合物38(10.1mg，25min)。将级分(2)溶解于少量四氢呋喃中，在与级分(1)相同的条件下，通过制备性高效液相层析纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物37(19.8mg，25min)和化合物39(23.2mg，27min)。

实施例20(化合物40和41)

将化合物7(61mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氢氧化钾(5mg)和1-溴丁烷(1ml)，随后在室温下搅拌3.5小时。向反应溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用(60∶40)到(90∶10)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物40(25.6mg，33min)和化合物41(21.4mg，40min)。

实施例21(化合物42和43)

将化合物7(67mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氢氧化钾(5mg)和1-溴己烷(1ml)，随后在室温下搅拌3.5小时。向反应溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用(60∶40)到(90∶10)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物42(24.9mg，38min)和化合物43(32.9mg，53min)。

实施例22(化合物44)

将化合物7(62mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氢氧化钾(5mg)和1-溴丙烷(1ml)，随后在室温下搅拌1.5小时。向反应溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用(45∶55)到(85∶15)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物44(453mg，38min)。

实施例23(化合物45)

将化合物7(64mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氢氧化钾(5mg)和2-(溴甲基)环己烷(2ml)，随后在室温下搅拌7小时。向反应溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量丙酮中，使用(65∶35)到(85∶15)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。获得的级分在减压下浓缩，产生化合物45(24.7mg，70min)。

实施例24(化合物46)

将化合物7(200mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，加入氢溴酸(5ml)，随后在110℃下搅拌6小时。向反应溶液中加入乙酸乙酯(150ml)后，用碳酸氢钠洗涤混合物(150ml×2)。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯。将获得的残余物溶解于少量甲醇中，使用(38∶62)到(50∶50)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物46(17.0mg，18min)。

实施例25(化合物47)

将化合物62(154mg)溶解于乙酸乙酯(5ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(30mg)，随后进行氢置换(1atm)，并在室温下搅拌90分钟。在过滤披钯碳后，在减压下馏出滤液，获得化合物47(134.8mg)。

实施例26(化合物48)

将化合物61(211mg)溶解于乙酸乙酯(11ml)中，加入5％披钯碳(湿型)(42mg)，随后进行氢置换(1atm)，在室温下搅拌90分钟。在过滤披钯碳后，在减压下馏出滤液。用氯仿-甲醇(95∶5)作为展开剂，通过制备性薄层层析[硅胶60 F254(商品名，Merck生产)，20cm×20cm，厚度为0.5mm]纯化所得残余物(184mg)。收集Rf值为0.5的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在减压下浓缩，产生化合物48(159.7mg)。

实施例27(化合物49和50)

将化合物61(233mg)溶解于甲醇(10ml)/四氢呋喃(2ml)中，加入七水合氯化铈(III)(754mg)，随后在室温下搅拌30分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(236mg)，随后在室温下搅拌5分钟。用水(30ml)稀释反应溶液后，加入1N盐酸水溶液(3ml)，将pH值调节为中性，进一步用水(30ml)稀释该混合物。水层用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯，获得白色粉末(267mg)。然后将获得的粉末溶解于少量水中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(45∶55)作为流动相，通过制备的高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分均在减压下浓缩，产生化合物49(49.3mg，19min)和化合物50(184.6mg，21min)。

实施例28(化合物51)

将化合物62(191mg)溶解于甲醇(10ml)/四氢呋喃(4ml)中，加入七水合氯化铈(III)(641mg)，随后在室温下搅拌30分钟。然后在冰冷却下向溶液中缓慢加入硼氢化钠(216mg)，随后在室温下搅拌10分钟。用水(30ml)稀释反应溶液后，加入1N盐酸水溶液(3ml)，将pH值调节为中性，进一步用水(30ml)稀释该混合物。水层用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。获得的乙酸乙酯层在无水硫酸钠上干燥，然后在减压下馏出乙酸乙酯，获得无色油状物质(182mg)。然后将获得的油状物溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物51(137.3mg，29min)。

实施例29(化合物52)

将根赤壳菌素(205mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入S-氯乙酰基苯硫酚(330mg)和碳酸钾(310mg)，随后在室温下搅拌1.5小时。然后向反应溶液中加水，随后用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠水溶液洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后通过硅胶柱层析(20g，乙酸乙酯∶正己烷＝1∶2)粗纯化残余物。获得的粗纯化产物然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脱)纯化，产生化合物52(105mg)。

实施例30(化合物53)

将根赤壳菌素(406mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，加入三乙胺(57.6mg)和苯硫酚(260mg)，随后在冰冷却下搅拌过夜。然后向反应溶液中加入稀释的盐酸，随后用乙酸乙酯抽提。用水及饱和氯化钠水溶液连续洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后将238mg所得残余物通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脱)纯化，产生化合物53(46.0mg)。

实施例31(化合物54和55)

将根赤壳菌素(378mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，在冰冷却下加入三乙胺(56.4mg)和硫代乙酸(163mg)，随后在冰冷却下搅拌过夜。然后向反应溶液中加入稀释的盐酸，随后用乙酸乙酯抽提。用水及饱和氯化钠水溶液连续洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后将238mg所得残余物通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脱)纯化，产生化合物54(49.0mg)和化合物55(15.7mg)。

实施例32(化合物56)

将根赤壳菌素(131mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入溴乙酸甲酯(219mg)和碳酸钾(183mg)，随后在室温下搅拌3小时。向反应溶液中加入稀释的盐酸，随后用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠水溶液洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，减压干燥提取物。然后将获得的残余物从乙酸乙酯中再结晶，产生化合物56(81.8mg)。

实施例33(化合物57)

将化合物7(116mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入溴乙酸甲酯(330mg)和碳酸钾(276mg)，随后在室温下搅拌3天。向反应溶液中加入稀释的盐酸，随后用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠水溶液洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后将获得的残余物从乙酸乙酯中再结晶，产生化合物57(27.7mg)。

实施例34(化合物58)

将根赤壳菌素(103mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，加入烟酸(190mg)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(270mg)和4-二甲基吡啶(37.7mg)，随后在室温下搅拌3.5小时。然后向反应溶液中加水，随后用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠水溶液洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后将获得的残余物从丙酮-水中再结晶，产生化合物58(94.5mg)。

实施例35(化合物59)

将化合物56(312mg)溶解于甲醇(60ml)中，加入氢氧化钾(206mg)-水(20ml)，随后在室温下搅拌15分钟。然后向反应溶液中加入稀释的盐酸，随后用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠水溶液洗涤并在无水硫酸镁上干燥后，将提取物在减压下干燥。然后通过高效液相层析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脱)纯化所得残余物，产生化合物59(10.6mg)。

实施例36(化合物60、61、62、63、68和70)

在含有2.0％葡萄糖、4.0％甘露醇、2.0％燕麦粉、0.4％酵母提取物、0.001％七水合硫酸铁(II)、0.001％七水合硫酸锌(II)、0.001％四-五水合硫酸镁(II)和0.0005％五水合硫酸铜(II)的无菌液体培养基中接种Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480株，然后在26℃振摇培养72小时。使用一个50L的罐，在与种子培养中使用的培养基组成相同的无菌培养基中接种300ml种子培养基，然后在26℃通气搅拌下培养144小时。培养完成后，离心培养物，从上清液中分离细胞。上清液吸附于1.5L HP-20(Mitsubishi Chemical生产)，用水洗涤，然后用3L甲醇洗脱。将洗脱物在减压下浓缩，获得的水层用乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯层在无水硫酸钠上脱水，在减压下浓缩，产生一种褐色糖浆状物质(60g)。

将一部分(30g)培养提取物溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用正己烷湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(1600ml)。然后用正己烷-乙酸乙酯混合物连续洗脱，获得用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶剂混合物洗脱的级分(130mg)、(2∶1)洗脱的级分(1)(1.88g)和级分(2)(780mg)以及(1∶2)洗脱的级分(3.56g)。将正己烷-乙酸乙酯(4∶1)洗脱的级分(130mg)溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(55∶45)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物63(23.5mg，20min)和化合物70(4.8mg，24min)。将正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱的级分(1.88g)从丙酮(30ml)中再结晶，产生化合物61(277mg)。用正己烷-丙酮(3∶2)作为展开剂，通过制备性薄层层析[硅胶60 F254(商品名，Merck生产)，20cm×20cm，厚1mm]纯化洗脱的级分(2)(780mg)。收集Rf值为0.4的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在减压下浓缩，产生化合物60(80.3mg)。然后将正己烷-乙酸乙酯(1∶2)洗脱的级分(3.56g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(880ml)。然后用氯仿-甲醇溶剂混合物连续洗脱，获得氯仿-甲醇(98∶2)洗脱的级分(926mg)。然后从丙醇-甲醇(1ml/3ml)中再结晶，产生化合物62(339mg)。用Sephadex LH-20(商品名，Amersham Pharmacia Biotech生产)(甲醇，900ml)柱层析，乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化氯仿-甲醇(97∶3)洗脱的级分(1.42g)。将所得级分在减压下浓缩，产生化合物68(4.5mg，21min)。

