CN112334488B - 靶向免疫检查点的双特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双特异性抗体，其拮抗人PD‑1和激动人CD137，并且可以用于单独且与化学疗法和电离辐射组合治疗实体肿瘤和血液肿瘤。
Description
本发明在医学领域中。具体地，本发明涉及拮抗人程序性细胞死亡1 (PD-1)和激动人CD137的新型双特异性抗体，包含此类双特异性抗体的组合物，以及单独或与化学疗法和其他癌症治疗剂组合使用此类双特异性抗体来治疗实体肿瘤和血液肿瘤的方法。
免疫检查点是在免疫细胞(例如，T细胞和树突状细胞)上表达的一组膜蛋白，包括多种共抑制和共刺激受体，其在调节适应性免疫应答中发挥重要作用。充分研究的检查点包括PD-1和CD137。PD-1及其配体(程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(PD-L2))之间的相互作用提供了抑制信号，其已被显示在肿瘤免疫逃逸和在肿瘤微环境中发生的免疫抑制中发挥关键作用。尽管抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体对PD-1抑制性信号传导的阻断得到临床验证，并且已经导致某些癌症的治疗的重大的临床进展，但有许多患者对PD-1或PD-L1抗体治疗没有应答，复发，获得对其的抗性，或另外对治疗不耐受。CD137，也称为4-1BB，在活化T细胞驱动的免疫应答中发挥作用，诸如通过促进T细胞增殖和效应子功能，加强免疫记忆和抑制活化诱导的细胞死亡。在鼠肿瘤模型中，靶向CD137的激动性抗体已显示作为单一疗法和作为组合疗法的前景，然而，靶向人CD137的激动性抗体由于毒性和/或缺乏效力，尚未在人癌症患者中作为单一疗法或作为组合疗法证明足够的应答。实际上，尚未批准靶向人CD137的激动性抗体用于人中的治疗用途。因此，需要靶向免疫检查点途径的额外治疗。
已经在用于治疗实体肿瘤的临床试验中研究了激动CD137和拮抗PD-1的抗体的组合，例如urelumab(即，抗CD137激动剂单克隆抗体)和纳武单抗(即，抗PD-1拮抗剂单克隆抗体)的组合(Tolcher等人, Clin Cancer Res 23(18) 2017)。然而，较高的潜在有效剂量的urelumab已经与转氨酶升高症(transaminitis)和其他不良事件相关。将CD137激动性抗体特异性靶向至表达PD-1的那些细胞可能限制与激动性CD137抗体的全身施用相关的不良事件。因此，需要本发明的双特异性抗体，其经设计以通过优先结合表达PD-1的细胞，潜在地将CD137激动作用限于也表达PD-1的那些细胞，来提供免疫加强。
WO2018/045110公开了几种结合共抑制受体和共刺激受体以活化T细胞来治疗癌症的双特异性抗体(Fab-scFv-Fc形式)，包括[ICOS x PD-1]和[CD137 x PD-1]。似乎WO2018/045110中公开的CD137 Fab衍生自BMS20H4.9，其可能与严重的转氨酶升高症(transaminitis)的发展相关(Segal等人, Clinical Cancer Research (2016) 1-8)。与WO2018/045110中公开的双特异性抗体相反，IgG-样双特异性抗体具有许多与天然IgG抗体相关的有利特性，诸如高稳定性、长血清半衰期和低免疫原性(Ha等人, Frontiers in Immunology (2016) Article 394)。由于与BMS20H4.9相关的已知毒性以及由于WO2018/045110中描述的双特异性抗体的不期望的结构形式，需要额外的作为IgG-样双特异性抗体的双特异性抗体，其拮抗人PD-1并激动人CD137，并促进稳健的抗癌免疫应答，并展示可接受的毒性概况。
本发明的双特异性抗体被设计为有利于两条不同的重链的异源二聚体配对并且不利于同源二聚体的形成。优选地，本文所述的双特异性抗体包含衍生自人IgG1的Fc部分。已知IgG1结合Fc-γ受体(FcγR)家族的蛋白以及C1q。IgG1与FcγR或C1q的结合分别诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，优选地，本文所述的抗体是经工程改造以降低抗体与FcγR以及C1q的结合的人IgG1。优选地，将EU编号中的位置L234A和L235A的氨基酸取代引入CH2区域，以降低抗体与FcγR以及C1q的结合。任选地，引入EU编号中的位置N297Q的氨基酸取代以进一步降低抗体的ADCC和CDC活性。
此外，用于生成本文所述的抗体(以下称为“抗体A”)的选择性诱变概述于表1-7中。此外，表1-4显示与亲本抗体7A5和11444相比，抗体A(抗CD137臂-7A5*/抗PD-1臂-11444*)的可变区中的残基的选择性诱变。表5-7概述与野生型人IgG1和野生型(wt)人λ和κ相比在抗体A的恒定区内进行的选择性诱变。抗体A的两个臂以及亲本单克隆抗体抗CD137(7A5)和抗PD-1 (11444)中的残基的选择性诱变进一步概述于表8中。
表1：HCVR
表2：LCVR
表3：HCVR
表4：LCVR
表5：重链恒定区
表6：轻链恒定区
表7：轻链恒定区
a括号中的编号基于Kabat编号(Kabat EA等人, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, MD)。
b括号中的编号基于EU编号(Kabat EA等人, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD)。
c进行7A5重链中的M101A和G106A的选择性诱变，以消除甲硫氨酸氧化并降低双特异性抗体的人CD137激动性臂的结合亲和力。抗体A与人PD-1的结合亲和力是抗体A与人CD137的结合亲和力的至少10倍，优选大于100倍。还进行11444重链中的M54S的选择性诱变，以消除甲硫氨酸氧化。
本发明的抗体是异源二聚的，因为部分由于两条不同的重链和两条不同的轻链，抗体的每个臂表现出与其同源抗原的选择性单价结合。在本发明中，所述抗体的一个臂结合人PD-1 (SEQ ID NO:25)，而另一臂结合人CD137 (SEQ ID NO:26)。本发明的抗体证明有利的药理学特性，部分由于所述双特异性抗体展示的与人PD-1 (SEQ ID NO:25)的结合亲和力是与人CD137 (SEQ ID NO:26)的结合亲和力的至少10倍，优选大于100倍。因此，本发明的抗体选择性靶向表达PD-1的细胞，并且潜在地将CD137激动作用限于共表达PD-1的那些细胞。此外，与亲本抗体的组合相比，本发明的抗体保留在人外周血单核细胞(PBMC)共刺激测定中促进干扰素γ(IFNγ)产生的功能。此外，与亲本单克隆抗体的组合相比，当向小鼠施用本文所述的抗体时，所述抗体出乎意料地在H292肿瘤组织中诱导独特的免疫基因表达模式。
因此，本发明提供了拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)的抗体，其中与人PD-1的结合亲和力是与人CD137的结合亲和力的至少10倍。本发明提供了拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)的抗体，其中与人PD-1的结合亲和力是与人CD137的结合亲和力的100倍。
