CN113122503B

CN113122503B - 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113122503B
Application number: CN202011609666.9A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 袁鹏飞; 牛立超; 付建强; 吴兰兰
Original assignee: Edigene Biotechnology Inc
Current assignee: Edigene Biotechnology Inc
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN113122503A

Abstract

本发明涉及一种新型的制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR‑T细胞的制备方法及通过该方法制备的通用型CAR‑T细胞以及包含该通用型CAR‑T细胞的生物制品。本申请靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR‑T细胞的制备方法包括从淋巴系统健康的人类供体获得T细胞，之后通过基因编辑技术破坏所述T细胞中TRAC基因组区域和B2M基因组区域，使靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子在所述T细胞中稳定表达。通过本申请的制备方法制备的靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR‑T细胞消除了T细胞的天然TCR表达，大大减低了移植物抗宿主反应，同时也大大减低了自身的免疫原性，能够持续、高效杀伤T细胞淋巴瘤细胞。

Description

一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及治疗T细胞淋巴瘤的通用型CAR-T的制备技术以及由此制备技术制备的通用型CAR-T细胞及其用途。

背景技术

恶性肿瘤已成为严重威胁身体健康和生命安全的疾病，肿瘤的治愈一直是人类的梦想。近年来，肿瘤免疫疗法获得了广泛的关注，尤其是CAR-T(Chimeric AntigenReceptor T Cells)技术的出现使得对肿瘤的控制得到了里程碑式的发展。从1989年CAR-T技术首次应用，到2012年宾夕法尼亚大学Carl June教授带领团队治愈的EmilyWhitehead，再到2017年FDA肿瘤药物专家咨询委员会(ODAC)以10∶0的压倒优势投票结果一致推荐批准诺华CAR-T药物CTL019用于青少年晚期B细胞急性淋巴性白血病(r/rAll)治疗。

一般地，传统的CAR-T技术T细胞主要来源于患者自身，在GMP环境下经过体外分离T细胞、激活、CAR导入、培养扩增，最后经过质控回输回患者体内。但由于T系淋巴细胞白血病患者本身T细胞发生癌变，无法用于CAR-T细胞治疗，同时患者在病危的情况下，对于其他细胞的制备也没有足够的等待时间。这些问题给CAR-T技术的广泛应用带来了局限性，因此目前CAR-T细胞治疗的一个重要研究方向是如何使用一个健康献血者的T细胞制备大量的CAR-T细胞，满足患者的临床使用。这一技术的建立将为T细胞淋巴瘤患者提供一种治疗方法，并且极大降低CAR-T疗法的成本，可以更好的保证统一制备的细胞质量，患者在需要时可以马上得到CAR-T细胞治疗。

在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过题述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。

发明内容

本发明涉及一种新型的制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的制备方法及通过该方法制备的通用型CAR-T细胞以及包含该通用型CAR-T细胞的生物制品。通过本申请的制备方法制备的靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞无天然TCR的表达，大大减低了移植物抗宿主反应。同时，由于所述T细胞中B2M基因的敲除，也大大减低和消除了I类HLA蛋白的表达，降低了T细胞的自身免疫原性。通过本申请方法制备的通用型CAR-T细胞，能够持续、高效杀伤T细胞淋巴瘤细胞，同时移植物抗宿主反应大大减低，增加了使用的安全性。

因此，一个方面，本发明首次公开了以TCRα/β为靶点制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的方法，具体地本申请提供了以下各项：

1.一种制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的方法，该方法包括：

1)从淋巴系统健康的人类供体获得T细胞；

2)通过基因编辑技术破坏所述T细胞中：

(i)TRAC基因组区域；和

(ii)B2M基因组区域；

3)使靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子在所述T细胞中稳定表达。

在一些实施方案中，本申请的制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的方法还包括

4)培养从步骤3)获得的细胞适当时间，以清除仍然表达天然TCR的T细胞。所述适当时间为例如3-21、4-18、5-16、6-14、7-12、8-10天，以使表达所述CAR的细胞消除仍然表达天然TCR的T细胞。

2.根据项1的方法，还包括培养从步骤3)获得的细胞适当时间，以清除仍然表达天然TCR的T细胞。

3.如项1或2所述的方法，其中，所述TRAC基因组区域包括人第14号染色体第23016448位至第23016490位的基因组区域，并且所述B2M基因组区域包括人第15号染色体第45003745位至第45003788位的基因组区域。

4.如项1-3中任一项所述的方法，其中，所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的胞外区为与T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的胞外区结合的scFv分子。

5.如项4所述的方法，其中CAR分子包含由接头连接的如下序列：

所述scFv的轻链可变区SEQ ID NO：19

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK；

所述scFv的重链可变区SEQ ID NO：20

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA。

6.如项5所述的方法，其中，所述接头为包含(G)n(S)m的氨基酸序列，其中，n为1-20的正整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20；m为1-10的正整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。

7.如项6所述的方法，其中所述接头序列为SEQ ID NO：21所示的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

8.如项1-7任一项所述的方法，其中，所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

9.如项8所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。

10.如项9所述的方法，其中：

(i)靶向TRAC基因组的向导RNA(sgRNA)具有选自SEQ ID NOs：2-5中任一项的序列；和/或

(ii)靶向B2M基因组的向导RNA(sgRNA)具有选自SEQ ID NOs：6-13中任一项的序列。

11.如项10所述的方法，其中，将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

12.如项10或11所述的方法，其中所述sgRNA是经过化学修饰的。

13.如项12所述的方法，其中所述化学修饰包括2’-O-甲基修饰或核苷酸间3’硫代修饰。

14.如项13所述的方法，其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端三个碱基和3’端三个碱基的2’-O-甲基修饰和核苷酸间3’硫代修饰。

