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CN111593010B - 一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19‑08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明显提高畜禽采食量、促进营养消化吸收、降低料肉比，具有较高的利用价值。

Description

一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法。
背景技术
在饲料中添加抗生素可以提高仔猪生长性能及降低腹泻率和死亡率。目前中国的养殖场中都普遍使用含有抗生素的饲料添加剂，以达到预防疾病和促进生长的目的。这将增加动物体内致病性细菌产生耐药性的风险，并使这些耐药细菌和基因传递给人类。2006年1月1日，欧盟已全面禁止抗生素类添加剂在动物饲料中的应用，其他国家也加大了对抗生素的使用限制。寻找安全、高效、对环境无污染的替代品是当前急待解决的问题。
发酵饲料可以看作为活菌制剂和发酵底物的复合物，是以植物性农副产品为主要原料(底物)，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原料。
植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，利用乳酸菌来发酵饲料，通过饲喂畜禽发酵饲料，可以维持畜禽肠道内微生态平衡而发挥作用，可以降低养殖室内的氨气、硫化氢等有害气体的浓度，并且具有防治疾病、增强机体免疫力、提高生长性能、无毒副作用、无耐药性、无残留、促进生长、增加体重等优点。乳酸菌是我国农业部公布的可直接饲喂动物且允许使用的饲料级益生菌菌种之一，以其发酵饲料饲喂畜禽具有良好的抗菌性能、稳定性及对动物和人具有很好的益生作用而被用于畜禽养殖具有广阔的前景。
因此，从自然界筛选出更好的具有降解有机胺类物质功能的菌株成为研究人员的重要任务之一。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19-08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明显提高畜禽采食量、促进营养消化吸收、降低料肉比，具有较高的利用价值。
本发明提供的具体技术方案是：
本发明获得了一株新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其生物保藏编号为CGMCC No.18401，命名为YJY19-08，其具体获得方法如下：
该菌株是发明人从山东某养猪场厂新鲜粪便中取样，经初筛和复筛得到的一株高效植物乳杆菌菌株，其筛选过程如下：无菌操作取新鲜猪粪样1g，用无菌生理盐水稀释成100倍、1000倍的均匀稀释液，取0.1mL稀释液涂布于含有碳酸钙的固体MRS培养基中，35℃恒温培养48h，挑选能够产生透明圈的单菌落划线培养，挑选单菌落于甘油培养基中低温保藏，
将低温保藏的菌株接种到200mL液体MRS培养基中，32℃培养48h，检测发酵液中活菌含量、pH和产酸量；将活力最高、产酸能力最强的乳酸菌菌种送至中国科学院微生物研究所进行鉴定，根据测序结果，鉴定为植物乳杆菌，该菌株的形态学特征：菌株在固体MRS培养基呈圆形，菌落较小，边缘整齐，菌体外表面呈乳白色，凸起明亮，培养基内菌落圆扁形。在显微镜下观察，为杆状，将该菌株送至中国科学院微生物研究所进行16S rDNA测序，该序列如Seq ID No:1所示，根据测序结果鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
发明人进一步对其进行了生物保藏，生物保藏编号为CGMCC No.18401；
发明人将该菌株进行了相关产酸实验，结果发现该植物乳杆菌生长速度较快、产酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到2.8*109CFU/mL，产酸量可达到12.3g/L。
由此，发明人将其应用于生产发酵饲料，分别为制备植物乳杆菌发酵液和制备植物乳杆菌固体发酵产品：
其中制备植物乳杆菌发酵液的具体步骤如下：
(1)菌种活化：取10-30μL冻存的植物乳杆菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基中，于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子；
(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa,搅拌速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是MRS液体无菌培养基；
(4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得植物乳杆菌发酵液；
上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
上述获得的发酵液可以作为饲料添加剂直接使用，饲喂前将上述发酵液与常规普通固体饲料按1：9-1：19的重量比例混合后直接饲喂即可；
除此之外，还可以以上述发酵液为起始进行固体发酵获得相应的固体发酵产品，具体步骤如下：
(5)接种与发酵：将获得的植物乳杆菌发酵液按每克0.01-0.1毫升接种到固体培养基中，混合均匀，25-32℃条件下密封发酵72h，得到固体发酵产品；
上述固体培养基组成按重量百分比为：次粉15％、玉米粉35％、小麦麸15％、豆粕7％，加适量水，调节水分含量至40％-50％；
发明人针对上述发酵过程中液体种子中乳酸菌含量、液体种子pH及乳酸含量、发酵液乳酸菌含量、固体发酵饲料中乳酸菌含量进行了相关检测，具体过程和结果如下：
取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为2.8*109CFU/mL；
取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液离心测定pH和乳酸含量，pH为3.0-3.5，乳酸含量为10.0-15.0g/L，优选的控制pH为3.27，乳酸含量为12.3g/L；
取上述步骤(4)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为5.2*109CFU/mL；
取上述步骤(5)获得的固体发酵产品1g，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后进行乳酸菌菌落计数，计算得产品中活菌含量为4.6*109CFU/g；28℃保藏7天后剩余菌量为2.76*109CFU/g；14d后剩余菌量为1.58*109CFU/g；20d后剩余菌量为1.03*109CFU/g，存活率23％；
现有技术中的常规乳酸菌固体发酵2d菌量在20-50亿CFU/g左右，本发明所获得的菌株发酵2d菌量能稳定在45-50亿CFU/g左右，处于较高水平，表明本发明所获得的菌株的活性较高，发酵性能良好。
根据具体的实验，验证了本发明的有益效果如下：
