CN120505316A

CN120505316A - 靶向猪PKHD1基因座的sgRNA及其应用

Info

Publication number: CN120505316A
Application number: CN202510690069.XA
Authority: CN
Inventors: 贺津; 许赛肥; 庄乐南; 张元�; 罗嘉宁
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2025-05-27
Filing date: 2025-05-27
Publication date: 2025-08-19

Abstract

本发明公开了一种靶向猪PKHD1基因座的sgRNA及其应用，属于基因编辑工程技术领域。本发明基于CRISPR/Cas9系统设计了一种长片段PKHD1基因敲除方法，具体地，通过对gRNA靶点进行筛选，发现在靶向PKHD1外显子10起始处和PKHD1外显子19末端处的一段序列时可以实现高效的大于18，000bp的基因删除。有望采用本发明方法高效删除猪成纤维细胞中相关基因片段，在ARPKD相关研究中具有巨大潜力。

Description

靶向猪PKHD1基因座的sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种靶向猪PKHD1基因座的sgRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。

背景技术

常染色体隐性遗传性多囊肾病(autosomal recessive polycystic kidneydisease，ARPKD)是一种表现为双侧肾脏肿大和肝纤维化的肝肾纤维囊性疾病。ARPKD主要是由致病基因多囊肾和肝病1(polycystic kidney and hepatic disease 1，PKHD1)突变引起的，PKHD1基因编码一个单次跨膜受体样蛋白——纤维囊(fibrocystin/polycystin，FPC)。FPC包括一个跨膜结构域、一个广泛高度糖基化的胞外N端结构域和C端胞质尾部。

研究表明，FPC可能作为一个膜受体样蛋白，将细胞外的信号通过结合与调节TRPP2(PKD2)钙离子介导的通道传递到细胞内，调控体内各管道上皮细胞分化、增殖、极化和移行，从而促成各种生理管道的形成。但是，FPC的确切功能及PKHD1基因突变导致ARPKD的具体发病机制目前尚不清楚。因此，为了深入研究该基因对疾病发展的机制，有许多研究构建了PKHD1基因突变的动物模型。然而，目前大部分PKHD1敲除的小鼠模型没有ARPKD表型，且只有一个大鼠模型呈现了肾脏表型。传统的CRISPR/Cas9技术常用于单个或多个基因的插入和敲除，而应用于至少18kb长片段基因的删除还未成熟。同时，小型猪由于与人类的相似性而成为最重要的实验动物之一。它们体积小巧，易于操作。它们与人的生理和解剖学相似性很高，因此广泛用于疾病模型研究以及异种移植。为此，本发明在小型猪上开展PKHD1敲除的实验，希望建立一种可以高效、准确、有效地删除PKHD1的方法，以期获得具有ARPKD表型的动物疾病模型。这对研究该基因在哺乳动物中的功能，以及猪的育种都具有重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9系统的高效长片段删除载体，其包括根据sgRNA靶位点设计的至少靶向18，000bp的长片段基因；这种载体可以高效、便捷地实现长片段基因的删除，同时减少对转染细胞的损伤。

本发明的第一个目的是提供一种用于敲除PKHD1长片段基因的sgRNA组合，所述sgRNA组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的序列。其中：

SEQ ID NO.1为gRNA3：5'-CTTCTTTGATAACCCTGCCC-3'；

SEQ ID NO.2为gRNA5：5'-CCTGCCTTTGTCTCCGGAGA-3'。

本发明的第二个目的是提供含有所述sgRNA组合的重组表达载体。

本发明的第三个目的是提供一种用于基因PKHD1敲除的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括所述sgRNA组合的表达框和Cas9核酸酶表达框。