15.如项12-14任一项所述的方法，其中，通过电转方式将所述sgRNA与编码Cas9的mRNA核苷酸序列共同导入所述T细胞。

16.如项15的方法，其中，所述电转条件选自如下条件中的任一项：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；和250V，0.5ms。

17.如项1-16中任一项所述的方法，其中所述TRAC和B2M分别被敲除的效率为90％、95％、96％、97％、98％、99％以上，同时被敲除的效率在75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、以上。

18.如项1-17任一项所述的方法，其中，将编码所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的核苷酸序列通过病毒转染的方式导入到所述T细胞中。

19.如项18所述的方法，其中病毒为腺相关病毒(AAV)或慢病毒。

20.如项1-17任一项所述的方法，其中通过同源重组方式将表达所述CAR分子的核苷酸序列导入该T细胞的TRAC基因位点，使编码所述CAR分子的核苷酸序列在TCR基因启动子调控下在所述TRAC基因位点表达。

21.如项1-20任一项所述的方法，其中培养从步骤3)获得的细胞3-21天，以清除仍然表达天然TCR的T细胞。

22.一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞，该细胞表达靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子。

23.如项22的通用型CAR-T细胞，其中所述CAR分子包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。

24.如项22或23的通用型CAR-T细胞，其低水平表达或不表达选自以下的一项或多项蛋白：l类HLA蛋白、PD-1，TIM3，和LAG3。

25.包含如项22-24任一项的通用型CAR-T细胞的生物制品。

26.如项25的生物制品，其中98％、99％以上的所述通用型CAR-T细胞TCR阴性。在一些实施方案中，TCR98％、99％以上的所述通用型CAR-T细胞TCR和B2M阴性。

27.如项22-24任一项的通用型CAR-T细胞或项25或26的生物制品在制备治疗T细胞淋巴瘤的药物中的用途。

28.一种治疗T细胞淋巴瘤的方法，包括给药患T细胞淋巴瘤的受试者治疗有效量的如项22-24任一项所述的通用型CAR-T细胞或项25或26所述的生物制品。

附图说明

图1显示细胞电转后的生长活率，T细胞和UCAR-T细胞活率较好，并且随着培养时间的增长细胞活率达到90％以上，而U-CAR-T细胞在day5天的时候活率低于起始活率，由于CAR可以靶向TCR，因此在前期U-CAR-T细胞有“自杀”现象，因此活率较低，但随着时间的增长，活率逐渐升高，在培养到9天以后活率达到90％以上。

图2显示细胞电转后的生长情况，T cell增殖速度最快，U-T cell和U-CAR-T cell较慢，培养至12天，对U-T cell进行TCRα/β的纯化，其纯化回收率在40％左右。从而最终U-CAR-T cell的细胞数量要多余U-T cell。

图3展示了加入TCRα/β-CAR的DKO-T细胞经过培养后CAR表型分析。通过结果可以看出加入TCRα/β-CAR的DKO-T细胞经过培养后，其CAR的表达率为10％以上。

图4展示了利用经过优化的sgRNA及CRISPR/Cas9基因编辑技术，对T细胞进行TRAC/B2M(Double Knock-Out，DKO)的敲除结果分析。对sgRNA进行化学修饰，然后将化学修饰后的sgRNA与Cas9通过进一步优化后的电转条件递送到原代T细胞中进行相关基因敲除。结果如图所示，双基因即TRAC和B2M的敲除效率提高至84％。

图5展示了加入TCRα/β-CAR的DKO-T细胞经过培养后表型分析。通过结果可以看出加入TCRα/β-CAR的DKO-T细胞经过培养后，其TCRα/β阴性比例细胞不少于98％。

图6展示了T细胞、DKO-T及DKO CAR-T细胞杀伤功能的验证与结果比较。该实验中，以Jurkat为靶细胞T细胞、DKO-T及DKO CAR-T细胞为效应细胞，按照效靶比为10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1、0.625∶1进行体外杀伤实验。

图7展示了T细胞、DKO-T及DKO CAR-T细胞因子释放。该实验中，以Jurkat为靶细胞，T细胞、DKO-T及DKO CAR-T细胞为效应细胞，按照效靶比为10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1、0.625∶1进行体外共培养后，取上清对其中IFN-γ进行检测。

具体实施方式

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请在第一方面提供了制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的方法。

在一个具体实施方式中，提供了一种制备靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞的方法，该方法包括：

1)从淋巴系统健康的人类供体获得T细胞；

2)通过基因编辑技术破坏所述T细胞中：

(i)TRAC基因组区域；和

(ii)B2M基因组区域；

3)使靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子在所述T细胞中稳定表达；和

4)培养从步骤3)获得的细胞。

在本说明书的上下文中，T细胞来源于健康人。T细胞来源如脐带血，骨髓，或外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。在一些实施方案中，T细胞来源于干细胞，例如各个分化阶段的造血干细胞。本申请中所述的制备方法可以用于在例如PBMC或干细胞中敲除TRAC，B2M并进一步培养，分化，和/或提纯出相应的基因改造的T细胞。

本发明的CAR-T细胞中表达的CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。本文使用的术语″信号肽″是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(例如长度5-30个氨基酸)肽链。在本发明中，可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽，例如其氨基酸序列如发明专利申请US20140271635A1中所示。在一些实施方案中，所述绞链区可以使用各种不同抗体或抗原受体的铰链区，特别是CD分子的铰链区。在一个具体的实施方案中，所述铰链区可以选自CD8或CD28等蛋白的铰链区。所述CD8或CD28是T细胞表面的天然标记物。

