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CN111423510B - 重组抗人pd-1抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD‑1)的抗体或其片段，以及所述抗体或其片段用于预防或治疗肿瘤或癌症的用途。本发明的抗体或其片段能够有效阻断PD‑1/PD‑L1、PD‑1/PD‑L2相互作用，而且具有独特的抗原结合表位，在药效和安全性上具有独特的性质。

Description

重组抗人PD-1抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及针对人PD-1的抗体及其用于制备药物的用途。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，也被称为CD279，是T细胞受体CD28家族的成员，表达于多种免疫细胞，如T细胞，B细胞，单核细胞等的表面，是一种在肿瘤微环境中抑制CD4+和CD8+ T细胞功能的重要的免疫检查点分子。PD-1的关键配体包括PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，它们由免疫细胞表达，并且还可以在多种组织上诱导，当T细胞上的PD-1结合PD-L1或PD-L2时，T细胞接收抑制信号，从而抑制T细胞增殖和细胞因子产生，会有效降低T细胞参与的免疫应答。而PD-L1和PD-L2在多种人类肿瘤细胞上高表达，因此使得肿瘤细胞逃避T细胞的监督(Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat.Rev.Cancer12(4)，252-264(2012))。
目前在全球范围内已上市的抗人PD-1的单抗共有3种。抗人PD-1的全人源抗体纳武单抗(Nivolumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗晚期黑色素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和肝细胞癌；抗人PD-1的人源化抗体派姆单抗(Perbrolizumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗恶性黑色素瘤，非小细胞肺癌，经典型霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤(Alsaab et al.PD-1 and PD-L1Checkpoint Signaling Inhibition forCancer Immunotherapy：Mechanism，Combinations，and ClinicalOutcome.Front.Pharmacol.8：561)。抗人PD-1的Libtayo单抗(Cemiplimab)可与PD-1结合并阻断其与PD-L1和PD-L2的相互作用，释放PD-1通路介导的免疫应答抑制，包括抗肿瘤免疫应答，临床用于治疗转移性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)患者或局部晚期CSCC患者(Markham，A.&Duggan，S.Drugs.2018.doi：10.1007/s40265-018-1012-5)。国内处于临床阶段的抗人PD-1的单抗就有10多种，适应症覆盖复发难治恶性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，B细胞非霍奇金淋巴瘤，腺泡状软组织肉瘤，晚期或复发性恶性肿瘤，食管癌、胃癌或胃食管结合部癌，鼻咽癌、头颈部鳞癌，肺癌，转移性结直肠癌，局限性肾细胞癌，尿路上皮癌，肝细胞癌，黑色素瘤，晚期三阴性乳腺癌，胸膜间皮瘤，晚期神经内分泌肿瘤，不可切除或d-mmr突变或MSI-H实体瘤。其中恒瑞的SHR-1210、百济神州的tislelizumab、信达的IBI-308已递交上市申请，君实的JS001已于12月17日有条件批准上市，名为特瑞普利单抗注射液(商品名：拓益)。
国际上，抗PD-1的抗体已经有三个上市品种，多个临床在研品种。涉及的专利包括：WO2004004771，WO2006121168，WO2008156712，WO2010029435，WO2012145493，WO2015085847，US20170044260，CN104250302，CN105330740，CN105531288等。通过分析这些专利发现，可以通过杂交瘤筛选、人源化途径，或通过噬菌体展示或者酵母表面展示技术，或通过转基因小鼠技术获得抗PD-1的抗体。其中WO2015085847中获得抗人PD-1的抗体的方法为：利用杂交瘤技术获得鼠抗体，通过抗体活性分析(ELISA(结合，阻断)，亲和力动力学)获得候选鼠抗体后；将鼠抗体轻重链基因可变区序列克隆至编码人抗体轻重链恒定区序列的上游，进行哺乳动物细胞表达，制备嵌合抗体，然后通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验确定先导抗体后；根据Germline数据库选择人源化模板，进行抗体序列人源化设计，获得的人源化抗体再次通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验验证后；再进行人源化抗体对体内外肿瘤细胞生长抑制实验进行最后的成药性评价，最终获得亲和力和特异性保持不变的PD-1人源化抗体序列。
抗体的抗原识别表位是抗体的重要特性之一。抗PD-1抗体，通过阻断PD-1与其配体PD-L1/PD-L2的结合发挥激活T细胞的作用。目前已报道的抗体虽然都能阻断PD-1与配体的相互作用，但其所针对的抗原表位却并不完全相同(Tan S，Zhang H，Chai Y，et al.Anunexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab.NatCommun.2017；8：14369)。而抗原表位的不同，可能导致抗体在药效和安全性上具有独特的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过杂交瘤筛选和人源化技术，获得特异性结合人PD-1的高亲和力抗体，其不但能够有效阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2相互作用，而且具有独特的抗原结合表位，因此在药效和安全性上具有独特的性质。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种特异性结合人PD-1的抗体或其功能片段，并提供其用途。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的轻链CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)、CDR3(LCDR3)和/或重链CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)、CDR3(HCDR3)：
在本发明提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：
在本发明提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：
选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的LCDR1；
选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的LCDR2；
选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的LCDR3；和/或
选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的HCDR1；
选自SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的HCDR2；
选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51的HCDR3。
在本发明提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区包含以下序列组合所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3：
组合 LCDR1 LCDR2 LCDR3
1 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
2 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
3 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
4 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
5 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
6 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：18
7 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：18
