CN113637616B - 一株耐盐促生微杆菌及其应用和基于其的活菌制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株在盐碱环境下可以促进油菜耐盐，增加油菜组织亚油酸含量和降低芥子酸含量的根际微杆菌，属于生物技术领域。本发明经过如下方法得到：保藏号为CGMCC No.22803的菌株N1分离自中国西藏盐碱地，通过在无氮Ashby培养基上培养初步鉴定该菌株具有生物固氮能力，基于形态学和16Sr RNA序列的系统发育关系，将该菌株鉴定为微杆菌属细菌(Microbacterium sp.)。栽培试验研究表明，供试油菜根际接种了N1菌株后，其生物量、根长及株高明显优于对照组；菌株N1共培养能显著诱导植株积累多种氨基酸、可溶性糖类耐渗透压物质，并显著增加亚油酸含量和降低芥子酸含量。该菌株在植物促生微生态菌剂及油菜功能菌肥开发方面具有广泛的应用价值。

Description

一株耐盐促生微杆菌及其应用和基于其的活菌制剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株耐盐根际促生微杆菌及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是制约我国农业发展的关键因素之一。据报道，我国盐碱地约1亿公顷，其中盐碱耕地达920万公顷。盐碱土渗透压增大、土体通透性和透水性变差以及土壤养分有效性降低，造成植物生理干旱、危害作物生长发育和产量，甚至导致植株大面积死亡，造成森林和草原退化，加剧荒漠化，对生态系统危害极大。而微生物菌剂能活化并促进植物对营养元素的吸收，提高作物耐盐性和产量。因此微生物菌剂是改良盐碱地的有效手段之一。

目前，已报道多种微生物具有提高植物耐盐的作用，如解钾菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus MZ4)、解磷菌链霉菌(Streptomyces sp.H29)、产生长素菌粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis JBCS1294)、耐Pb促生菌芽孢杆菌(Bacillus sp.YM.1)。在盐碱土壤中，这些微生物的生长以及生物活性会受到氮素匮乏的限制。固氮菌能通过生物固氮作用有效增加土壤肥力，明显促进土壤菌群的活性以及调控植物生长发育。有报道显示，从甘蔗组织中分离到的一株内生固氮泛菌属细菌(Pantoea sp.NN08200)能高效固氮并促进甘蔗的生长；有研究发现，从野生水稻中分离的克雷伯氏固氮菌(Klebsiella variicolaCX24)，具有较高的固氮酶活性和溶磷性，具有分泌生长素和产铁载体能力，能够有效促进水稻种子的萌发和植株生长。这表明固氮菌在促进植物生长方面具有显著优势。目前所报道的植物促生固氮菌多来自于普通环境。在盐碱土壤中，施加从普通环境分离的固氮促生菌，其生物活性往往受高盐离子的抑制。因此，从盐碱土壤中分离筛选耐(嗜)盐促生固氮菌在增强植物耐盐逆境及修复盐碱化土壤方面具有更广阔的应用前景。

油菜是重要的油料作物。甘蓝型油菜是油用油菜中籽粒产量最高的种类，在中国南北各地区均有大量种植，也是我国重要的经济农作物。甘蓝型油菜不仅可生产食用油，而且其饼粕富含蛋白质，也可作为动物饲料。该油菜品种虽具有一定的抗逆性，但其种子萌发期和苗期生长对土壤盐度比较敏感，在中高盐浓度土壤中种植该品种油菜时，易出现种子萌发率低以及缺苗现象。

因此，挖掘促进盐碱地油菜生长的耐(嗜)盐微生物功能菌株，在提高油菜耐盐性及改善菜籽油品质方面具有潜在应用前景，在促进油菜种植及改良盐碱土壤等方面具有重要意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株促进盐碱地植物生长的细菌菌株及应用和基于其的活菌制剂。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种耐盐促生微杆菌，其分类命名为微杆菌属Microbacterium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年6月30日，保藏号为CGMCCNo.22803。