本发明的第四个目的是提供一种经过所述基因编辑系统处理的重组细胞。

进一步地，使用所述基因编辑系统敲除成纤维细胞中的基因PKHD1。

进一步地，所述重组细胞PKHD1基因中的序列由编辑前的SEQ ID NO.3变为编辑后的SEQ ID NO.4-6之一。

野生型序列：

SEQ ID NO.3：

TTATAGGAGACTTCTTTGATAACCCTGCCCAGGCCTGCCTTTGTCT CCGGAGATGGGCGTGTTCTC；

删除后序列：

SEQ ID NO.4：

TTATAGGAGACTTCTTTGATAACCCTGAGATGGGCGTGTTCTC；

SEQ ID NO.5：

TTATAGGAGACTTCTTTGATGTTCTC；

SEQ ID NO.6：

TTATAGGAGACTTCTTTGATAACCCGGAGACAAAGGCAGGAGGACAATCTGATGAACCAGCACTGAGGAGTTCACAGGAGGTGGCTGGATGGGCGTGTTCTC。

本发明的第五个目的是提供一种体内或体外敲除基因PKHD1的方法，采用所述基因编辑系统进行敲除。

进一步地，体外指对细胞进行基因敲除。

本发明的第六个目的是提供一种PKHD1基因敲除模型，包括所述重组细胞。

本发明的第七个目的是提供所述sgRNA组合、重组表达载体、基因编辑系统、重组细胞或PKHD1基因敲除模型在常染色体隐性遗传性多囊肾病相关生物医药研究中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过对gRNA靶点进行筛选，发现在靶向PKHD1外显子10起始处和PKHD1外显子19末端处的一段序列时可以实现高效的PKHD1长片段(>18，000bp)基因删除，有助于ARPKD相关研究的开展及机制的探索。

附图说明

图1为pX459质粒示意图。

图2为PKHD1基因示意图和F1/R1、F2/R2引物位置示意图。

图3为pX459-gRNA-1/2/3/4/5/6质粒示意图。

图4为不同gRNA组合敲除效率验证结果。

图5为部分细胞的基因型鉴定结果。

图6为克隆点长片段删除示意图。

图7为冻存前的细胞汇合状态。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：基因删除载体的构建

使用的载体是U6启动子驱动的gRNA克隆载体pX459(见图1)。我们设计了靶向猪基因座两端的gRNA，其中gRNA1(5'-CTATCTGTGTTTCCAGAAAC-3')、gRNA2(5'-TGGGGGAAGAACAGACATCA-3')、gRNA3(5'-CTTCTTTGATAACCCTGCCC-3')分别靶向PKHD1外显子10起始处的序列5'-GTTTCTGGAAACACAGATAG-3'、5'-TGATGTCTGTTCTTCCCCCA-3'、5'-GGGCAGGGTTATCAAAGAAG-3'；gRNA4(5'-CAGTGCTGGTTCATCAGATT-3')、gRNA5(5'-CCTGCCTTTGTCTCCGGAGA-3')、gRNA6(5'-GGAGATGGGCGTGTTCTCTG-3')分别靶向PKHD1外显子19末端处序列5'-AATCTGATGAACCAGCACTG-3'、5'-CCATCTCCGGAGACAAAGGC-3'、5'-CCACAGAGAACACGCCCATC-3'。

见图2。

首先利用BbsI限制性内切酶将pX459载体线性化，然后利用引物gDNA-PKHD1-F1：5'-caccgCTATCTGTGTTTCCAGAAAC-3'和gDNA-PKHD1-R1：5'-aaacGTTTCTGGAAACACAGATAGc-3'退火来构建pX459-gRNA-1载体；利用引物gDNA-PKHD1-F2：5'-caccgTGGGGGAAGAACAGACATCA-3'和gDNA-PKHD1-R2：5'-aaacTGATGTCTGTTCTTCCCCCAc-3'退火来构建pX459-gRNA-2载体。利用引物gDNA-PKHD1-F3：5'-caccgCTTCTTTGATAACCCTGCCC-3'和gDNA-PKHD1-R3：5'-aaacGGGCAGGGTTATCAAAGAAGc-3'退火来构建pX459-gRNA-3载体。利用引物gDNA-PKHD1-F4：5'-caccgCAGTGCTGGTTCATCAGATT-3'和gDNA-PKHD1-R4：5'-aaacAATCTGATGAACCAGCACTGc-3'退火来构建pX459-gRNA-4载体。利用引物gDNA-PKHD1-F5：5'-caccgCCTGCCTTTGTCTCCGGAGA-3'和gDNA-PKHD1-R5：5'-aaacTCTCCGGAGACAAAGGCAGGc-3'退火来构建pX459-gRNA-5载体。利用引物gDNA-PKHD1-F6：5'-caccgGGAGATGGGCGTGTTCTCTG-3'和gDNA-PKHD1-R6：5'-aaacCAGAGAACACGCCCATCTCCc-3'退火来构建pX459-gRNA-6载体。pX459-gRNA-1/2/3/4/5/6的示意图见图3。