8 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：18
9 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：18
10 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：18
11 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：19
12 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：20
13 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：21
14 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：22
15 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：23
16 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：24
17 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：25
18 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：26
19 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：27
20 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：18
21 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：22
22 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：25
23 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：22
24 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：22
和/或，所述重链可变区包含以下序列组合所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：
优选地，所述轻链可变区和重链可变区包含以下序列组合所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3：
本发明提供的抗体或其片段具有以下活性中的一个或多个：
(1)阻断PD-1与其配体PD-L1或PD-L2的结合；
(2)特异性结合灵长类动物PD-1，与非灵长类动物PD-1无交叉反应；
(3)不结合除PD-1之外的其他CD28家族成员；
(4)在CD4+ T细胞中诱导IL-2和/或IFN-γ产生；
(5)无ADCC效应功能。
优选地，所述抗体或其片段结合人PD-1N58糖链；优选地，所述抗体或其片段的重链可变区包含SEQ ID NO：47所示氨基酸序列。
优选地，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，
所述重链可变区包含SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的抗体或其片段中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：52所示氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO：54所示氨基酸序列；或者所述轻链可变区包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列。
在本发明提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO：60所示氨基酸序列的残基编号和组成，所述变体相对于SEQ ID NO：60具有选自以下的一个或多个、优选1-3个氨基酸置换：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y91A、Y91F、S92D、S92N、R93N、R93S、Y94F、W96G和W96Y；优选地，所述变体相对于SEQ ID NO：60具有选自以下的一个或多个、优选1-3个氨基酸置换：K24R、V32A、V32Y、T56S、S92D、S92N、R93S和Y94F；
和/或
所述重链可变区包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO：62所示氨基酸序列的残基编号，所述变体相对于SEQ ID NO：62具有选自以下的一个或多个、优选1-3个氨基酸置换：S31D、Y32A、Y32N、D33S、D33Y、S52K、S52W、G53S、G53Y、G54D、G54S、G55S、S56G、Y57T、Y59A、Y59T、D100E、D100Y、S101A和Y106T；优选地，所述变体相对于SEQ ID NO：62具有选自以下的一个或多个、优选1-3个氨基酸置换：S31D、Y32A、D33S、G53S、G54S、G55S、Y59A和D100Y。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供变体抗体或其片段，所述变体抗体或其片段的重链可变区包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，而轻链可变区相比SEQ ID NO：60所示氨基酸序列的残基编号和组成，仅具有以下氨基酸置换：1)K24R；2)E30S；3)V32A；4)V32Y；5)W50A；6)W50G；7)H55A；8)H55Q；9)T56S；10)Y91A；11)Y91F；12)S92D；13)S92N；14)R93N；15)R93S；16)Y94F；17)W96G；18)W96Y；19)K24R和T56S；20)K24R和S92N；21)K24R和Y94F；22)T56S和S92N；或，23)K24R、T56S和S92N。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供变体抗体或其片段，所述变体抗体或其片段的轻链可变区包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，而重链可变区相比SEQ ID NO：62所示氨基酸序列的残基编号和组成，仅具有以下氨基酸置换：1)S31D；2)Y32A；3)Y32N；4)D33S；5)D33Y；6)S52K；7)S52W；8)G53S；9)G53Y；10)G54D；11)G54S；12)G55S；13)S56G；14)Y57T；15)Y59A；16)Y59T；18)D100E；19)D100Y；20)S101A；21)Y106T；22)D33S和G54S；23)D33S和Y59A；或，24)G54SY59A。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供变体抗体或其片段，所述变体抗体或其片段的轻链可变区相比SEQ ID NO：60所示氨基酸序列的残基编号和组成，仅具有K24R、T56S和S92N的氨基酸置换，并且重链可变区相比SEQ ID NO：62所示氨基酸序列的残基编号和组成，仅具有D33S和G54S的氨基酸置换，或仅具有G54S和Y59A的氨基酸置换。
本发明提供的抗体可以为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式；优选地，所述抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1或IgG4；
本发明提供的片段为所述抗体能够特异性结合PD-1或其任何部分的片段；优选地，所述片段为所述抗体的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。
优选地，本发明提供的抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型；
进一步优选地，所述抗体的轻链恒定区包含SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：64所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；其中，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的抗体中，所述轻链可变区包含SEQID NO：52所示氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NO：56所示氨基酸序列，重链可变区包含SEQ ID NO：54所示氨基酸序列，重链恒定区包含SEQ ID NO：58所示氨基酸序列；或者，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，重链可变区包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列，重链恒定区包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列。