实施例37(化合物64、65、71、72和76)

将实施例36获得的部分培养提取物(30g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(700ml)。然后用氯仿-甲醇溶剂混合物连续洗脱。将氯仿-甲醇(93∶7)洗脱的级分分成两份，即级分(1)(156mg)和级分(2)(164mg)。将级分(1)溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得四个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物64(35.4mg，21min)、化合物72(13.7mg，27min)、化合物71(6.6mg，29min)和化合物65(4.1mg，33min)。级分(2)在相同条件下通过制备性高效液相层析纯化，收集获得的级分，在减压下浓缩，产生化合物71(3.7mg)以及化合物76(4.5mg，20min)。

实施例38(化合物69和74)

将实施例36获得的培养提取物(39.5g)溶解于正己烷中(300ml×2)。过滤形成的沉淀物，除去溶剂。将获得的沉淀物(8.1g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(650ml)。然后用氯仿-甲醇的溶剂混合物连续洗脱，获得用氯仿-甲醇(88∶12)洗脱的级分(318mg)。将该级分溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作为流动相，通过制备的高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物74(15.3mg，19min)和化合物69(8.0mg，38min)。

实施例39(化合物66)

将实施例36获得的培养提取物(39.5g)溶解于正己烷中(300ml×2)。过滤形成的沉淀物，除去溶剂。将获得的沉淀物(8.1g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(650ml)。然后用氯仿-甲醇的溶剂混合物连续洗脱，获得用氯仿-甲醇(100∶0)洗脱的级分(1.5mg)。然后过硅胶柱(620ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶剂混合物，获得用正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱的级分(321mg)。将获得的级分溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(梯度为45∶55到70∶30)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，产生化合物66(14.4mg，34min)。

实施例40(化合物73、77和78)

将实施例36获得的培养提取物(500g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(6000ml)。然后用氯仿-甲醇的溶剂混合物连续洗脱。获得用氯仿-甲醇(95∶5)洗脱的级分(57g)。将该级分的一部分(18g)进一步过硅胶柱(800ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶剂混合物。将正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱的级分分成两份，即级分(1)(126mg)和级分(2)(985mg)。将级分(1)溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(55∶45)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化。将获得的级分在减压下浓缩，产生化合物78(13.4mg，26min)。另一方面，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(45∶55)作为流动相，通过制备性高效液相层析纯化级分(2)，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物73(38.1mg，10min)和化合物77(67.2mg，26min)。

实施例41(化合物67和75)

将实施例36获得的培养提取物(500g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶剂混合物中，吸附于用氯仿湿润制备的硅胶[硅胶60(商品名，Merck生产)]柱(6000ml)。然后用氯仿-甲醇的溶剂混合物连续洗脱。获得氯仿-甲醇(95∶5)洗脱的级分(57g)。将该级分的一部分(18g)进一步过硅胶柱(800ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶剂混合物，获得正己烷-乙酸乙酯(1∶2)洗脱的级分。将该级分溶解于少量丙酮中，用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(40∶60)作为流动相，通过制备性高效液相层析[柱：YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，检测：254nm的紫外线吸收，流速：10ml/min]纯化，获得两个级分。每个级分都在减压下浓缩，产生化合物67(17.4mg，11min)以及一种半纯样品(23.9mg)。使用氯仿-甲醇(90∶10)作为展开剂，通过制备性薄层层析[硅胶60 F254(商品名，Merck生产)，20cm×20cm，厚0.5mm]纯化这种半纯样品。收集Rf值为0.5的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在减压下浓缩，产生化合物75(4.3mg)。

表2显示在上述实施例中合成并纯化的化合物及其数据。

试验实施例1

真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的表达：

人真皮乳头细胞购自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培养。根据Arase等人(J.Dermatol.Sci.， 2，66-70(1991))的方法，从拔出的毛发中分离人毛囊细胞，使用KGM-2(SankoJunyaku)培养。

将第5代真皮乳头细胞和第2代毛囊细胞接种于一个10cm的培养皿中，使其密度为2×10⁶细胞/孔，培养2夜。除去培养基后，用PBS(-)洗涤细胞，利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。用50ng总RNA、0.4μM WNT-5A或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异的引物[WNT-5A正向引物：AATGTCTTCC AAGTTCTTCCTAGTGGC(SEQ ID NO：8)，WNT-5A反向引物：GATGTCGGAATTGATACTGG CA(SEQ ID NO：9)，GAPDH正向引物：ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO：10)和GAPDH反向引物：TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ ID NO：11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附操作方案进行RT-PCR。简言之，第一链的合成在总体积为25μl的反应体系中50℃下进行30分钟。加热到94℃2分钟后，将所有cDNA片段均扩增23或20个循环，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。

每个反应溶液都在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。图1显示结果。

如果使用真皮乳头细胞(DPC)来源的RNA，在使用WNT-5A特异性引物的23个循环的PCR中观察到cDNA片段显著扩增。如果使用毛囊细胞(HFC)来源的RNA，在相同条件下未见扩增产物。

试验实施例2

减少WNT-5A mRNA含量之活性的测定：

人真皮乳头细胞购自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培养。

将第5代真皮乳头细胞接种于一个12孔板中，使其密度为1.6×10⁵细胞/孔，培养过夜。然后将培养基替换为不添加化合物的培养基或含有化合物1、2、3、4、5、7、9或24的培养基，继续培养24小时。在培养完成后，除去所有培养基，用PBS(-)洗涤细胞。然后使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。用50ng总RNA、0.4μM WNT-5A或GAPDH特异性引物[WNT-5A正向引物：AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO：8)，WNT-5A反向引物：GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQ ID NO：9)，GAPDH正向引物：ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO：10)和GAPDH反向引物：TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ IDNO：11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUMTaq所附操作方案进行RT-PCR。简言之，第一链的合成在总体积为25μl的反应体系中50℃下进行30分钟。加热到94℃2分钟后，将WNT-5A或GAPDH的cDNA片段扩增23或20个循环，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。

每个反应溶液都在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。图2显示结果。

在使用WNT-5A特异性引物的23个循环的PCR中，与使用不添加化合物的培养基的培养物相比，在含化合物的培养物中扩增的WNT-5A cDNA片段显著减少。

另一方面，在使用GAPDH特异性引物的20个循环的PCR中，无论是否存在化合物，扩增的cDNA片段的量均未见改变。

试验实施例3

真皮乳头细胞生长促进活性的检测：

将第5代真皮乳头细胞接种于一个用于球体培养的96孔板中，使其密度为1.6×10⁴细胞/孔，并培养过夜。然后将培养基替换为不添加化合物的培养基或含有化合物1、2、3、4、5、7、9或24的培养基，继续培养72小时。培养完成后，用细胞计数试剂盒(WakoPure Chemicals)计数细胞。在完成培养前5小时，向每个培养基中各加入1/10培养基量的WST-1试剂，然后在培养完成时测量培养基的光密度(O.D.450nm/620nm)。在0.25-4×10⁴细胞/孔范围内，观察到在细胞数与光密度之间正相关。

结果表明，具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促进真皮乳头细胞生长的活性(图3)。在该图中，每个数值代表6个孔(对照组)或3个孔(试验组)的平均值。为了比较对照组与试验组，使用Student’s t检验：

^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，^***：P＜0.001。

上述试验实施例表明，人真皮乳头细胞中表达WNT-5A，本发明的化合物可减少真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的含量，具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促进真皮乳头细胞生长的活性。

试验实施例4

减少WNT-5A mRNA含量的化合物(表2)的活性(通过QuantiGene法对mRNA定量)

