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CN113121689B - Ctla-4结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性CTLA‑4结合分子以及含有所述CTLA‑4结合分子的免疫缀合物、组合物。本发明还涉及编码所述CTLA‑4结合分子的核酸及包含其的宿主细胞，以及制备所述CTLA‑4结合分子的方法。此外，本发明涉及这些CTLA‑4结合分子的治疗和诊断用途。特别地，本发明涉及这些CTLA‑4结合分子与其它疗法，例如治疗方式或治疗剂的联合治疗。

Description

CTLA-4结合分子及其用途
本发明涉及特异性CTLA-4结合分子以及含有所述CTLA-4结合分子的免疫缀合物、组合物。此外，本发明涉及编码所述CTLA-4结合分子的核酸及包含其的宿主细胞，以及制备所述CTLA-4结合分子的方法。本发明还涉及这些CTLA-4结合分子的治疗和诊断用途，特别地，本发明还涉及这些CTLA-4结合分子与其它疗法，例如治疗方式或治疗剂的联合治疗。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)，又称CD152，是一种白细胞分化抗原。作为免疫球蛋白超家族成员中的一种跨膜蛋白质，主要表达于活化的T淋巴细胞和B细胞表面。
在T细胞表面表达的CTLA-4和T细胞表面的共刺激分子CD28具有高度的同源性，它们拥有相同的配体CD80(B7-1)或CD86(B7-2)，但CTLA-4以比CD28更大的亲和力和亲合力结合CD80和CD86。CTLA-4与CD80(B7-1)或CD86(B7-2)结合后形成的CTLA-4/CD80和/或CTLA-4/CD86复合物负调节T细胞受体信号传导，导致随后的T细胞活化的下调、抗肿瘤免疫活性的抑制和肿瘤的免疫逃逸。CTLA-4在许多癌症组织中过表达，所述癌症包括多种实体瘤，诸如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌等。活化的T淋巴细胞表面CTLA-4过表达可促进肿瘤侵袭，并且常常与不良预后相关。
单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单克隆抗体(150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。因此，需要开发新的分子量小的抗体分子。
单结构域抗体(single domain antibody,sdAb)是目前最小的抗体分子，其分子量是普通抗体的1/10。单结构域抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达、免疫原性弱、穿透性强、靶向性强、人源化简单，制备成本低廉等，几乎完美克服了传统抗体开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷。
目前现有技术中针对CTLA-4靶点的单结构域抗体药物不多，而且这些单结构域抗体药物的治疗效果也不甚理想。因此，本领域迫切需要开发新的包含有效针对CTLA-4的单结构域抗体的CTLA-4结合分子。
发明概述
本发明人通过锐意研究，开发了一组包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的CTLA-4结合分子，其能够
(1)以高亲和力结合CTLA-4，例如人CTLA-4，例如，所述CTLA-4结合分子与CTLA-4之间结合的Kd是约10-5M至约10-12M，优选地，约10-7M至约10-12M；
(2)有效阻断CTLA-4的相关活性，例如，有效阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合；
(3)有效诱导IL-2的分泌和TNF-α的分泌；且
(4)使T细胞保持活化状态。
因此，在第一方面，本发明提供了CTLA-4结合分子，其包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含三个互补决定区，分别为CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)CDR1包含选自SEQ ID NO:1、4、8和11中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:1、4、8和11中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体；
(b)CDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、9、12、14中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:2、5、9、12、14中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体；和
(c)CDR3包含选自SEQ ID NO:3、6、7、10、13中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:3、6、7、10、13中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体，
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，优选地，所述sdAb部分是骆驼科动物VHH、部分人源化的或完全人源化的VHH、嵌合的VHH。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个氨基酸变化的CDR3；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的不超过2个氨基酸变化的CDR3；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的不超过2个氨基酸变化的CDR3；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个氨基酸变化的CDR3；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:12的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的不超过2个氨基酸变化的CDR3；或
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个氨基酸变化的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如ATIFDRSVMX1所示的的CDR1、含有氨基酸序列如RITSGGNX2X3所示的CDR2和含有氨基酸序列如RGSVLLSX4YDY所示的CDR3,其中X1为A或者S；X2为I或者T；X3为Y或者N；X4为R或者Q。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:6的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的CDR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CDR2和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含从N端至C端顺次排列的四个构架区，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。所述顺次排列的四个构架区包含：
(i)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的FR4；
(ii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的FR4；
(iii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的FR4；
(iv)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的FR4；
(v)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示3的FR4；
(vi)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的FR4；
(vii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的FR4；
(viii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ IDNO:37所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ IDNO:60所示的FR4；
(ix)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的FR4；
(x)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的FR4；
(xi)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:56的所示FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的FR4；
(xii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的FR4；
(xiii)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ IDNO:62所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ IDNO:59的FR4；
(xiv)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的FR4；或
(xv)含有氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的FR1、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的FR2、含有氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的FR3和含有氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的FR4。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含
(i)SEQ ID NO:18-27中的任一氨基酸序列；或
(ii)与SEQ ID NO:18-27中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:28、29、30、31、32或33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子还在所述sdAb部分的N端或C端与免疫球蛋白的Fc区连接，例如与来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区连接。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子是双特异性或多特异性抗体，优选地，所述双特异性抗体分子与CTLA-4和PD-1或PD-L1结合，由此阻断或抑制CTLA-4与CD80和/或CD86的结合，并阻断或抑制PD-1和PD-L1的结合，由此使T细胞处于活化状态。
在第二方面，本发明提供了制备本发明的CTLA-4结合分子的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明的CTLA-4结合分子的核酸的条件下培养导入有编码本发明的CTLA-4结合分子的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，分离所述CTLA-4结合分子，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述CTLA-4结合分子。
在第三方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明的CTLA-4结合分子和其它物质，例如细胞毒性剂。
在第四方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的CTLA-4结合分子或免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的CTLA-4结合分子或免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选地药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、其他抗体(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)、细胞毒性剂。
在一些实施方案中，本发明提供了组合产品，其包含本发明的CTLA-4结合分子或免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体，优选地抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在第五方面，本发明提供了在受试者中预防或治疗受试者或个体肿瘤或感染性疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的CTLA-4结合分子、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品预防或治疗的肿瘤是癌症，例如具有升高的表达水平的CTLA-4的癌症；或者本发明的CTLA-4结合分子、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品预防或治疗的感染性疾病为例如细菌感染、病毒感染、真菌感染或原生动物感染，优选地所述感染性疾病是慢性感染，所述感染中升高的CTLA-4表达水平导致了受试者或个体的免疫力低下。