基于本发明的抗体或其片段，本发明还提供包含本发明的抗体或其片段的缀合物或融合蛋白。该缀合物或融合蛋白可包含通过化学或物理方法结合于本发明所述抗体或其片段的其他部分，例如细胞表面受体、小分子化合物如氨基酸和糖类、小分子聚合物或对本发明所述抗体进行修饰的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽。例如，该缀合物或融合蛋白可以是包含本发明所述抗体或其片段的双特异性抗体。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明任意抗体或其片段中的重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区、重链或轻链；
优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：67所示核苷酸序列。
还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。
因此，另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
基于本发明的公开内容，本发明提供的抗体或其片段以及相应的缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以通过使用本领域已知的任何常规技术方法获得。所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。
因此，在又一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
作为特异性结合人PD-1或其任何部分的抗体或其片段，本发明还提供上述主题的相关应用。
具体而言，再一方面，本发明提供本发明所述的抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。优选地，所述肿瘤或癌症选自非小细胞肺癌、经典霍德金淋巴瘤、胃癌、(原发性)肝癌、黑色素瘤、d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤、宫颈癌、头颈部鳞癌、尿道膀胱癌、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌和尿路上皮癌；更优选地，所述肿瘤或癌症为非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、头颈部鳞癌、经典霍德金淋巴瘤或尿路上皮癌。
还一方面，本发明提供一种药物组合，其包括：
(1)本发明所述的抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物；(2)其他免疫增强药物或手段，例如小分子化药、靶向药、抗体等重组蛋白药，疫苗、ADC、溶瘤病毒、基因和核酸治疗药物和放射疗法。
另外，本发明提供一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物，以及任选的其他药物或手段。优选地，所述肿瘤或癌症选自非小细胞肺癌、经典霍德金淋巴瘤、胃癌、(原发性)肝癌、黑色素瘤、d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤、宫颈癌、头颈部鳞癌、尿道膀胱癌、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌和尿路上皮癌；更优选地，所述肿瘤或癌症为非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、头颈部鳞癌、经典霍德金淋巴瘤或尿路上皮癌。该任选的其他药物或手段是指可以与本发明抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物联合施用的其他免疫增强药物或手段，例如小分子化药、靶向药、抗体等重组蛋白药，疫苗、ADC、溶瘤病毒、基因和核酸治疗药物和放射疗法。二者的联合施用可以采取任意形式进行，例如同时、连续或间隔一定时间进行。所述受试者为哺乳类动物，优选地，所述受试者为人。
再一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物。
在本发明中，利用人PD-1胞外区结构域重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)，免疫小鼠后取脾细胞，利用杂交瘤技术筛选获得与人PD-1胞外区结构域重组蛋白和细胞表面人PD-1均具有高亲和力结合，并且能特异性阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2配受体结合的抗体分子(本发明中命名为317)，进一步通过人源化技术获得亲和力和特异性保持不变的人源化抗体(本发明中命名为h317)，对其全抗体IgG4的结合、阻断、促进T细胞活化及体内抗肿瘤药效进行了全面的评估，并且构建了其Fab和PD-1-ECD的晶体复合物，通过晶体衍射和进一步的突变体验证确认了其抗原结合表位。
实验证明，本发明抗体能够有效阻断PD-1和PD-L1/PD-L1的结合，同时与Nivolumab和帕博利珠单抗(Keytruda)具有竞争结合关系；但是，通过抗原抗体复合物晶体结构分析发现，本发明抗体的抗原结合表位与Nivolumab和Keytruda均不同，是首个明确抗原表位与PD-1的第58位Glu的N糖基化位点相关的抗体分子。
具体而言，与现有技术相比，本发明具有以下有益之处：
第一，本发明的抗体为具有高亲和力的抗PD-1人源化抗体。
本发明的人源化抗PD-1抗体h317可以特异性结合人PD-1蛋白，其亲和力(KD)为6.16E-09M，而对照抗体Nivolumab亲和力(KD)为8.06E-09M，且在同等条件下，h317解离(kd(1/s)9.50E-04)优于Nivolumab解离(kd(1/s)：1.69E-03)，表明h317与人PD-1具有高亲和力，为h317对PD-1/PD-L1信号通路的抑制作用提供了依据。
第二，本发明的抗体具有良好的生物学活性。
实验证明，本发明的h317可以有效阻断重组人PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合作用，二者IC50均为1.4nM，与对照抗体Nivolumab(IC50：1.3nM)的阻断活性相近，并且在体外实验中证明h317可以促进人混合淋巴细胞分泌杀伤性细胞因子IL-2和IFN-γ，即可以诱导Th1型细胞介导的免疫反应。
第三，本发明的抗体具有特殊的抗原识别表位。
本发明抗体特异性结合人PD-1，其结合的抗原表位具有独特性。
PD-1-h317-Fab复合物整体结构分析显示，PD-1抗原(胞外区1-167aa)以单体形式存在，与PD-1抗体的h317-Fab片段形成一个1∶1的复合物结构。PD-1与抗体的结合部位主要是在其loop区，包括BC loop，C’D loop和FG loop区域。此外，在PD-1抗原结构中可以观察到N49、N58、N116位点的糖基化，N74的糖基化位点不明确，其中N58位的糖链参与了与h317-Fab的结合。相比之下，其他已报道的PD-1抗原抗体复合物结构中该位点的糖链没有参与二者相互作用。并且，根据晶体复合物信息将PD-1上的4个糖基化位点分别定点突变为丙氨酸(A)，并瞬转至293细胞，通过FACS检测h317与PD-1-mut分子的结合情况，结果表明PD-1的N58位突变为A失去糖基化使得h317失去与PD-1的结合能力，因此h317是首个明确抗原表位与N58糖链相关的抗体分子。
第四，本发明抗体在PD-1转基因鼠移植瘤模型中有明显的抑瘤效果。
在PD-1转基因鼠移植瘤模型中，h317在高剂量(10mg/kg)和中剂量(2mg/kg)下可显著抑制PD-1转基因鼠皮下移植瘤的生长，在高中剂量水平下h317与其参比抗体Nivolumab的抑瘤效果相当。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了ELISA检测阳性杂交瘤上清与人PD-1胞外区结构域重组蛋白的结合情况，其中1A、1B、1C分别示出了第一轮、第二轮、第三轮的结果。
图2显示了ELISA检测阳性杂交瘤克隆上清与不同种属重组PD-1之间的交叉反应情况，其中Nivo为纳武单抗。
图3显示了克隆317的抗体亚型鉴定，其中显示重链为IgG1，轻链为Kappa链。
图4显示了317嵌合抗体(4A)和Nivolumab(4B)对人PD-1胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果。
图5显示了h317抗体(5A)和Nivolumab(5B)对人PD-1胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果。
图6显示了ELISA测定h317抗体和Nivolumab竞争抑制PD-1与PD-L1(6A)、PD-1与PD-L2(6B)的结合情况。
图7显示了h317与不同种属重组PD-1的结合分析曲线。
图8显示了h317与CD28家族成员的结合分析曲线。
图9显示了h317刺激MLR生成IL-2(9A)和IFN-γ(9B)的检测结果。
图10显示了h317介导人PBMC对293T/hPD-1细胞ADCC效应的结果。
图11显示了h317抑制PD-1转基因鼠皮下移植瘤增长的肿瘤体积统计结果。
图12显示了PD-1介导的h317内吞情况。
图13显示了PD-1-h317-Fab复合物整体结构。