将第5代真皮乳头细胞接种于一个96孔板中，使其密度为1×10⁴细胞/孔，并培养过夜。然后将培养基替换为不添加化合物的培养基或含有这些化合物的培养基，继续培养24小时。在培养完成后，使用QuantiGene High Volume试剂盒(Bayer Medical)，通过分支DNA(bDNA)信号扩增法(Drug Metabolism and Disposition， 28(5)，608-616(2000))测定WNT-5A或GAPDH mRNA的含量。根据QuantiGene High Volume试剂盒所附的方案，利用裂解混合物裂解细胞，将裂解溶液加到捕获板上。然后添加一组WNT-5A或GAPDH特异的探针，使之在53℃下反应20小时。用含有0.03％硫酸月桂酯的0.1×SSC洗板后，加入含有bDNA的扩增探针，使之在46℃下反应1小时。洗板后，加入碱性磷酸酶标记的标记探针，使之在46℃下反应1小时。洗板后，加入底物Lumi-Phos Plus，使之在46℃下反应30分钟。然后用WALLAC 1420ARVO_SX测量发光。

WNT-5A特异性探针组根据人WNT-5A mRNA编码区序列设计。使用10种探针(SEQ ID NOs：12-21)作为捕获探针(CaptureExtenders，CEs)；使用31种探针(SEQ ID NOs：22-52)作为标记探针(Label Extenders，LEs)；使用9种探针(SEQ ID NOs：53-60)作为阻断探针(Blockers)。

用人GAPDH的bDNA探针组(XenoTech LLC，B0960)作为GAPDH特异性探针组。

WNT-5A和GAPDH mRNAs的量表示为与不添加化合物的对照组相比的相对值(％)，计算mRNA量减半时的化合物浓度(IC₅₀)作为相应化合物的WNT-5A mRNA减少活性的指标。

表3显示化合物对WNT-5A和GADPH mRNA含量的影响。表中的每个数值是2个孔的平均值。这些化合物减少了真皮乳头细胞中的WNT-5A mRNA含量。活性最高的化合物的IC₅₀值为0.12μM。在每种化合物抑制WNT-5A mRNA的IC₅₀浓度下测定的GAPDH mRNA含量未见减少。

表3

IC ₅₀ (μM)

化合物编号 WNT-5A GAPDH

1 0.20 28.25

2 0.39 26.41

3 3.16 57.95

4 3.46 ＞30

5 3.47 ＞30

7 4.07 ＞120

18 0.63 6.58

24 4.74 21.07

35 0.46 4.29

38 6.42 ＞120

52 0.12 13.47

53 0.12 45.45

54 2.37 ＞30

55 0.74 ＞30

58 0.50 79.95

65 8.28 109.16

68 10.69 50.63

73 9.37 ＞120

76 8.56 55.94

77 8.13 ＞120

79 0.90 38.16

试验实施例5

化合物的真皮乳头细胞生长促进活性(表2)：

将第5代真皮乳头细胞接种于一个用于球形培养的96孔板中，使其密度为1.5×10⁴细胞/孔，并培养过夜。然后将培养基替换为不添加化合物的培养基或含有该化合物的培养基，继续培养72小时。在培养完成后，用细胞计数试剂盒(Wako Pure Chemicals)计数细胞。在完成培养前5小时，向每个培养基中添力1/10培养基量的WST-1试剂，然后在培养完成时测量培养基的光密度(O.D.450nm/620nm)。在0.25-4×10⁴细胞/孔范围内，观察到在细胞数与光密度之间正相关。

表4显示具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物对真皮乳头细胞生长的影响。在该表中，每个数值代表6个孔(对照组)或3个孔(试验组)的平均值。为了比较对照组与试验组，使用Student’s t检验：

^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，^***：P＜0.001。

具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的每种化合物在16μM时都显示显著的促进真皮乳头细胞生长的活性。具有减少WNT-5AmRNA含量之强活性(即IC₅₀低于1μM)的化合物1、2、18、35、52、53和58在1μM时也显示明显的生长促进活性。

表4

ΔO.D.450nm/620nm(对照的％)

化合物编号 1 4 16(μM)

1 132.9±11.6^*** 183.7±12.1^*** 144.7±13.0^***

2 142.6±10.1^*** 167.3±8.5^*** 241.0±25.3^***

3 92.9±1.6 92.9±9.9 244.2±33.4^***

4 97.4±24.4 148.2±4.9^*** 180.2±6.9^***

5 110.2±45.0 174.7±29.2^*** 236.4±26.4^***

7 82.6±3.9 169.7±10.4^*** 194.8±12.7^***

18 115.6±9.0^* 147.1±11.3^*** 210.9±25.9^***

24 108.2±6.9 104.3±10.5 119.7±3.7^**

35 160.8±3.5^*** 181.6±3.7^*** 158.6±18.3^***

38 103.5±2.6 89.6±7.3 124.9±5.1^**

52 124.5±1.0^*** 143.2±9.5^*** 197.0±5.4^***

53 126.6±14.3^** 149.5±12.8^*** 184.4±3.6^***

54 80.0±2.4 97.1±5.6 135.0±0.9^***

55 89.0±1.8 126.9±7.2^*** 175.6±9.8^***

58 123.3±1.8^*** 150.4±9.4^*** 217.4±14.5^***

65 92.1±6.7 87.6±8.7 141.0±5.3^***

73 91.7±5.7 81.2±7.8 205.6±9.2^***

76 80.0±5.6 77.1±7.0 120.7±6.3^*

77 81.6±4.4 86.3±5.0 180.8±21.7^***

79 87.5±9.9 98.6±3.6 120.0±4.1^**

^*：p＜0.05，^**：p＜0.01，^***：p＜0.001

试验实施例6

猴皮肤器官培养物中WNT-5A mRNA的减少

采集猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))(雄性，6岁)的背部皮肤，在立体显微镜下分成小片(5mm×8mm)。然后在William’s MediumE(Invitrogen)中培养每个皮肤组织片，该培养基中不添加化合物或添加化合物7或化合物3，并且含有10μg/ml胰岛素(Sigma)和10ng/ml氢化可的松(Kurabo)。

在培养的第11天，从每个皮肤组织片上分离毛囊，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。使用200ng总RNA、0.4μM WNT-5A或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异的引物[WNT-5A正义：AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO：8)，WNT-5A反义：GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQ ID NO：9)，GAPDH正义：ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO：10)和GAPDH反义：TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ ID NO：11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPT One-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附的操作方案进行RT-PCR。简言之，按照SUPERSCRIPT One-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附的操作方案，第一链的合成在总体积为25μl的反应体系中50℃下进行30分钟。加热到94℃2分钟后，将WNT-5A或GAPDH的cDNA片段扩增40或30个循环，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。

每个反应溶液都在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用Cyber Green(Takara)染色。图4显示结果。

在使用WNT-5A特异性引物的40个循环的PCR中，与不添加化合物的培养物相比，在添加化合物7或化合物3的培养物中扩增的WNT-5A cDNA片段显著减少。

另一方面，在使用GAPDH特异性引物的30个循环的PCR中，无论是否存在化合物，扩增的cDNA片段的量均未见改变。

试验实施例7

猴皮肤器官培养物中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的增多

采集猕猴(食蟹猴)(雄性，6岁)的背部皮肤，在立体显微镜下分成小片(5mm×8mm)。然后在William’s Medium E(Invitrogen)中培养每个皮肤组织片，该培养基中不添加化合物或添加化合物7或化合物3，并且含有10μg/ml胰岛素(Sigma)和10ng/ml氢化可的松(Kurabo)。

在培养的第30天，皮肤组织片均在室温下用10％中性福尔马林固定。制备石蜡包埋的切片。加入含有1％BSA的PBS后，在室温下放置30分钟，然后在0.1M柠檬酸缓冲液中煮沸。然后与抗PCNA抗体(Dako Japan，稀释200倍)在4℃下反应过夜，然后与生物素化抗小鼠IgG抗体反应。进而与ABC标准试剂盒(载体)反应，用AEC物质(Sigma)显色。