在本发明中，可以使用各种人体内蛋白的跨膜区，特别是各种不同抗原受体的跨膜区。优选使用的跨膜区是CD分子的跨膜区。在一个实施方案中，所述跨膜区选自CD8蛋白的跨膜区。

在本发明中，所述铰链区为CD8 a铰链区(CD8-hinge)，其氨基酸序列如发明专利申请US20140271635A1中所示。

所述″胞外结合区″是指包含特异性识别靶抗原的区域。在一些实施方案中，该胞外结合区包含特异性识别靶肿瘤细胞表面抗原的区域。例如这个区域可以是scFv或其他抗体的抗原结合片段。本文使用的术语″scFv″是指通过连接区(linker)连接的重链可变区(variable region of heavy chain，VH和轻链可变区(variable region of lightchain，VL)的重组蛋白，连接区使得这两个结构域相关联，最终形成抗原结合位点。scFv通常是由一条核苷酸链编码的氨基酸序列。上述scFv还可以包括其衍生物。

本发明使用的CAR及其各结构域可通过单独或联合使用本领域己知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加，和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是公知的(参见例如，Sambrook分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。所述修饰优选在核酸水平上进行。

本文使用的术语″特异性识别″意指本发明的抗原识别区不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。

所述胞外结合区为特异性识别TCRα/β的抗原结合区域。

在本发明中，所述胞内信号区为CD137(4-1BB)蛋白的胞内信号区。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称ζ)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转化区。FcgRI y主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD137是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR-T细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。在某些实施方案中，由单独CAR产生的信号不足以完全活化天然T细胞，需要通过TCR起始抗原依赖性初次活化的序列(初级细胞内信号传导结构域)以及以不依赖于抗原的方式作用以提供共刺激信号的序列(共刺激性结构域)。初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初次活化。以刺激性方式作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。本发明中的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列为CD3ζ。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如活性相较于天然ITAM结构域有所改变(例如增加或降低)的突变的ITAM结构域，或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个或多个ITAM基序。

共刺激信号传导结构域是指TCR中包含共刺激分子细胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原高效反应所需的除抗原受体或其配体外的细胞表面分子。本发明的共刺激分子区域为4-1BB(CD137)。

“T细胞受体(TCR)”为所有T细胞表面的特征性标志，其与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2；而且任一T细胞只表达TCR2和TCR1之一。

“β2微球蛋白(B2M)”是细胞表面人白细胞抗原(HLA)的β链(轻链)部分，是分子质量为11800，由99个氨基酸组成的单链多肽。

如本申请使用的，“Indel”全称为插入/缺失，即插入和缺失突变。

“移植物抗宿主反应(GVHD)”是指由于供受体之间存在免疫遗传学差异，例如，一方面，当供体细胞，例如具有免疫活性的供体的T淋巴细胞，在进入受体病人体内并增殖到一定程度后，将受体病人的正常细胞或组织误认为靶标进行攻击从而产生的反应。另一方面，作为异体细胞，受体体内的正常免疫系统也可能会对其进行清除产生“宿主抗移植物反应(HVGR)”。

HVGR与GVHR相关基因包含TCR、HLA分子相关基因，这些基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)，因此可以称为“通用型T细胞”。例如，单个TRAC基因是编码TCRα链的基因与编码TCRβ的两个TRBC基因形成完整的有功能的TCR复合物，敲除TRAC是可以致使TCR失活，而B2M为MHCI相关基因。这两个基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。

“CAR-T”为“嵌合抗原受体T细胞”的简写形式，其中，嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别靶细胞(如肿瘤)抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。在一些实施中，靶向肿瘤的CAR的设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(例如，通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

“通用型CAR-T细胞”指能够靶向特异的靶细胞(如肿瘤)相关标志并且细胞表面TCR和MHC功能失活，可以降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的CAR-T细胞。

自体细胞的CAR-T治疗需要抽取血液分离病人自身T淋巴细胞制备，一方面由于病人T细胞发生癌变，无法用自身的T细胞进行CAR-T的制备或者在CAR-T细胞制备过程中若出现突发状况已准备细胞不能及时回输给病人也会影响治疗效果；可用于同种异体治疗的通用型CAR-T细胞在上述情况下便占有很大的优势。

过继细胞疗法(Adoptive cellular therapy，ACT)、过继免疫疗法(adoptiveimmunotherapy)，例如肿瘤过继免疫疗法(tumor adoptive immunotherapy)，是指将免疫细胞在体外处理，例如加入特异性抗原，对免疫细胞表达的分子进行改造或利用细胞因子对其进行刺激等方法，筛选并大量扩增具有高度特异性的靶细胞(如肿瘤)杀伤性免疫效应细胞，然后输给患者，杀灭靶细胞(如肿瘤)的一种治疗方法，是一种被动免疫治疗。

“稳定表达”意指持续表达。转基因在宿主细胞中的稳定表达可通过稳定转染的方式，将目的基因整合到细胞染色体DNA中并指导适量目的蛋白的合成来实现。在稳定转染(例如通过病毒转染)的情况下，外源基因能够整合到细胞的基因组中，外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此实现稳定表达。

在另一具体实施方式中，所述TRAC基因组区域包括人第14号染色体第23016448位至第23016490位的基因组区域，并且所述B2M基因组区域包括人第15号染色体第45003745位至第45003788位的基因组区域。

在本说明书的上下文中，“基因组”符合分子生物学领域的一般定义，即指生物体所有遗传物质的总和。这些遗传物质可以包括DNA或RNA。

在再一具体实施方式中，所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的胞外区为与T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的胞外区结合的scFv分子。

在本说明书的上下文中，“scFv”即指单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker，即接头)连接而成的抗体。scFv分子可以理解为CAR分子的胞外部分，其由轻链可变区、接头和重链可变区共同组成。