本发明还提供了拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)的抗体，其激动人CD137的水平低于BMS20H4.9的CD137激动水平，如在本文公开的Jurkat NFκB-Luc报告子测定中，在经工程改造以共表达CD137和PD-1两者的细胞中所测量的。
本发明还提供了拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)的抗体，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键；任选地其中所述抗体与人PD-1的结合亲和力是与人CD137的结合亲和力的10倍或更高，优选地其中所述抗体与人PD-1的结合亲和力是与人CD137的结合亲和力的100倍或更高。
本发明提供了拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)的抗体，其包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的互补决定区2 (CDR2)和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的互补决定区(CDR3)；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3。
本发明提供了包含第一和第二重链以及第一和第二轻链的抗体，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了包含第一和第二重链以及第一和第二轻链的抗体，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了包含第一和第二重链以及第一和第二轻链的抗体，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了本文公开的抗体，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了DNA分子，其包含编码至少一种多肽的多核苷酸，所述多肽具有SEQID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:11的氨基酸序列、SEQ ID NO:17的氨基酸序列和SEQ IDNO:23的氨基酸序列。
本发明提供了哺乳动物细胞，其包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少一种多肽的多核苷酸，所述多肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:11的氨基酸序列、SEQID NO:17的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；任选地，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，且其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了用于产生本文公开的本发明的抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；任选地，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，且其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了包含抗体的药物组合物，其中所述抗体拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；且其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了包含抗体的药物组合物，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了包含抗体的药物组合物，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；且其中：
所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射组合施用。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂组合施用。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；且其中：
所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的包含抗体的药物组合物，其中所述抗体拮抗人PD-1(SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；且其中：
所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了用于治疗癌症的包含抗体的药物组合物，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了用于治疗癌症的包含抗体的药物组合物，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了用于治疗癌症的包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了用于治疗癌症的包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
本发明提供了用于治疗癌症的包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了用于治疗癌症的包含本发明的抗体的药物组合物，其中所述药物组合物与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体拮抗人PD-1 (SEQ ID NO:25)和激动人CD137 (SEQ ID NO:26)，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述抗体的第一重链包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
b) 所述抗体的第一轻链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3；
c) 所述抗体的第二重链包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；且
d) 所述抗体的第二轻链包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3；且其中：
所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a) 所述第一重链的可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链的可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
c) 所述第二重链的可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链的可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中：