结果在毛囊和表皮基底层的细胞中观察到阳性反应。在毛囊中，在毛发生长终期和生长期毛囊的真皮乳头和真皮鞘中观察到PCNA阳性细胞计数显著增加(图5)。

试验实施例8

猴皮肤器官培养物中毛球直径的增大

在培养的第30天，分离每个皮肤组织片中的所有毛囊，在立体显微镜下测量毛球的直径。

图6和图7显示结果。在这些图中，每个数值代表每个皮肤组织切片中所有毛囊的毛球直径的平均值±S.E.。为了比较对照组与试验组，使用Student’s t检验：

^*：P＜0.05。

这些图也是显示毛球直径分布的直方图。将每个皮肤组织片中的所有毛囊分成如图所示的毛球直径组，每个组中的毛囊计数表示为相对于从组织片中分离的总毛囊计数的相对值(％)。图6显示在化合物7存在下培养后达到的效果。在化合物7存在下培养30天后，皮肤片中所含毛囊的平均毛球直径显著高于不添加化合物的对照组。如分布所示，在直径140μm或更大但小于170μm的组中，不加化合物的对照组显示最大毛囊计数，而在直径170μm或更大但是小于200μm的组中，添加化合物7的组显示最大毛囊计数。在不添加化合物的组中，毛球直径为170μm或更大的毛囊的比例为57.6％，而在含有化合物7的组中该比例升高到82.4％。

另一方面，图7显示在化合物3存在下培养后达到的效果。与化合物7的情况类似，在化合物3存在下培养30天后，皮肤片中所含毛囊的平均毛球直径显著高于不添加化合物的对照组。如分布所示，在直径140μm或更大但小于170μm的组中，不加化合物的对照组显示最大毛囊计数，而在直径200μm或更大但小于230μm的组中，添加化合物3的组显示最大毛囊计数。在不添加化合物的组中，毛球直径为170μm或更大的毛囊的比例为55.8％，而在含有化合物3的组中该比例升高到74.5％。

试验实施例9

残尾猕猴毛发生长试验

向患有脱毛症的残尾猕猴(短尾猴(Macaca arctoides))(雄性，14岁)的前额施用1mL含有0.3％化合物7的洗剂，一天一次，每周5次，共6个月。在开始施用之前，前额的脱毛部位用文身标记。在开始施用之前和施用6个月之后对含文身的皮肤部分照相。

图8提供在施用含有化合物7的洗剂之前和施用6个月之后的放大皮肤照片。在施用前，观察到许多细毫毛。相反，在同一部位施用6个月后，毫毛减少，粗终毛增多。也就是说，可以认为施用6个月含有化合物7的洗剂明显改善了残尾猕猴前额的脱毛症。

上述试验实施例的结果表明，人真皮乳头细胞表达WNT-5A，本发明的化合物减少人真皮乳头细胞中WNT-5A mRNA的含量，具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促进真皮乳头细胞生长的活性。

这些结果还表明，本发明的化合物也使猴皮肤器官培养物中WNT-5A mRNA的含量减少，该化合物使毛发生长终期和生长期毛囊中PCNA染色阳性的增殖细胞显著增多，而且该化合物使毛囊的毛球增大。

而且这些结果还表明，本发明的化合物具有改善残尾猕猴(雄性型脱毛症的动物模型)脱毛症的作用。

也就是说，促进真皮乳头细胞生长的化合物可以提高脱毛症处毛囊的真皮乳头中降低的细胞生长能力，因此有利于形成发育良好的真皮乳头组织，从而促进毛发生长。

工业实用性

WNT-5A功能抑制剂(例如，具有减少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物或其药物可接受的盐)具有促进真皮乳头细胞生长的活性，因此可以用作具有新型作用机制的毛发生长刺激剂/毛发生长补剂。

本发明提供了一种全新的概念，使用抑制WNT-5A功能的化合物作为改善或预防脱毛症的药物，筛选这种抑制WNT-5A功能的化合物用于开发新型毛发生长刺激剂/毛发生长补剂。

序列表

<110>大正制药株式会社

<120>毛发生长制剂

<130>P600

<160>61

<150>JP 2002-115529

<151>2002-04-17

<210>1

<211>365

<212>蛋白质

<213>智人

<400>1

Met Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu

5 10 15

Ala Ile Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu Ala Asn Ser

20 25 30

Trp Trp Ser Leu Gly Met Asn Asn Pro Val Gln Met Ser Glu Val

35 40 45

Tyr Ile Ile Gly Ala Gln Pro Leu Cys Ser Gln Leu Ala Gly Leu

50 55 60

Ser Gln Gly Gln Lys Lys Leu Cys His Leu Tyr Gln Asp His Met

65 70 75

Gln Tyr Ile Gly Glu Gly Ala Lys Thr Gly Ile Lys Glu Cys Gln

80 85 90

Tyr Gln Phe Arg His Arg Arg Trp Asn Cys Ser Thr Val Asp Asn

95 100 105

Thr Ser Val Phe Gly Arg Val Met Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr

110 115 120

Ala Phe Thr Tyr Ala Val Ser Ala Ala Gly Val Val Asn Ala Met

125 130 135

Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser Thr Cys Gly Cys Ser

140 145 150

Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp Trp Leu Trp Gly

155 160 165

Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Lys Glu

170 175 180

Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys Gly Ser

185 190 195

Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala

200 205 210

Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys

215 220 225

His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln

230 235 240

Leu Ala Asp Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr

245 250 255

Asp Ser Ala Ala Ala Met Arg Leu Asn Ser Arg Gly Lys Leu Val

260 265 270

Gln Val Asn Ser Arg Phe Asn Ser Pro Thr Thr Gln Asp Leu Val

275 280 285

Tyr Ile Asp Pro Ser Pro Asp Tyr Cys Val Arg Asn Glu Ser Thr

290 295 300

Gly Ser Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu

305 310 315

Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asp

320 325 330

Gln Phe Lys Thr Val Gln Thr Glu Arg Cys His Cys Lys Phe His

335 340 345

Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Lys Lys Cys Thr Glu Ile Val Asp