图14显示了PD-1-h317-Fab复合物分子间相互作用，其中A为PD-1与h317-Fab的结合部位，B为BC loop与h317-Fab相互作用，C为C’D loop与h317-Fab相互作用，D为FG loop与h317-Fab相互作用。
图15显示了PD-1N58的糖链与h317-Fab的相互作用。
图16显示了h317与人PD-1-mut重组蛋白结合情况，其中每次实验各抗体与WT的MAPC做为标准，取值为1，计算本次实验其他各组的APC，三次平行实验的结果。
图17显示了h317-Fab与PD-L1竞争性结合PD-1，其中A为PD-1-h317-Fab复合物与PD-1-PD-L1结构比较，灰色为PD-1，砖红色为PD-L1，蓝色和绿色为h317-Fab的重链和轻链；B为作用表面比较，灰色为PD-1分子表面，绿色为317-Fab作用部分，砖红色为PD-L1作用部分，黄色为317-Fab和PD-L1都作用的部分。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：抗人PD-1抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定及抗体序列测定
免疫：小鼠免疫采用弗氏佐剂和水溶佐剂两种免疫方法，弗氏佐剂在第0天和第14天给小鼠进行两次腹腔免疫注射，水溶佐剂在第0天和第21天给8-10周龄Balb/c小鼠进行两次肌肉免疫注射小鼠，免疫抗原为：人PD-1/mFc重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.3.16)，由北京科诺信诚科技有限公司在HEK293细胞中重组表达。第一次免疫剂量为50μg，第二次免疫剂量为25μg。免疫前取小鼠血清作为检测时的阴性对照，弗氏佐剂在初次免疫后第28天，水溶佐剂在初次免疫后第35天尾静脉取血，用包被重组人PD-1蛋白的96孔酶标板以ELISA法检测血清滴度；血清滴度达到融合要求的小鼠加强免疫，将25μg抗原用D-PBS稀释成500μl，腹腔注射。初次免疫后第38天取血清滴度高的小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。
细胞融合及杂交瘤制备：初次免疫后第38天，选取滴度达到要求的小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；并无菌取小鼠脾脏，制备B淋巴细胞悬液，与FO骨髓瘤细胞以5∶1的比例混合，在PEG4000作用下使两种细胞融合。融合后的细胞用HAT培养基重悬后，分装含有巨噬细胞的96孔细胞培养板。置37℃，5％CO2培养箱内培养。两周后换HT培养基继续培养2周，然后换R1640完全培养基。
阳性杂交瘤筛选：融合后10-14天，以人PD-1/His重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22)(10μg/ml，pH9.6，0.1M NaHCO3)包被酶标板，4℃，过夜；用4％脱脂奶粉-PBS封闭，37℃，2hr；用PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入杂交瘤克隆培养上清，37℃，1hr。设以下对照：(1)阳性对照：免疫后小鼠血清(用PBS 1∶1000稀释)(2)阴性对照：免疫前小鼠血清(用PBS 1∶1000稀释)(3)空白对照：PBS。经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入HRP-羊抗小鼠IgG(Fcγ)，1∶20000稀释，37℃，1hr；再经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗五遍，加入OPD显色液，避光显色10-15min，加入2M H2SO4终止反应；酶标仪读A490值。检测孔A490值大于阴性对照孔A490值2.1倍以上判断为阳性。为确定阳性克隆的可靠性，在一次筛选换液后隔一天再进行第二轮筛选，共进行三轮筛选。经检测鉴定，共获得多个抗体分泌阳性细胞株(图1)：6，317，500，763，795，904号。
将重组人PD-1/His(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22)、食蟹猴(Cat：90311-C08H，北京义翘神州)、大鼠(Cat：80448-R08H，北京义翘神州)及小鼠(Cat：50124-M08H，北京义翘神州)PD-1蛋白4℃包被过夜，包被浓度1μg/mL；PBS洗板3次后，加入5％BSAPBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入稀释100倍的杂交瘤上清，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1∶5000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG(Fcr)(Cat：115-035-071，JacksonImmuno Research)，37℃孵育30min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。共选用五个(317，500，763，795，904号)杂交瘤上清进行不同种属重组PD-1之间的交叉反应检测，ELISA结果显示五个抗体均可以特异性地与重组人、食蟹猴PD-1结合，但与重组大鼠、小鼠PD-1则无结合活性，不产生交叉反应(图2)。选择其中317号克隆用于下一步的序列鉴定。
将分泌抗人PD-1抗体的杂交瘤细胞317号克隆扩大培养后，用Mouse MonoclonalAntibody IgG Subclass Test Card(Cat：A12403)及Mouse Monoclonal Antibody Light/Heavy Chain Test Card(Cat：A12401)按照试剂操作规程进行亚型检测，亚型鉴定为：重链为IgG1，轻链为Kappa链(图3)，为317抗体基因的克隆提供依据。
将317杂交瘤细胞按照TRIzol试剂盒(Cat：15596026，Invitrogen)说明书步骤提取细胞总RNA；利用M-MuLV反转录酶(Cat：M0253S，NEB)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物(表1，表2)和Phusion试剂盒(Cat：E0553L，NEB)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用胶回收试剂盒(Cat：AP-GX-250，Axygen)纯化PCR扩增产物；按照T载体克隆试剂盒(Cat：ZC205，庄盟生物)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。测序结果显示317抗体轻链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：53，由该DNA序列推测得到317抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：52；317抗体重链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ IDNO：55，由该DNA序列推测得到317抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：54。
表1.轻链PCR扩增引物
表2.重链PCR扩增引物
实施例2：抗人PD-1嵌合抗体的制备
将克隆获得的单克隆抗体轻链可变区和重链可变区基因通过如下引物(表3)PCR引入酶切位点，分别克隆至装有人-kappa轻链恒定区和人IgG4重链恒定区编码基因上游的真核表达载体中，获得人-鼠嵌合轻链(pKN019-317L)和人-鼠嵌合重链(pKN034-317H)表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含人-鼠嵌合抗体轻链和重链的质粒，将二者与293fectin混合后共转染入HEK293细胞中。细胞转染5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得的317嵌合抗体利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器，采用抗人抗体捕获法测定抗体亲和力。测定时将抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针浸泡于PBS，10min；将4μl稀释后的抗体样品(317嵌合抗体，Nivolumab，20μg/mL)分别上样到2根AHC生物探针上，然后在PBS中平衡30s，进一步将AHC探针与不同稀释浓度的人PD-1-His重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22)(1μM，0.6μM及0nM)进行结合反应，结合时间45s，之后将AHC探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为120s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1∶1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