在第六方面，本发明提供了检测样品中CTLA-4的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的CTLA-4结合分子，用于实施以下步骤：
(a)将样品与本发明的CTLA-4结合分子接触；和
(b)检测所述CTLA-4结合分子和CTLA-4间的复合物的形成；任选地，所述CTLA-4结合分子是被可检测地标记的，
由此，判断来自受试者或个体的样品中是否存在升高的CTLA-4表达水平。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1A：显示了将多个抗CTLA-4VHH抗体分别以1:1、1:3、1:9稀释后，通过FACS方法检测它们与CTLA-4的特异性结合活性的结果。图中阴性对照为同种型对照(IsotypeCtrl)，是纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)，IPI是抗CTLA-4抗体伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写；SS320表示大肠杆菌SS320菌的空白对照；MFI表示平均荧光强度。
图1B和图1C：显示了将多个抗CTLA-4VHH抗体分别以1:1、1:6、1:36、1:216稀释后，通过FACS方法检测它们与CTLA-4的特异性结合活性的结果。图中同种型对照(IsotypeCtrl)是纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)，IPI是抗CTLA-4抗体伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写；仅细胞表示大肠杆菌SS320菌的空白对照；MFI表示平均荧光强度。
图2A和图2B：显示了实施例3筛选到的8个VHH分子分别与Fc融合后得到的8个VHH-Fc嵌合抗体对人CTLA-4CHO细胞上的CTLA-4的结合亲和力。图中同种型对照(IsotypeCtrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示人CTLA-4CHO细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图3A和图3B：通过FACS实验显示了实施例3筛选到的8个VHH分子与Fc融合后得到的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD80结合的阻断活性。图中同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示人CTLA-4CHO细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图4A和图4B：通过FACS实验显示了实施例3筛选到的8个VHH分子与Fc融合后得到的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD86结合的阻断活性。图中同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示人CTLA-4CHO细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图5A和图5B：显示了实施例3筛选到的8个VHH分子分别与Fc融合后得到的8个VHH-Fc嵌合抗体对猴CTLA-4CHO细胞上的猴CTLA-4的结合亲和力。图中同种型对照(IsotypeCtrl)均是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示猴CTLA-4CHO细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图6A：显示了实施例3筛选到的5个VHH分子分别与Fc融合后得到的5个VHH-Fc嵌合抗体对PBMC细胞激活后的IL-2分泌量的影响。在图中，同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示PBMC细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图6B：显示了实施例3筛选到的另外3个VHH分子分别与Fc融合后得到的3个VHH-Fc嵌合抗体对PBMC细胞激活后的IL-2分泌量的影响。在图中，同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示PBMC细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图7A：显示了实施例3筛选到的5个VHH分子分别与Fc融合后得到的5个VHH-Fc嵌合抗体对PBMC细胞激活后的TNFα分泌量的影响。在图中，同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示PBMC细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图7B：显示了实施例3筛选到的另外3个VHH分子分别与Fc融合后得到的3个VHH-Fc嵌合抗体对PBMC细胞激活后的TNFα分泌量的影响。在图中，同种型对照(Isotype Ctrl)是指纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)；仅细胞表示PBMC细胞的空白对照，图中对各VHH-Fc嵌合抗体仅用各自的VHH部分的克隆编号表示。
图8：通过FACS实验显示了人源化后的VHH-Fc嵌合抗体对人CTLA-4的结合亲和力，图中对NB25B-17-Fc嵌合抗体和NB25gb-1-Fc嵌合抗体分别仅用各自的VHH部分的克隆编号即NB25B-17和NB25gb-1表示。
图9：显示了使用FACS鉴定人源化后的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD80结合的阻断活性，图中对NB25B-17-Fc嵌合抗体和NB25gb-1-Fc嵌合抗体分别仅用各自的VHH部分的克隆编号即NB25B-17和NB25gb-1表示。
图10：显示了使用FACS鉴定人源化后的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD86结合的阻断活性，图中对NB25B-17-Fc嵌合抗体和NB25gb-1-Fc嵌合抗体分别仅用各自的VHH部分的克隆编号即NB25B-17和NB25gb-1表示。
图11：通过FACS实验显示了人源化后的VHH-Fc嵌合抗体对猴CTLA-4的结合亲和力，图中对NB25B-17-Fc嵌合抗体和NB25gb-1-Fc嵌合抗体分别仅用各自的VHH部分的克隆编号即NB25B-17和NB25gb-1表示。
发明详述：
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。优选地，本发明的抗体是单结构域抗体或重链抗体。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体(重链抗体)；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，人CTLA-4)中与抗体分子特异性相互作用的部分。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。在一个实施方案中，参照抗体是伊匹木单抗。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。在一个给定的重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(http://imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的AbM编号位置而确定。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体的CDR根据AbM编号方案确定位置。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区和CDR中的残基位置(包括重链可变区残基)时，是指根据AbM编号系统的编号位置。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“单结构域抗体”通常指这样的抗体，其中单个可变结构域(例如，重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)、衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、衍生自鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR))即可赋予抗原结合。即，该单个可变结构域不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的单结构域抗体(WO 2005/035572)。骆驼科的单结构域抗体在本申请中也称作“骆驼科动物VHH”，其仅由一个重链可变区组成，是从C端到N端仅包含一条链：FR4-CDR3-FR3-CDR2-FR2-CDR1-FR1的抗体，可由骆驼天然产生或由基因工程技术产生。单结构域抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文所用，术语“重链抗体(heavy-chain antibody,hcAb)”是指不具有轻链的抗体，从N端到C端可以包含VH-CH2-CH3，或包含VH-CH1-CH2-CH3；可以构成同型二聚体，例如不具有轻链的重链二聚体抗体。本发明的重链抗体中可以包含来自标准抗体的VH或者来自单结构域抗体的VH。例如，本发明的重链抗体中的VH可以就是单结构域抗体。
如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。多特异性抗体是对至少两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。
术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，骆驼抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始骆驼抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体中的所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“免疫检查点分子”意指免疫系统中存在的一类抑制性信号分子，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受(Pardoll DM.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.NatRev Cancer,2012,12(4):252-264)。研究发现，肿瘤细胞能够逃避体内免疫系统而失控增殖的原因之一是利用了免疫检查点分子的抑制性信号通路，由此抑制了T淋巴细胞活性，使得T淋巴细胞不能有效发挥对肿瘤的杀伤效应(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances intargeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev DrugDiscov,2013,12(2):130-146)。免疫检查点分子包括但不限于CTLA-4、程序性死亡1(PD-1)、PD-L2、LAG-3、TIM-3。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导T细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、OX40、GITR、4-1BB(即CD137)和/或CD27。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。
“免疫缀合物”是与一个或多个其他物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。
术语“抑制”或“阻断”是指使所给出分子(例如，免疫检查点分子)的某些参数(例如，活性)降低。例如，这个术语包括使得所给出的分子(例如，CTLA-4)被抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性的物质。因此，抑制作用不必是100％。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。例示性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应子功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。
“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
术语“有效量”指本发明的CTLA-4结合分子或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
术语“感染性疾病”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或者原生动物例如寄生虫感染。