350 355 360

Gln Phe Val Cys Lys

365

<210>2

<211>4428

<212>DNA

<213>智人

<400>2

ttaaggaaat ccgggctgct cttccccatc tggaagtggc tttccccaca tcggctcgta 60

aactgattat gaaacatacg atgttaattc ggagctgcat ttcccagctg ggcactctcg 120

cgcgctggtc cccggggcct cgccccccac cccctgccct tccctcccgc gtcctgcccc 180

catcctccac cccccgcgct ggccaccccg cctccttggc agcctctggc ggcagcgcgc 240

tccactcgcc tcccgtgctc ctctcgccca tggaattaat tctggctcca cttgttgctc 300

ggcccaggtt ggggagagga cggagggtgg ccgcagcggg ttcctgagtg aattacccag 360

gagggactga gcacagcacc aactagagag gggtcagggg gtgcgggact cgagcgagca 420

ggaaggaggc agcgcctggc accagggctt tgactcaaca gaattgagac acgtttgtaa 480

tcgctggcgt gccccgcgca caggatccca gcgaaaatca gatttcctgg tgaggttgcg 540

tgggtggatt aatttggaaa aagaaactgc ctatatcttg ccatcaaaaa actcacggag 600

gagaagcgca gtcaatcaac agtaaactta agagaccccc gatgctcccc tggtttaact 660

tgtatgcttg aaaattatct gagagggaat aaacatcttt tccttcttcc ctctccagaa 720

gtccattgga atattaagcc caggagttgc tttggggatg gctggaagtg caatgtcttc 780

caagttcttc ctagtggctt tggccatatt tttctccttc gcccaggttg taattgaagc 840

caattcttgg tggtcgctag gtatgaataa ccctgttcag atgtcagaag tatatattat 900

aggagcacag cctctctgca gccaactggc aggactttct caaggacaga agaaactgtg 960

ccacttgtat caggaccaca tgcagtacat cggagaaggc gcgaagacag gcatcaaaga 1020

atgccagtat caattccgac atcgacggtg gaactgcagc actgtggata acacctctgt 1080

ttttggcagg gtgatgcaga taggcagccg cgagacggcc ttcacatacg ccgtgagcgc 1140

agcaggggtg gtgaacgcca tgagccgggc gtgccgcgag ggcgagctgt ccacctgcgg 1200

ctgcagccgc gccgcgcgcc ccaaggacct gccgcgggac tggctctggg gcggctgcgg 1260

cgacaacatc gactatggct accgctttgc caaggagttc gtggacgccc gcgagcggga 1320

gcgcatccac gccaagggct cctacgagag tgctcgcatc ctcatgaacc tgcacaacaa 1380

cgaggccggc cgcaggacgg tgtacaacct ggctgatgtg gcctgcaagt gccatggggt 1440

gtccggctca tgtagcctga agacatgctg gctgcagctg gcagacttcc gcaaggtggg 1500

tgatgccctg aaggagaagt acgacagcgc ggcggccatg cggctcaaca gccggggcaa 1560

gttggtacag gtcaacagcc gcttcaactc gcccaccaca caagacctgg tctacatcga 1620

ccccagccct gactactgcg tgcgcaatga gagcaccggc tcgctgggca cgcagggccg 1680

cctgtgcaac aagacgtcgg agggcatgga tggctgcgag ctcatgtgct gcggccgtgg 1740

gtacgaccag ttcaagaccg tgcagacgga gcgctgccac tgcaagttcc actggtgctg 1800

ctacgtcaag tgcaagaagt gcacggagat cgtggaccag tttgtgtgca agtagtgggt 1860

gccacccagc actcagcccc gctcccagga cccgcttatt tatagaaagt acagtgattc 1920

tggtttttgg tttttagaaa tattttttat ttttccccaa gaattgcaac cggaaccatt 1980

ttttttcctg ttaccatcta agaactctgt ggtttattat taatattata attattattt 2040

ggcaataatg ggggtgggaa ccacgaaaaa tatttatttt gtggatcttt gaaaaggtaa 2100

tacaagactt cttttggata gtatagaatg aagggggaaa taacacatac cctaacttag 2160

ctgtgtggga catggtacac atccagaagg taaagaaata cattttcttt ttctcaaata 2220

tgccatcata tgggatgggt aggttccagt tgaaagaggg tggtagaaat ctattcacaa 2280

ttcagcttct atgaccaaaa tgagttgtaa attctctggt gcaagataaa aggtcttggg 2340

aaaacaaaac aaaacaaaac aaacctccct tccccagcag ggctgctagc ttgctttctg 2400

cattttcaaa atgataattt acaatggaag gacaagaatg tcatattctc aaggaaaaaa 2460

ggtatatcac atgtctcatt ctcctcaaat attccatttg cagacagacc gtcatattct 2520

aatagctcat gaaatttggg cagcagggag gaaagtcccc agaaattaaa aaatttaaaa 2580

ctcttatgtc aagatgttga tttgaagctg ttataagaat tgggattcca gatttgtaaa 2640

aagaccccca atgattctgg acactagatt ttttgtttgg ggaggttggc ttgaacataa 2700

atgaaatatc ctgtattttc ttagggatac ttggttagta aattataata gtagaaataa 2760

tacatgaatc ccattcacag gtttctcagc ccaagcaaca aggtaattgc gtgccattca 2820

gcactgcacc agagcagaca acctatttga ggaaaaacag tgaaatccac cttcctcttc 2880

acactgagcc ctctctgatt cctccgtgtt gtgatgtgat gctggccacg tttccaaacg 2940

gcagctccac tgggtcccct ttggttgtag gacaggaaat gaaacattag gagctctgct 3000

tggaaaacag ttcactactt agggattttt gtttcctaaa acttttattt tgaggagcag 3060

tagttttcta tgttttaatg acagaacttg gctaatggaa ttcacagagg tgttgcagcg 3120

tatcactgtt atgatcctgt gtttagatta tccactcatg cttctcctat tgtactgcag 3180

gtgtacctta aaactgttcc cagtgtactt gaacagttgc atttataagg ggggaaatgt 3240

ggtttaatgg tgcctgatat ctcaaagtct tttgtacata acatatatat atatatacat 3300

atatataaat ataaatataa atatatctca ttgcagccag tgatttagat ttacagctta 3360

ctctggggtt atctctctgt ctagagcatt gttgtccttc actgcagtcc agttgggatt 3420

attccaaaag ttttttgagt cttgagcttg ggctgtggcc ccgctgtgat cataccctga 3480

gcacgacgaa gcaacctcgt ttctgaggaa gaagcttgag ttctgactca ctgaaatgcg 3540

tgttgggttg aagatatctt tttttctttt ctgcctcacc cctttgtctc caacctccat 3600

ttctgttcac tttgtggaga gggcattact tgttcgttat agacatggac gttaagagat 3660

attcaaaact cagaagcatc agcaatgttt ctcttttctt agttcattct gcagaatgga 3720

aacccatgcc tattagaaat gacagtactt attaattgag tccctaagga atattcagcc 3780

cactacatag atagcttttt tttttttttt ttttttttaa taaggacacc tctttccaaa 3840

caggccatca aatatgttct tatctcagac ttacgttgtt ttaaaagttt ggaaagatac 3900

acatcttttc ataccccccc ttaggaggtt gggctttcat atcacctcag ccaactgtgg 3960

ctcttaattt attgcataat gatatccaca tcagccaact gtggctcttt aatttattgc 4020

ataatgatat tcacatcccc tcagttgcag tgaattgtga gcaaaagatc ttgaaagcaa 4080

aaagcactaa ttagtttaaa atgtcacttt tttggttttt attatacaaa aaccatgaag 4140

tacttttttt atttgctaaa tcagattgtt cctttttagt gactcatgtt tatgaagaga 4200

gttgagttta acaatcctag cttttaaaag aaactattta atgtaaaata ttctacatgt 4260

cattcagata ttatgtatat cttctagcct ttattctgta cttttaatgt acatatttct 4320

gtcttgcgtg atttgtatat ttcactggtt taaaaaacaa acatcgaaag gcttattcca 4380

aatggaagat agaatataaa ataaaacgtt acttgtaaaa aaaaaaaa 4428

<210>3

<211>2460

<212>DNA

<213>智人

<400>3

cgtggcacgc gcggaagatt ctcagtgtcc ttacagagtc atcttccctg agccccggaa 60

gtgttggaaa acatttagcc ccttctttgg gaaactcagt ttctgatcag aatttttgtt 120

ttaccctggg gttgacagtc tcgccagagg tctcatttca tactgtcttt tcggatctga 180

tcctcttggt aaacaggcgg ggatgtttta ccctacagag ccgatgtatg tgtgagttcg 240