317嵌合抗体(图4，4A)及对照抗体Nivolumab(图4，4B)与人PD-1重组蛋白的反应曲线如图4所示，拟合曲线并计算亲和力，结果317嵌合抗体亲和力(KD)为1.02E-09M，Nivolumab亲和力(KD)为1.01E-09M。详细动力学参数如表4所示。结果表明317嵌合抗体与人PD-1具有高亲和力，且在同等条件下，解离值与对照抗体Nivolumab相近。该结果为317抗体的人源化及对PD-1/PD-L1信号通路的抑制作用提供了理论依据。
表3. 317抗体轻链及重链可变区克隆引物
表4. 317嵌合抗体与人PD-1胞外区结构域重组蛋白的亲和力测定结果
KD值(M) kon(1/Ms) kd(1/s)
317 2.64E-09 2.15E+05 5.66E-04
Nivolumab 2.018E-09 3E+05 6.05E-04
实施例3：抗人PD-1单克隆抗体的人源化及稳定细胞株的构建
首先对鼠源抗体重链序列进行综合分析，确定抗体与抗原结合的抗原互补决定簇(CDR)区域及支撑抗体保守三维构象的框架区(framework)。随后根据同源性比对结果，在人抗体germline库(http：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)寻找最相似人源抗体模板，选择VH3(3-21)为基础模板，结合全序列blast结果，考虑重排(rearranged)抗体在特定FR区位点氨基酸出现频率(A49)，进行CDR移植，考虑FR3区(S98)靠近CDR3区，不进行更换，根据CDR3序列(Pdssgvay)情况，选择JH4(wgqgtlvtvss)为J区序列，实现了H1在框架区的高度人源化。根据同源性比对结果，在人抗体germline库(http：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)寻找最相似人源抗体模板，选择VK II(A19)为基础模板，结合全序列blast结果，考虑重排抗体在特定FR区位点氨基酸出现频率(R45)，进行CDR移植，根据CDR3序列(Qqysrypw)情况，选择JK1(fgqgtkveik)为JK区序列，实现了轻链框架区的全人源化。
将317抗体鼠源序列进行全人源化设计并全合成该序列，并将人源化后的317抗体命名为h317，将人源化的h317-VH1通过酶切克隆入真核表达载体pKN034的人IgG4的重链恒定区编码基因的上游，将人源化的h317-VL2通过酶切克隆入真核表达载体pKN019的人轻链Cκ的编码基因的上游，构建人源化317轻、重链表达载体，将h317-H和L通过酶切的方法克隆至pKN002真核稳定高表达载体，通过Pvu I线性化后，利用Nucleofector 2b电转仪(300452，Lonza)，将h317基因整合到CHO细胞DNA中，经过MSX(Cat：M5379-500MG，Sigma)加压筛选及亚克隆得到最终高表达h317的稳定细胞株。317人源化后轻链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：61，氨基酸序列见SEQ ID NO：60；人源化后重链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：63，氨基酸序列见SEQ ID NO：62。
实施例4：h317与人PD-1蛋白的结合动力学研究
h317及Nivolumab的生物素化：将200μL的5mg/ml EZ-LinkNHS-LC-LC-Biotin(Cat：21343，Thermo)室温放置5分钟，与1ml 1mg/mL的h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药有限公司)或Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)蛋白溶液混匀，室温放至30min。超滤浓缩至0.5mL，以280nm的吸收值测定蛋白含量，分装，-80℃保存，冻融不超过1次。
结合动力学测定：利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用Streptavidin捕获Biotin标记抗体法测定抗体亲和力。测定时将Biotin标记的抗体(h317-biotin，Nivolumab-biotin)用PBS缓冲液稀释至5μg/mL，流经预包被了Streptavidin的探针(Cat：1612101，PALL)表面，时间为120s。人PD-1重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)作为流动相，用PBS作两倍浓度梯度稀释，其浓度范围为100nM～12.5nM。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1∶1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
结果显示h317(图5，5A)及对照抗体Nivolumab(图5，5B)与人PD-1重组蛋白的反应曲线如图5所示，拟合曲线并计算亲和力，h317亲和力(KD)为6.16E-09M，Nivolumab亲和力(KD)为8.06E-09M。详细动力学参数如表5所示。结果表明h317与人PD-1具有高亲和力，且在同等条件下，解离值优于对照抗体Nivolumab。该结果为h317对PD-1/PD-L1信号通路的抑制作用提供了理论依据。
表5.h317与人PD-1胞外区结构域重组蛋白的亲和力测定结果
KD值(M) kon(1/Ms) kd(1/s)
h317 6.16E-09 1.54E+05 9.50E-04
Nivolumab 8.06E-09 2.09E+05 1.69E-03
实施例5：ELISA检测h317对PD-1与其配体PD-L1、PD-L2结合的抑制作用
ELISA检测h317对PD-1与PD-L1结合的抑制作用：将人PD-1-hFc(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329)浓度稀释至0.5μg/mL，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。加入h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药有限公司)或Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)(起始浓度为3μg/mL，1.5倍连续稀释)，37℃恒温培养箱反应120min，加入1μg/mL的PD-L1-mFc(序列号：NP_054862.1，19aa-238aa，Lot：20180412)与抗体共孵育，37℃恒温培养箱反应60min。然后加入1∶5000稀释的HRP-anti-mouse Fc(Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research)，反应45min，加入TMB(Cat：ME142，北京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl终止后读板。以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm-630nm。
ELISA检测h317对PD-1与PD-L2结合的抑制作用：将PD-1-hFc(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329)浓度稀释至0.5μg/mL，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。加入h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)或Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)(起始浓度为3μg/mL，1.5倍连续稀释)，37℃恒温培养箱反应120min，加入2μg/mL的PD-L2-hFc-Biotin(序列号：NP_079515.2，20aa-220aa，Lot：2016.12.05)，与抗体共孵育，37℃恒温培养箱反应60min。然后加入1∶2000稀释的HRP-streptavidin(Cat：S2438，Sigma)反应30min，加入TMB底物显色15min，2M HCl终止后读板。以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm-630nm。
结果显示h317可以有效阻断重组人PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合作用。通过ELISA测定了h317和Nivolumab对PD-1与其配体PD-L1结合的竞争抑制效应，其半数有效抑制浓度(IC50)值分别1.4nM和1.3nM(图6，6A)。通过ELISA测定了h317和Nivolumab对PD-1与其配体PD-L2结合的竞争抑制效应，其半数有效抑制浓度(IC50)值分别1.2nM和1.0nM(图6，6A)。与Nivolumab相比，h317阻断活性相近。
实施例6：ELISA检测h317与PD-1结合的种属特异性研究