在一个具体实施方式中，所述CAR分子包含由接头连接的如下序列：

scFv的轻链可变区SEQ ID NO：19

scFv的重链可变区SEQ ID NO：20

在又一具体实施方式中，所述接头为包含(G)n(S)m的氨基酸序列，其中，n为1-20的正整数，m为1-10的正整数。具体地，n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；而m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在此，G为甘氨酸的缩写形式，也可以简写为Gly；在此，S为丝氨酸的缩写形式，也可以简写为Ser。

在一个具体实施方式中，所述接头序列为SEQ ID NO：21所示的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

在又一具体实施方式中，所述CAR分子的氨基酸序列包含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列或由SEQ ID NO.14所示氨基酸序列组成。

在一个具体实施方式中，所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

在又一具体实施方式中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术。

如本申请使用的，“CRISPR/Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统，如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359中所描述的系统和方法。

在又一具体实施方式中，本申请的CRISPR/Cas9方法使用：

(i)靶向TRAC基因组的向导RNA(sgRNA)具有选自SEQ ID NOs：2-5中任一项的序列；和

在本发明中，“sgRNA(single guide RNA)”和“gRNA(guide RNA)”或可以是“单指导RNA”、“合成的指导RNA”或“指导RNA”可互换使用。本发明的sgRNA包含靶向目标序列的指导序列(guide sequence)。

一般而言，sgRNA中的指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies，ELAND((Illumina，San Diego，CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度可以为约或大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度少于约75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指导序列指导CR1SPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定方法评估。例如，可向具有相应靶序列的宿主细胞提供足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组件(包括待测试的指导序列)，如可通过使用编码CRISPR序列组件的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割来进行。同样地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物(包含待测试的指导序列和不同于指导序列的对照指导序列)的组件，并比较测试和对照指导序列在靶序列的结合或切割率，以此进行评估。也可以使用本领域技术人员知道的其它测定方法进行上述测定和评估。

在又一具体实施方式中，将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

在一个具体实施方式中，通过电转方式将所述sgRNA与编码Cas9的mRNA核苷酸序列共同导入所述T细胞。

具体地，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或Cas9编码核苷酸(如mRNA)通过电转导入该T细胞。在一些实施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和Cas9编码核苷酸通过电转方式共同导入T细胞。

具体地，所述Cas9编码核苷酸为mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸在病毒载体中，如慢病毒载体。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸包含如SEQ ID NO：1所述的序列。在一些实施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA与Cas9编码核苷酸在同一载体中。

具体地，所述电转条件选自如下条件中的任一项：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；和250V，0.5ms。

在本申请中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA同时导入T细胞。具体地，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA同时导入T细胞时，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA之间的量可以是近似的或等同的。在一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA以任何合适的顺序逐一导入T细胞。在一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA与Cas9编码核苷酸同时导入T细胞。在一些实施方案中，Cas9编码核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA导入T细胞。具体地，T细胞包含Cas9编码核苷酸或Cas9蛋白。

在本申请中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除。例如，在一些具体的实施方案中，本发明TCRα链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRAC-sg 2、3、4、6分子之一(具体见表1)。

表1

在一个具体实施方式中，所述sgRNA是经过化学修饰的。

在又一具体实施方式中，所述化学修饰包括2’-O-甲基修饰或核苷酸间3’硫代修饰。

在再一具体实施方式中，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端和3’端三个碱基的2’-O-甲基修饰和核苷酸间3’硫代修饰。

除了实施例中使用的具体的化学修饰之外，还包括采用其它的修饰方法，例如，Deleavey GF1，Damha MJ.Designing chemically modified oligonucleotides fortargeted gene silencing.Chem Biol.2012 Aug 24；19(8)：937-54，以及Hendel etal.Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in humanprimary cells.Nat Biotechnol.2015 Sep；33(9)：985-989文献中报道的化学修饰方法。

本发明将经过化学修饰的sgRNA与Cas9编码基因共同电转进入T细胞，产生高效的基因编辑效率(如，以TCRα/β-/B2M-％表示)，其中sgRNA的化学修饰是本发明中的关键因素之一。实施例中的数据显示，如果和Cas9 mRNA一起电转的是未经化学修饰的sgRNA，其Indels效率远远低于电转经化学修饰的sgRNA时获得的基因编辑效率。在一个具体实施方式中，所述TRAC和B2M分别被敲除的效率为90％、92％、94％、96％、98％以上，同时被敲除的效率在75％、80％、85％以上。

“敲除效率”可以在基因水平上以产生基因敲除的INDEL的效率来表示，也可以在细胞水平上以所述基因敲除致使该基因表达蛋白消失或显著降低的细胞的百分比来表示。在本发明中，“敲除效率”是指基于后者计算的敲除效率。本领域技术人员可以理解，高的敲除效率可以提高目的细胞的收获率，降低生产成本和治疗成本。

具体地，基因编辑的T细胞(如通用T细胞)被进一步筛选，以得到更高纯度的双基因(TRAC和B2M)敲除T细胞。例如，可通过FACS筛选TRAC，B2M表达量低的基因编辑的T细胞(如通用T细胞)。

具体地，本发明的通用型T细胞的TCR和\或HLA基因被敲除。在一些具体的实施方案中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除。B2M的编码区被敲除。

在一个具体实施方式中，将编码所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的核苷酸序列通过病毒转染的方式导入到所述T细胞中进行稳定表达。具体地，所述病毒为腺相关病毒(AAV)或慢病毒。