术语“慢性感染”是指这样的感染，其中传染原(例如，病原体如病毒、细菌、原生动物例如寄生虫、真菌或诸如此类)已经在感染的宿主中诱导了免疫应答，但尚未如在急性感染过程中一样被从宿主中清除或消除。慢性感染可以是持续性的、潜伏性的或缓慢的。在一个实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子用于治疗由结核分枝杆菌(MTB)引起的慢性感染病－结核病。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接被标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体进行的第一抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。
“分离的”CTLA-4结合分子是指已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将CTLA-4结合分子纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“分离的编码CTLA-4结合分子的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码CTLA-4结合分子的链或其片段，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
如本文所用，术语“在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指导可以在通过引用方式并入的CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。该参考文献中描述了含水方法和非含水方法并且可以使用任一方法。在一些实施方案中，本文中提及的特异性杂交条件如下：1)低严格性杂交条件是在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃(对于低严格性条件，可以增加洗涤的温度至55℃)于0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严格性杂交条件是在约45℃于6X SSC中、随后在60℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件是在约45℃在6X SSC中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；并且优选地4)极高严格性杂交条件是在65℃于0.5M磷酸钠、7％SDS中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件和除非另外说明，否则应当使用的一个条件。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、载体(carrier)、赋形剂或稳定剂等。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物，包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂；抗代谢物；天然产物；抗生素；酶；杂类试剂；激素和拮抗剂；抗雌激素；抗雄激素；以及非类固醇抗雄激素等。化疗剂的例子参见WO2015/153513或WO2016/028672或WO2015/138920中所公开的那些。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包括免疫检查点分子抑制剂和共刺激性分子激活剂。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂例子参见WO2015/153513、WO2016/028672或WO2015/138920中所公开的那些。
术语“抗感染活性剂”包括在施用浓度和给药间隔下特异性抑制或消除微生物生长但对宿主不致命的任何分子，所述微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫。用于本文时，术语抗感染活性剂包括抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面中，抗感染活性剂在施用浓度和给药间隔对宿主是无毒的。
抗细菌的抗感染活性剂或抗细菌剂可广泛的分类为杀菌的(即，直接杀死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性剂可进一步再分类为窄谱抗细菌剂(即，仅影响小类细菌亚型，例如，革兰氏阴性等)或广谱抗细菌剂(即，影响广泛种类)。实例包括阿米卡星、庆大霉素、格尔德霉素、除莠霉素、莫匹罗星、呋喃妥因、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平/异福酰胺或替硝唑等。
术语“抗病毒剂”包括抑制或消除病毒生长、致病和/或存活的任何物质。这包括例如阿昔洛韦、西多福韦、齐多夫定、去羟肌苷(ddI，VIDEX)、扎西他滨(ddC，HIVID)、司他夫定(d4T，ZERIT)、拉米夫定(3TC，EPIVIR))、阿巴卡韦(ZIAGEN)、恩曲他滨(EMTRIVA)等。
术语“抗真菌剂”包括抑制或消除真菌生长、致病和/或存活的任何物质。这包括例如那他霉素、龟裂杀菌素、非律平、制霉菌素、两性霉素B、坎底辛、绿叶刺蕊草(patchouli)、印度楝树种子油(neem seed oil)、椰子油(Coconut Oil)等。
术语“抗原生动物剂”包括抑制或消除原生动物生物体(例如寄生虫)生长、发病和/或存活的任何物质。抗原生动物剂的实例包括抗疟疾试剂例如，奎宁、奎尼丁等。
示例性的抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂参见例如WO2010/077634等。抗感染活性剂还参见例如WO2014/008218、WO2016/028672或WO2015/138920。
术语“组合产品”是指一种剂量单位形式的固定组合或非固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以独立地在同一时间同时施用或在一定时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合的各治疗剂展示协作，例如，协同效应时。术语“固定组合”是指本发明的CTLA-4结合分子和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明的CTLA-4结合分子和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供了患者体内两种治疗剂的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的癌症或感染。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中，施用还包括以大致相同的时间，或在不同的时间以顺序的方式，使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
术语“载体(vector)”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
II.本发明的CTLA-4结合分子
本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分从N端至C端包含三个互补决定区，分别为CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)CDR1包含选自SEQ ID NO:1、4、8和11中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:1、4、8和11中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体；
(b)CDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、9、12、14中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:2、5、9、12、14中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体；和
(c)CDR3包含选自SEQ ID NO:3、6、7、10、13中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:3、6、7、10、13中的任一氨基酸序列的不超过2个氨基酸变化的变体，
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子结合哺乳动物CTLA-4，例如人CTLA-4、猴CTLA-4。例如，本发明的CTLA-4结合分子与CTLA-4上的表位(例如，线性或构象表位)特异性结合。在一些实施方案中，所述CTLA-4结合分子与CTLA-4的一个或多个胞外结构域结合。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子具有以下一个或多个特性：
(1)以高亲和力结合CTLA-4，例如人CTLA-4，例如，所述CTLA-4结合分子与CTLA-4之间结合的Kd是约10-5M至约10-12M，优选地，约10-7M至约10-12M；
(2)阻断CTLA-4的相关活性，例如，阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合；
(3)诱导IL-2和/或TNF-α分泌；
(4)使T细胞保持活化状态。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:12的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个氨基酸变化的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的不超过2个氨基酸变化的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个氨基酸变化的CDR3，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列ATIFDRSVMX1的CDR1、含有氨基酸序列RITSGGNX2X3的CDR2和含有氨基酸序列RGSVLLSX4YDY的CDR3,其中X1为A或者S；X2为I或者T；X3为Y或者N；X4为R或者Q。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2和含有氨基酸序列SEQ IDNO:6的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2和含有氨基酸序列SEQ IDNO:7的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:7的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:7的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:6的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:6的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR2和含有氨基酸序列SEQ IDNO:3的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：其中所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的CDR3。
又在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中的所述sdAb部分包含：所述sdAb部分从N端至C端包含四个构架区，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，其中：
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO37:的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的FR4；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO41:的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的FR4；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的FR4；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的FR4；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:46的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的FR4；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:47的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的FR4；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:47的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的FR4；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的FR4；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:54的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的FR4；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的FR4；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:56的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的FR4；(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的FR2、含有氨基酸序列SEQID NO:58的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的FR4；