所述耐盐促生微杆菌是由中国西藏盐碱荒漠采集的盐碱化土壤制成的稀释液在Ashby培养基上，32℃恒温培养2-3d，分离纯化得到。

本发明还公开了耐盐促生微杆菌在提高油菜耐盐性、改善菜籽油品质，以及促进盐碱地油菜功能菌肥方面的应用。

优选地，通过将所述耐盐促生微杆菌与萌发后的油菜种子共培养来提高油菜种子的耐盐能力。

进一步优选地，共培养包括以下步骤：

1)用5％NaClO对油菜种子进行浸泡消毒；

2)将消毒后的油菜种子接种到1/2MS培养基上，于22℃暗培养2d，获得萌发的无菌苗；

3)将步骤2)得到的萌发的无菌苗转入Ashby无氮培养基培养的N1菌悬液中，在120rpm，22℃条件下共培养6h，再转接到含灭菌蛭石的组培瓶中培养。

进一步优选地，步骤3)中，所述灭菌蛭石中包含1/2MS培养基和120mmol/L NaCl；所述组培瓶中培养的温度为22℃，培养相对湿度为70％，培养光照条件为2000Lx强度下光照培养16h，转入黑暗培养8h。

优选地，所述的耐盐促生微杆菌能够增加油菜茎叶组织中的亚油酸含量、降低反式芥子酸含量。

本发明还公开了耐盐促生微杆菌作为有效成分的活菌制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种耐盐促生微杆菌属菌株N1，命名为Microbacterium sp.N1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.22803。该耐盐促生微杆菌属菌株自中国西藏盐碱土中分离获得。

本发明提供的根际耐盐促生微杆菌属菌株为耐(嗜)盐固氮菌，具有生物固氮作用。盐碱土壤栽培试验研究表明，油菜根际接种了N1菌株的试验组植株在盐胁迫下其生物量、根长、株高明显优于未接种N1菌株的对照组油菜植株；代谢组研究发现，同对照组相比，实验组植株的组织中显著积累多种氨基酸、可溶性糖类耐渗透压物质，并显著增加亚油酸含量和降低芥子酸含量。因此，本发明提供的菌株N1在提高油菜耐盐性，促进油菜生长及改善菜籽油品质方面具有潜在应用前景，在开发盐碱地农作物生长的微生态菌剂和油菜功能菌肥方面具有良好的应用前景。

保藏说明

本发明对所述的微杆菌属菌株N1进行了下述保藏：

保藏时间：2021年6月30日；保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No.22803。

附图说明

图1为本发明微杆菌N1的电子显微形态图；

图2为本发明菌株N1的16Sr RNA基因NJ系统发育树；

图3为本发明油菜植株茎长对比图；

图4为本发明油菜植株根长对比图；

图5为本发明油菜植株株高对比图；

图6为本发明油菜植株鲜重对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明的促生微杆菌属菌株分离自中国西藏盐碱土中。耐盐促生微杆菌属菌株(Microbacterium sp.N1)，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点：中国，北京。中国科学院微生物研究所，邮编为：100101，保藏编号：CGMCC No.22803。

本发明的油菜耐盐促生微杆菌，通过在无氮Ashby培养基上培养，初步鉴定该菌株具有生物固氮能力，基于形态学和16Sr RNA序列的系统发育关系，将该菌株鉴定为微杆菌属(Microbacterium sp.)。

本发明获得的油菜促生固氮菌经如下具体步骤得到：

1.菌株的分离

将从中国西藏盐碱荒漠采集的盐碱化土壤制成10^-1-10^-3稀释液。在无菌台中取200μl上述土壤悬液涂布于Ashby培养基上，32℃恒温培养2-3d，分离纯化菌株。

2.菌株的形态学鉴定

菌株N1在Ashby液体培养基中30℃、160r/min培养至OD₆₀₀为0.8，离心收集菌体，用电镜固定液固定细胞，用梯度乙醇溶液对固定的细胞进行脱水，用乙酸异戊酯置换2次，离心收集菌体并置于冻干燥机中进行冷冻干燥；取少许干燥细胞于导电胶上，经离子溅射喷金后，对菌株细胞的大小、形状特征进行扫描电镜观察。在扫描电子显微镜下，幼龄培养物中细胞呈细长、不规则的杆菌，单个或成对，有的排列成V字形，平均大小为(0.5-1.0)μm-(1.0-5.0)μm。菌株N1在Ashby无氮平板上的菌落较大，透明至半透明菌落，菌落形状不规则，边缘光滑。其电子显微形态图如图1所示。

3.菌株的分子生物学鉴定

⑴将纯化的菌株N1接种于LB斜面培养基中，置于32℃恒温培养2-3d，无菌环境下收集细胞培养物。

⑵采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，DNA溶于40μl TE缓冲液中，于-20℃保存备用。