将重组人(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180423)、食蟹猴(Cat：90311-C08H，北京义翘神州)、大鼠(Cat：80448-R08H，北京义翘神州)及小鼠(Cat：50124-M08H，北京义翘神州)PD-1蛋白4℃包被过夜，包被浓度1μg/mL；PBS洗板3次后，加入5％BSAPBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入不同稀释倍数的生物素化的h317(同实施例4)(起始浓度为1μg/mL，3倍梯度依次稀释11个浓度)，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1∶100稀释的HRP-streptavidin(Cat：019-035-098，Jackson Immuno Research)，37℃孵育30min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
实验结果表明，h317可以特异性地与重组人、食蟹猴PD-1结合(图7)，其半数有效结合浓度(EC50)值分别为0.004703nM及0.01823nM，但与重组大鼠、小鼠PD-1则无结合活性，不产生交叉反应(图7)，为h317进行体内外药效学实验提供依据。
实施例7：ELISA检测h317与CD28家族成员结合的专一性研究
将重组人PD-1(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180423)、CD28(Cat：11524-HCCH，北京义翘神州)、CTLA4(Cat：11159-H08H，北京义翘神州)及ICOS(序列号：NP_036224.1，1aa-199aa)蛋白4℃包被过夜，包被浓度1μg/mL；PBS洗板3次后，加入5％BSAPBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入不同稀释倍数的生物素化的h317(同实施例4)(起始浓度为1μg/mL，3倍梯度依次稀释11个浓度)，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1∶100稀释的HRP-streptavidin(Cat：019-035-098，Jackson Immuno Research)，37℃孵育30min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
实验结果表明，h317可以特异性地与重组人PD-1结合，与其他CD28家族成员无结合活性，不产生交叉反应(图8)，为h317进行体内外药效学实验提供依据。
实施例8：h317体外刺激人T细胞(PBMC)活性研究
A.分离CD14+单核细胞和DC细胞的分化
根据Ficoll-Paque PLUS(Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare)试剂提取说明提取PBMC后，按照CD14磁珠(Cat：130-050-201，Lot：5170814438，Miltenyi)说明，阳选CD14+单核细胞。随后将细胞用ImmunoCultTM DC Differentiation Medium(Cat：10988，Lot：17G83035，STEMCELL)重悬至5×105细胞/ml，5ml体积接入到一个T-25细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3天后，离心换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2天后，加入50μl的ImmunoCultTM Dendritic Cell Maturation Supplement(Cat：10989，Lot：17B77271，STEMCELL)，混匀后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2天，用于MLR实验。
B.CD4+ T细胞的分离提取
根据Ficoll-Paque PLUS(Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare)试剂提取说明提取PBMC后，按照CD4+ T细胞分离试剂盒(Cat：130-096-533，Lot：5171016623，Miltenyi)说明，从PBMC中分离CD4+ T细胞，用于MLR实验。
C.MLR实验
先用完全培养基配置浓度为8μg/mL的待测抗体(h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)，Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)，Human NC-IgG4对照(Lot：AB170090)溶液，再进行10倍梯度稀释，共配制6个浓度。随后根据实验板的设计加50μL的抗体到相应的孔中。将CD4+ T细胞的浓度调整到1×106/mL，加100μL(1×105/孔)的细胞悬液到相应的孔中。用2mM的EDTA消化DC细胞，1500rpm离心5min，调整DC细胞的浓度为2×105/mL，加50μL(1×104/孔)DC细胞悬液到相应孔中，总体积为200μL，CD4+ T细胞∶DC细胞＝10∶1。将96孔细胞培养板置37℃细胞培养箱中培养5天后，收集细胞上清液，用IFN-γELISA试剂盒(Cat：430106，Lot：B247782，Biolegend)，IL-2 ELISA试剂盒(Cat：DY202，Lot：P155804，R&D)检测IFN-γ和IL-2的浓度。
检测结果表明，h317体外刺激人混合淋巴细胞，可促进其分泌杀伤性细胞因子IL-2(图9，9A)和IFN-γ(图9，9B)，提示h317可以诱导Th1型细胞介导的免疫反应。
实施例9：h317对293T/hPD-1细胞的ADCC毒性作用研究
根据Ficoll-Paque PLUS(Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare)试剂提取说明提取PBMC后，细胞重悬在ADCC培养基(无酚红RPMI1640培养基(Cat：11835-030，Lot：1860152，Gibco)+2％FBS(Cat：SH30084.03，Lot：GAE0138，Hyclone))中。对得到的PBMC进行细胞计数，按照NK细胞分离试剂盒(Cat：130-092-657，Lot：5170911524，Miltenyi)说明，进行NK细胞分离，用于ADCC毒性分析。按照CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒(Cat：G1781，Lot：0000265175，Promega)说明，取在对数生长期的表达人PD-1蛋白的293T细胞，用ADCC培养基稀释调整目的细胞悬液浓度为50×104个/mL，在96孔圆底板中每孔加入40μL细胞悬液，每孔加入10μL药物溶液(每个细胞浓度设置三个复孔)，并在室温孵育30分钟。被测抗体(h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)，h317-hIgG1(Lot：20180528)，Human NC-IgG4(Lot：20180521))终浓度为10000ng/mL，1000ng/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。通过加入调整至不同浓度的50μL NK细胞细胞悬液，设置两个E∶T比例10∶1、5∶1。将96孔板于250g离心4min，让效应细胞和目的细胞的充分接触，在37℃、5％CO2、95％空气条件下进行细胞培养4h。转移上清前45min时，在最大裂解对照孔(maxlysis孔)中加入10μL裂解液(每100μL加入10μL)。孵育4h后，250g离心5min。将50μL上清转移到干净的96孔平板中。加入50μL反应底物并混合30s后，在室温孵育30min。加入50μL终止液并混合30s后，读取吸光度值(OD490nm)。
将实验组孔数值，目的细胞对照孔数值，NK细胞+目的细胞孔数值减去培养基对照孔数值。将得到的数值用下列公式计算细胞毒性。
实验结果表明，h317与293T细胞表面的hPD-1结合后并不启动人PBMC(外周血单个核细胞)中NK细胞对靶细胞的杀伤作用(图10)。与不加抗hPD-1抗体的对照组相比，h317对高表达hPD-1的293T细胞没有ADCC活性。结论是h317没有ADCC效应功能。
实施例10：h317在PD-1转基因鼠移植瘤模型中的药效体内抗肿瘤药效评价
试验共选用65只HuGEMMPD-1小鼠(6-8周，上海南方模式生物)，在受试小鼠右侧皮下接种MC38-hPD-L1肿瘤细胞(1×106/只，1×106细胞重悬于100μL PBS)。当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达约60-100mm3时，测定动物体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积，开始给药，给药前使用StudyDirectorTM(版本号3.1.399.19，供应商Studylog System，Inc.，S.SanFrancisco，CA，USA)进行随机分组，共分为6组，进行给药(D0)，每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见表6，给药、肿瘤测量及体重称量等全部过程都在生物安全柜或超净工作台中进行。实验中使用StudyDirectorTM(版本号3.1.399.19，供应商Studylog System，Inc.)软件收集数据，包括肿瘤的长短径的测量和动物体重的称量，原始数据由天平和游标卡尺测量后直接导入软件，当对照组小鼠瘤体积均值超过2000mm3时或最后一次给药后一星期终止实验。并收集肿瘤块，测量肿瘤重量，拍摄肿瘤照片，结束实验当天取瘤做FACS，每组4只(与采集血液动物编号对应)，Marker：CD3，CD4，CD8，CD45，Live/Dead。结实验当天取全血做FACS，每组4只(与采集肿瘤动物编号对应)，Marker：CD3，CD4，CD8，CD45。
