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CN111286456B - 微流控通道、微流控芯片及制备囊泡的方法 - Google Patents

微流控通道、微流控芯片及制备囊泡的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微流控通道、微流控芯片及制备纳米级囊泡的方法。所提供的微流控通道包括入口；通过第一衔接区域与入口相连的破碎区，破碎区包括至少一个挤压通道和至少一个破碎通道，一个挤压通道分别和至少一个破碎通道相连，挤压通道设定为第一预定宽度，破碎通道设定为第二预定宽度，第一预定宽度大于第二预定宽度；和通过第二衔接区域与破碎区相连的出口。所提供的微流控芯片包括：基板和上述微流控通道，微流控通道形成在基板上。应用所提供的微流控通道或者微流控芯片可以制备纳米级囊泡，所制备的纳米级囊泡与天然外泌体性能无差异，产量远高于天然外泌体。

Description

微流控通道、微流控芯片及制备囊泡的方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种微流控通道、微流控芯片与制备囊泡的方法。
背景技术
细胞外囊泡，根据其尺寸大小，可以分为30-150nm的外泌体，200-1000nm的微囊泡，以及800-5000nm的凋亡小体。根据其来源，外泌体是由细胞膜内陷，形成内体，然后形成多泡体(MVBs)，多泡体与细胞质膜融合后释放到细胞外的一种囊泡。微囊泡是细胞出芽与细胞膜融合后直接脱落形成的囊泡。凋亡小体是胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质，内含DNA物质及细胞器，形成泡状小体。其中，外泌体是细胞外囊泡的重要组成部分，大多数细胞在生理及病理状态下，均可分泌外泌体。外泌体具有磷脂双分子层膜，其中富含核酸(microRNA、mRNA等)、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27等。
近年来，外泌体治疗逐渐成为了现代临床医学的重要发展方向，成为新一代的纳米药物治疗方式。相对于细胞治疗，外泌体治疗有如下优势：1.具有良好的生物相容性，更低的免疫原性。2.由于外泌体的纳米级尺寸优势，在血液循环中有较长的停留时间，在进入人体肺循环时，不会堵塞于肺泡的毛细血管网，且能够穿过致密的细胞外基质，以及穿越人体厚实的组织屏障，如血脑屏障等。3.没有细胞活性，避免成瘤风险。4.比细胞更稳定，易储存。
外泌体可以作为组织再生药剂，2018年4月，美国食品和药物管理局(FDA)批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药(IND)申请，用于皮肤受伤修复治疗。外泌体可以作为药物递送载体，Capricor，从心脏球源细胞(CDC)中分离纯化得到外泌体，该外泌体具有治疗炎症和纤维化疾病、Duchenne肌营养不良症的潜力。外泌体可以作为肿瘤诊断的标志物，2016年1月21日，全球首个基于外泌体的癌症诊断产品于美国上市，ExosomeDiagnostics公司基于外泌体内含物RNA，推出癌症液体活检产品。
但是，外泌体治疗也存在一个重要的问题。外泌体的分离需要大量的细胞培养液上清，而且这些细胞的细胞来源往往受到极大的限制。目前，从小规模培养细胞提取外泌体正向大规模培养细胞提取外泌体转变。可是其操作复杂，耗费大量人力与物力，成本较大，不利于临床应用。此外，收集大量培养液上清后，通过离心法或密度梯度离心法等方法，提取外泌体，最终得到的外泌体的蛋白总量极低，无法满足未来临床应用的需求。因此如何高效、可控地制备出与外泌体类似的纳米级囊泡，对于推进外泌体治疗领域的发展至关重要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种微流控通道、微流控芯片及制备囊泡的方法。