a) 所述第一重链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b) 所述第一轻链具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c) 所述第二重链具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d) 所述第二轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
在涉及如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗或可替代地用于制备用于该治疗的药物的进一步实施方案。
有用的化学治疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉酚(taxol)、喜树碱、FOLFIRI、FOLFOX、多西他赛、柔红霉素、紫杉醇(paclitaxel)、奥沙利铂及其组合。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径(其非限制性实例为静脉内施用)施用。本发明的抗体可以单独与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于人患者。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的方法制备(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版 (2012), A. Loyd等人,Pharmaceutical Press)。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗效果)。对于静脉内(i.v.)或非静脉内施用(局部或全身或其组合)的给药时间表通常范围为单次推注剂量或连续输注至每天多次施用(例如，每4-6小时)，或如由主治医师和患者的状况所指示。
如本文所用，术语“拮抗”是指阻断、中断、抑制或降低期望的生物活性的行为。在这方面，本发明的抗体通过结合人PD-1和阻断人PD-L1与人PD-1的结合来拮抗人PD-1。
如本文所用，术语“激动”是指刺激、促进、活化或增强期望的生物活性的行为。在这方面，本发明的抗体通过结合人CD137和不依赖于CD137的天然人配体而活化CD137下游的信号转导途径来激动人CD137。
术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment))”是指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减轻或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度。
“有效量”意指本发明的抗体或包含本发明的抗体的药物组合物诱发研究者、医师或其他临床医师寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医学应答或期望的治疗作用的量。抗体的有效量可根据因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体在个体中诱发期望应答的能力。有效量也是治疗有益作用胜过抗体的任何毒性或有害作用的量。
如本文所用的术语“抗体”是指工程改造的、非天然存在的多肽复合物，其具有两条重链和两条轻链，使得所述重链和轻链通过二硫键互连；其中所述抗体是IgG-样抗体。每条重链由N-末端HCVR(重链可变区)和重链恒定区构成。每条轻链由N-末端LCVR(轻链可变区)和轻链恒定区构成。重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。
如本文所用的术语“修饰的人IgG1”意指经工程改造以降低人IgG1与至少一种人Fcγ受体的结合的人IgG1。通常，这通过导致所述抗体与Fcγ受体的结合降低的残基突变进行。
HCVR和LCVR区可进一步细分成间插有更保守区(称为框架区("FR"))的超变区(称为互补决定区("CDR"))。各HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR被称为"HCDR1、HCDR2和HCDR3"且轻链的三个CDR被称为"LCDR1、LCDR2和LCDR3"。CDR含有大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。出于本发明的目的，使用North CDR定义。North CDR定义(North等人, “A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal ofMolecular Biology, 406, 228-256 (2011))基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类。
本发明的DNA分子是包含非天然存在的多核苷酸序列的DNA分子，所述多核苷酸序列编码具有本发明的抗体中的至少一个多肽的氨基酸序列的多肽。
可以通过将编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子来将编码HCVR区的分离DNA分子转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以例如通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。
可以通过将编码LCVR的DNA可操作连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子来将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。
在将序列可操作连接至表达控制序列之后，可以在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。
可以通过已知方法将含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽的多核苷酸和表达控制序列)的表达载体转移至宿主细胞中，所述方法根据宿主细胞的类型而变化。
本发明的抗体可以容易地在哺乳动物宿主细胞中产生，所述哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293或COS细胞。可以使用本领域已知的技术培养宿主细胞。
可以采用各种蛋白纯化方法来纯化本发明的抗体，且此类方法是本领域已知的，且描述于，例如，Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)。
抗体表达和纯化
抗体A的重链和轻链可变区以及全长重链和轻链的氨基酸序列和编码抗体A的全长重链和轻链的核苷酸序列列在标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分中。另外，抗体A的CDR、可变区、恒定区、全长重链和轻链以及编码抗体A的全长重链和轻链的核苷酸序列的SEQ ID NO显示于表9中。