⑶使用细菌16Sr RNA通用引物序列：

27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；

以该细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。

⑷扩增后得到的片段，经电泳验证后，做胶纯化。

⑸纯化后的PCR产物送由上海生工生物工程有限公司进行双向测序，利用Mega 5构建16Sr RNA基因的NJ系统发育树，如图2所示。

根据16Sr RNA的系统发育关系分析，确定该菌株N1为微杆菌属(Microbacterium)细菌。

在步骤1)中所用到的培养基的组成：

加水定容至1L，pH7.2-7.5；121℃灭菌30min。

在步骤2)中所用到的培养基的组成：

加水定容至1L，pH7.0-7.5；121℃灭菌30min。

4.菌株N1对油菜植株促生检测

利用瓶栽试验对菌株N1促生性进行评价。

实施例1：油菜种子表面消毒

选择颗粒饱满的油菜种子，用5％NaClO对种子进行浸泡消毒5min，再用无菌水冲洗5–6次。将表面消毒的种子接种到1/2MS培养基表面，于22℃暗培养2d，获得萌发的无菌苗。

实施例2：菌株N1-油菜共培养试验

萌发后的油菜种子转入到Ashby无氮培养基培养的ZM96菌悬液中，于120rpm，22℃共培养6h(对照组油菜种子接种到无菌Ashby液体培养基中震荡培养)，最后分别将上述植物种子转接到含50g灭菌蛭石(加入60mL的1/2MS+120mmol/L NaCl)的组培瓶中培养(温度22℃，相对湿度70％，16h光照培养(2000Lx)/8h黑暗培养)。每个组培瓶中均匀种植10粒种子，实验组和对照组各10个重复。

实施例3：试验结果记录分析

每天观察记录油菜的长势，培养20d后收集植株并测定植株根长、株高及生物量，取其平均值绘制出柱状图，如图3～6所示，盐碱土壤栽培试验研究表明，油菜根际接种了N1菌株的试验组植株在盐胁迫下其生物量、根长及株高明显优于未接种N1菌株的对照组油菜植株。

实施例4：油菜组织的差异代谢物检测

取100mg油菜茎段于2mL EP管中，加入0.4mL甲醇/氯仿提取液(V/V＝3:1)和适量瓷珠，研磨仪(45Hz)处理4min，于冰浴上超声处理5min。样本于4℃和12000rpm离心15min。取0.4mL上清液于2mL进样瓶中，真空干燥提取物，向干燥的代谢物中加入40μL甲氧胺盐试剂，混匀后放入烘箱中80℃孵育30min。向每个样品中加入60μL BSTFA(含有1％TMCS,v/v)，将混合物置于70℃孵育1.5h，冷却至室温，向混合的样本中加入5μL饱和脂肪酸甲酯标准混合液。利用GC-MS检测代谢物，用ChromaTOF软件(V 4.3x，LECO)和LECO-Fiehn Rtx5数据库对质谱数据进行分析，结果如表1所示：

表1.菌株N1诱导油菜植株的差异代谢物分析(试验组和对照组相比)

从表1中可以看出，代谢组研究发现，同对照组相比，实验组植株的组织中显著积累多种氨基酸、可溶性糖类耐渗透压物质，并显著增加亚油酸含量和降低芥子酸含量。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种耐盐促生微杆菌，其特征在于，该耐盐促生微杆菌的分类命名为微杆菌属Microbacterium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年6月30日，保藏号为CGMCC No.22803。

2.权利要求1所述的耐盐促生微杆菌在提高油菜耐盐性和改善菜籽油品质方面的应用，其特征在于，提高油菜耐盐性是通过将耐盐促生微杆菌与萌发后的油菜种子共培养来提高油菜种子的耐盐能力；改善菜籽油品质是耐盐促生微杆菌能够增加油菜茎叶组织中的亚油酸含量、降低反式芥子酸含量。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，共培养包括以下步骤：

1）用5%NaClO对油菜种子进行浸泡消毒；

2）将消毒后的油菜种子接种到1/2 MS培养基上，于22℃暗培养2 d，获得萌发的无菌苗；

3）将步骤2）得到的萌发的无菌苗转入Ashby无氮培养基培养的权利要求1所述的耐盐促生微杆菌菌悬液中，在120 rpm，22℃条件下共培养6 h，再转接到含灭菌蛭石的组培瓶中培养。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3）中，所述灭菌蛭石中包含1/2MS培养基和120 mmol/L NaCl；所述组培瓶中培养的温度为22°C，培养相对湿度为70%，培养光照条件为2000 Lx强度下光照培养16 h，转入黑暗培养8 h。

5.一种以权利要求1所述的耐盐促生微杆菌作为有效成分的活菌制剂。