目前，囊泡的分离提纯制备面临着诸多问题，限制了囊泡的应用和相关研究。一方面，从上清中分离所获得的天然细胞外囊泡的产量非常小，从而很大程度地影响了囊泡功能的行使；另一方面，现有的体外囊泡的制备工艺十分繁琐，使得只能小规模的制备囊泡，还耗费了大量人力与物力。如何自动化地可控地体外制备大量的性能优异的囊泡，是发明人研究的重点。本发明的发明人通过设计微流控通道以及微流控芯片，可以实现对细胞进行挤压破碎，使细胞膜重组成纳米级囊泡。所设计的微流控通道通过破碎区，通过破碎区的挤压通道使得使细胞挤压变形，然后进入空间更为狭窄的破碎通道，使得细胞破碎，细胞膜重组成纳米级囊泡。通过所设计的微流控通道或者微流控芯片，可以高效地制备出尺寸均一、与天然外泌体相似的纳米级囊泡。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种微流控通道，包括：入口；破碎区，所述破碎区与所述入口相连，所述破碎区通过第一衔接区域与所述入口相连，所述破碎区包括至少一个挤压通道和至少一个破碎通道，一个所述挤压通道分别和至少一个所述破碎通道相连，所述挤压通道设定为第一预定宽度，所述破碎通道设定为第二预定宽度，所述第一预定宽度大于所述第二预定宽度；出口，所述出口通过第二衔接区域与所述破碎区相连。本发明所提供的微流控通道，其在破碎区含有挤压通道和破碎通道，一个挤压通道和至少一个破碎通道相连，细胞经过微流控通道，在挤压通道内被挤压变形，然后经过更狭窄的破碎通道，细胞发生破碎，重塑成纳米级囊泡。经过该微流控通道所制备的纳米级囊泡与天然外泌体相似，例如无论是膜组成还是形貌均与天然外泌体相似，而且所制备的纳米级囊泡的产量远高于天然外泌体的产量。而且该微流控通道的适用范围广，适合于各类细胞的处理，例如除干细胞外，其他细胞如淋巴细胞、组织细胞等均可以利用该微流控通道实现细胞的挤压破碎，从而制备出纳米级囊泡。
根据本发明的实施例，以上所提供的微流控通道可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述第一衔接区域包括至少两个入口流道，所述入口通过所述至少两个入口流道与所述破碎区相连。入口通过至少两个入口流道与破碎区相连，从而可以一次性处理多个细胞，而且经过分流，能够缓解细胞在破碎过程中遇到的阻力，从而可以快速制备大量的纳米级囊泡。
根据本发明的实施例，所述入口与至少两个第一入口流道相连，每一个所述第一入口流道与至少两个第二入口流道相连，所述第二入口流道与所述破碎区相连。入口与至少两个第一入口流道相连，每一个第一入口流道分别与至少两个第二入口流道相连，由此可以一次性处理多个细胞，而且经过分流，能够缓解细胞在破碎过程中遇到的阻力，从而可以快速制备大量的纳米级囊泡。
根据本发明的实施例，所述第二衔接区域包括至少两个出口流道，所述破碎区通过所述至少两个出口流道与所述出口相连。由此可以同时处理大量的细胞。
根据本发明的实施例，所述出口与至少两个第一出口流道相连，每一个所述第一出口流道与至少两个第二出口流道相连，所述第二出口流道与所述破碎区相连。由此可以同时处理大量的细胞。
根据本发明的实施例，所述第一预定宽度为所述第二预定宽度的至少两倍，优选为2～10倍。由此，通过挤压通道可以使得细胞变形，然后经过更狭窄的破碎通道，使得细胞破碎，重塑，可以获得纳米级的囊泡。
根据本发明的实施例，所述第一预定宽度为5～20微米，所述第二预定宽度为1～5微米，优选为2～5微米，更优选为2.5～5微米，例如为2.5～4微米。由此，通过挤压通道可以使得细胞变形，然后经过更狭窄的破碎通道，使得细胞破碎，重塑，可以获得纳米级的囊泡。
根据本发明的实施例，所述每一个所述挤压通道之间设置有缓冲区，所述缓冲区的宽度为所述第一预定宽度的至少3倍。通过在挤压通道之间设置缓冲区，能够提高细胞流经微流控通道的通量，从而可以在短时间内处理更多的细胞。根据本发明的实施例，所述缓冲区的宽度为30～40微米。该宽度大约是常规细胞细胞直径的2倍，能够使得细胞短时间在缓冲区汇集。
根据本发明的实施例，每一个所述挤压通道之间设置有两个所述缓冲区，所形成的每段挤压通道的长度为35～200微米。根据本发明的实施例，所形成的每段挤压通道的长度可以为40～200微米，例如可以为40～150微米。挤压通道的长度会影响到细胞在挤压通道的经过时间，从而可以影响到细胞的挤压效果。在该长度下可以提高细胞经过挤压处理的效果。缓冲区不做特殊要求，可以设定为圆形区域或者设定为椭圆形等。根据本发明的实施例，缓冲区可以设置为圆形区域。
根据本发明的实施例，所述破碎区包括64～128个所述挤压通道和64～256个所述破碎通道，每一个所述挤压通道之间设置有两个缓冲区。由此可以有效实现细胞的分流，提高细胞经过挤压破碎处理的通量。
根据本发明的实施例，所述第一衔接区域的长度为1～10毫米，所述第一衔接区域的宽度为0.15～0.5毫米。根据本发明的实施例，所述第一衔接区域的长度为1.8～8毫米，例如可以为1.8～3毫米，优选为2毫米；所述第一衔接区域的宽度为0.2～0.4毫米，优选为0.32毫米；