在一些具体实施方式中，伴随步骤4)的培养过程，表达天然TCR的T细胞被清除。在本申请中，此清除过程也称作“纯化”，是传统的使用磁珠对U(通用型)CAR-T细胞进行纯化的方法的替代方案。通过该方法进行纯化，不需要额外的纯化步骤，不损失细胞，同时也减少时间和成本。

本申请在第二方面涉及靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞。

在一个具体实施方式中，提供了一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞，该细胞表达靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子，无天然TCR分子。在又一具体实施方式中，所述CAR分子包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。

在再一具体实施方式中，提供了上述通用型CAR-T细胞，其低水平表达或不表达选自以下的一项或多项蛋白：1类HLA蛋白、PD-1，TIM3，和LAG3。

在本说明书的上下文中，PD-1(程序性死亡受体1)也称为CD279(分化簇279)，是一种重要的免疫抑制分子。通过向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。通过敲除PD-1，TIM3，和/或LAG3基因可使T细胞低水平表达或不表达这些蛋白，从而减弱受试者对输入的外来T细胞的耐受性，减少对其的清除，从而延长CAR-T细胞在受试者体内存活和起作用的时间。

在一个具体实施方式提供了包含上述通用型CAR-T细胞的生物制品。

本申请在第三方面提供了通用型CAR-T细胞的用途。

在一个具体实施方式中，提供了上述通用型CAR-T细胞或生物制品在制备治疗T细胞淋巴瘤的药物中的用途。

在本说明书的上下文中，“T细胞淋巴瘤(T-cell lymphomas，TCL)”是由于T细胞异常增生出现的恶性肿瘤，属于非霍奇金淋巴瘤的特殊类型，发病率低，但恶性程度高，患者的一年生存率较低。本病的临床表现为淋巴结肿大，抵抗力低下，高钙血症，骨骼溶蚀性病症等。T细胞淋巴瘤大致分为两类：前T细胞肿瘤和胸腺后T细胞淋巴瘤，可原发于淋巴结、结外组织或皮肤。具体实例例如间变性大细胞淋巴瘤(Anaplasticlarge cell lymphoma，ALCL)和外周T细胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphomas，PTCL)。与侵袭性B细胞淋巴瘤相比，成熟或外周T细胞淋巴瘤的预后较差。起源于固有免疫系统的外周T细胞淋巴瘤好发生于青少年，多为结外受累，好发部位为皮肤和黏膜，而起源于其他免疫系统的外周T细胞淋巴瘤则好发于成年人，多为淋巴结受累，占PTCL的2/3以上。

在又一具体实施方式中，上述用途包括：给药患T细胞淋巴瘤的受试者治疗有效量的上述通用型CAR-T细胞或生物制品。

本发明涉及的CAR-T细胞可以通过给药包含细胞成分的医药制品常规使用的途径，例如静脉输注途径，给药有此需要的受试者。给药剂量可以基于受试者的病情和一般健康状况具体确定。

在进行扩增和基因修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”意图包括能够引起免疫反应的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤(T细胞淋巴瘤除外)。本发明的T细胞还可来源于各个分化阶段的造血干细胞。在定向分化培养条件下，造血干细胞向T细胞分化。在本发明的某些方面，可以使用本领域中可得到的多种T细胞系。

在本发明的某些方面，T细胞可以使用熟练技术人员已知的多种技术，如FicollTM分离从受试者收集的血液获得。也可以通过单采血液成分术(apheresis)从个体的循环血获得细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞及血小板。在一个方面，可以对通过单采血液成分术收集的细胞进行洗涤以去除血浆部分并将细胞放入适当缓冲液或介质中用于后续加工步骤。

可以通过将红细胞溶解并例如经PERCOLL^TM梯度离心或逆流离心淘选耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离出T细胞。特定T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+及CD45RO+T细胞可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。举例来说，在一个方面，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(例如3×28)偶联珠粒，如DYNABEADS^TMM-450CD3/CD28T一起孵育一段足以对所希望的T细胞进行阳性选择的时间来分离。可以从肿瘤组织分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过提述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。

实施例

实施例1：通用型T细胞的制备

通用型CAR-T细胞的制备和扩增

从人外周血分选获得T细胞，利用细胞因子对分选后的T细胞进行激活，然后用T细胞培养基将细胞密度调至1X10⁶个细胞/mL。72h后观察细胞的状态，收集细胞悬液，以300g离心7min，弃上清，用DPBS溶液(生产商：Gibco；货号：1924294)清洗2遍，然后用电转试剂培养基将细胞密度调至2.5X10⁷个细胞/mL。使用合成的Cas9 mRNA及合成的sgRNA，将T细胞和RNA混合，使其最终浓度达到每100μL中含2.5X10⁶个细胞和2μgRNA(Cas9 mRNA和sgRNA各2μg)，然后利用电转仪BTX Agile pulse MAX将RNA导入细胞中后进行培养。每天观察细胞的生长状况，每隔一天进行细胞计数补液，在第4天按照MOI＝2-10的比例加入包装有CAR(具体序列参见以下)(抗TCRα/βscFv、链接区(Linker)、CD8 alpha铰链区(CD8alpha hinge)、CD8跨膜区(CD8 transmemberane domain)、4-11BB信号区(4-11BB signaling domain)及CD3 zeta，具体结构参见US20140271635A1)的慢病毒。

细胞在扩增培养过程中的活率检测结果如图1所示。在细胞培养前期，第4-8天左右，U-CAR-T(导入了靶向TCRα/β的CAR的通用型T细胞)加入活率不好，因为细胞可以自我杀伤仍然表达天然TCRa/β的T细胞，但后期细胞活率与其他两组无明显差异。图2所示，细胞在培养到13天后扩增的倍数。由于加入CAR的细胞进行自我杀伤，所以扩增倍数不如其他对照组。但U-T需要进一步纯化，导致最后收获细胞数低于不需要纯化的通用型CAR-T。