1、本发明的植物乳杆菌生长速度较快、产酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到2.8*109cfu/mL，产酸量可达到12.3g/L；
2、应用本发明的植物乳杆菌制备发酵饲料也就是步骤(5)获得的固体发酵产品，32℃条件下发酵72h菌量可达到4.5*109cfu/g，其作为饲料直接进行饲喂时可有效抑制发酵饲料中其他微生物的生长，分解固体培养基中大分子蛋白和脂肪，提高营养水平；
3、应用本发明的植物乳杆菌制备的发酵饲料利于储存，常温密封保藏20d植物乳杆菌存活率可达到20％以上，较之常规的乳杆菌，本发明所提供的这株菌存活率较高，活性较高、耐受性强。
保藏信息，
保藏时间：2019年8月20日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.18401
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成下述实施例中所采用的菌种均为保藏号CGMCC No.18401的菌种。
实施例1
一株新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其生物保藏编号为CGMCCNo.18401，命名为YJY19-08，其具体获得方法如下：
(1)从养猪场猪舍内取新鲜粪便，无菌操作称取新鲜猪粪样1g，用无菌生理盐水稀释成100倍、1000倍的均匀稀释液；
(2)取0.1mL稀释液涂布于含有碳酸钙的MRS选择培养基中，35℃恒温培养48h；
(3)挑选能够产生透明圈的单菌落划线培养，挑选单菌落于甘油培养基中低温保藏；
(4)将低温保藏的菌株接种到200mL液体MRS培养基中，32℃培养48h，检测发酵液中活菌含量、pH和产酸量；
(5)将活力最高、产酸能力最强的乳酸菌菌种送至中国科学院微生物研究所进行鉴定，根据测序结果，鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株的形态学特征：菌株在固体MRS培养基呈圆形，菌落较小，边缘整齐，菌体外表面呈乳白色，凸起明亮，培养基内菌落圆扁形。在显微镜下观察，为杆状。将该菌株送至中国科学院微生物研究所进行16S rDNA测序，该序列如SeqID No:1所示，根据测序结果鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
发明人进一步对其进行了生物保藏，生物保藏编号为CGMCC No.18401，经检测其为存活状态；
发明人将该菌株进行了相关产酸实验，结果发现该植物乳杆菌生长速度较快、产酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到2.8*109cfu/mL，产酸量可达到12.3g/L。
上述过程中：
液体MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖15g，乙酸钠5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，pH值自然，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
MRS选择培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖15g，乙酸钠5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙7.5g，琼脂15g，pH值自然，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
实施例2
实验室中菌株的生长性能和产酸性能测定：
2.1液体菌种制备
将上述菌株接种至液体MRS培养基中，置于32℃,160-180rpm振荡培养至对数期。
将上述培养液按5％(v/v)接种到液体MRS培养基中，32℃培养48h，得到液体菌种。
2.2菌量检测
取上述液体菌种1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h进行乳酸菌菌落计数，计算得液体菌种中活菌数量为2.9*109CFU/g。
2.3产酸量检测
取种子液离心测定pH和乳酸含量，pH为3.53，乳酸含量为10.5g/L。
实施例3
制备植物乳杆菌液体发酵产品和固体发酵产品的具体步骤如下：
(1)菌种活化：取10-30μL冻存的植物乳杆菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养基中，置于35℃，160rpm振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基中，置于35℃，160rpm振荡培养24h；
(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa,搅拌速率120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是MRS液体无菌培养基；
(4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109CFU/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得植物乳杆菌发酵液；
上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
上述获得的发酵液可以作为饲料添加剂直接使用，饲喂前将上述发酵液与常规普通固体饲料按1：9-1：19的重量比例混合后直接饲喂即可；
除此之外，还可以以上述发酵液为起始进行固体发酵获得相应的固体发酵产品，具体步骤如下：
(5)接种与发酵：将上述获得的植物乳杆菌发酵液按每克0.01-0.10毫升接种到固体培养基中，混合均匀，28℃条件下密封发酵72h，得到固体发酵产品；
上述固体培养基组成按重量百分比为：次粉15％、玉米粉35％、小麦麸15％、豆粕7％，加适量水，调节水分含量至40％-50％；
取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌液体种子1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后测得活菌含量为2.8*109CFU/mL；
取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌液体种子离心测定pH和乳酸含量，pH为3.27，乳酸含量为12.3g/L；
取上述步骤(4)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为5.2*109CFU/mL；
取上述步骤(5)获得的固体发酵产品1g，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后进行乳酸菌菌落计数，计算得产品中活菌含量为4.6*109CFU/g。
对上述发酵产品发酵前后营养成分进行测定，结果见表1。
表1植物乳杆菌发酵饲料营养成分测定结果
Figure BDA0002562623100000051
结果显示，发酵10d后，粗蛋白含量基本维持不变，酸溶蛋白含量显著增加。同时，粗脂肪、粗纤维和灰分指标都有明显降低。表明该植物乳杆菌菌株具有改善发酵饲料营养结构、提高饲料利用率的作用。