ctgtgagttc tttgagtgtc tcaaacttgt ggggcctttt ctcggttgca ctgggattga 300

agagggaaga ggcccaaggt gtttccgggc aagcggcggg gttaagtgga gatgcgactc 360

gtgaggctct cctttccgat ccccctttgg gacaccctct gcctacctct accctggagc 420

cagggagacc caagtcttgg tgaccggatg ggcccgctct cagttggcct gggctctggg 480

aactggtgga ctctccctgg gggcttcggg ctgggagtgg gttcggtttg tgtggcttcg 540

gctctaacaa agagatccgc tgtaatccgc cgaatctgtt atcaatttct ctgctgcttg 600

agccccgccc cacgcgcccc gcccgccgcg aagcttggaa agtgcacgcg gccagcacca 660

atctgggccg ctgactcgga aacatgtcgc agcgtgtgtg tctatggacg cgtgtgagtg 720

tgtaaatgtg cacgagtgtg aatgtgtatg atgtgtgtgc acgcggcatc ggctgccctt 780

ggggagagtt gactttgcag cctgggctgc gcgagaagca gactttgcag cccactccct 840

cccctggagg aaatttgaca cttagggcgg gggtggggag atagccggag ccttctctct 900

cctagctggg gaaaccccag atttccattc tccaggatgc gccccccagc tttgcagcgt 960

cttggggaca actggcctgg tgttggagcc ctgcttagca ggcgctgggg accacataag 1020

cattcctctt tggagaagcc ccgaagcgtc caggccaaag ggggcggttc acggaagaaa 1080

aaccttgcac gcccttgagc gcatagcttt accagggctg cctaggtccc gcctcttgcc 1140

cttttacggc acaggttcca agccaggctc ttcccaccgc cttaaagagg ctcacctttc 1200

ttttcttttc tgtggaaggg gctccttcag gggctatggg cgatgcagtg cggcagggtt 1260

agacttacgt gtaaggggat ttttaaaacc cgctcctccc acccgcaccc gccacctact 1320

cgctccgccg ccgcctacag gtggagaagt caccagtggg gaggaacggc agcggaagct 1380

tccaaggcca actcctaccc ctgaaattct tcaggaaggg aaccttcgcc gctggggggc 1440

tctttggcct ggaatcgatg cgcccagctg cggctcggaa gccagcgcct ctggccccgt 1500

ctggactcat ctgcaagggc tctggcctcg ccccgcaccc ccacctttcg ggactgaccg 1560

aaccaagtct gagttgggct ggagaggcta gactggaggc agggtggcag agttccaacg 1620

acaggctcgc agtgccgcga atggcaaagt gggccacaac cccagatcag gacccagaga 1680

aactggagtc tctctctggg cctcccatct cctccctccc tggcaactac caggttgtgg 1740

ggtgggaggg agagtgaaaa atcaagaatt tgggagaaag ctgtggggag ggcagggaag 1800

ggatccttct ccccggggaa gcgagaccca gactcccttc tttcctctag ggttccatcc 1860

cttctctcag tccgtggaag aggccacagg cgacgcgggc gagggtggca ctcttttcca 1920

gtttccttgg ttgggagacc cgacctctct ctccattatc ccctagggcc cccatctcct 1980

tctcccctcc ctagtctggc tgaagaacgt ccttaaggaa atccgggctg ctcttcccca 2040

tctggaagtg gctttcccca catcggctcg taaactgatt atgaaacata cgatgttaat 2100

tcggagctgc atttcccagc tgggcactct cgcgcgctgg tccccggggc ctcgcccccc 2160

accccctgcc cttccctccc gcgtcctgcc cccatcctcc accccccgcg ctggccaccc 2220

cgcctccttg gcagcctctg gcggcagcgc gctccactcg cctcccgtgc tcctctcgcc 2280

catggaatta attctggctc cacttgttgc tcggcccagg ttggtgagag gacggagggt 2340

gcccacagcg ggttcctgag tgaattaccc aggagggact gagcacagca ccaactagag 2400

gggggccagg gggtgcggga ctcgagcgag caggaaggag gcagcgcctg gcaccagggc 2460

<210>4

<211>585

<212>蛋白质

<213>智人

<400>4

Met Ala Arg Pro Asp Pro Ser Ala Pro Pro Ser Leu Leu Leu Leu

5 10 15

Leu Leu Ala Gln Leu Val Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ser Lys Ala

20 25 30

Pro Val Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Met Cys Arg Gly Ile Gly

35 40 45

Tyr Asn Leu Thr His Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln

50 55 60

Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu

65 70 75

Ile Gln Cys Ser Pro Asp Leu Arg Phe Phe Leu Cys Thr Met Tyr

80 85 90

Thr Pro Ile Cys Leu Pro Asp Tyr His Lys Pro Leu Pro Pro Cys

95 100 105

Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ser Pro Leu Met

110 115 120

Arg Gln Tyr Gly Phe Ala Trp Pro Glu Arg Met Ser Cys Asp Arg

125 130 135

Leu Pro Val Leu Gly Arg Asp Ala Glu Val Leu Cys Met Asp Tyr

140 145 150

Asn Arg Ser Glu Ala Thr Thr Ala Pro Pro Arg Pro Phe Pro Ala

155 160 165

Lys Pro Thr Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ser Gly Gly

170 175 180

Glu Cys Pro Ala Gly Gly Pro Phe Val Cys Lys Cys Arg Glu Pro

185 190 195

Phe Val Pro Ile Leu Lys Glu Ser His Pro Leu Tyr Asn Lys Val

200 205 210

Arg Thr Gly Gln Val Pro Asn Cys Ala Val Pro Cys Tyr Gln Pro

215 220 225

Ser Phe Ser Ala Asp Glu Arg Thr Phe Ala Thr Phe Trp Ile Gly

230 235 240

Leu Trp Ser Val Leu Cys Phe Ile Ser Thr Ser Thr Thr Val Ala

245 250 255

Thr Phe Leu Ile Asp Met Asp Thr Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro

260 265 270

Ile Ile Phe Leu Ser Ala Cys Tyr Leu Cys Val Ser Leu Gly Phe

275 280 285

Leu Val Arg Leu Val Val Gly His Ala Ser Val Ala Cys Ser Arg

290 295 300

Glu His Asn His Ile His Tyr Glu Thr Thr Gly Pro Ala Leu Cys

305 310 315

Thr Ile Val Phe Leu Leu Val Tyr Phe Phe Gly Met Ala Ser Ser

320 325 330

Ile Trp Trp Val Ile Leu Ser Leu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Ala

335 340 345

Met Lys Trp Gly Asn Glu Ala Ile Ala Gly Tyr Gly Gln Tyr Phe

350 355 360

His Leu Ala Ala Trp Leu Ile Pro Ser Val Lys Ser Ile Thr Ala

365 370 375

Leu Ala Leu Ser Ser Val Asp Gly Asp Pro Val Ala Gly Ile Cys

380 385 390

Tyr Val Gly Asn Gln Asn Leu Asn Ser Leu Arg Arg Phe Val Leu

395 400 405

Gly Pro Leu Val Leu Tyr Leu Leu Val Gly Thr Leu Phe Leu Leu

410 415 420

Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg Ile Arg Ser Val Ile Lys Gln

425 430 435

Gly Gly Thr Lys Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Ile Arg Ile

440 445 450

Gly Ile Phe Thr Leu Leu Tyr Thr Val Pro Ala Ser Ile Val Val

455 460 465

Ala Cys Tyr Leu Tyr Glu Gln His Tyr Arg Glu Ser Trp Glu Ala

470 475 480

Ala Leu Thr Cys Ala Cys Pro Gly His Asp Thr Gly Gln Pro Arg

485 490 495

Ala Lys Pro Glu Tyr Trp Val Leu Met Leu Lys Tyr Phe Met Cys

500 505 510

Leu Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Val Trp Ile Trp Ser Gly Lys

515 520 525

Thr Val Glu Ser Trp Arg Arg Phe Thr Ser Arg Cys Cys Cys Arg

530 535 540

Pro Arg Arg Gly His Lys Ser Gly Gly Ala Met Ala Ala Gly Asp

545 550 555

Tyr Pro Glu Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Arg Thr Gly Pro Pro