实施例2：不同gRNA组合敲除效率的检验

将猪成纤维细胞复苏到6孔板中并传代，最终拥有6个孔进行电转的效率验证。待细胞汇合度到80％，使用Lonza 4D-Nucleofector对PFFs进行电转染，每个孔电转染的质粒为两个pX459-gRNA的组合，分别为3μgpX459-gRNA-1与3μg pX459-gRNA-4、3μg pX459-gRNA-1与3μgpX459-gRNA-5、3μg pX459-gRNA-1与3μg pX459-gRNA-6、3μgpX459-gRNA-2与3μg pX459-gRNA-4、3μg pX459-gRNA-2与3μgpX459-gRNA-5、3μg pX459-gRNA-2与3μgpX459-gRNA-6、3μgpX459-gRNA-3与3μg pX459-gRNA-4、3μg pX459-gRNA-3与3μgpX459-gRNA-5、3μg pX459-gRNA-3与3μg pX459-gRNA-6，上述在后文中分别用gRNA1+4、gRNA1+5、gRNA1+6、gRNA2+4、gRNA2+5、gRNA2+6、gRNA3+4、gRNA3+5、gRNA3+6(实施例3：猪胎儿成纤维细胞的培养，转染；无筛选步骤)，3天后，利用Genomic DNA Purification Kit(EZBioscoence)提取基因组DNA，然后使用高保真聚合酶(Thermo Fisher Scientific)进行PCR检测。检测长片段基因被删除的引物为F1：5'-GCTTACCTTCTTTTCTCCTCTTGC-3'和R1：5'-ACTAGGACTATTGAGACCAACTGT-3'；检测长片段基因未被删除的引物为F2：5'-TGCTACAGCAACTGGCAGAA-3和R2：5'-TGGTGGCCCCATCACAATAC-3。F1/R1位于设计的gRNA1和gRNA2位点两侧，中间为长片段PKHD1的外显子10至外显子19的基因片段；而F2/R2是根据PKHD1基因上约231bp的片段设计的引物。若长片段PKHD1基因未被删除，由于F1/R1引物扩增跨度过大而不能对模版进行完整的扩增以致无特异性条带，而使F2/R2引物能扩增出一定大小的特异性条带，如gRNA1+4(320bp)、gRNA1+5(281bp)、gRNA1+6(266bp)、gRNA2+4(335bp)、gRNA2+5(296bp)、gRNA2+6(281bp)、gRNA3+4(382bp)、gRNA3+5(343bp)、gRNA3+6(328bp)。若长片段PKHD1基因被删除，使用F1/R1引物能扩增出的特异性条带，而使用F2/R2引物则无特异性条带。PKHD1基因示意图和F1/R1、F2/R2引物位置示意图见图2(同实施例4：检测基因修饰和外源基因整合)。核酸电泳的照片用Fiji软件进行灰度值分析。核酸电泳结果发现，用gRNA1+5、gRNA3+5、gRNA3+6进行效率验证时，使用F2/R2引物有肉眼可见的扩增条带，且gRNA3+5敲除效率最高，约为23.97％，故后续使用该gRNA组合进行正式的基因敲除实验。效率验证的核酸电泳图见图4，其中M为Marker即蛋白分子量标准，-表示阴性对照组，WT表示野生型组。gRNA1+3表示用pX459-gRNA-1与pX459-gRNA-3或gRNA1质粒共转染PFFs细胞进行基因编辑，其他同上。F1/R1，F2/R2表示分别用F1/R1，F2/R2引物对基因编辑后的细胞DNA进行PCR扩增，条带为扩增结果。

实施例3：猪胎儿成纤维细胞的培养，转染和筛选

猪胎儿成纤维细胞(PFFs)是从32天大的雄性中国实验用小型猪胚胎中分离出来的。这些原代细胞在含20％胎牛血清(FBS,Gibco)的高葡萄糖Dulbecco's Medium Eagle培养基(Gibco,Gaithersburg,DEME,USA)中培养。