根据本发明的实施例，所述第二衔接区域的长度为1～10毫米，所述第二衔接区域的宽度为0.2～0.5毫米。根据本发明的实施例，所述第二衔接区域的长度为1.2～8毫米，例如为1.2～2毫米，优选为1.2毫米；所述第二衔接区域的宽度为0.3～0.4毫米，优选为0.32毫米。
根据本发明的实施例，进一步包括：筛选区，所述筛选区分别与所述入口和所述破碎区相连，所述筛选区内设置有阻隔物，所述阻隔物在所述筛选区形成预定间隙通道。在进入破碎区之前设置筛选区，可以打散或者阻隔体积较大的细胞团块，而且尺寸较大的杂质被阻隔，从而可以去除尺寸较大的杂质。
根据本发明的实施例，依照液体流动方向，所述筛选区依次设置有第一阻隔物和第二阻隔物，所述第一阻隔物和所述第二阻隔物为菱形柱状结构，所述第二阻隔物的边长小于所述第一阻隔物的边长。通过设置第一阻隔物和第二阻隔物，能够防止体积大的细胞团阻塞下游的破碎区，避免影响所制备的纳米级囊泡的品质。
根据本发明的实施例，所述第一阻隔物在所述筛选区形成70～90微米的预定间隙通道，所述第二阻隔物在所述筛选区形成30～50微米的预定间隙通道。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种微流控芯片，包括：基板；和微流控通道，所述微流控通道形成在所述基板上，所述微流控通道为本发明第一方面任一实施例所述的微流控通道。通过基板，能够在基板上形成所述微流控通道，基板的材料和高度不做特殊限制，一些常用的材料，例如硅片、玻璃，聚碳酸酯-聚苯乙烯合金(PCPS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，均可以作为基板使用。基板的高度只要适于形成所述微流控通道即可。所提供的微流控芯片体积小、便于携带。应用该微流控芯片制备囊泡，产率高，能够制备出与外泌体形貌，膜组成相似的囊泡，产率是天然外泌体产率的8～12倍。而且适用范围广，除干细胞外，其他细胞如淋巴细胞、组织细胞、癌细胞等均可利用该微流控芯片对细胞进行挤压破碎，制备出纳米级囊泡。根据本发明的实施例，所述微流控通道的高度为1～10微米，例如为2～10微米，3～10微米，4～8微米等等。设置合适高度的微流控通道，可以允许细胞经过，并经过微流控通道处理，获得类似于天然外泌体的囊泡。所提到的微流控通道的高度与基板的高度方向一致，是指在该方向上，微流控通道的顶部距离底部的垂直距离。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备囊泡的方法，包括：利用微流控通道或者微流控芯片对所述细胞进行处理，其中微流控通道为本发明第一方面任一实施例所述的微流控通道，所述微流控芯片为本发明第二方面任一实施例所述的微流控芯片。根据本发明的实施例，所制备的囊泡的粒径为190～250纳米，优选为200～220纳米，例如为200～210纳米。根据本发明的实施例，所制备的囊泡与天然外泌体相比，所述囊泡的产量是所述天然外泌体的至少5倍，优选为至少8倍，更优选为至少10倍。
根据本发明的实施例，所述制备囊泡的方法进一步包括：将所述细胞制备细胞悬液，装入无菌注射器中；将所述无菌注射器分别与微流注射泵和所述微流控通道或者所述微流控芯片相连，通过调节微流注射泵的压力，使得所述细胞悬液通过所述微流控通道或者所述微流控芯片。通过微流注射泵可以调节细胞悬液在微流控通道或者微流控芯片中的流速，从而可以制备与天然外泌体无差异的囊泡。所提供的微流控通道或者所提供的微流控芯片的可控性强。
本发明所取得的有益效果为：本发明所提供的微流控流道或者微流控芯片，体积小，便携性好；可控性强，细胞破碎的效率可以通过细胞悬液的浓度，破碎区中挤压通道和破碎通道的尺寸，细胞悬液在微流控流道中的流速等进行调节。而且，适用范围广，除干细胞外，其他细胞如淋巴细胞、组织细胞等均可利用该微流控芯片对细胞进行挤压破碎，制备出纳米囊泡。经过所提供的微流控通道或者微流控芯片能够制备出与外泌体形貌，膜组成相似的纳米囊泡，而且产率高，是天然外泌体产率的10倍。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的微流控通道的俯视结构示意图，其中标号1为入口，标号2为第一衔接区域，标号3为破碎区，标号4为第二衔接区域，标号5为出口，标号301为挤压通道，标号302为破碎通道。
图2是根据本发明的实施例提供的囊泡的形貌图。
图3是根据本发明的实施例提供的囊泡的粒度分布图。
图4是根据本发明的实施例提供的囊泡的膜成分分析图。
图5是根据本发明的实施例提供的囊泡的产率分析图。