(xiii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的FR4；
(xiv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的FR4；或
(xv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的FR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的FR2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:64的FR3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的FR4。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分是骆驼科动物VHH。在一些实施方案中，所述骆驼科动物VHH包含以下序列或由以下序列组成：
(i)SEQ ID NO:18-27中的任一氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:18-27中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:28、29、30、31、32或33的氨基酸序列；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:18-27中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子中包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分是部分人源化的或完全人源化的VHH、嵌合的VHH。用于使骆驼科动物VHH人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的方法，其内容通过引用完整并入本文作为参考(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience 13:1619-1633)。
在一些实施方案中，所述人源化的VHH
(i)包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32或33的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含与SEQ ID NO:28、29、30、31、32或33氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:28、29、30、31、32或33的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子在其sdAb部分的N端或C端与免疫球蛋白的Fc区连接，任选地，通过氨基酸接头连接，例如通过长度介于1与20个氨基酸之间的氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述氨基酸接头中有至少90％为甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1。在一些实施方案中，所述Fc区来自人IgG1。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸变化发生在VHH外的区域。在一些实施方案中，取代为保守性取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表1所示：
表1
原始残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
在某些实施方案中，本文中所提供的CTLA-4结合分子经改变以增加或降低其糖基化的程度。对CTLA-4结合分子的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。当CTLA-4结合分子包含Fc区时，可以改变与Fc区连接的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方案中，可在本文中所提供CTLA-4结合分子的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如本发明的CTLA-4结合分子治疗癌症或感染性疾病的有效性。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子是双特异性或多特异性抗体分子形式。在一个实施方案中，双特异性抗体分子具有针对CTLA-4的第一结合特异性和针对PD-1或PD-L1的第二结合特异性。在一个实施方案中，双特异性抗体分子与CTLA-4和PD-1结合。在另一个实施方案中，双特异性抗体分子与CTLA-4和PD-L1结合。多特异性抗体分子例如可以是三特异性抗体分子，其包含针对CTLA-4的第一结合特异性和针对以下一种或多种的分子的第二及第三结合特异性：PD-1、PD-L1、41BB、OX40或LAG-3。
III.免疫缀合物
本发明还涉及与其他物质缀合的CTLA-4结合分子(“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，其它物质是例如治疗剂(如细胞毒性剂)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素；生长抑制剂；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。
适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子还参见例如WO2015/153513或WO2015/138920等。
本发明的CTLA-4结合分子也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何CTLA-4结合分子或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:18-33中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:18-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。
本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸相比编码具有一个或多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸：包含编码选自SEQ ID NO:18-33中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQID NO:18-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pHEN1载体。
一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。
另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或293细胞。
V.本发明的CTLA-4结合分子的生产和纯化
在一个实施方案中，本发明提供了制备CTLA-4结合分子的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述CTLA-4结合分子的核酸的条件下培养包含编码所述CTLA-4结合分子的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述CTLA-4结合分子。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收CTLA-4结合分子。
为了重组产生本发明的CTLA-4结合分子，首先分离编码本发明CTLA-4结合分子的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明CTLA-4结合分子的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。
如本文所述制备的本发明的CTLA-4结合分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的CTLA-4结合分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
VI.本发明的CTLA-4结合分子的活性测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的CTLA-4结合分子鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的CTLA-4结合分子测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CTLA-4的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用SPR或生物膜层干涉测定本发明的CTLA-4结合分子对CTLA-4的结合。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的CTLA-4结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如对细胞表面CTLA-4(例如人CTLA-4、猴CTLA-4)的结合、对CTLA-4/CD80的结合或CTLA-4/CD86的结合的抑制作用、对IL-2和/或TNF-α分泌的促进作用等。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达CTLA-4或经改造而表达CTLA-4细胞系。所述经改造而表达CTLA-4细胞系是正常情况下不表达CTLA-4的、将编码CTLA-4的DNA转染入细胞之后表达CTLA-4的细胞系。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换CTLA-4结合分子来进行任何上述测定法。
VII.药物组合物和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何CTLA-4结合分子或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的CTLA-4结合分子或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，优选地抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)的组合。
在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
本发明还包括包含CTLA-4结合分子或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和/或包含编码CTLA-4结合分子的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的CTLA-4结合分子与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的CTLA-4结合分子的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗癌活性成分或抗感染活性成分，例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的CTLA-4结合分子的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VIII.组合产品或试剂盒
在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的CTLA-4结合分子或其抗原结合片段，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。在一些实施方案中，其它抗体例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症等。在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
在一些方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的CTLA-4结合分子、药物组合物、免疫缀合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的CTLA-4结合分子、药物组合物、免疫缀合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。
IX.本发明的CTLA-4结合分子的用途
在一个方面，本发明涉及调节个体中免疫反应的方法。该方法包括向对象施用有效量的本文公开的CTLA-4结合分子或包含所述CTLA-4结合分子的药物组合物或免疫缀合物或组合产品，从而调节对象中的免疫反应。在一个实施方案中，本文公开的治疗有效量的CTLA-4结合分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品恢复、增强、刺激或增加对象中的免疫反应。