所有动物实验均根据中国动物保护和协议委员会制定的指南进行，并得到浙江大学实验动物福利委员会(中国浙江省)的批准。

使用Lonza 4D-Nucleofector进行3μg pX459-gRNA-3与3μgpX459-gRNA-5对PFFs的转染。转染前一天，将PFFs解冻并培养。然后使用电转试剂82μL PS solution和18μLsupplement在参数DO-113下进行转染，转染约1×10⁶PFFs细胞。由于pX459-gRNA-3和pX459-gRNA-5载体均携带Puro^R抗性，故后续筛选采用puromycin抗生素。转染24h后，使用单克隆有限稀释法进行细胞筛选：将细胞按照50cells/孔铺于96孔板中。24h后，将细胞在含3μg/mL的puromycin，20％ FBS的DEME中培养3天后更换无puromycin的含20％ FBS的DEME培养基直至单个细胞克隆点生长。然后选择单个细胞克隆点并在24孔板中培养。当24孔板中出现克隆点后，消化转入6孔板中继续培养，剩余的少量细胞于24孔板中继续生长，后续进行基因组提取以鉴定突变。待转入6孔板中的细胞达到汇合时进行冷冻保存，可以用于后续的体细胞核移植操作。

实施例4：检测基因修饰和外源基因整合

利用Genomic DNA Purification Kit(EZBioscoence)提取基因组DNA，然后使用高保真聚合酶(Thermo Fisher Scientific)进行PCR检测。检测长片段基因被删除的引物为F1：5'-GCTTACCTTCTTTTCTCCTCTTGC-3'和R1：5'-ACTAGGACTATTGAGACCAACTGT-3'；检测长片段基因未被删除的引物为F2：5'-TGCTACAGCAACTGGCAGAA-3和R2：5'-TGGTGGCCCCATCACAATAC-3。

纯水用作阴性对照。阳性细胞克隆点若为纯合子，使用F1/R1进行PCR扩增时有343bp的条带，而在使用引物F2/R2进行PCR扩增时无条带；阳性细胞克隆点若为杂合子，使用F1/R1和F2/R2引物进行PCR扩增分别出现343bp和231bp的条带。筛选的细胞基因型鉴定见图5，其中M为蛋白分子标准量，-为阴性对照组，其他为需要进行基因型鉴定细胞样品编号(均为PFFs)。从结果中看出，B1、B2、B3、C1为PKHD1基因长片段删除杂合子，即PKHD1^+/-。值得注意的是，B2细胞使用F1R1引物扩增时在250-500bp之间有两条目的条带，暗示B2细胞非单克隆而是多个不同基因型细胞长成。

经过3天左右筛选，鉴定10个克隆点中至少存在4个正确的长片段删除克隆点，基因型为PKHD1^+/-，删除率为40％。克隆点冻存后用作体细胞核移植供体细胞。野生型PKHD1基因座序列为5'-TTATAGGAGACTTCTTTGATAACCCTGCCCAGG—//—CCTGCCTTTGTCTCCGGAGATGGGCGTGTTCTC-3'。经过测序，几个克隆点删除后位点序列为：5'-TTATAGGAGACTTCTTTGATAACC CTGAGATGGGCGTGTTCTC-3'；5'-TTATAGGAGACTTCTTTGATGTTCTC-3'；5'-TTATAGGAGACTTCTTT GATAACCCGGAGACAAAGGCAGGAGGACA ATCTGATGAACCAGCACTGAGGAGTTCACAGGAGGTGGCTGGATGGGCGTGTTCTC-3'。4个阳性克隆点长片段删除的示意图见图6。阳性克隆点冻存前的细胞汇合状态见图7。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种用于敲除PKHD1长片段基因的sgRNA组合，其特征在于，所述sgRNA组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的序列。

2.含有权利要求1所述sgRNA组合的重组表达载体。

3.一种用于基因PKHD1敲除的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述sgRNA组合的表达框和Cas9核酸酶表达框。

4.一种经过权利要求3所述基因编辑系统处理的重组细胞。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞包括动物细胞。

6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，使用基因编辑系统敲除成纤维细胞中的基因PKHD1。

7.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞PKHD1基因中的序列由编辑前的SEQ ID NO.3变编辑为SEQ ID NO.4-6之一。

8.一种体内或体外敲除基因PKHD1的方法，其特征在于，采用权利要求3所述基因编辑系统进行敲除。

9.一种PKHD1基因敲除模型，其特征在于，包括权利要求4-7任一项所述的重组细胞。

10.权利要求1所述sgRNA组合、权利要求2所述重组表达载体、权利要求3所述基因编辑系统、权利要求4-7任一项所述重组细胞或权利要求9所述PKHD1基因敲除模型在常染色体隐性遗传性多囊肾病相关生物医药研究中的应用。