实施例4
发酵饲料保藏及保育猪饲喂实验：
4.1发酵饲料保藏效果
将上述方法制备的固体发酵产品置于28℃条件下储存，定期观察是否发生霉变，是否有异常气味，同时取样检测剩余植物乳杆菌含量。
结果显示，保藏7天后剩余菌量为2.76*109CFU/g；14d后剩余菌量为1.58*109CFU/g；20d后剩余菌量为1.03*109CFU/g，存活率23％。菌存活率优于普通植物乳杆菌。发酵饲料28℃条件下储存40天不发生霉变。
4.2发酵饲料饲喂效果
选取体重相近、公母数量相同、健康状态良好的50kg左右的育肥猪20头，平均分为两组，分别为实验组和对照组每组2个重复，每个重复5头。实验为期60天，每30天为一个阶段。对照组饲喂商品化全价饲料，实验组饲喂复合饲料(发酵饲料：商品化全价料＝1:9)。各阶段实验结果见表2。
表2植物乳杆菌发酵饲料对猪生长性能的影响
Figure BDA0002562623100000061
注：A为实验组，B为对照组。
结果显示，试验组平均日增重第一个月、第二个月、整个试验期比对照组分别提高了5.53％、15.34％、10.77％；试验组料肉比较对照组分别下降了5.24％、13.30％、12.00％。表明以该植物乳杆菌为基础制备的发酵饲料具有提高采食量、降低料肉比的作用，具有较高的利用价值。
序列表
<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120> 一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 60
tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt 120
gcagcctaca atccgaactg agaatggctt taagagatta gcttactctc gcgagttcgc 180
aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 240
ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcaccaga gtgcccaact 300
taatgctggc aactgataat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac 360
gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtatccatg tccccgaagg gaacgtctaa 420
tctcttagat ttgcatagta tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgtag cttcgaatta 480
aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg 540
gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc 600
tccaacactt agcattcatc gtttacggta tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc 660
tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt 720
gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc 780
actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc ttcggttgag ccgaaggctt tcacatcaga 840
cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta 900
cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat 960
acctgaacag ttactctcag atatgttctt ctttaacaac agagttttac gagccgaaac 1020
ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga agattcccta 1080
ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg attaccctct 1140
caggtcggct acgtatcatt gccatggtga gccgttaccc caccatctag ctaatacgcc 1200
gcgggaccat ccaaaagtga tagccgaagc catctttcaa gctcggacca tgcggtccaa 1260
gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca ggtgttatcc cccgcttctg ggcaggtttc 1320
ccacgtgtta ctcaccagtt cgccactcac tcaaatgtaa atcatgatgc aagcaccaat 1380
ca 1382

Claims (4)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于，其生物保藏编号为CGMCC No.18401，命名为YJY19-08；
所述的植物乳杆菌，其16S rDNA的核苷酸序列如Seq IDNo:1所示。
2.应用权利要求1所述植物乳杆菌生产发酵饲料的方法，其特征在于：制备植物乳杆菌发酵液的具体步骤如下：
(1)菌种活化：取10-30μL冻存的植物乳杆菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基中，于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子；
(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa,搅拌速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是MRS液体无菌培养基；
(4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109 /mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得植物乳杆菌发酵液；
上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌生产发酵饲料的方法，其特征在于：获得的发酵液作为饲料添加剂直接使用，饲喂前将上述发酵液与常规普通固体饲料按1：9-1：19的重量比例混合后直接饲喂即可。
4.根据权利要求2所述的植物乳杆菌生产发酵饲料的方法，其特征在于：取步骤(2)获得的液体种子离心测定pH和乳酸含量，pH为3.0-3.5，乳酸含量为10.0-15.0g/L。
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