560 565 570

Gly Pro Ala Ala Thr Tyr His Lys Gln Val Ser Leu Ser His Val

575 580 585

<210>5

<211>2334

<212>DNA

<213>智人

<400>5

acccagggac ggaggaccca ggctggcttg gggactgtct gctcttctcg gcgggagccg 60

tggagagtcc tttccctgga atccgagccc taaccgtctc tccccagccc tatccggcga 120

ggagcggagc gctgccagcg gaggcagcgc cttcccgaag cagtttatct ttggacggtt 180

ttctttaaag gaaaaacgaa ccaacaggtt gccagccccg gcgccacaca cgagacgccg 240

gagggagaag ccccggcccg gattcctctg cctgtgtgcg tccctcgcgg gctgctggag 300

gcgaggggag ggagggggcg atggctcggc ctgacccatc cgcgccgccc tcgctgttgc 360

tgctgctcct ggcgcagctg gtgggccggg cggccgccgc gtccaaggcc ccggtgtgcc 420

aggaaatcac ggtgcccatg tgccgcggca tcggctacaa cctgacgcac atgcccaacc 480

agttcaacca cgacacgcag gacgaggcgg gcctggaggt gcaccagttc tggccgctgg 540

tggagatcca atgctcgccg gacctgcgct tcttcctatg cactatgtac acgcccatct 600

gtctgcccga ctaccacaag ccgctgccgc cctgccgctc ggtgtgcgag cgcgccaagg 660

ccggctgctc gccgctgatg cgccagtacg gcttcgcctg gcccgagcgc atgagctgcg 720

accgcctccc ggtgctgggc cgcgacgccg aggtcctctg catggattac aaccgcagcg 780

aggccaccac ggcgcccccc aggcctttcc cagccaagcc cacccttcca ggcccgccag 840

gggcgccggc ctcggggggc gaatgccccg ctgggggccc gttcgtgtgc aagtgtcgcg 900

agcccttcgt gcccattctg aaggagtcac acccgctcta caacaaggtg cggacgggcc 960

aggtgcccaa ctgcgcggta ccctgctacc agccgtcctt cagtgccgac gagcgcacgt 1020

tcgccacctt ctggataggc ctgtggtcgg tgctgtgctt catctccacg tccaccacag 1080

tggccacctt cctcatcgac atggacacgt tccgctatcc tgagcgcccc atcatcttcc 1140

tgtcagcctg ctacctgtgc gtgtcgctgg gcttcctggt gcgtctggtc gtgggccatg 1200

ccagcgtggc ctgcagccgc gagcacaacc acatccacta cgagaccacg ggccctgcac 1260

tgtgcaccat cgtcttcctc ctggtctact tcttcggcat ggccagctcc atctggtggg 1320

tcatcctgtc gctcacctgg ttcctggccg ccgcgatgaa gtggggcaac gaggccatcg 1380

cgggctacgg ccagtacttc cacctggctg cgtggctcat ccccagcgtc aagtccatca 1440

cggcactggc gctgagctcc gtggacgggg acccagtggc cggcatctgc tacgtgggca 1500

accagaacct gaactcgctg cggcgcttcg tgctgggccc gctggtgctc tacctgctgg 1560

tgggcacgct cttcctgctg gcgggcttcg tgtcgctctt ccgcatccgc agcgtcatca 1620

agcagggcgg caccaagacg gacaagctgg agaagctcat gatccgcatc ggcatcttca 1680

cgctgctcta cacggtcccc gccagcattg tggtggcctg ctacctgtac gagcagcact 1740

accgcgagag ctgggaggcg gcgctcacct gcgcctgccc gggccacgac accggccagc 1800

cgcgcgccaa gcccgagtac tgggtgctca tgctcaagta cttcatgtgc ctggtggtgg 1860

gcatcacgtc gggcgtctgg atctggtcgg gcaagacggt ggagtcgtgg cggcgtttca 1920

ccagccgctg ctgctgccgc ccgcggcgcg gccacaagag cgggggcgcc atggccgcag 1980

gggactaccc cgaggcgagc gccgcgctca caggcaggac cgggccgccg ggccccgccg 2040

ccacctacca caagcaggtg tccctgtcgc acgtgtagga ggctgccgcc gagggactcg 2100

gccggagagc tgaggggagg ggggcgtttt gtttggtagt tttgccaagg tcacttccgt 2160

ttaccttcat ggtgctgttg ccccctcccg cggcgacttg gagagaggga agaggggcgt 2220

tttcgaggaa gaacctgtcc caggtcttct ccaaggggcc cagctcacgt gtattctatt 2280

ttgcgtttct tacctgcctt ctttatggga accctctttt taatttatat gtat 2334

<210>6

<211>570

<212>蛋白质

<213>鼠属

<400>6

Met Arg Ala Arg Ser Ala Leu Pro Arg Ser Ala Leu Pro Arg Leu

5 10 15

Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Ala Ala Gly Pro Ala Gln Phe

20 25 30

His Gly Glu Lys Gly Ile Ser Ile Pro Asp His Gly Phe Cys Gln

35 40 45

Pro Ile Ser Ile Pro Leu Cys Thr Asp Ile Ala Tyr Asn Gln Thr

50 55 60

Ile Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gln Glu Asp Ala Gly

65 70 75

Leu Glu Val His Gln Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gln Cys Ser

80 85 90

Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys

95 100 105

Thr Val Leu Glu Gln Ala Ile Pro Pro Cys Arg Ser Ile Cys Glu

110 115 120

Arg Ala Arg Gln Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe

125 130 135

Gln Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg His Gly

140 145 150

Ala Glu Gln Ile Cys Val Gly Gln Asn His Ser Glu Asp Gly Thr

155 160 165

Pro Ala Leu Leu Thr Thr Ala Pro Pro Ser Gly Leu Gln Pro Gly

170 175 180

Ala Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro

185 190 195

Arg Tyr Ala Thr Leu Glu His Pro Phe His Cys Pro Arg Val Leu

200 205 210

Lys Val Pro Ser Tyr Leu Ser Tyr Lys Phe Leu Gly Glu Arg Asp

215 220 225

Cys Ala Ala Pro Cys Glu Pro Ala Arg Pro Asp Gly Ser Met Phe

230 235 240

Phe Ser His His His Thr Arg Phe Ala Arg Leu Trp Ile Leu Thr

245 250 255

Trp Ser Val Leu Cys Cys Ala Ser Thr Phe Phe Thr Val Thr Thr

260 265 270

Ser Leu Val Ala Met Gln Arg Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile

275 280 285

Ile Phe Leu Ser Gly Cys Tyr Thr Met Val Ser Val Ala Tyr Ile

290 295 300

Ala Gly Phe Val Leu Gln Glu Arg Val Val Cys Asn Glu Arg Phe

305 310 315

Ser Glu Asp Gly Tyr Arg Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Lys Glu

320 325 330

Gly Cys Thr Ile Leu Phe Met Met Leu Tyr Phe Phe Ser Met Ala

335 340 345

Ser Ser Ile Trp Trp Val Ile Leu Ser Leu Thr Trp Phe Leu Ala

350 355 360

Ala Gly Met Lys Trp Gly His Ala Ala Ile Glu Ala Asn Ser Gln

365 370 375

Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Val Pro Ala Val Lys Thr Ile

380 385 390

Thr Ile Leu Ala Met Gly Gln Ile Asp Gly Asp Leu Leu Ser Gly

395 400 405

Val Cys Phe Val Gly Leu Asn Arg Leu Asp Pro Leu Arg Gly Phe

410 415 420

Val Leu Ala Pro Leu Phe Val Tyr Leu Phe Ile Gly Thr Ser Phe

425 430 435

Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg Ile Arg Thr Ile Met

440 445 450

Lys His Asp Gly Thr Lys Thr Glu Pro Leu Glu Arg Leu Met Val

455 460 465

Arg Ile Gly Val Phe Ser Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Ile

470 475 480

Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr Glu Gln Ala Phe Arg Glu His Trp