可以基本上如下所述表达和纯化本发明的抗体。可以用使用最佳预定重链：轻链载体比率的用于分泌抗体的表达系统，或编码重链和轻链两者的单一载体系统瞬时或稳定转染适当宿主细胞(诸如HEK 293或CHO)。本发明的抗体A可以使用一种或多种DNA分子，以用于分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染，所述DNA分子编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第一轻链、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二轻链。
可以使用许多常用技术之一纯化所述抗体。例如，可以将培养基便利地施加至已用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)。可以洗涤该柱以除去非特异性结合组分。可以例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液(pH 7)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)，或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))洗脱结合抗体。可以诸如通过UV吸光度或SDS-PAGE检测抗体级分，且然后可合并。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常用技术浓缩和/或无菌过滤纯化的抗体。可通过常用技术(包括大小排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模态或羟基磷灰石色谱)有效地除去可溶性聚集物和多聚体。所述纯化的抗体可以立即在-70℃下冷冻或可以冻干。
抗体A结合人PD-1和人CD137
使用Biacore® 2000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)在37℃下通过表面等离子共振测量抗体A与可溶性人PD-1-细胞外结构域(ECD)和人CD137-ECD的结合动力学和亲和力。将样品稀释于HBS-EP+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.6)运行缓冲液(Teknova 目录号H8022)中。使用胺偶联化学法，将蛋白A (5 mg/mL,Calbiochem 目录号539202)以3000至4000响应单位(RU)的水平固定在CM5传感器芯片(GEHealthcare目录号29149604)的流动室1-4上。简而言之，通过以10 µL/分钟注入EDC/NHS的1:1混合物7分钟来活化所有四个流动室的表面。将蛋白A在10mM醋酸盐，pH 4.5缓冲液中稀释至200 µg/mL，并通过以10 µL/min的流速注入7分钟，以近似3000-4000RU固定至所有四个流动室上。通过以10 µL/分钟注入1M乙醇胺-HCl pH 8.5 7分钟来封闭未反应的位点。使用五次以10 µL/分钟注入甘氨酸pH 1.5 30秒来除去任何非共价缔合的蛋白。
通过抗体捕获方法，使用多循环动力学评估结合。每个循环都在37℃下以20或25μL/min的流速进行，用于将抗体捕获至蛋白A芯片，并以100μL/min的流速进行，用于分析物缔合和解离。每个循环由以下步骤组成：注入HBS-EP+中的2.5 μg/mL的抗体，目标为流动室上50 RU的Rmax值，180或200秒注入HBS-EP+中的分析物(对于PD-1-ECD和CD137-ECD，浓度范围分别为1000 nM至1.95 nM或5000 nM至19.5nM (通过两倍连续稀释))，随后为600秒解离阶段，并使用5 μL的10 mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.5)经30秒接触时间，利用10 μL/min的流速进行再生。利用单体分子量(MW)值测定所有分析物浓度。PD-1-ECD的缔合速率(kon)和解离速率(koff)使用双重参考(通过减去流动室1参考以及减去0nM空白)进行评估，并拟合至BIAevaluation软件版本4.1中的“1:1 (Langmuir)结合”模型。根据关系KD = Koff/Kon从结合动力学计算解离常数(KD)。值报告为平均值±标准偏差。CD137-ECD结合数据使用双重参考进行评估，并使用“稳定状态亲和力(Steady State Affinity)”结合模型进行拟合，以利用Scrubber2版本2.0c (BioLogic Software Ltd.)测定亲和力(KD)。
在基本上如上所述进行的实验中，与相应的亲本抗体相比，抗体A以相当的亲和力结合人PD-1-ECD (Sino Biologicals, 目录号10377-H08H)和人CD137-ECD(内部生成)，如表10中所示。
抗体A的亲本抗体在不同于BMS20H4.9的特定氨基酸残基处结合人CD137
将点突变引入人CD137，以确定p-7A5(抗体A的抗CD137臂的亲本抗体)和BMS20H4.9结合人CD137的氨基酸残基。如本文所用，BMS20H4.9是指先前已在US7288638中描述的抗体。使用市售的定点诱变试剂盒(Quickchange II试剂盒，Qiagen)的标准方案生成CD137-Fc突变体。表达和纯化野生型和突变型CD137-Fc蛋白。此处报告的所有突变体都具有与野生型CD137-Fc的大小排阻概况相似的大小排阻概况(即引入的突变不损害蛋白的结构完整性)。为了确定突变对抗体的结合的影响，利用针对CD137-Fc野生型和突变体的点ELISA测定。将96-孔Immulon 4HBX ELISA板的孔，在4℃下在温和搅拌下用在100微升的PBS，pH 7.2中的50纳克人CD137-ECD-C121S-Fc或其突变体包被过夜。在封闭(用PBST中的5% BSA)和洗涤后，添加指定抗体的五倍稀释八点系列(100至0.00128纳摩尔)，并在室温下在温和搅拌下孵育1 h。洗涤孔并添加HRP-缀合的二抗(HRP-缀合的山羊抗Fab抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的1:10000稀释液)并遵循标准方案在室温下孵育。根据制造商的用于显现和检测信号的说明书，使用TMB过氧化物酶显色底物和终止溶液。每个浓度点的吸光度读数通过野生型相互作用的吸光度进行归一化。对于每种突变体，确定八个浓度的归一化比率的平均值。
将突变单独地引入人CD137 (SEQ ID NO:26)中的以下位置处：P27、N42、D63、Q67、A97、G98、S100、M101、Q104、K114、K115、R130、I132和R134。表11显示BMS20H4.9和p-7A5对所示的人CD137的突变体的结合概况，表明与BMS20H4.9相比，p-7A5结合人CD137上不同的氨基酸残基。在先前关于人PBMC共刺激测定中的IFNγ产生的研究中，p-7A5增强通过CD3/CD28共刺激对人PBMC的次优活化。在这方面，以5微克/ml的p-7A5处理导致IFN-γ产生的3.8倍增加，其高于PF83 (1.6倍增加)，且低于BMS20H4.9 (9.4倍增加)。如本文所用，PF83是指先前已在US8337850中描述的抗体。
抗体A拮抗人PD-1/PD-L1活性