在一些实施方案中，本发明涉及在个体中抑制CTLA-4的活性、阻断CTLA-4与CD80分子的结合、阻断CTLA-4与CD86分子的结合、诱导IL-2和/或TNF-α分泌的方法，该方法包括向对象施用有效量的本文公开的CTLA-4结合分子或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。
在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的肿瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的CTLA-4结合分子或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。
在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的CTLA-4结合分子或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。在一个实施方案中，感染性疾病是慢性感染，例如结核病。
在另一方面，本发明涉及在受试者中引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的CTLA-4结合分子或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的肿瘤或感染性疾病)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。备选地或组合下，受试者因感染而免疫受损或具有因感染而免疫受损的风险。
在一些实施方案中，本文所述的肿瘤，例如癌症，包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌(括腺癌和鳞状细胞癌)，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道的(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮细胞)、前列腺和咽的那些癌。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，如在肺、食道、皮肤、头颈区域、口腔、肛门和子宫颈的那些癌。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤。在一个实施方案中，癌症是肾细胞癌。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防。
用于治疗的优选癌症的非限制性例子包括淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌(例如，转移性乳腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，IV期或复发性非小细胞肺癌、NSCLC腺癌、或NSCLC鳞状细胞癌)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、白血病(例如，慢性髓性白血病)、皮肤癌(例如，黑色素瘤(例如，III期或IV期黑色素瘤)或Merkel细胞癌)、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、脊髓发育不良综合征、膀胱癌(例如，移行细胞癌)、肾癌(例如，肾细胞癌，例如，透明细胞肾细胞癌，例如，晚期或转移性透明细胞肾细胞癌)和结肠癌。另外，难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文所述的CTLA-4结合分子或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品治疗。
在一个实施方案中，疾病是具有升高的(核酸或蛋白质)水平的CTLA-4的疾病。在一些实施方案中，肿瘤是能够通过抑制CTLA-4与CD80分子和/或CD86分子的结合而受抑制的肿瘤，例如癌症。在一些实施方案中，肿瘤或感染是将受益于抑制核酸或蛋白质水平的CTLA-4的疾病。
在一些实施方案中，所述感染是急性的或慢性的。在一些实施方案中，所述慢性感染是持续性的感染、潜伏的感染或缓慢感染。在一些实施方案中，所述慢性感染是由选自细菌、病毒、真菌和原生动物的病原体导致的。
在另一个实施方案中，所述慢性感染是由结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。CTLA-4结合分子可以出于治疗优势与结核病的常规治疗组合。在某些实施方案中，CTLA-4结合分子与异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或氨硫脲等药物组合施用。
在一些实施方案中，本发明的CTLA-4结合分子或包含其的免疫缀合物或组合物或组合产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本文所述的预防或治疗方法还包括向所述受试者或个体联合施用本文公开的CTLA-4结合分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术(例如肿瘤切除术)；放射疗法(例如，外粒子束疗法，它涉及其中设计照射区域的三维适形放射疗法)、局部照射(例如，指向预选靶或器官的照射)或聚焦照射)等。聚焦照射可以选自立体定位放射手术、分割立体定位放射手术和强度调节型放射疗法。聚焦照射可以具有选自粒子束(质子)、钴-60(光子)和直线加速器(X射线)的辐射源，例如，如WO 2012/177624中描述。
放射疗法可以通过几种方法之一或方法组合施用，所述方法包括而不限于外粒子束疗法、内部放射疗法，植入物照射、立体定位放射手术、全身放射疗法、放疗法和永久或短暂间质近距放射疗法。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂(例如共刺激分子的激活剂或免疫检查点分子的抑制剂)。
示例性的其它抗体包括但不限于免疫检查点分子的抑制剂(例如，抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3、抗CEACAM或抗LAG-3)；刺激免疫细胞的抗体(例如，激动性GITR抗体或CD137抗体)等。优选地，其他抗体选自抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。更优选地，所述抗PD-1抗体是百时美施贵宝(BMS)公司的纳武单抗(Nivolumab)、默克(Merck)公司的派姆单抗(Pembrolizumab)；所述抗PD-L1抗体是罗氏(Roche)研发的atezolizumab、德国默克(MerckKGaA)和美国辉瑞(Pfizer)合作开发的avelumab、阿斯利康研发的durvalumab。
在一些实施方案中，免疫调节剂是共刺激分子的激活剂或激动剂。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂选自以下分子的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段、或可溶性融合物)：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。
本发明的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一制剂或分开的制剂中)和分开施用。在分开施用的情况中，可以在施用其他疗法之前、同时和/或之后实施本发明的CTLA-4结合分子或免疫缀合物等的施用。
在一个实施方案中，CTLA-4结合分子的施用和其他疗法(例如治疗方式或治疗剂)的施用彼此在约一个月内，或约一、两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。
本发明的CTLA-4结合分子(以及包含其的药物组合物或免疫缀合物)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括但不限于单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的CTLA-4结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、CTLA-4结合分子的类型、疾病的严重性和进程、所述CTLA-4结合分子是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述CTLA-4结合分子的应答，和主治医师的判断力。所述CTLA-4结合分子以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。可以由技术人员确定CTLA-4结合分子的剂量和治疗方案。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或组合物或组合产品替换CTLA-4结合分子来进行上述的任何预防或治疗。
X.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何CTLA-4结合分子可以用于检测CTLA-4在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。在某些实施方案中，生物样品是血液、血清或生物来源的其他体液样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的CTLA-4结合分子。在另一个方面中，提供检测CTLA-4在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测CTLA-4蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，CTLA-4是人CTLA-4。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的CTLA-4结合分子在允许CTLA-4结合分子与CTLA-4结合的条件下接触，并检测在CTLA-4结合分子和CTLA-4之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在CTLA-4。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，CTLA-4结合分子被用于选择适合利用CTLA-4结合分子治疗的受试者，例如其中CTLA-4是用于选择所述受试者的生物标志物。
在一个实施方案中，可以使用本发明的CTLA-4结合分子诊断癌症或肿瘤，例如评价(例如，监测)对象中本文所述疾病(例如，过度增生性或癌性疾病)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的CTLA-4结合分子。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，萤光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用CTLA-4结合分子治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测CTLA-4。
在一些实施方案中，提供了一种治疗肿瘤或感染的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验CTLA-4的存在，因而确定CTLA-4值，将CTLA-4值与对照值(例如健康个体的样品中的CTLA-4的值)比较，并且如果CTLA-4值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的CTLA-4结合分子(例如，本文所述的CTLA-4结合分子)，因而治疗肿瘤或感染。
能够理解的是，在本发明各部分中描述的各个实施方案，例如疾病、治疗剂、治疗方式和施用等同样适用于本发明的其他部分的实施方案，或可以与其他部分的实施方案组合。在本发明各部分中描述的适用于CTLA-4结合分子的性质、用途、和方法等实施方案，同样适用于包含CTLA-4结合分子的组合物、缀合物、组合产品和试剂盒等。
实施例
实施例1.动物免疫与血清效价检测
I.动物免疫
使用人CTLA-4(GenBank中的gi号：NP_005205.2)蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，目录号：11159-HNAH)作为抗原，对羊驼免疫接种。在施用至羊驼之前用佐剂配制人CTLA-4蛋白。
具体而言，每次将500μg人CTLA-4蛋白与弗氏完全佐剂(初次免疫)或与弗氏不完全佐剂(加强免疫)配制成乳液，施用至羊驼，每2周免疫一次，共免疫4次。
II.血清效价检测
在最后一次免疫羊驼后两周，抽取羊驼血液。通过ELISA方法对羊驼血清进行免疫效价检测，以测定人CTLA-4蛋白免疫羊驼后，羊驼血清针对所述人CTLA-4蛋白的结合能力，并根据血清中的抗体效价进行抗原免疫效果的判定。具体方法如下：
II.1抗原包被：在免疫后测定血清中抗体效价的前一天，将作为抗原的人CTLA-4蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，目录号：11159-HNAH)用PBS缓冲液稀释至终浓度2μg/mL，得到抗原稀释液。向96孔板的各孔中以30μL/孔的量加入该稀释液，4℃包被过夜。在免疫效价测定当日用PBS洗96孔板三次，然后用含有5％脱脂奶粉的PBST室温封闭96孔板两小时，再用PBS缓冲液洗板三次。
II.2血清稀释：在另外一块96孔板上将未经人CTLA-4蛋白免疫接种的阴性羊驼血清和经人CTLA-4蛋白免疫后的羊驼血清分别用PBS进行系列稀释，首孔为200倍稀释，然后后续7个孔采用首孔基础上依次2倍梯度稀释。
II.3抗原与抗体的结合反应：分别将上述II.2的稀释好的血清以30μL/孔的量加入到上述II.1制备的抗原包被板的各孔中，37℃孵育1小时。弃去上清液，用PBS缓冲液洗板两次后每孔加入1:5000稀释的第二抗体30μL，所述第二抗体为MonoRabTM兔抗骆驼科VHH抗体(金斯瑞生物科技有限公司，目录号：A01862-200)，37℃孵育0.5h。