在细胞扩增培养的过程中，用流式细胞技术仪器监测CAR的表达比例，结果分别如图3所示，CAR的阳性率约12.76％。经过化学修饰后的RNA做基因敲除，其编辑效率稳定且高效，如图4中为T敲除TCR和B2M的细胞进行流式检测，双基因敲除效率为84.95％。而加入靶向TCRα/β的CAR的双基因敲除T细胞，如图5所示，其TCR和B2M的阴性率大于98％，进一步消除了表达TCR和B2M的细胞，起到了进一步的纯化的效果，简化了工艺，节省了时间和成本，同时获得了更多的细胞。

通用型U-T细胞的筛选

用如下方法筛选TCR和B2M阴性、CD4和CD8阳性的T细胞。

利用免疫磁珠技术筛选出TCR和B2M阴性，同时CD4和CD8阳性的T细胞，并通过T细胞存活率监测被编辑后的T细胞状态，具体步骤如下：

第一步，在第12-14天将电转后的T细胞收集，400G，离心5min，弃上清，用Easybuffer把细胞定容为1X10⁸/ml，然后把细胞转移至5ml流式管中，利用筛选磁珠去除掉T细胞中仍表达TCR、B2M的细胞，筛选得到终产品即通用型T细胞。

第二步，取少量T细胞，进行流式检测，同时染TCR和B2M细胞表面生物标记物，如果TCR和/或B2M阳性率＜1％，即可进行下一步工作。在本实施例中，TCR阳性率为1％，TCR和B2M DKO的T细胞阳性率＜0.79％。

实施例2：由实施例1得到的通用型CAR-T的功能验证

观察实施例1得到的通用型CAR-T细胞(即效应细胞)对T细胞型急性淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用。

一、对特异性肿瘤细胞的体外杀伤作用

本发明实验步骤如下：

第一步：靶细胞标记

使用CELL TRACE^TM Far Red Cell Proliferation Kit(生产商：Gibco；货号：1888569)标记靶细胞(人淋巴瘤细胞Jurkat，所有细胞来自ATCC)。

1.将Cell TraceTM Far Red Ccll Proliferation用双蒸水稀释成1mmol溶液；

2.取1X10⁶个靶细胞400g离心5分钟后去上清；

3.加入Cell TraceTM Far Red Cell Proliferation溶液1μl，37℃、避光孵育20min。

4.将细胞加入T细胞培养基，37℃孵育5min。

5. 400g离心5分钟后去上清，标记完成。

第二步：效应细胞对靶细胞的杀伤检测

将标记好的靶细胞用R1640+10％FBS培养液按照2X10⁵个细胞/mL的密度重悬，取500μL加入到48孔板中。按照适当的效靶比(2.5∶1、1.25∶1、0.6∶1)，每孔加入500μL效应细胞，同时以T细胞和健康人脐血CAR-T细胞(在T细胞培养到第2天时，以MOI＝2-10的比例加入包装有CAR(具体结构参见US20140271635A1)的慢病毒制得的CAR-T作为对照细胞，每组3个平行，设计单独的靶细胞组，检测其死亡率；37℃、5％CO2培养12-16h，400g离心5min，取细胞沉淀，用150μl用DPBS(生产商：Gibco；货号：1924294)重悬。利用PI(生产商：Sigma；货号：P4170)染色后，用流式细胞仪检测靶细胞死亡率，结果如图6所示，通用型CAR-T表现出高效特异性杀伤作用。同时对非特异性靶细胞的几乎无杀伤功能。

第三步：细胞因子释放的ELISA检测

将标记好的靶细胞用RPMI 1640+10％FBS按照2X10⁵个/mL的密度重悬，取500μL加入到48孔板中。按照适当的效靶比(10∶1)每孔加入500μL效应细胞，同时以T细胞和健康人脐血CAR-T作为对照细胞，每组3个平行，设计单独的靶细胞组，37℃、5％CO2培养12-16h，每孔取培养上清100μl，400g离心5min去沉淀，取上清后利用LEGEND MAX^TMHuman IL-2/IFN-gama(生产商：Biolegend；货号分别为：431807、430108)试剂盒，根据使用说明检测因子释放。结果请见图7。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

序列表

SEQ ID No.1：Cas9 mRNA序列

TRAC-sg 2(T2)序列：SEQ ID NO：2

TRAC-sg 3(T3)序列：SEQ ID NO：3

TRAC-sg 4(T4)序列：SEQ ID NO：4

TRAC-sg 6(T6)序列：SEQ ID NO：5

B2M-sg 1(B1)序列：SEQ ID NO：6

B2M-sg 2(B2)序列：SEQ ID NO：7

B2M-sg 3(B3)序列：SEQ ID NO：8

B2M-sg 4(B4)序列：SEQ ID NO：9

B2M-sg 5(B5)序列：SEQ ID NO：10

B2M-sg 6(B6)序列：SEQ ID NO：11

B2M-sg 7(B7)序列：SEQ ID NO：12

B2M-sg8(B8)序列：SEQ ID NO：13

抗TCRα/β的scFv的氨基酸序列：SEQ ID NO：14

其中，带下划线的部分为接头(即Linker)序列。

CD8 alpha铰链区的核苷酸序列：SEQ ID NO：15

CD8跨膜区的核苷酸序列：SEQ ID NO：16

4-11BB信号区的核苷酸序列：SEQ ID NO：17

CD3 zeta的核苷酸序列：SEQ ID NO：18

抗TCRα/β的scFv的轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：19

抗TCRα/β的scFv的重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：20

连接scFv的轻链可变区和重链可变区的接头的氨基酸序列：SEQ ID NO：21

序列表

<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司

<120> 一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T及其制备方法和应用

<130> PD01318

<141> 2020-12-28

<150> 2019113975801

<151> 2019-12-30

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4101

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9 mRNA序列

<400> 1

gacaagaagu acagcaucgg ccuggacauc ggcaccaacu cugugggcug ggccgugauc 60

accgacgagu acaaggugcc cagcaagaaa uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcccug cuguucgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggcuga agagaaccgc cagaagaaga uacaccagac ggaagaaccg gaucugcuau 240

cugcaagaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaguccu uccuggugga agaggauaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 360

aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gagaaagaaa 420

cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu aucuggcccu ggcccacaug 480

aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 540

gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc uacaaccagc uguucgagga aaaccccauc 600

aacgccagcg gcguggacgc caaggccauc cugucugcca gacugagcaa gagcagacgg 660

cuggaaaauc ugaucgccca gcugcccggc gagaagaaga auggccuguu cggcaaccug 720

auugcccuga gccugggccu gacccccaac uucaagagca acuucgaccu ggccgaggau 780

gccaaacugc agcugagcaa ggacaccuac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcccag 840

aucggcgacc aguacgccga ccuguuucug gccgccaaga accuguccga cgccauccug 900

cugagcgaca uccugagagu gaacaccgag aucaccaagg ccccccugag cgccucuaug 960

aucaagagau acgacgagca ccaccaggac cugacccugc ugaaagcucu cgugcggcag 1020

cagcugccug agaaguacaa agagauuuuc uucgaccaga gcaagaacgg cuacgccggc 1080

uacauugacg gcggagccag ccaggaagag uucuacaagu ucaucaagcc cauccuggaa 1140

aagauggacg gcaccgagga acugcucgug aagcugaaca gagaggaccu gcugcggaag 1200

cagcggaccu ucgacaacgg cagcaucccc caccagaucc accugggaga gcugcacgcc 1260

auucugcggc ggcaggaaga uuuuuaccca uuccugaagg acaaccggga aaagaucgag 1320

aagauccuga ccuuccgcau ccccuacuac gugggcccuc uggccagggg aaacagcaga 1380

uucgccugga ugaccagaaa gagcgaggaa accaucaccc ccuggaacuu cgaggaagug 1440

guggacaagg gcgcuuccgc ccagagcuuc aucgagcgga ugaccaacuu cgauaagaac 1500

cugcccaacg agaaggugcu gcccaagcac agccugcugu acgaguacuu caccguguau 1560

aacgagcuga ccaaagugaa auacgugacc gagggaauga gaaagcccgc cuuccugagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccau cguggaccug cuguucaaga ccaaccggaa agugaccgug 1680

aagcagcuga aagaggacua cuucaagaaa aucgagugcu ucgacuccgu ggaaaucucc 1740

ggcguggaag aucgguucaa cgccucccug ggcacauacc acgaucugcu gaaaauuauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caaugaggaa aacgaggaca uucuggaaga uaucgugcug 1860

acccugacac uguuugagga cagagagaug aucgaggaac ggcugaaaac cuaugcccac 1920

cuguucgacg acaaagugau gaagcagcug aagcggcgga gauacaccgg cuggggcagg 1980

cugagccgga agcugaucaa cggcauccgg gacaagcagu ccggcaagac aauccuggau 2040

uuccugaagu ccgacggcuu cgccaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugaccuuua aagaggacau ccagaaagcc cagguguccg gccagggcga uagccugcac 2160

gagcacauug ccaaucuggc cggcagcccc gccauuaaga agggcauccu gcagacagug 2220

aagguggugg acgagcucgu gaaagugaug ggccggcaca agcccgagaa caucgugauc 2280

gaaauggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaaug 2340

aagcggaucg aagagggcau caaagagcug ggcagccaga uccugaaaga acaccccgug 2400

gaaaacaccc agcugcagaa cgagaagcug uaccuguacu accugcagaa ugggcgggau 2460

auguacgugg accaggaacu ggacaucaac cggcuguccg acuacgaugu ggaccauauc 2520

gugccucaga gcuuucugaa ggacgacucc aucgacaaca aggugcugac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgugccc uccgaagagg ucgugaagaa gaugaagaac 2640

uacuggcggc agcugcugaa cgccaagcug auuacccaga gaaaguucga caaucugacc 2700

aaggccgaga gaggcggccu gagcgaacug gauaaggccg gcuucaucaa gagacagcug 2760

guggaaaccc ggcagaucac aaagcacgug gcacagaucc uggacucccg gaugaacacu 2820

aaguacgacg agaaugacaa gcugauccgg gaagugaaag ugaucacccu gaaguccaag 2880

cugguguccg auuuccggaa ggauuuccag uuuuacaaag ugcgcgagau caacaacuac 2940

caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc gucgugggaa ccgcccugau caaaaaguac 3000

ccuaagcugg aaagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3060

aucgccaaga gcgagcagga aaucggcaag gcuaccgcca aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu uuuucaagac cgagauuacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccu 3180

cugaucgaga caaacggcga aaccggggag aucguguggg auaagggccg ggauuuugcc 3240

accgugcgga aagugcugag caugccccaa gugaauaucg ugaaaaagac cgaggugcag 3300

acaggcggcu ucagcaaaga gucuauccug cccaagagga acagcgauaa gcugaucgcc 3360

agaaagaagg acugggaccc uaagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuau 3420