使用NFAT-Luc报告子测定法，测试抗体A拮抗由PD-1与PD-L1连接介导的活性的能力。简而言之，表达PD-L1和人工细胞表面TCR (T细胞受体)活化剂的CHO-K1细胞(Promega专有)(Promega CS187108，PD1/PD-L1 Blockade Assay System的一部分，PropagationModel CS187109)用作抗原呈递细胞。通过逆转录病毒转移将人CD137引入表达PD-1和NFAT-Luc2报告子的Jurkat细胞(GloResponse NFAT-luc2/PD-1 Jurkat, PromegaCS187102, PD1/PD-L1 Blockade Assay System的一部分, Propagation ModelCS187109)。CHO-K1+PD-L1+TCR活化细胞(在第7-9代)用胰蛋白酶分离，并以40,000个细胞/孔接种在白色不透明96-孔组织培养板(Costar 35-3296)中的100 ul生长培养基中。CHO-K1+PD-L1+TCR活化剂生长培养基由具有10%限定的FBS (HyClone SH30070.03)、200 µg/ml潮霉素B (Thermo Fisher 10687-010)和250 µg/ml G418 (遗传霉素，Corning 30-234-CI)的Ham's F-12培养基(Corning Cellgro 10-080-CV)组成。使细胞在37℃、5% CO2和95%RH下生长过夜。第二天，在具有2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES (Gibco 22400)与2%限定的FBS (HyClone SH30070.03)的RPMI 1640中以2X工作浓度制备抗体。
将表达PD-1、CD137和NFAT-Luc2报告子的Jurkat细胞在具有2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES (Gibco)、10%限定的FBS (HyClone)、100 μg/ml潮霉素B (Thermo Fisher)、500 µg/ml G418 (遗传霉素，Corning)和1 µg/ml嘌呤霉素(Calbiochem 540411，在无菌水中)的RPMI 1640中繁殖。为了准备这些Jurkat效应子细胞(在第5代至第7代之间)用于测定，将它们离心，并以1.25 x 106个细胞/ml的浓度重悬浮于RPMI/2%限定的FBS中。从96孔板中的CHO+PD-L1+TCR活化细胞的单层小心除去95 µl培养基。每孔添加40 µl 2X处理液(包括单独培养基对照)，每种处理具有一式三份孔。然后，每孔添加40 µl Jurkat+PD1+CD137+NFAT-Luc2细胞(50,000个细胞/孔)。将测定板在37℃、5% CO2、95% RH下孵育6小时。在孵育结束时，将板在室温(RT)平衡5-10分钟。每孔添加每孔80 µl的重构的Bio-Glo™荧光素酶底物(Promega G7940)，并在室温下孵育5-10分钟。在具有EnVision Manager软件v.1.13.3009.1409、超灵敏模式和0.2秒积分时间的Perkin Elmer Envision MultimodeReader上读板。在每个板内，将发光值(相对光单位(RLU))针对从用单独的培养基处理的细胞获得的值归一化(诱导倍数= RLU处理/RLU单独培养基对照)。使用GraphPad Prism 7软件计算EC50值。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A和抗体A的抗PD-1臂的亲本抗体的EC50值分别为7.31 nM和1.40 nM。
抗体A激动人CD137
人PD-1和CD137两者在活化的肿瘤浸润淋巴细胞中表达或共表达。因此，在JurkatNFkB-Luc报告子测定(其中Jurkat T细胞经工程改造以共表达人PD-1 (每个细胞9,000个PD-1分子)和CD137 (每个细胞5,500个CD137分子))中测试抗体A激动人CD137介导的活性的能力。简而言之，将抗体与Jurkat+CD137+PD1+NFkB-Luc细胞孵育6小时。添加Bio-Glo荧光素酶底物，并在孵育结束时读取发光。数据(诱导倍数= RLU处理/RLU单独培养基对照)表示为每种处理一式三份孔的平均值。
在基本上如上所述进行的实验中，当PD-1与CD137在同一细胞上表达时，抗体A表现出的剂量依赖性的CD137激动活性大于p-7A5和PF-83的CD137激动活性，但低于BMS20H4.9的CD137激动活性，如表2中所示。数据表示为荧光素酶信号相比单独培养基对照的平均倍数变化(每种处理n=3)。
抗体A增强人PBMC的IFNγ生成
可以使用人PBMC共刺激测定法，针对抗体A促进IFNγ产生的能力检查其功能活性。使用Ficoll密度梯度离心(Ficoll-Paque PLUS; GE Healthcare)从全血或leukopac(NY Blood Center, AllCells或BioSpec)分离人PBMC，并使其在具有10%胎牛血清(HyClone)的RPMI (Life Technologies)中生长。将PBS中的抗人CD3抗体克隆HIT3 (BDBiosciences; 555336)包被至96孔板上(典型范围：3至5 ng/孔)。然后将包被的板在4℃下孵育过夜。抽吸后，将包被的孔用PBS冲洗。将人PBMC以1.5 x 105个细胞/孔的密度添加至包被的96-孔板上。通过以80 µg/mL的起始浓度在RPMI-10% FBS中以1:4向下稀释，制备抗体A、抗体p-11444(抗体A的抗PD1臂的亲本抗体)、抗体p-7A5(抗体A的抗CD137臂的亲本抗体)和对照人IgG1。将CD28抗体(BioLegend; 302933)添加至板(典型范围为0.4至2 µg/mL)，随后添加测试抗体，并在潮湿的5% CO2孵育箱中在37℃下孵育96小时。收集上清液，并使用R&D Systems DuoSet ELISA试剂盒DY285测量人IFNγ水平。简而言之，将IFNγ捕获抗体在室温下包被至板上(100 µg/mL)过夜。在抽吸和洗涤后，将板在室温下封闭一小时。添加样品上清液和IFNγ标准品，并在室温下孵育两小时。在洗涤后，添加100 μg/mL IFNγ检测抗体，在室温下孵育两小时，随后洗涤。添加链霉抗生物素蛋白-HRP (100 µL的1:40稀释液)，在室温下持续20 min。在洗涤后，添加100 µL底物溶液，持续20 min，随后添加50 µL终止溶液，并使用SpectraMax微孔板读取器(Molecular Devices)在450nm处捕获信号。使用SoftMax Pro软件和GraphPad Prism (GraphPad Software)进行数据分析。诱导倍数被计算为样品平均IFNγ (pg/ml)/对照人IgG1平均IFNγ (pg/ml)。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A的关于人PBMC的IFNγ产生(诱导倍数)的功能活性与亲本抗体的组合的功能活性相当，如下表13中所示。
抗体A在H292 NSCLC Winn肿瘤模型中诱导独特的免疫基因表达模式