II.4显色读数：弃去上清液，向96孔板上各孔中加入PBS清洗3次后，加入100μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色5分钟。用H2SO4终止反应，并使用ELISA板读数仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在450nm处测量光密度(OD)。结果见表2。
表2.对羊驼血清稀释不同倍数后的ELISA显色实验结果
血清稀释倍数 阴性血清的OD<sub>450nm</sub> NSY007羊驼血清的OD<sub>450nm</sub>
1:200 0.348 2.268
1:400 0.219 2.306
1:800 0.186 1.93
1:1600 0.147 1.395
1:3200 0.122 1.188
1:6400 0.103 0.788
1:12800 0.071 0.479
1:25600 0.09 0.335
注：阴性血清为未经人CTLA-4蛋白免疫的羊驼血清。
由上表2可见，使用人CTLA-4蛋白免疫后，NSY007羊驼的免疫效果好。将该NSY007羊驼用于随后的外周血免疫抗体库的构建。
实施例2.构建VHH抗体的cDNA基因文库
如实施例1所述进行动物免疫后，在最后一次免疫羊驼后两周，取ELISA实验显示免疫效果好的NSY007羊驼新鲜血液50mL，通过Ficoll-Paque密度梯度分离液分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)，进行VHH抗体的cDNA基因文库构建。具体方法如下：
I.外周血单个核细胞的分离
取Ficoll-Paque密度梯度分离液(购自GE公司,目录号：17144003S)15mL缓缓加入50mL离心管中。将采集的NSY007羊驼血50mL用肝素抗凝，然后用PBS缓冲液以1:1等体积比例稀释后，将离心管倾斜并沿管壁缓慢加入羊驼血的PBS稀释液共30mL，使得Ficoll-Paque密度梯度分离液与羊驼血的PBS稀释液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心管于4℃离心20min，其中将离心机设置为1500rpm，保持加速度为升3降0的参数。离心之后，整个液面分为四层,上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll-Paque PLUS，在上、中层交界处有以PBMC为主的白色狭窄带，即PBMC细胞层。小心使用移液枪吸取中间的PBMC细胞，将PBMC细胞转移至新的50mL离心管中。用PBS缓冲液洗PBMC细胞两次，每次洗完后置于4℃于1500rpm离心10min，最后收集PBMC细胞沉淀，用1.5mL PBS缓冲液重悬，并通过显微镜计数。
II.VHH抗体的cDNA基因文库的构建
通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒(购自TaKaRa公司,目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。
由于羊驼血液中抗体的分子形式不同于普通抗体，其不含有轻链而且重链不含有CH1，因此首先在VHH的N端和CH2上通过设计引物对，进行PCR得到两个不同大小的片段，通过割胶回收较小的目的片段以去除PCR产物中含有的大片段VH基因，获得小片段PCR扩增产物。
通过比对在所有羊驼种系中常见的VHH基因的氨基酸序列，设计出两端分别含有NcoI和NotI限制性酶切位点的羊驼种系VHH基因特异性简并引物。
以回收的小片段PCR扩增产物为模板，使用羊驼种系VHH基因特异性简并引物扩增所有的VHH基因。所用引物衍生自文献Sabir J.S.M.等人，Construction of
Figure BDA0002369892150000342
camelidsVHH repertoire in phage display-based library，C.R.Biologics,2014，337(4):244-249中所用的引物，其中将文献中引物所用酶切位点替换成NotI和NcoI。实施了两轮PCR扩增反应，PCR扩增条件如下表所示。
表3.一轮PCR扩增反应体系
Figure BDA0002369892150000341
Figure BDA0002369892150000351
表4.一轮PCR扩增反应程序
Figure BDA0002369892150000352
一轮PCR共实施了32个反应体系，纯化扩增子，共回收到3.6μg产物。
将一轮PCR产物作为模板，进行二轮PCR扩增。PCR体系和程序如下：
表5.二轮PCR扩增反应体系
反应体系组分 单反应体系所需的量
2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶 25μL
引物-F 1μL
引物-R 1μL
模板 10ng
ddH<sub>2</sub>O 补足至50μL
表6.二轮PCR扩增反应程序
Figure BDA0002369892150000353
二轮PCR共实施了96个反应体系，纯化扩增子，共回收到产物13.82μg。
用限制性酶NcoI和限制性酶NotI通过双酶切处理pHEN1噬菌体表面展示载体(4539bp)(获自BioVector NTCC Inc.)
表7载体酶切体系
Figure BDA0002369892150000354
Figure BDA0002369892150000361
类似地，用限制性酶NcoI和限制性酶NotI通过双酶切处理经二轮PCR扩增后回收到的所有VHH抗体基因。
将上述经限制性酶处理的pHEN1噬菌体表面展示载体与经限制性酶处理的VHH抗体基因以2.5:1的质量比混合。将连接酶(购自Takara，目录号：2011A)加入混合物溶液。将所得的混合物溶液在16摄氏度的温度静置两小时。以这种方式，将VHH抗体基因各自连接入pHEN1噬菌体表面展示载体，使得VHH抗体基因的C端融合在噬菌体表达载体中的GIII基因N端。具体而言，参照Takara连接酶试剂盒的方法，并结合目标库容大小，进行足量的连接反应。连接体系设计如下(单反应体积的总体积为20μL)：
表8.连接反应体系
Figure BDA0002369892150000362
通过回收试剂盒(购自Omega公司,目录号：D6492-02)回收连接产物。使用电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)将连接物通过电穿孔法转化至感受态大肠杆菌SS320(购自Lucigen,目录号：MC1061 F)中。
取10μL经转化的大肠杆菌SS320菌液用无抗生素的2YT培养液进行10倍梯度稀释，每个稀释梯度取2μL铺板在含有100微克/毫升浓度羧苄青霉素的2YT平板培养基上，通过计算在平板上形成的克隆来计算所有电转化形成的总克隆数，即库容量。经过计算，此免疫库库容量为1×109个VHH抗体基因(cfu/mL)。库容所对应的菌量为2OD600，也即1mL抗体库的OD600值为2OD600。
实施例3.展示抗体的噬菌体文库的制备和抗体候选分子的筛选
在本实施例中，首先制备了展示抗人CTLA-4的VHH抗体的噬菌体文库，然后通过不同方法对噬菌体文库进行了筛选，并对筛选得到的候选VHH抗体进行了与抗原结合的亲和力分析。
I.展示抗体的噬菌体文库的制备
取10倍于实施例2的库容菌量(约20OD600，1×1010个菌体细胞)的上述转化后大肠杆菌1ml，向其中加入新鲜的2-YT液体培养基稀释，调整2-YT培养基的加入用量使得菌液稀释液初始OD值约为0.05。将稀释后菌液置于37℃，220rpm培养至对数生长期。此时以50倍于细菌数的数量(即，感染复数(MOI)为大约50)加入VCSM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min，然后在220rpm振摇条件下培养1h。10000rpm离心5min后，将培养液取代为羧苄青霉素50μg/mL/卡那霉素40μg/mL双抗性的2-YT培养基，并于30℃，220rpm振摇培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min，其上清通过加入20％PEG/NaCl溶液，沉淀，得到展示抗人CTLA-4的VHH抗体的噬菌体文库，经PBS洗一次之后，用于筛选能够与CTLA-4特异性结合的VHH抗体。
II.抗体候选分子的筛选
II.1磁珠法筛选噬菌体文库
磁珠法筛选噬菌体文库是基于将生物素标记的重组人CTLA-4蛋白结合到抗生物素蛋白偶联的磁珠上进行抗体噬菌体库的筛选。首先用生物素标记重组人CTLA-4蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，目录号：11159-HNAH)，将生物素标记的CTLA-4蛋白和磁珠Dynabeads(购自Invitrogen)孵育，孵育的具体操作条件按照Kingfisher磁珠筛选系统方法对磁珠进行结合和清洗，使用含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS作为封闭液。使得生物素标记的CTLA-4蛋白结合到磁珠上。将结合有CTLA-4抗原的磁珠和上述具有纳米抗体展示的噬菌体文库室温孵育2小时，经PBST缓冲液洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体。加入胰酶(购自Gibco，货号25200072)轻轻混匀20min，以洗脱特异性结合人CTLA-4蛋白的纳米抗体展示噬菌体。
接着对洗脱的噬菌体进行扩增。具体而言，将洗脱的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(购自Lucigen,目录号：MC1061 F)，并将噬菌体侵染的SS320菌体涂布于含有50μg/mL浓度的羧苄青霉素的2YT平板培养基，37℃过夜培养，第二天收集噬菌体文库。所述采用SS320菌体制备噬菌体文库的其他步骤参见实施例3.I。将得到的噬菌体文库继续用于第二轮的筛选。具体而言，将结合有CTLA-4蛋白的磁珠和该噬菌体文库室温孵育2小时，经PBST缓冲液洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，去除残留液体后，只保留磁珠，向磁珠中加入CD80蛋白溶液进行竞争结合，去除与CTLA-4蛋白结合力较弱的的噬菌体，经PBST缓冲液洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体。所使用的CTLA-4配体蛋白CD80的蛋白序列为NP_005182.1，可以从义翘神州公司购买，货号10698-HCCH。
向PBST洗脱后的磁珠中加入稀释后的胰酶(购自Gibco，货号25200072)，反应30min，取上清离心后得到噬菌体颗粒。
将所述经第二轮扩增/结合筛选得到的噬菌体同样地用于第三轮扩增/结合筛选，采用CTLA-4配体蛋白CD80竞争、胰酶等多种方式进行洗脱。由此富集可特异性结合人CTLA-4蛋白的VHH展示噬菌体。如此反复，每轮随机挑选10个克隆进行序列分析。
对经过三轮筛选后得到的111个单克隆噬菌体进行测序。结果显示，不同克隆的基因序列有部分重复，由此可见，磁珠法筛选噬菌体文库能够明显富集VHH抗体序列。
II.2免疫管法筛选噬菌体文库
免疫管筛选是基于将抗原包被在免疫管表面，筛选特异性结合目的抗原的抗体展示噬菌体。具体而言，筛选前一天将重组人CTLA-4蛋白溶液(2毫升)注入免疫管(购自康宁公司)，静置过夜，由此使重组人CTLA-4蛋白包被免疫管，将包被有人CTLA-4抗原的免疫管和具有纳米抗体展示的噬菌体库室温孵育2小时，经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体。加入胰酶(购自Gibco，货号25200072)轻轻混匀20min，以洗脱特异性结合人CTLA-4蛋白的纳米抗体展示噬菌体。
接着对洗脱的噬菌体进行扩增。具体而言，将洗脱的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(购自Lucigen,目录号：MC1061 F)，并将噬菌体侵染的SS320菌体涂布于含有50μg/mL浓度的羧苄青霉素的2YT平板培养基，37℃过夜培养，第二天收集噬菌体文库。所述采用SS320菌体制备噬菌体文库的其他步骤参见实施例3.I。将得到的噬菌体文库继续用于第二轮的筛选。将包被有人CTLA-4抗原的免疫管和该噬菌体文库室温孵育2小时，经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体。在第二轮筛选时同样地采用CTLA-4配体蛋白CD80竞争、胰蛋白酶等多种方式进行洗脱。将第二轮筛选得到的噬菌体用于第三轮筛选，在第三轮筛选时采用CTLA-4配体蛋白CD80竞争、胰酶的方式进行洗脱。如此反复，每轮随机挑选10个克隆进行序列分析。
对经过三轮筛选后得到的124个单克隆噬菌体在SS320菌体中扩增后测序。结果显示，不同克隆的基因序列有部分重复，由此可见，免疫管法筛选噬菌体文库能够明显富集序列。
III.候选分子的活性鉴定
III.1抗体VHH分子的单克隆裂解液的制备
将实施例3.II获得的单克隆细菌的菌液以1:1000接种50mL羧苄青霉素50μg/mL/四环素12μg/mL双抗性培养基，37℃恒温摇床振荡培养14h，10000g常温离心5min，使用1mLpH 9.0的含有Benzonase核酸酶(Merck，70746-3)(Benzonase核酸酶的浓度为0.002U/mL)的Tris-HCl缓冲液重悬细菌，冰上裂解30min，4℃10000g离心10min，收集上清得到含抗体VHH分子的单克隆细胞裂解液。
III.2通过流式细胞术测定候选分子的亲和力
i)稳定过表达CTLA-4的细胞株的构建和鉴定
构建了稳定过表达全长人CTLA-4(GenBank中的gi号：NP_005205.2)、恒河猴CTLA-4(GenBank中的gi号：XM_015110722.2)的CHO-s细胞株，并使用FACS进行了过表达细胞株的鉴定。