图6是根据本发明的实施例提供的囊泡的免疫印迹分析结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种微流控通道，如图1所示，为了更清楚的显示微流控通道的结构示意图，将微流控通道的破碎区放大，在图1中右图示出。根据本发明的实施例，所提供的微流控通道包括：入口1；破碎区3，所述破碎区3与所述入口1相连，所述破碎区通过第一衔接区域2与所述入口1相连，所述破碎区3包括至少一个挤压通道301和至少一个破碎通道302，一个所述挤压通道301分别和两个所述破碎通道302相连，所述挤压通道301设定为第一预定宽度，所述破碎通道设定为第二预定宽度，所述第一预定宽度大于所述第二预定宽度；出口5，所述出口5通过第二衔接区域4与所述破碎区3相连。
本文中所提到的第一预定宽度是指根据所处理的细胞的直径等差异，将挤压通道设置为一定的宽度。沿着液体(例如细胞悬液)流动方向的挤压通道的长度作为挤压通道长度，这里所提到的宽度是指与该液体流动方向垂直方向上的，挤压通道的宽度。本文中所提到的第二预定宽度是指根据所处理的细胞的直径等差异，将破碎通道设置为一定的宽度。沿着液体(例如细胞悬液)流动方向的破碎通道的长度作为破碎通道长度，这里所提到的宽度是指与该液体流动方向所垂直方向上的，破碎通道的宽度。
根据本发明的实施例，所述第一预定宽度为所述第二预定宽度的至少两倍，优选为2～10倍。根据本发明的实施例，所述第一预定宽度为5～20微米，所述第二预定宽度为1～5微米，优选为2～4微米。微流控通道中破碎通道的宽度一定程度上会影响到囊泡的品质和产率。破碎通道的宽度稍窄时，虽然会在一定程度上提高囊泡的均一性，但是也会影响到囊泡的产率；破碎通道的宽度稍宽时，囊泡的产率会提高，但是也会影响到囊泡的均一性。将破碎通道的宽度设置为1～5微米，可以获得高产率的粒径均一的囊泡。同时考虑到微流控通道的制备工艺，为了降低成本，节省微流控通道的制备难度，可以将破破碎通道的宽度设置为2～5微米，例如可以为2～4微米，也可以为2.5～4微米或者2.5～3微米。
为了能够一次性处理多个细胞，缓解细胞在破碎过程中遇到的阻力，可以在第一衔接区域和第二衔接区域通过设置分岔流道来进行衔接。还可以根据需要设置几级分岔流道。根据本发明的实施例，所述第一衔接区域包括至少两个入口流道，所述入口通过所述至少两个入口流道与所述破碎区相连。根据本发明的实施例，所述入口与至少两个第一入口流道相连，每一个所述第一入口流道与至少两个第二入口流道相连，所述第二入口流道与所述破碎区相连。根据本发明的实施例，所述第二衔接区域包括至少两个出口流道，所述破碎区通过所述至少两个出口流道与所述出口相连。例如，所述出口与至少两个第三出口流道相连，每一个所述第三出口流道与至少两个第四出口流道相连，所述第四出口流道与所述破碎区相连。根据本发明的实施例，所述每一个所述挤压通道之间设置有缓冲区，所述缓冲区的宽度为所述第一预定宽度的至少3倍。例如，所述缓冲区的宽度可以设置为30～40微米。根据本发明的实施例，每一个所述挤压通道之间设置有两个所述缓冲区，所形成的每段挤压通道的长度为35～200微米。例如，所述破碎区包括32～128个挤压通道和64～256个所述破碎通道，每一个所述挤压通道之间设置有两个缓冲区。
根据本发明的实施例，所提供的微流控通道还可以进一步包括筛选区，所述筛选区分别与所述入口和所述破碎区相连，所述筛选区内设置有阻隔物，所述阻隔物在所述筛选区形成预定间隙通道。根据本发明的实施例，依照液体流动方向，所述筛选区依次设置有第一阻隔物和第二阻隔物，所述第一阻隔物和所述第二阻隔物为菱形柱状结构，所述第二阻隔物的边长小于所述第一阻隔物的边长。例如，所述第一阻隔物在所述筛选区形成70～90微米的预定间隙通道，所述第二阻隔物在所述筛选区形成30～50微米的预定间隙通道。
本发明还提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括基板；和微流控通道，所述微流控通道为上述所提供的微流控通道。