表6.药效学实验设计
注：给药体积为10μL/g；hIgG对照(Lot：20180521)，h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)，Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)
HuGEMMPD-1小鼠模型是基因工程鼠，是在C57BL/6J遗传背景下，将人源PD-1蛋白编码区插入到小鼠PD-1的ATG位置，表达人源PD-1，取代小鼠PD-1的表达。MC38是C57BL/6小鼠中诱导获得的鼠源肠癌细胞系。通过基因工程的方法，敲除MC38的鼠源PD-L1，并敲入人源PD-L1，获得了表达人源PD-L1的MC38细胞系，即MC38-hPD-L1细胞系。在PD-1转基因鼠移植瘤模型上评价并比较了h317及其参比抗体Nivolumab对肿瘤生长的抑制效果。结果表明(见图11，表7)，h317在高剂量和中剂量下可显著抑制PD-1转基因鼠皮下移植瘤的生长，并且在高中剂量水平下h317与其参比抗体Nivolumab的抑瘤效果相当。
表7.各组PD-1转基因鼠皮下移植瘤的瘤重数据及统计分析
注释：a.数据以“平均值±标准误差”表示；n＝8
b.p值运用单因素方差分析(one way ANOVA)肿瘤体积所得，F值有显著性差异(p＜0.05)，应用Dunnett’s T3法进行分析。
实施例11：h317结合PD-1受体内化
瞬时表达人PD-1的293细胞株的构建：将HEK293细胞按6*105个/ml的密度接入摇瓶中，体积10ml，置于37℃，5％CO2的振摇培养箱中130rpm振摇培养24h。将编码全长人PD-1(NP_005009.2，21aa-288aa)表达质粒与293fectin(Cat：12347019，Gibco)按1∶1.2的比例分别在0.5mL Opti-MEM(Cat：11058021，Gibco)培养基中静置5min后，二者混匀室温静置15min，然后加入到HEK293细胞中。置于37℃，5％CO2的振摇培养箱中130rpm振摇培养48h，293/hPD-1细胞用于FACS检测。
PD-1介导的h317内吞：Mix-n-StainTM CFTM 488A(Cat：MX488AS100，Sigma)标记h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药有限公司)和Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)；用5％的BSA将标记好的抗体稀释至10μg/mL，PBS洗涤293/hPD-1细胞1次，加入稀释好的h317-CF488A或Nivolumab-CF488A，一组放37℃电热恒温培养箱，一组放4℃冰箱做为阴性对照；孵育1h后PBS洗涤3次，仍继续放置于原来温度37℃或4℃培养；放置3h和6h后各用荧光显微镜观察一次并拍照。
通过荧光显微镜观察PD-1介导的h317内吞，实验结果(见图12)表明h317和Nivolumab在37℃条件下都能够被PD-1介导内吞。
实施例12：317识别表位研究
PD-1-h317-Fab复合物的制备：人PD-1胞外区结构域(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20170626)重组蛋白分子量为16.4Kd，h317-Fab(Lot：20170626)分子量约为46.5KD，在20mM Tris 150mM NaCl溶液，根据二者的摩尔比计算，选择PD1∶h317-Fab＝1∶1.5的比例混合，冰上放置30min，复合物形成以后，将复合物超滤浓缩至浓度为12mg/ml，用于结晶分析。
PD-1-h317-Fab复合物结晶及晶体衍射数据的收集和结构解析：采用坐滴法，利用结晶筛选机器人完成，该装置每孔消耗0.2μl蛋白样品，加样结束后密封晶体板，放置恒温室培养。晶体生长温度为16℃和4℃，蛋白的浓度为8mg/ml、12mg/ml。筛选的试剂盒包括：HAMPTON公司：Crystalscreen(1-98)、Index(1-96)、PEGRX(1-96)、SaltRx(1-96)、Nartrix(1-96)、PEG/ion(1-96)；QIAGEN公司：Protein Complex Suite(1-96)；EmeraldBiosystems公司：WIZARD I/II(1-96)、WIZARD III/IV(1-96)。15天内观察晶体生长结果，对初筛晶型较好的晶体生长条件进行优化。优化后获得的晶体，衍射实验前将晶体在添加10％乙二醇的结晶溶液中浸泡数秒，然后浸入液氮快速冷冻。晶体衍射实验在上海同步辐射光源(SSRF)BL17U线站，使用的X射线波长为晶体衍射温度为100K，衍射数据使用ADSC公司Q315r探测器收集。衍射数据处理使用HKL2000软件，确定晶体空间群为P2，晶体衍射分辨率为使用PHASER软件通过分子置换法解析结构，所选用的分子置换模型为PD-1单独蛋白结构(PDB ID 3RRQ)和PD-1 Fab(PDB ID 5WT9)结构。使用COOT软件重新搭建模型，并用REFMAC5和PHENIX软件进行结构精修。
去糖基化人PD-1重组蛋白与h317的结合：在人PD-1抗原(NP_005009.2)结构中可以观察到N49、N58、N116、N74位四个糖基化位点，通过定点突变的方法，将糖基化位点突变为丙氨酸(A)，装入带有EGFP的表达载体共构建5种人PD-1全长表达质粒(WT，N49A、N58A、N116A、N74A)，将质粒分别与293fectin混合后共转染入HEK293细胞中。细胞转染2天，取细胞，收集细胞于96孔板中，1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl PBS重悬，1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl用5％BSA稀释的一抗(h317(Lot：2017.05.24)，Nivolumab(Lot：2017.04.26))，工作浓度为2μg/ml，阴性对照不加一抗，室温孵育1h。1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl PBS重悬，1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl用5％BSA稀释的羊抗人IgG(Fc)-Cy5(Cat：12136，Lot：017M4800V，Sigma)，4℃孵育1h。1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl PBS重悬，1500rpm，离心2min，弃上清。加入200μl PBS重悬，流式细胞仪(型号B49007AD，SNAW31211)检测。
PD-1-h317-Fab复合物整体结构分析显示，PD-1抗原(胞外区1-167aa)以单体形式存在，与PD-1抗体的h317-Fab片段形成一个1∶1的复合物结构(图13)。PD-1与抗体的结合部位主要是在其loop区，包括BC loop，C’D loop和FG loop区域(图14)。相互作用方式包括氢键、盐键、范德华力以及疏水相互作用，参与相互作用的氨基酸及作用力(表8)。
表8.PD-1与Fab317相互作用的氨基酸
此外，在PD-1抗原结构中可以观察到N49、N58、N116位点的糖基化，N74的糖基化位点不明确，其中N58位的糖链参与了与h317-Fab的结合(图15)。其他已报道的PD-1抗原抗体复合物结构中该位点的糖链没有参与二者相互作用，因此h317-Fab与N58糖链的相互作用有可能提高了二者识别和结合的特异性。将PD-1上的糖基化位点突变，并瞬转至293细胞，通过FACS检测h317与PD-1-mut分子的结合情况；FACS结果显示人PD-1的N58糖链参与h317与PD-1的结合，N58突变为A失去糖基化使h317失去与PD-1表达细胞结合(图16)，PD-1的N58糖链参与h317与PD-1的结合。通过比较PD-1-h317-Fab复合物结构与PD-1/PD-L1的复合物结构发现，h317-Fab和PD-L1在与PD-1相互作用界面上存在很大面积的重叠(图17A)，大部分重叠部位在PD-1的FGloop(图17B)，表明h317-Fab结合PD-1与PD-L1具有竞争性，能够阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。
实施例13 h317轻、重链CDR区定向突变
1.根据PD-1-h317Fab晶体复合物结构解析，构建h317轻、重链CDR区突变体，表达载体的构建采用质粒定点突变的方法进行，具体可参照文献[王荣浩，陈瑞川，刘润忠。快速点突变的优化方法。厦门大学学报(自然科学版)，2008，Vol 47，sup 2，282-285]。突变体抗体表达和纯化方法同上。
2.突变体相对亲和力比较
突变体与亲本抗体亲和力比较采用Fortebio公司的Octet QKe system仪器完成。具体方法同实施例4，不同之处在于所有突变体亲和力仅测定单线以评估相对亲和力。首先包被相同目标值的待测抗体，并以100nM的人PD-1重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)为流动相进行相对亲和力测定。