1.稳定过表达细胞株的构建
1.1表达人CTLA-4胞外域蛋白的质粒构建
采用合成的基因序列分别构建蛋白表达载体，表达载体质粒构建方法为：通过基因合成法合成出含有人CTLA-4和恒河猴CTLA-4全长蛋白基因序列的DNA片段，分别将这两种合成的基因片段和表达载体pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen货号：K830001)使用限制性酶HindIII和SmalI酶切并连接。导入SS320大肠杆菌，挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认，得到正确构建的质粒。
1.2电转化
使用CD-CHO无血清培养基(购自Gibco，目录号：10743029)培养中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO-s)(Invitrogen)，电转前一天将细胞传代至5×106个/mL，电转当天使用电转试剂盒(Invitrogen，NeonTMKit,MPK10096)和电转仪(Invitrogen，NeonTM TransfectionSystem，MP922947)以1700V/20ms/1次将构建好的质粒分别导入CHO-s细胞中。将电转后的细胞加入3mL CD-CHO培养基中，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养48小时。
1.3细胞铺板与培养
将上述1.2的电转化和培养后的CHO-s细胞按2000个细胞/孔铺到96孔板中，加入终浓度30μM蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)(Millipore，GSS-1015-F)和GS supplement(Sigma，58672C-100ml)，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，10天后补充加入含30μM MSX和1×GSsupplement的培养基。
1.4克隆鉴定与细胞扩增培养
挑取长出的克隆，转移至24孔细胞培养板中培养。获得了分别产生过量表达人CTLA-4的CHO-s细胞(下文中也称为人CTLA-4-CHO细胞)和过量表达恒河猴CTLA-4的CHO-s细胞(下文中也称为恒河猴CTLA-4-CHO细胞)。
ii)对照抗体的获得或制备
使用伊匹木单抗(Ipilimumab)作为对照抗体。所述对照抗体可以从伊匹木单抗原生产厂家百时美施贵宝公司(BMS)处购买，也可以如下制备：
采用ExpiCHO瞬转表达系统进行对照抗体轻重链全基因的表达，培养基为ExpiCHOTMExpression Medium(Gibco,A29100-01)，转染试剂盒为ExpiFectamineTMCHOTransfection Kit(Gibco,A29129)。具体方法如下：分别合成(基因合成供应方：通用生物)对照抗体-伊匹木单抗(BMS)的轻链全基因序列(编码SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的核苷酸序列)和重链全基因序列(编码SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的核苷酸序列)，通过分子克隆构建伊匹木单抗抗体轻链和重链基因的ExpiCHO表达质粒，并将分别含有伊匹木单抗抗体轻、重链基因质粒按照质量比为2:1进行混合。
转染前一天将ExpiCHO细胞进行传代，在25mL体系内，按照转染试剂盒说明书方法进行操作，将构建好的上述质粒混合物25μg与转染试剂进行混合，混合之后滴加入25mLExpiCHO细胞培养物体系中，充分混匀，之后于37℃表达18-22小时。向上述转染混合物中添加补料培养基GS supplement(Sigma，58672C-100ml)，补料后，细胞置于32℃培养，转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃培养10-12天。其后将表达好的细胞混悬液以12000-15000g高速离心10分钟至30分钟，取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后采用Protein A/G亲和层析柱亲和纯化方法进行纯化,用100mM甘氨酸盐缓冲液(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl缓冲液中和至pH7.0。小量取样后经SDS-PAGE鉴定后分装、入库冻存。抗体浓度为1.46mg/ml。
iii)候选分子的亲和力测定
首先收集培养好的人CTLA-4-CHO细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个/mL；将人CTLA-4-CHO细胞以100μL每孔加入96孔圆底板，300g离心去上清；向对应孔中加入梯度稀释抗体，分别为1:1、1:3和1:9的梯度浓度或者分别为1:1、1:6、1:36、1:216的梯度浓度的候选抗体裂解液(上述III.1制备)和对照抗体(15μg/mL)稀释液，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL FACS缓冲液并使用排枪重悬细胞；重复该洗涤步骤两次，300g离心去上清；加入PE标记的抗人IgG Fc流式抗体(Abcam,98596)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；300g离心去上清，加入200μL FACS缓冲液并重悬细胞；重复该洗涤步骤两次，向孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细胞，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测荧光强度。设置阴性对照(NC)，为纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)，在图中缩写为“同种型对照”。
结果如图1A、图1B和图1C所示，通过FACS方法的初步筛选，筛选到抗体裂解液中含有对CTLA-4有特异性结合效果的抗体的蛋白，是克隆编号分别为NB25gb-21，NB25ga-14，NB25B-17，NB25gb-6，NB25gb-1，SY23-32，SY23-33，SY23-119，SY23-146，SY23-162的10个有良好亲和力的候选分子
实施例4.嵌合VHH-Fc抗体的表达和分析鉴定
在本实施例中，进行了融合有Fc片段的VHH-Fc嵌合抗体蛋白的表达和分析鉴定。
首先，进行了表达载体的构建。将通过实施例3的筛选获得的10种阳性VHH候选抗体分别与人IgG1 Fc段融合，采用阳性VHH基因序列的C端连接到人IgG1 Fc段基因序列的N端的方式构建，连接入表达载体pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen货号：K830001)，将该连接有VHH-Fc序列的表达载体转化ExpiCHO细胞，诱导表达得到融合了Fc片段的VHH-Fc嵌合抗体蛋白。
抗体表达采用的是ExpiCHO瞬转表达系统，培养基为ExpiCHOTMExpression Medium(Gibco,A29100-01)，转染试剂盒为ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit(Gibco,A29129)。具体方法如下：转染前一天将ExpiCHO细胞进行传代，在25mL体系内，将构建好的融合表达载体25μg与转染试剂混合之后滴加入25mL ExpiCHO细胞中，充分混匀，于37℃培养18-22小时后，根据试剂盒内说明添加补料培养基GS supplement(Sigma，58672C-100ml)，补料后，细胞置于32℃培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃培养，10-12天之后，将表达好的细胞混悬液以12000-15000g高速离心10分钟至30分钟，取上清。所得上清经0.22μm过滤后采用Protein A/G亲和纯化方法进行纯化,用100mM甘氨酸盐(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和。各VHH-Fc嵌合抗体蛋白的浓度为500μg/mL，置于4℃待用。
实施例5.体外检测VHH-Fc候选抗体与细胞上人CTLA-4蛋白的结合活性
对实施例4获得的VHH-Fc候选抗体进行评价，采用FACS方法检测各VHH-Fc候选抗体与细胞上CTLA-4蛋白的体外结合活性，具体方法如下。
1)收集培养好的人CTLA-4-CHO细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个细胞/mL。
2)将人CTLA-4-CHO细胞以100μL每孔加入96孔圆底板，300g离心去上清；
3)向对应孔中加入使用FACS缓冲液梯度稀释的候选抗体稀释液，每孔100μL，浓度如图2A、图2B所示，并设置对照抗体稀释液，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
4)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL FACS缓冲液并使用排枪重悬细胞；
5)重复步骤4)两次，300g离心去上清；
6)加入PE标记的抗人IgG Fc流式抗体(Abcam,ab98596)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
7)300g离心去上清，加入FACS缓冲液并重悬细胞；
8)重复步骤7)两遍，向各孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细胞，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测荧光强度。
如图2A和图2B所示，通过FACS实验可见，实施例3筛选到的8个VHH分子分别与Fc融合后得到了具有高亲和力的VHH-Fc嵌合抗体，亲和力均与对照抗体IPI相当或者更好。
实施例6.嵌合VHH-Fc抗体阻断CTLA-4与CD80/CD86的结合
对获得的VHH-Fc候选抗体进行评价，采用FACS方法检测其对CTLA-4与CD80/CD86结合的阻断活性，具体方法如下：
1)收集培养好的人CTLA-4-CHO细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个细胞/mL。
2)将人CTLA-4-CHO细胞悬液以100μL每孔加入96孔圆底板，300g离心去上清；
3)向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体稀释液和对照抗体稀释液，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
4)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL FACS缓冲液并使用排枪重悬细胞；
5)重复步骤4)两次，300g离心去上清；
6)向对应孔中加入100μL huCD80_EDC mFc(储液浓度为98.55μg/mL)或huCD86_EDC-mFc(储液浓度为112.07μg/mL)稀释液，稀释后浓度为0.0625μg/mL；
7)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入稀释好的CTLA-4抗体的稀释液100μL，重悬细胞并将细胞放置于4℃孵育30分钟；
8)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL FACS缓冲液并用排枪重悬细胞；
9)重复步骤8)两次，300g离心去上清；
10)加入PE标记的抗人Fc抗体(eBioscience,98742)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
11)300g离心去上清，加入FACS缓冲液并重悬细胞；
12)重复步骤11)两遍，向孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细胞，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
如图3A和图3B所示，通过FACS实验可见，实施例3筛选到的8个VHH分子与Fc融合后得到的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD80的结合有高阻断活性，阻断活性均与对照抗体IPI相似。
如图4A和图4B所示，通过FACS实验可见，实施例3筛选到的8个VHH分子与Fc融合后得到的VHH-Fc嵌合抗体对CTLA-4与CD86的结合有高阻断活性，阻断活性均与对照抗体IPI相似。
实施例7.嵌合VHH-Fc抗体结合猴CTLA-4的活性
为了评价VHH-Fc候选抗体结合猴CTLA-4的活性，采用FACS方法检测其与猴CTLA-4-CHO细胞上的猴CTLA-4蛋白的结合活性，具体方法如下：
1)收集培养的猴CTLA-4-CHO细胞，300g离心去培养基，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个细胞/mL；
2)将猴CTLA-4-CHO细胞以100μL每孔加入96孔圆底板，300g离心去上清；
3)向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体稀释液和对照抗体稀释液，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
4)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL并使用排枪重悬细胞；
5)重复步骤4两次，300g离心去上清；
6)向对应孔中加入CTLA-4蛋白稀释液(200nM)100μL，重悬细胞并将细胞放置于4℃孵育30分钟；