ucugugcugg ugguggccaa aguggaaaag ggcaagucca agaaacugaa gagugugaaa 3480

gagcugcugg ggaucaccau cauggaaaga agcagcuucg agaagaaucc caucgacuuu 3540

cuggaagcca agggcuacaa agaagugaaa aaggaccuga ucaucaagcu gccuaaguac 3600

ucccuguucg agcuggaaaa cggccggaag agaaugcugg ccucugccgg cgaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcccu gcccuccaaa uaugugaacu uccuguaccu ggccagccac 3720

uaugagaagc ugaagggcuc ccccgaggau aaugagcaga aacagcuguu uguggaacag 3780

cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucuccaa gagagugauc 3840

cuggccgacg cuaaucugga caaagugcug uccgccuaca acaagcaccg ggauaagccc 3900

aucagagagc aggccgagaa uaucauccac cuguuuaccc ugaccaaucu gggagccccu 3960

gccgccuuca aguacuuuga caccaccauc gaccggaaga gguacaccag caccaaagag 4020

gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac acggaucgac 4080

cugucucagc ugggaggcga c 4101

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TRAC-sg 2 (T2)序列

<400> 2

gcugguacac ggcaggguca 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TRAC-sg 3 (T3) 序列

<400> 3

cucucagcug guacacggca 20

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TRAC-sg 4 (T4)序列

<400> 4

auuuguuuga gaaucaaaau 20

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TRAC-sg 6 (T6)序列

<400> 5

ucucucagcu gguacacggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 1(B1) 序列

<400> 6

acucucucuu ucuggccugg 20

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 2(B2) 序列

<400> 7

gaguagcgcg agcacagcua 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 3(B3) 序列

<400> 8

cgcgagcaca gcuaaggcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 4(B4)序列

<400> 9

ucacgucauc cagcagagaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 5(B5) 序列

<400> 10

gcuacucucu cuuucuggcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 6(B6) 序列

<400> 11

uuugacuuuc cauucucugc 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg 7(B7)序列

<400> 12

cgugaguaaa ccugaaucuu 20

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B2M-sg8(B8)

<400> 13

cucgcgcuac ucucucuuuc 20

<210> 14

<211> 246

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗TCRα/β的scFv的氨基酸序列

<400> 14

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr Val Met

145 150 155 160

His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

165 170 175

Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ala

245

<210> 15

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8 alpha 铰链区的核苷酸序列

<400> 15

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8跨膜区的核苷酸序列

<400> 16

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4-11BB信号区的核苷酸序列

<400> 17

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 18

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD3 zeta的核苷酸序列

<400> 18

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗TCRα/β的scFv的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 19

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 20

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗TCRα/β的scFv的重链可变区的氨基酸序列

<400> 20

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 连接scFv的轻链可变区和重链可变区的接头的氨基酸序列

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

Claims

1)从淋巴系统健康的人类供体获得T细胞；

2)通过基因编辑技术破坏所述T细胞中：

(i)TRAC基因组区域；和

(ii)B2M基因组区域；

3)使靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子在所述T细胞中稳定表达；

其中，所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的胞外区为与T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的胞外区结合的scFv分子；

其中，所述CAR分子包含由接头连接的如下序列：

所述scFv的轻链可变区SEQ ID NO：19

所述scFv的重链可变区SEQ ID NO：20

2.根据权利要求1的方法，还包括培养从步骤3)获得的细胞适当时间，以清除仍然表达天然TCR的T细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述TRAC基因组区域包括人第14号染色体第23016448位至第23016490位的基因组区域，并且所述B2M基因组区域包括人第15号染色体第45003745位至第45003788位的基因组区域。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述接头为包含(G)n(S)m的氨基酸序列，其中，n为1-20的正整数，m为1-10的正整数。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述接头序列为SEQ ID NO：21所示的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。

8.如权利要求7所述的方法，其中:

9.如权利要求8所述的方法，其中，将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

10.如权利要求8或9所述的方法,其中所述sgRNA经过化学修饰。

11.如权利要求10所述的方法,其中所述化学修饰包括2’-O-甲基修饰或核苷酸间3’硫代修饰。

12.如权利要求11所述的方法,其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端三个碱基和3’端三个碱基的2’-O-甲基修饰和核苷酸间3’硫代修饰。

13.如权利要求10-12任一项所述的方法,其中，通过电转方式将所述sgRNA与编码Cas9的mRNA核苷酸序列共同导入所述T细胞。

14.如权利要求13的方法，其中，所述电转条件选自如下条件中的任一项：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；和250V，0.5ms。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述TRAC和B2M分别被敲除的效率为90％以上，同时被敲除的效率在75％以上。

16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中，将编码所述靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子的核苷酸序列通过病毒转染的方式导入到所述T细胞中。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述病毒为腺相关病毒(AAV)或慢病毒。

18.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中，通过同源重组方式将表达所述CAR分子的核苷酸序列导入所述T细胞的TRAC基因位点，使编码所述CAR分子的核苷酸序列在TCR基因启动子调控下在所述TRAC基因位点表达。

19.如权利要求1-18任一项所述的方法，其中培养从步骤3)获得的细胞3-21天，以清除仍然表达天然TCR的T细胞。

20.一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的通用型CAR-T细胞，该细胞表达靶向T细胞淋巴瘤细胞TCRα/β的CAR分子，其中所述CAR分子包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，所述通用型CAR-T细胞低水平表达或不表达选自以下的一项或多项蛋白：TCRα/β、1类HLA蛋白、PD-1，TIM3，和LAG3。

21.包含如权利要求20所述的通用型CAR-T细胞的生物制品，其中98％或99％以上的所述通用型CAR-T细胞为TCR阴性。

22.如权利要求20所述的通用型CAR-T细胞或权利要求21所述的生物制品在制备治疗T细胞淋巴瘤的药物中的用途。