对突变体抗体亲和力测定结果显示，多个位点突变后抗体的亲和力发生较大改变，突变位点信息如表9，部分亲和力变化如表10所示。
表9.h317突变体CDR区的氨基酸序列
表10.h317 CDR区突变体亲和力变化情况统计表(除所示突变位点外，可变区其余氨基酸与h317相同)
从表中数据看出，个别位置的氨基酸突变后，对亲和力会产生较大影响，有些位点亲和力降低10倍以上。同时，有些位点突变后抗体的亲和力有所提升，比如轻链第24位K突变为R、第56位T突变成S、第92位S突变为N后，重链第33位D突变为S、第54位G突变成S、第59位Y突变为A后，均可使抗体亲和力得到一定提高，并且这些突变位点可以进一步叠加突变，其亲和力保持不变或进一步提高。HCDR3对结合至关重要，突变后大多亲和力下降。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (22)

1.一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体或其片段，所述片段为所述抗体的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段，并且所述抗体或其片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含以下任一个序列组合所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3：
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有以下活性中的一个或多个：
(1)阻断PD-1与其配体PD-L1或PD-L2的结合；
(2)特异性结合灵长类动物PD-1，与非灵长类动物PD-1无交叉反应；
(3)不结合除PD-1之外的其他CD28家族成员；
(4)在CD4+T细胞中诱导IL-2和/或IFN-γ产生；
(5)无ADCC效应功能。
3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段结合人PD-1N58糖链。
4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段中包含的轻链可变区和重链可变区为以下之一：
(1)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；和，所述重链可变区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列；
(2)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；和，所述重链可变区包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；
(3)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的残基编号和组成，所述变体相对于SEQ ID NO:60仅具有以下氨基酸置换：
1)K24R；
2)E30S；
3)V32A；
4)V32Y；
5)W50A；
6)W50G；
7)H55A；
8)H55Q；
9)T56S；
10)Y91A；
11)Y91F；
12)S92D；
13)S92N；
14)R93N；
15)R93S；
16)Y94F；
17)W96G；
18)W96Y；
19)K24R和T56S；
20)K24R和S92N；
21)K24R和Y94F；
22)T56S和S92N；或，
23)K24R、T56S和S92N；和，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；
(4)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；和
所述重链可变区包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的残基编号和组成，所述变体相对于SEQ ID NO:62仅具有以下氨基酸置换：
1)S31D；
2)Y32A；
3)Y32N；
4)D33S；
5)D33Y；
6)S52K；
7)S52W；
8)G53S；
9)G53Y；
10)G54D；
11)G54S；
12)G55S；
13)S56G；
14)Y57T；
15)Y59A；
16)Y59T；
18)D100E；
19)D100Y；
20)S101A；
21)Y106T；
22)D33S和G54S；
23)D33S和Y59A；或，
24)G54S和Y59A：
(5)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的残基编号和组成，所述变体相对于SEQ ID NO:60仅具有以下氨基酸置换：K24R、T56S和S92N；和，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的变体，根据SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的残基编号和组成，所述变体相对于SEQ ID NO:62仅具有以下氨基酸置换：
1)D33S和G54S；或
2)G54S和Y59A。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
7.根据权利要求5所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为IgG1或IgG4。
8.根据权利要求5所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区为IgG1或IgG4亚型；和，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区为κ型。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列；和，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列；和，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列。
11.一种缀合物，所述缀合物包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段。
12.一种核酸分子，其编码权利要求1至10中任一项限定的所述抗体或其片段。
13.一种载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。
14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求12所述的核酸分子和/或权利要求13所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求12所述的核酸分子和/或权利要求13所述的载体转化或转染。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段、权利要求11所述的缀合物、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体和/或权利要求14所述的宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
16.权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段、权利要求11所述的缀合物、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或癌症选自非小细胞肺癌、经典霍德金淋巴瘤、胃癌、肝癌、黑色素瘤、d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤、宫颈癌、头颈部鳞癌、尿道膀胱癌、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌和尿路上皮癌。
18.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或癌症为非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、头颈部鳞癌、经典霍德金淋巴瘤或尿路上皮癌。
19.根据权利要求17或18所述的用途，其特征在于，所述肝癌为原发性肝癌。
20.一种药物组合，其包括：
(1)权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段、权利要求11所述的缀合物、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的药物组合物；
(2)其他免疫增强药物；
所述其他免疫增强药物选自小分子化药、靶向药、重组蛋白药、疫苗、ADC、溶瘤病毒和基因或核酸治疗药物。
21.根据权利要求20所述的药物组合，其特征在于，所述重组蛋白药为抗体药。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段、权利要求11所述的缀合物、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的药物组合物。
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