7)将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL并使用排枪重悬细胞；
8)重复步骤7)两次，300g离心去上清；
9)加入PE标记的抗人Fc流式抗体(Abcam,98596)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃孵育30分钟；
10)300g离心去上清，加入FACS缓冲液并重悬细胞；
11)重复步骤10)两遍，向孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细胞，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
如图5A和图5B所示，通过FACS实验可见，实施例3筛选到的8个VHH分子与Fc融合后得到的VHH-Fc嵌合抗体均有很好的识别猴CTLA-4的活性，与猴CTLA-4存在交叉反应。
实施例8.嵌合VHH-Fc抗体的体外生物学活性验证
金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)作为一种超抗原，能够在极低浓度条件下活化T细胞，使T细胞表面大量表达CTLA-4蛋白。而PBMC中的B淋巴细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMC)及树突状细胞等细胞表面能表达CD80蛋白或CD86蛋白，其与活化的T细胞表面的CTLA-4蛋白结合，进而抑制T细胞的活化。基于此原理，将嵌合VHH-Fc抗体和SEB加入到PBMC细胞中，其中所述嵌合VHH-Fc抗体能够阻断CTLA-4和CD80或CD80的结合，从而使T细胞保持活化状态。通过检测相应的细胞因子水平(IL-2、TNF-α)来检测嵌合VHH-Fc抗体在体外刺激PBMC细胞的激活能力，具体方法如下：
1)使用Ficoll体外分选得到PBMC细胞，然后在补充有10％FBS、1％青霉素/链霉素、1％非必需氨基酸NEAA和1％丙酮酸钠的1640RPMI培养基中将细胞悬液密度调整为2.5×106个细胞/mL；
2)将PBMC细胞以100μL每孔加入96孔细胞培养板；
3)向对应孔中加入CTLA-4抗体稀释液和10ng/mL SEB(超抗原)混合液，然后在37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时；
4)收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测上清中IL-2和TNF-α的分泌水平；
IL-2分泌量的检测结果如下表9A和图6A、以及表9B和图6B所示。与阴性对照比较，所测试的8种抗体能够激活PBMC细胞的免疫反应，使之分泌IL-2。从图6A和图6B可见，SEB为10ng/mL时，8种候选抗体刺激PBMC产生IL-2的水平均超过了阳性抗体或者与阳性抗体相当。
表9A IL-2的分泌量
Figure BDA0002369892150000441
表9B IL-2的分泌量
Figure BDA0002369892150000442
TNF-α分泌量的检测结果如下表10A和图7A、以及表10B和图7B所示。与阴性对照比较，所测试的8种抗体能够激活PBMC细胞的免疫反应，使之分泌TNF-α。从图7A和图7B可见，SEB为10ng/mL时，8种候选抗体刺激PBMC产生TNF-α的水平均超过了阳性对照抗体或与阳性抗体相当
表10A TNF-α的分泌量
Figure BDA0002369892150000451
表10B TNF-α的分泌量
Figure BDA0002369892150000452
实施例9.抗体的人源化
选择NB25B-17和NB25gb-1这两个抗体进行了人源化改造，具体改造位点参见序列表。
对NB25B-17-Fc和其人源化改造后的3种抗体NB25B-17-H1-IgG1、NB25B-17-H2-IgG1、NB25B-17-H3-IgG1；对NB25gb-1-Fc和其人源化改造后的3种抗体NB25gb-1-H1-IgG1、NB25gb-1-H2-IgG1、NB25gb-1-H3-IgG1进行了生物学活性检测。生物学活性测试方法分别与实施例5、6、7、8所使用的方法一致。
图8显示了人源化改造后的抗体分子对表达在细胞上的人CTLA-4的结合亲和力。图9显示了人源化改造后的抗体分子对CTLA-4与CD80结合的阻断活性。图10显示了人源化改造后的抗体分子对CTLA-4与CD86结合的阻断活性。图11显示了人源化改造后的抗体分子对表达在细胞上的猴CTLA-4的结合亲和力。
使用NB25B-17-H1-IgG1和NB25gb-1-H1-IgG1抗体通过动物模型体内证实了人源化抗体的抗肿瘤活性。具体而言，通过将人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ATCC)接种小鼠引起乳腺癌来建立肿瘤动物模型。对小鼠分组，分别施用NB25B-17-H1-IgG1抗体或NB25gb-1-H1-IgG1抗体或纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号,403502)，定期测定荷瘤动物肿瘤体积的大小。
结果显示，NB25B-17-H1-IgG1抗体和NB25gb-1-H1-IgG1抗体能够显著减小荷瘤小鼠的肿瘤体积。
尽管已经出于说明本发明的目的显示了某些代表性实施方案和细节，但是本领域技术人员显而易见的是可以对它们进行多种变化和修改而不脱离主题发明的范围。在这个方面，本发明范围仅由以下权利要求限定。
序列表
表A单结构域抗体名称和其序列(框内为根据AbM编号确定的CDR序列)
Figure BDA0002369892150000461
Figure BDA0002369892150000471
Figure BDA0002369892150000481
表B单结构域抗体名称和其CDR序列
Figure BDA0002369892150000482
表C人源化抗体名称和其CDR序列
Figure BDA0002369892150000483
表D单结构域抗体名称和其FR序列
Figure BDA0002369892150000484
Figure BDA0002369892150000491

Claims (32)

1.CTLA-4结合分子，其包含至少一个特异性结合CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分，其中所述sdAb部分包含：氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:5所示的CDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的CDR3；或者
其中所述sdAb部分包含：氨基酸序列SEQ ID NO:15所示的CDR1、氨基酸序列SEQID NO:16所示的CDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的CDR3；或者
其中所述sdAb部分包含：氨基酸序列SEQ ID NO:15所示的CDR1、氨基酸序列SEQID NO:17所示的CDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的CTLA-4结合分子，其中所述sdAb部分包含
(i)SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；或
(ii)与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的CTLA-4结合分子，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:28、29或30所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CTLA-4结合分子，其中所述sdAb部分在N端或C端与免疫球蛋白的Fc区连接。
5.根据权利要求4所述的CTLA-4结合分子，其中所述sdAb部分在N端或C端与IgG的Fc区连接。
6.根据权利要求5所述的CTLA-4结合分子，其中所述sdAb部分在N端或C端与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区连接。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的CTLA-4结合分子，其具有以下一个或多个特性：
(1)以高亲和力结合CTLA-4，所述CTLA-4结合分子与CTLA-4之间结合的Kd是10-5M至10-12M；
(2)阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合；
(3)诱导IL-2和/或TNF-α分泌；
(4)使T细胞保持活化状态。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的CTLA-4结合分子，其是双特异性或多特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的CTLA-4结合分子，其是双特异性抗体，所述双特异性抗体分子与CTLA-4和PD-1或PD-L1结合。
10.分离的核酸，其编码权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子。
11.包含权利要求10的核酸的载体。
12.根据权利要求11所述的载体，其是表达载体。
13.根据权利要求12所述的载体，其是pHEN1载体。
14.包含权利要求10的核酸或权利要求11至13中任一项所述的载体的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
18.制备权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子的核酸的条件下培养权利要求14至17中任一项所述的宿主细胞，任选地分离所述CTLA-4结合分子，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述CTLA-4结合分子。
19.免疫缀合物，其包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子和其它物质。
20.免疫缀合物，其包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子和细胞毒性剂。
21.药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子或权利要求19的免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
22.药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子或权利要求19的免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选地药用辅料。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述其他抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
25.组合产品，其包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子或权利要求19的免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂。
26.根据权利要求25所述的组合产品，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂。
27.根据权利要求26所述的组合产品，其中所述其他抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
28.权利要求1至9中任一项所述的CTLA-4结合分子、权利要求19或20的免疫缀合物、权利要求21至24中任一项所述的药物组合物、或权利要求25至27中任一项所述的组合产品的用途，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤或感染性疾病的药物。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述肿瘤是具有升高的CTLA-4表达水平的癌症；所述感染性疾病为细菌感染、病毒感染、真菌感染或原生动物感染所引起的疾病。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述肿瘤是淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、骨髓瘤、白血病、皮肤癌、头颈癌、脊髓发育不良综合征、膀胱癌、肾癌和结肠癌；所述感染性疾病是慢性感染。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，所述乳腺癌是转移性乳腺癌，所述肝癌是肝细胞癌，所述肺癌是非小细胞肺癌、NSCLC腺癌或NSCLC鳞状细胞癌，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤，所述白血病是慢性髓性白血病，所述皮肤癌是黑色素瘤或Merkel细胞癌，所述头颈癌是头颈鳞状细胞癌，所述膀胱癌是移行细胞癌，所述肾癌是肾细胞癌；所述感染性疾病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染。
32.检测样品中CTLA-4的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子，用于实施以下步骤：
(a)将样品与权利要求1至9中任一项的CTLA-4结合分子接触；和
(b)检测所述CTLA-4结合分子和CTLA-4间的复合物的形成；任选地，所述CTLA-4结合分子是被可检测地标记的。
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