本发明还提供了一种制备囊泡的方法，包括：利用上述所提供的微流控通道或者微流控芯片对所述细胞进行处理。由此制备的囊泡的粒径为190～250纳米，优选为200～220纳米。而且，所述囊泡与天然外泌体相比，所述囊泡的产量是所述天然外泌体的至少5倍，优选为至少8倍，更优选为至少10倍。在制备囊泡时，可以将细胞制备成细胞悬液，装入无菌注射器中，然后将无菌注射器分别与微流注射泵和所述微流控通道或者所述微流控芯片相连，通过调节微流注射泵的压力，使得所述细胞悬液通过所述微流控通道或者所述微流控芯片。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明的类外泌体纳米级囊泡制备微流道设计如图1所示。微流道设计可分为入口、破碎区、出口三个部分。入口通过分岔流道与破碎区直接相连，具体地，入口经过3个第一入口流道，每个第一入口流道分别经过3个第二入口流道，每一个第二入口流道分别经过2个第三入口流道，每一个第三入口流道分别经过2个第四入口流道与破碎区相连。第一衔接区域的长度设置在8～9毫米左右、宽设置为0.2～0.4毫米左右。最后分岔形成96个挤压通道和192个破碎通道，再汇合经第二衔接区域后连至出口。具体地，出口经过3个第一出口流道，每一个第一出口流道分别经过3个第二出口流道，每一个第二出口流道分别经过2个第三出口流道，每一个第三出口流道分别经过2个第四出口流道与破碎区相连。第二衔接区域的长度设置为8～9毫米左右，宽度设置在0.3毫米～0.4毫米左右。其中入口、出口均设计为直径0.9mm的圆形。破碎区的挤压通道的宽度分别设计为20μm、10μm、5μm，破碎通道的宽度设计为2.5μm。
将根据图1所示的设计图纸交由微流控车间代加工，制备含有微流控通道的微流控芯片。包括如下步骤：
1.将本发明的设计图纸交由微流控车间代加工，可制得模具硅片。该硅片加工的刻蚀深度为10μm，则所制微流道为10μm高。
2.以Dow corning SYLGARDTM 184灌封胶(即聚二甲基硅氧烷，下文简称PDMS)为原料，交联剂按10：1的比例混合后充分搅拌，将其放置于真空罐中进行抽真空，直至无肉眼可见的气泡；
3.在硅片周围滴加一圈三甲基氯硅烷，利用三甲基氯硅烷挥发修饰模型硅片10min；
4.将PDMS倾倒至模型硅片表面进行倒模，在真空罐中抽真空1h；
5.将模型硅片和PDMS一同转移至65℃烘箱过夜，进行交联；
6.取下倒模后的PDMS，按图形排布进行切割，并以18号打孔器(内径0.9mm，外径1.3mm)在入口和出口处打孔；
7.用无水乙醇和去离子水配制75％(v/v)酒精，没过载玻片(76mm长，25mm宽)和打孔后的PDMS，超声清洗10min；
8.在超净台内完全风干载玻片和PDMS，转移入等离子清洗仪进行表面处理，取出后立即粘合PDMS与载玻片制成微流控芯片，并放入65℃烘箱过夜，促进界面键合。
9.取出键合好的微流控芯片置于室温保存。
实施例2
实施例2提供了一种制备纳米级囊泡的方法，具体操作步骤包括：
1.用外径0.9mm，内径0.5mm的聚四氟乙烯(PTFE)导管连接注射器与实施例1制备的微流控芯片，先用75％酒精润洗微流控通道，再用PBS润洗微流控通道，最后对微流控通道进行排气。
2.取间充质干细胞(MSC)消化离心后，以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)重悬至密度为1x106 mL-1的细胞悬液，转移至1mL无菌注射器中；
3.将注射器装载至微量注射泵上，设定1mL注射器规格(内径4.69mm)后以50μL/min的线速度进行推注。
4.从出口处收集挤压破碎的囊泡。
5.收集囊泡悬液，进行差速离心提纯分离。首先300g离心10min，去除细胞沉淀。然后2000g离心10min，去除死细胞沉淀。随后10000g离心30min，去除死细胞沉淀。
6.收集差速离心后的上清，进行超高速离心提纯分离纳米级囊泡。首先100000g离心2h，收集沉淀。然后用1ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS)重悬囊泡，过0.45μm滤膜。再次100000g离心1h，此时沉淀为较纯净的纳米级囊泡。
对所制备的纳米级囊泡进行如下表征：
(1)利用透射电镜对所制备的纳米级囊泡进行形貌表征，如图2所示，标尺为100nm，图2中左图箭头所指为利用间充质干细胞获得的纳米级囊泡，右图箭头所指为来自于间充质干细胞的天然外泌体。
(2)通过动态光散射(DLS)检测纳米级囊泡的粒径分布，如图3(图3中上图圆圈所圈住的呈现发白的部分即为囊泡)所示，经计算所获得的纳米级囊泡的平均粒径为201nm。
(3)通过Nikon超分辨率激光扫描共聚焦显微镜，对纳米级囊泡细胞膜进行表征，如图4所示，标尺为1μm，结果显示所制备的纳米级囊泡的细胞膜为磷脂双分子层。
(5)采用BCA试剂盒对纳米级囊泡进行蛋白总量检测，对挤压破碎前的细胞计数，最终换算为107个细胞挤压破碎出纳米级囊泡的总蛋白量进行比较分析。图5中1，2，3为三次重复实验。结果显示纳米级囊泡的产量为每1x107细胞能够获得20-40μg囊泡。该产量是天然外泌体产量的10倍(参考文献ACS Nano,2014,8(1):7698-7710.Sci Rep,2018,8(1):2471.所示)。