检查人免疫相关基因(QuantiGene 80-plex)在来自用抗体A、抗体p-7A5、抗体p-11444和/或对照人IgG1处理的H292 Winn模型的肿瘤组织样品中的表达。简而言之，在第0天向小鼠腹膜内注射H292肿瘤细胞和冷冻的人外周血单核细胞的混合物。抗体和对照人IgG1以10 mg/kg给药，并在第1天、第8天和第15天给予。在第16天收集肿瘤组织，并在液体N2中快速冷冻。将快速冷冻的肿瘤组织裂解(来自Life Technologies的MagMAX-96总RNA分离试剂盒)并匀浆(来自Qiagen的TissueLyser)。使用MagMAX Express-96 Deep WellMagnetic Particle Processor (Life Technologies)分离总RNA，并通过分光光度计在260和280 nm的光密度处进行定量。然后使用QuantiGene 2.0 plex测定(Affymetrix)分析总RNA (500ng)的基因表达，并使用FLEXMAP 3D Luminex仪器(ThermoFisher)进行分析。使用质量控制分析脚本将MFI数据转化为相对基因表达(归一化的调整的净MFI)。每种基因的基因表达与对照组相比的倍数变化通过公式(归一化的调整的净MFI处理样品/平均归一化的调整的净MFI)来计算。通过单向ANOVA进行每种基因与对照相比的平均倍数变化的统计分析。
在基本上如上所述进行的实验中，基因表达分析显示抗体A在体内H292肿瘤组织中诱导独特的免疫相关基因表达模式，包括与T细胞浸润和活化相关的基因(例如，CD3E、CD4、CD8B、IFNγ、GZMB)，多种细胞因子和趋化因子以及MHC I类和II类抗原(例如，HLA-B、HLA-DRA)。观察到的响应于抗体A的概况与对于抗体A的亲本抗体及其组合观察到的概况不同，如表14中所示。
抗体A诱导混合白细胞中的T细胞活化(MLR反应)
在人同种异体(allo) MLR测定中检查抗体A的PD1阻断功能。人PBMC冷冻获得(AllCells)或从进行血浆去除术的新鲜全血(Indiana Blood Center)获得，并在Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)密度梯度上分离。用人单核细胞分离试剂盒II或CD14Microbeads (Miltenyi Biotec)和AutoMACS Pro分离器(Miltenyi Biotec)分离CD14+单核细胞。未成熟的树突细胞(DC)通过如下生成：将单核细胞在含有10% FBS的完全RPMI-1640培养基中在1,000 IU/mL hGM-CSF (R&D; 215-GM-050，或Sanofi; Leukine, 沙格司亭; NDC 0024-5843-01)和500 IU/mL hIL-4 (R&D; 204-IL-050或另一来源)存在的情况下培养2天(表14)或5天(表16和17)。使用人CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从不同健康供体的新鲜人PBMC (AllCells或Indiana Blood Center)纯化CD4+ T细胞。然后将来自不同供体的两种类型的细胞在96-孔V型底板中的完全AIM-V培养基(Thermo FisherScientific)中混合，每孔含有5x104 - 1x105 CD4+个T细胞和5x103个未成熟DC。测试人IgG1-EN、p-11444、p-7A5和抗体A。将连续稀释的对照或测试抗体以8次重复添加至板中(100 µL/孔)，并在5% CO2中在37℃下孵育67小时，或将测试抗体以3次重复添加至板中(200 μL/孔)，并孵育4天。收集上清液，并根据制造商的说明进行人IFN-γ ELISA (R&DSystems; SIF50, 或DY285)和人IL-2 ELISA (R&D Systems; S2050)。在九个不同的供体对间测试抗体。用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)，使用来自三个T:DC供体对的数据计算EC50值。
在使用同种异体人DC和CD4+ T细胞的MLR测定中，添加p-11444、p-11444和p-7A5的组合以及抗体A各自相对于人IgG1以剂量依赖的方式增强T细胞活化。如表x中所示，IFN-γ和IL-2产生的平均EC50增加。该测定不能检测抗CD137 Ab的活性。
总之，在几个供体对间，抗体A单独地保留与p-11444抗体相似的抗PD-1阻断功能，如通过同种异体MLR测定中的增加的细胞因子释放所测量。
抗体A在H292 NSCLC Winn肿瘤模型中证明抗肿瘤效力
检查用抗体A、p-11444、p-7A5和p-11444 + p-7A5治疗的H292肿瘤异种移植物的肿瘤生长抑制。在这些研究中使用雌性NOD/SCID Gamma (NSG)小鼠(JacksonLaboratories)。人NSCLC细胞系NCI-H292 (ATCC; CRL-1848)和人PBMC (Stem CellTechnologies)以肿瘤细胞:PBMC的4:1比率合并。离心混合物，并将沉淀以每mL 10x106个NCI-H292细胞和2.5x106个PBMC的浓度重悬浮于HBSS中。在第0天，将每只小鼠在右侧腹用0.2 mL溶液皮下植入。每项研究中包括仅接受肿瘤细胞的一个对照组。将小鼠随机分配至8只小鼠的治疗组，并在第1天开始治疗。治疗组包括对照IgG、p-7A5、p-11444、p-11444 + p-7A5的组合和抗体A。向动物以10 mg/kg腹膜内(ip)给药，每周一次，持续4周。每周两次测量体重和肿瘤体积。通过公式π/6 * 长度 * 宽度2计算肿瘤体积(mm3)，并且如果几何平均值的ΔT > 0，则通过公式100 × ΔT /ΔC计算%T/C。使用SAS软件中的MIXED程序进行统计分析。
表16中的数据证明，相对于对照IgG，以10mg/kg的抗体A治疗抑制肿瘤生长(%T/C=~2%, p<.001)，其中8只动物中的6只实现完全应答(CR)。p-11444+p-7A5的组合和单一疗法p-7A5或p-11444未显示效力。
Claims (36)
1.拮抗人PD-1和激动人CD137的抗体，其中人PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中人CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a)所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的互补决定区1(CDR1)、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的互补决定区2(CDR2)和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的互补决定区(CDR3)；
b)所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c)所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d)所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中：
a)所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b)所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c)所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d)所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