485 490 495

Glu Arg Ser Trp Val Ser Gln His Cys Lys Ser Leu Ala Ile Pro

500 505 510

Cys Pro Ala His Tyr Thr Pro Arg Thr Ser Pro Asp Phe Thr Val

515 520 525

Tyr Met Ile Lys Tyr Leu Met Thr Leu Ile Val Gly Ile Thr Ser

530 535 540

Gly Phe Trp Ile Trp Ser Gly Lys Thr Leu His Ser Trp Arg Lys

545 550 555

Phe Tyr Thr Arg Leu Thr Asn Ser Arg His Gly Glu Thr Thr Val

560 565 570

<210>7

<211>1912

<212>DNA

<213>鼠属

<400>7

aggggaaggc gcgcggtctc tgggttgggg gcgggggctg gggggcgccc aggagccgag 60

tggggggcgg cggccagcat gcgggcccgc agcgccctgc cccgcagcgc cctgccccgc 120

ctgctgctgc cactgctgct gctgccggct gccgggccgg ctcagttcca cggggagaag 180

ggcatctcca tcccggacca cggcttctgc cagcccatct ccatcccgct gtgcacggac 240

atcgcctaca accagaccat catgcccaac cttcttgggc acacgaacca agaggacgcg 300

ggcctggagg tgcatcaatt ctacccgctg gtgaaggtgc agtgctcgcc cgagctgcgc 360

ttcttcctgt gctccatgta cgctccggtg tgcacggtgc tggagcaggc catcccgccg 420

tgccgctcca tctgcgaacg cgcgcgccaa ggctgcgagg cgctcatgaa caagttcggc 480

ttccagtggc ccgagcgcct ccgctgcgag catttcccgc gtcacggcgc ggagcagatc 540

tgcgtgggcc agaaccactc cgaggacgga actcctgcgc tactcaccac cgcgccaccg 600

tctgggctgc agcctggcgc tggtggcacc ccgggcggcc ctggcggtgg tggcgcgccc 660

ccgcgctacg ccactctgga gcaccctttc cactgtcccc gcgtcctcaa ggtgccgtcc 720

tatctcagct ataagtttct gggtgagcgc gattgtgccg cgccctgcga gcctgcacgg 780

cccgacggct ccatgttctt ctcgcaccac cacactcgtt ttgcccgtct ctggatcctc 840

acatggtcgg tgctgtgctg cgcttctact ttcttcacgg tcaccacctc tttagtggcc 900

atgcagcgat tccgctaccc agagcggccc atcatcttcc tgtccggttg ctacaccatg 960

gtgtcagtgg cctacattgc gggcttcgtg ctccaggagc gcgtggtgtg caacgagcgc 1020

ttctctgagg acggttatcg cacggtgggg cagggcacta agaaagaagg ctgtactata 1080

ctcttcatga tgctctactt cttcagtatg gccagctcca tctggtgggt gattctgtcc 1140

ctcacctggt tcctggcagc cggtatgaag tggggccacg cggccatcga ggccaattcg 1200

cagtacttcc acctggccgc ctgggcggtg ccggccgtca aaaccatcac catcctggcc 1260

atgggccaga tcgacggcga cctgctgagc ggcgtgtgct tcgtgggcct caacaggctg 1320

gacccgctgc gaggcttcgt gctggcgccg ctcttcgtgt acctgttcat cggcacatcc 1380

ttcctgctgg cgggcttcgt gtcactcttc cgcatccgca ccatcatgaa gcacgacggc 1440

accaagacgg agccgctgga gaggctcatg gtgcgtatcg gcgtcttctc cgtgctctac 1500

accgtaccgg ccaccatcgt catcgcctgc tacttctatg agcaggcctt ccgcgagcac 1560

tgggagcgct cgtgggtaag ccagcactgc aagagcctag ccatcccctg cccggcccac 1620

tacacgcccc gcacgtcgcc cgacttcaca gtctacatga tcaaatacct catgacgctc 1680

atcgtgggca tcacgtcggg cttctggatc tggtccggca agacgctgca ctcgtggagg 1740

aagttctaca cgcgtctcac caacagccgg catggagaga ccaccgtgtg aagcggtctc 1800

gctgctgggc gcccccctct cccaggtccg gactgcaacc gtgccctcct tcactcggga 1860

ggggggtgca ccctacggac tcctatttta tttttttaaa taaagaacag tg 1912

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为引物的核苷酸

<400>8

aatgtcttcc aagttcttcc tagtggc 27

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为引物的核苷酸

<400>9

gatgtcggaa ttgatactgg ca 22

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为引物的核苷酸

<400>10

accacagtcc atgccatcac 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为引物的核苷酸

<400>11

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>12

gtcctgggag cggggctttt ttctcttgga aagaaagt 38

<210>13

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>13

agagttctta gatggtaaca ggaaattttt ctcttggaaa gaaagt 46

<210>14

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>14

tatttccccc ttcattctat actatctttt tctcttggaa agaaagt 47

<210>15

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>15

catagaagct gaattgtgaa tagatttttt ttctcttgga aagaaagt 48

<210>16

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>16

gccctgctgg ggaagggttt ttctcttgga aagaaagt 38

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>17

cctccctgct gcccaaattt ttttctcttg gaaagaaagt 40

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>18

atcccaattc ttataacagc ttctttttct cttggaaaga aagt 44

<210>19

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>19

cttgttgctt gggctgagaa actttttctc ttggaaagaa agt 43

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>20

ggctcagtgt gaagaggaag gttttttctc ttggaaagaa agt 43

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>21

ccagtggagc tgccgtttgt ttttctcttg gaaagaaagt 40

<210>22

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>22

cactgtactt tctataaata agcggttttt aggcatagga cccgtgtct 49

<210>23

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>23

tttctaaaaa ccaaaaacca gaatttttta ggcataggac ccgtgtct 48

<210>24

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>24

aaaaatggtt ccggttgcat ttttaggcat aggacccgtg tct 43

<210>25

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>25

caaataataa ttataatatt aataataaac cactttttag gcataggacc cgtgtct 57

<210>26

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>26

agatccacaa aataaatatt tttcgtgttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51

<210>27

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>27

ccacacagct aagttagggt atgtgttttt taggcatagg acccgtgtct 50

<210>28

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>28

ttaccttctg gatgtgtacc atgtcttttt aggcatagga cccgtgtct 49

<210>29

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>29

aacctaccca tcccatatga tggtttttag gcataggacc cgtgtct 47

<210>30

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>30

ctaccaccct ctttcaactg gtttttaggc ataggacccg tgtct 45

<210>31

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>31

ccagagaatt tacaactcat tttggttttt taggcatagg acccgtgtct 50

<210>32

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>32

tcccaagacc ttttatcttg catttttagg cataggaccc gtgtct 46

<210>33

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>33

aggtttgttt tgttttgttt tgtttttttt aggcatagga cccgtgtct 49

<210>34

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>34

gtccttccat tgtaaattat cattttgttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51

<210>35

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>35

ttttccttga gaatatgaca ttcttttttt aggcatagga cccgtgtct 49

<210>36

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>36

ggagaatgag acatgtgata tacctttttt taggcatagg acccgtgtct 50

<210>37

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>37

tctgtctgca aatggaatat ttgattttta ggcataggac ccgtgtct 48

<210>38

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>38

tcatgagcta ttagaatatg acggttttta ggcataggac ccgtgtct 48

<210>39

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>39

aattttttaa tttctgggga ctttttttta ggcataggac ccgtgtct 48

<210>40

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>40

aaatcaacat cttgacataa gagttttatt tttaggcata ggacccgtgt ct 52

<210>41

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>41

ggggtctttt tacaaatctg gatttttagg cataggaccc gtgtct 46

<210>42

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>42

agaaaataca ggatatttca tttatgtttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51

<210>43

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>43

tactattata atttactaac caagtatccc tatttttagg cataggaccc gtgtct 56

<210>44

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>44

ctgtgaatgg gattcatgta ttatttcttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51

<210>45

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>45

gctgaatggc acgcaattac tttttaggca taggacccgt gtct 44

<210>46

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>46

aggttgtctg ctctggtgca gttttttagg cataggaccc gtgtct 46

<210>47

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>47

cacaacacgg aggaatcaga gagtttttag gcataggacc cgtgtct 47

<210>48

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>48

gaaacgtggc cagcatcaca ttttttaggc ataggacccg tgtct 45

<210>49

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>49

tgtcctacaa ccaaagggga ctttttaggc ataggacccg tgtct 45

<210>50

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>50

gagctcctaa tgtttcattt cctttttagg cataggaccc gtgtct 46

<210>51

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>51

agttttagga aacaaaaatc cctttttagg cataggaccc gtgtct 46

<210>52

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>52

gaaaactact gctcctcaaa ataaattttt aggcatagga cccgtgtct 49

<210>53

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>53

attcttgggg aaaaataaaa aata 24

<210>54

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>54

gttcccaccc ccattattgc 20

<210>55

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>55

caaaagaagt cttgtattac cttttcaa 28

<210>56

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>56

catatttgag aaaaagaaaa tgtatttct 29

<210>57

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>57

aaaatgcaga aagcaagcta gca 23

<210>58

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>58

caaaaaatct agtgtccaga atcattg 27

<210>59

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>59

tcaagccaac ctccccaaa 19

<210>60

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>60

ggatttcact gtttttcctc aaat 24

<210>61

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计作为探针的核苷酸

<400>61

taagtagtga actgttttcc aagca 25

Claims

1.一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。

2.根据权利要求1的真皮乳头细胞生长促进剂，其中抑制WNT-5A功能的化合物是WNT-5A生成抑制剂。

3.由下列通式(I)代表的化合物：

X代表氢原子或卤素原子；

R^3a和R^3b相同或不同，各自代表氢原子或羟基；和

4.一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有由下列通式(III)代表的化合物：

其中R¹和R²相同或不同，各自代表氢原子、C_1-6烷基或C_2-6烷酰基；X代表氢原子或卤素原子；

5.一种真皮乳头细胞生长促进剂，其含有由下列通式(IX)代表的化合物：

(CH₂)_pCO-Y-R¹⁰代表的基团，其中Y代表氧原子或硫原子；R¹⁰代表氢原子、C_1-6烷基或取代的或未取代的芳基；p＝0或1，

(CH₂)_qR¹¹代表的基团，其中R¹¹代表取代的或未取代的环烷基，或取代的或未取代的C_2-10杂环；q＝0或1，或

COR¹²代表的基团，其中R¹²代表取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的C_2-10杂环；

X代表氢原子或卤素原子；

Z-R¹³代表的基团，其中Z代表氧原子或硫原子；R¹³代表C_1-6烷基、C_1-6烷酰基或取代的或未取代的芳基，或

其相邻基团一起形成π键或醚键，或

R^5a和R^8a或R^5a和R^9a一起形成醚键；和

R^6b代表氢原子，或者与R^3e或R^3f一起形成醚键。

6.一种毛发生长刺激剂或毛发生长补剂，其含有根据权利要求1、2、4和5中任一项的真皮乳头细胞生长促进剂作为活性成分。

7.一种刺激毛发生长或促进毛发生长的方法，包括对人施用药物有效量的具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。

8.一种具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物在制备毛发生长刺激剂或毛发生长补剂中的用途。

9.一种筛选真皮乳头细胞生长促进剂的方法，该方法包括选择抑制WNT-5A功能的化合物。

10.根据权利要求9的方法，其包括下列步骤(a)-(c)：

(a)在已经添加化合物的培养基中培养表达人WNT-5A的细胞的步骤；

(c)比较步骤(b)中测定的WNT-5A mRNA含量的步骤。