同时对肝窦内皮细胞(LSEC)替换上述提到的间充质干细胞，利用实施例1所提供的微流控芯片进行相同的处理，经验证可以制备纳米级的囊泡，所制备的纳米级囊泡的产量是天然外泌体产量的9倍。而且所制备的纳米级囊泡的性能和天然外泌体无明显差异。
实施例3
实施例3利用Western blot，对处理前的细胞与实施例2所制备的纳米级囊泡的CD63，CD105，Actin进行表征。CD63在囊泡中呈现高表达，而在MSC和LESC中呈现低表达或者不表达，因此CD63作为囊泡的通用标志物，可以用于指示囊泡；CD105在囊泡中不表达或者低表达，在MSC和LESC中高表达，因此CD105作为MSC和LSEC的标志物，可以用于指示MSC和LSEC。通过对不同来源的囊泡以及相应的来源细胞上的标志物进行分析，可以进一步验证囊泡的来源。
实验结果如图6所示。对于MSC而言，Actin在MSC细胞与MSC囊泡(指由MSC处理获得的囊泡)均呈现出高表达；CD63在MSC囊泡中呈现出高表达，在MSC细胞中表达量较低；CD105在MSC细胞中高表达，在MSC囊泡中呈现出低表达。表明MSC囊泡源于MSC。
对于LSEC而言，Actin在LSEC细胞中高表达，在LSEC囊泡(指由LSEC处理获得囊泡)中低表达；CD63在LSEC囊泡中高表达，在LSEC细胞中表达量较低；CD105在LSEC细胞中高表达，在LSEC囊泡中低表达。表明LSEC囊泡来源于LSEC。
本发明首次通过利用狭窄空间限制，设计微流控通道以及微流控芯片对细胞进行挤压破碎，使其重组为纳米级囊泡。利用所提供的微流控通道或者微流控芯片制备纳米级囊泡，是一个新型的类外泌体纳米级囊泡的制备手段，避免了天然外泌体难于大量制备等问题，可以替代天然外泌体进行下游应用。
囊泡有较强的增溶能力，其双层膜具有较好的牢固性和稳定性，利用所制备的囊泡可以作为药物递送系统的载体，进行靶向治疗。
除此之外，利用微流控通道制备的囊泡还可以促进肝等组织再生；可以用于细胞间的交流通讯；可以用于调节细胞内分子水平，改善细胞活性；可以用于治疗心血管、肿瘤等疾病。由此，利用微流控通道或者微流控芯片制备囊泡的技术，更适合于工业生产和应用，从而可以应用于临床、大数据研究等多种领域。而且，为囊泡的大量生成和制备提供了可操作性的手段，所制备的囊泡表现为均一的特性，具有优异的性能。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (26)

1.一种制备囊泡的方法，其特征在于，包括：
利用微流控通道或者微流控芯片对细胞进行处理；
所述微流控通道包括：
入口；
破碎区，所述破碎区与所述入口相连，所述破碎区通过第一衔接区域与所述入口相连，所述破碎区包括至少一个挤压通道和至少一个破碎通道，一个所述挤压通道分别和至少一个所述破碎通道相连，所述挤压通道设定为第一预定宽度，所述破碎通道设定为第二预定宽度，所述第一预定宽度大于所述第二预定宽度；
出口，所述出口通过第二衔接区域与所述破碎区相连；
所述微流控芯片包括：
基板；和
微流控通道，所述微流控通道形成在所述基板上；
所述第一预定宽度为5～20微米，所述第二预定宽度为1～5微米，
所述每一个所述挤压通道之间设置有缓冲区，所述缓冲区的宽度为所述第一预定宽度的至少3倍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一衔接区域包括至少两个入口流道，所述入口通过所述至少两个入口流道与所述破碎区相连。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述入口与至少两个第一入口流道相连，每一个所述第一入口流道与至少两个第二入口流道相连，所述第二入口流道与所述破碎区相连。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二衔接区域包括至少两个出口流道，所述破碎区通过所述至少两个出口流道与所述出口相连。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出口与至少两个第一出口流道相连，每一个所述第一出口流道与至少两个第二出口流道相连，所述第二出口流道与所述破碎区相连。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二预定宽度为1～5微米。