3.权利要求1和2中任一项的抗体，其中：
a)所述抗体的第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
b)所述抗体的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
c)所述抗体的第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；且
d)所述抗体的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
4.权利要求1和2中任一项的抗体，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
5.权利要求1和2中任一项的抗体，其中所述抗体是修饰的人IgG1。
6.DNA分子，其包含编码权利要求3的抗体的多核苷酸。
7.哺乳动物细胞，其包含DNA分子，所述DNA分子包含编码权利要求3的抗体的多核苷酸。
8.用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a.所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
b.所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c.所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d.所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3；任选地，其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
9.权利要求8的方法，其中：
a.所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b.所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c.所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d.所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
10.权利要求8和9中任一项的方法，其中：
a.所述抗体的第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
b.所述抗体的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
c.所述抗体的第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；且
d.所述抗体的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
11.权利要求8和9中任一项的方法，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
12.包含抗体的药物组合物，其中所述抗体拮抗人PD-1和激动人CD137，其中人PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中人CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a)所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
b)所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c)所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d)所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3；且其中：所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
13.权利要求12的药物组合物，其中：
a.所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b.所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c.所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d.所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
14.权利要求12和13中任一项的药物组合物，其中：
a.所述抗体的第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
b.所述抗体的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
c.所述抗体的第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；且
d.所述抗体的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
15.权利要求12和13中任一项的药物组合物，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
16.用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体拮抗人PD-1和激动人CD137，其中人PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中人CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a)所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
b)所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c)所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d)所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3；且其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
17.权利要求16所用的抗体，其中：
a.所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b.所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c.所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d.所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
18.权利要求16和17中任一项所用的抗体，其中：
a.所述抗体的第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