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二预定宽度为2～5微米。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二预定宽度为2.5～5微米。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲区的宽度为30～40微米。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每一个所述挤压通道之间设置有两个所述缓冲区，所形成的每段挤压通道的长度为35～200微米。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破碎区包括32～128个挤压通道和64～256个所述破碎通道，每一个所述挤压通道之间设置有两个缓冲区。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一衔接区域的长度为1～10毫米；所述第一衔接区域的宽度为0.15～0.5毫米。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二衔接区域的长度为1～10毫米；所述第二衔接区域的宽度为0.2～0.5毫米。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一衔接区域的长度为1.8～8毫米；所述第一衔接区域的宽度为0.2～0.4毫米。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二衔接区域的长度为1.2～10毫米；所述第二衔接区域的宽度为0.3～0.4毫米。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控通道进一步包括：
筛选区，所述筛选区分别与所述入口和所述破碎区相连，所述筛选区内设置有阻隔物，所述阻隔物在所述筛选区形成预定间隙通道。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，依照液体流动方向，所述筛选区依次设置有第一阻隔物和第二阻隔物，所述第一阻隔物和所述第二阻隔物为菱形柱状结构，所述第二阻隔物的边长小于所述第一阻隔物的边长。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一阻隔物在所述筛选区形成70～90微米的预定间隙通道，所述第二阻隔物在所述筛选区形成30～50微米的预定间隙通道。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控通道的高度为1～10微米。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基板包括选自硅片、玻璃、聚碳酸酯-聚苯乙烯合金、聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一种。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡的粒径为190～250纳米。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡与天然外泌体相比，所述囊泡的产量是所述天然外泌体的至少5倍。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡的粒径为200～220纳米。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡与天然外泌体相比，所述囊泡的产量是所述天然外泌体的至少8倍。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡与天然外泌体相比，所述囊泡的产量是所述天然外泌体的至少10倍。
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述细胞制备细胞悬液，装入无菌注射器中；
将所述无菌注射器分别与微流注射泵和所述微流控通道或者所述微流控芯片相连，通过调节微流注射泵的压力，使得所述细胞悬液通过所述微流控通道或者所述微流控芯片。
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