b.所述抗体的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
c.所述抗体的第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；且
d.所述抗体的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
19.权利要求16和17中任一项所用的抗体，其中所述抗体是修饰的人IgG1。
20.权利要求16和17中任一项所用的抗体，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
21.权利要求16和17中任一项所用的抗体，其中所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
22.权利要求16和17中任一项所用的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
23.用于治疗癌症的包含抗体的药物组合物，其中所述抗体拮抗人PD-1和激动人CD137，其中人PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中人CD137的氨基酸序列如SEQID NO:26所示，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a)所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
b)所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c)所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d)所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3；且其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
24.权利要求23所用的药物组合物，其中：
a.所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b.所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c.所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d.所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
25.权利要求23和24中任一项所用的药物组合物，其中：
a)所述抗体的第一重链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b)所述抗体的第一轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
c)所述抗体的第二重链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；且
d)所述抗体的第二轻链包含SEQ ID NO.23的氨基酸序列。
26.权利要求23和24中任一项所用的药物组合物，其中所述抗体是修饰的人IgG1。
27.权利要求23和24中任一项所用的药物组合物，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
28.权利要求23和24中任一项所用的药物组合物，其中所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
29.权利要求23和24中任一项所用的药物组合物，其中所述组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
30.抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体拮抗人PD-1和激动人CD137，其中人PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中人CD137的氨基酸序列如SEQID NO:26所示，且所述抗体包含第一和第二重链以及第一和第二轻链，其中每条链包含可变区和恒定区，且其中：
a)所述抗体的第一重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
b)所述抗体的第一轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO:8所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；
c)所述抗体的第二重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CDR3；且
d)所述抗体的第二轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的CDR3；且其中所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
31.权利要求30的用途，其中：
a.所述第一重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
b.所述第一轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
c.所述第二重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；且
d.所述第二轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
32.权利要求30和31中任一项的用途，其中：
a.所述抗体的第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
b.所述抗体的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
c.所述抗体的第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；且
d.所述抗体的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
33.权利要求30和31中任一项的用途，其中所述抗体是经工程改造以降低所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
34.权利要求30和31中任一项的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌、甲状腺癌、肝细胞癌或间皮瘤。
35.权利要求30和31中任一项的用途，其中所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
36.权利要求30和31中任一项的用途，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
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