CN111217833B

CN111217833B - 噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111217833B
Application number: CN202010105624.5A
Authority: CN
Inventors: 康东伟; 刘新泳; 展鹏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111217833A; US12351586B2; AU2020430369A1; AU2020430369B2; WO2021164052A1; US20230067045A1

Abstract

本发明涉及一种噻吩并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂DK6‑1及其制备方法和应用。所述化合物结构如下，本发明还涉及含有DK6‑1的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。

Description

噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂DK6-1及其制备方法以及作为HIV-1抑制剂的应用。

背景技术

艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病，其主要病原体是人免疫缺陷病毒1型(HumanImmunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)。尽管高效抗逆转录疗法的实施可以延长患者的生存时间，改善患者的生活质量，但是长期服用药物带来的耐药、毒副作用以及费用等问题，迫使研究者研发高效低毒的新型HIV抑制剂。HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是高效抗逆转录疗法的重要组成部分，该类药物具有高效低毒、特异性强的优点，然而易产生耐药性的缺陷使该类药物临床效价大幅降低，因此新型高效低毒、广谱抗耐药性的NNRTIs的研发一直是抗HIV药物研究的热点之一。

二芳基嘧啶(diarylpyrimidine,DAPY)类是一类典型的HIV-1NNRTIs，具有较强的抗HIV活性，对耐药突变毒株也有很好的抑制作用。该类药物中依曲韦林(Etravirine)和利匹韦林(Rilpivirine)已经上市，但该类化合物水溶性较差，口服生物利用度较低。我们前期工作中，以依曲韦林为先导化合物，得到具有高效抗耐药性的新型非核苷类逆转录酶抑制剂K-5a2和25a。但是K-5a2对临床最常见双突变株RES056的活性明显弱于依曲韦林，25a的活性虽然明显优于依曲韦林，但是其细胞毒性(CC₅₀＝2.30μM)和心脏毒性(IC₅₀＝0.18μM)均较大。此外，K-5a2(F＝22.9％)和25a(F＝16.19％)均存在生物利用度低的问题。因此将该类化学结构进行进一步修饰，对发现广谱高效、生物利用度好且具有自主知识产权的新型抗HIV药物具有重大意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1及其制备方法，本发明还提供了该化合物作为HIV-逆转录酶抑制剂的活性结果和应用。

本发明的技术方案如下：

1、一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1

一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1，或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有如下所示的结构：

2、噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1的制备方法

噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与2,6-二甲基-4-羟基苯甲醛发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2与氰甲基磷酸二乙酯经Wittig-Horner反应生成中间体3，中间体3在N,N-二甲基甲酰胺中与N-Boc-4-氨基哌啶反应并随后在三氟乙酸条件下脱Boc基团保护生成关键中间体4；最后中间体4在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸钾做碱的条件下，与4-溴甲基苯磺酰胺反应生成目标产物DK6-1；

合成路线如下：

试剂及条件:(i)2,6-二甲基-4-羟基苯甲醛，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-30℃；(ii)氰甲基磷酸二乙酯，叔丁醇钾，四氢呋喃，0℃；(iii)①N-Boc-4-氨基哌啶，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，120℃；②二氯甲烷，三氟乙酸，20-30℃；(v)4-溴甲基苯磺酰胺，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-30℃。

3、噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1的抗HIV-1活性及应用

对按照上述方法合成的部分噻吩并嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(III_B)，单耐药突变株L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K以及双耐药突变株F227L+V106A、RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，依曲韦林为阳性对照。

其抗HIV-1活性和细胞毒性数据如图1所示。化合物DK6-1对HIV-1野生株和多种临床常见突变株均具有强有效的活性，与先导化合物依曲韦林相比大幅度提高。对HIV-1野生株和单突变株K103N的活性分别为3.24nM和2.34nM，与依曲韦林相当；对单突变株L100I、Y181C、Y188L和E138K，DK6-1的EC₅₀值均小于8nM，是上市药物依曲韦林的2倍以上；对双突变株F227L+V106A和RES056，DK6-1也均具有个位数纳摩尔的活性，分别为依曲韦林的6倍和3倍。此外，DK6-1(CC₅₀＝10.1μM)的细胞毒性较25a(CC₅₀＝2.30μM)相比也显著降低。

此外，将感染HIV-1的MT4细胞在不同浓度的K-5a2、25a和DK6-1中传代培养30次，基因测序发现RT依旧会发生四个残基突变位点(K101E、V108I、F227C和M230I)，进一步的活性测试发现DK6-1对这些突变体的EC₅₀大幅降低，但是核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)齐多夫定对这些突变株的活性(EC₅₀＝1.0nM)较野生株(EC₅₀＝12.7nM)相比提高了10倍。这些结果充分说明DK6-1不会导致不同作用机制抑制剂的交叉抗耐药性，有很大潜力作为HAART疗法的主要成分与NRTIs联用用于艾滋病的治疗。

药代动力学试验结果(表1)显示DK6-1具有良好的口服生物利用度(F＝37.06％)和极佳的安全性(LD₅₀>2000mg/kg)。心脏毒性实验结果(图2)显示其抑制hERG钾离子通道的作用较25a相比也明显降低，IC₅₀值为0.98μM。因此化合物DK6-1具有极大的研究与开发价值，可作为制备抗HIV的候选药物进行开发。

本发明的噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1可作为抗艾滋病药物候选药物用于制备抗艾滋病药物。

一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明提供了结构全新的噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1及其制备方法，本发明还提供了DK6-1抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1可作为抗艾滋病候选药物应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

附图说明

图1是依曲韦林与DK6-1的细胞活性和细胞毒性比较图；

图2是25a与DK6-1的hERG抑制活性比较图。

具体实施方式

通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1：2-(哌啶-4-胺)-4-(2,6-二甲基-4-氰基乙烯基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶(4)的制备

称取4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛(1.76g,11.7mmol)和碳酸钾(2.70g,19.5mmol)于40mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(2.0g,9.76mmol)继续室温搅拌1h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入200mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，然后在氯仿中重结晶得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛2，收率85％，熔点263-265℃。ESI-MS:m/z 319.4(M+1),341.2(M+Na).C₁₅H₁₁ClN₂O₂S(318.02).

氰甲基磷酸二乙酯(1.34g,7.52mmol)溶解到30mL的四氢呋喃中，冰浴条件下向此反应液中慢慢的加入叔丁醇钾(1.42g,12.5mmol)，冰浴搅拌30min。然后向此混合溶液中滴加溶于20mL四氢呋喃的4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛(2.0g,6.28mmol)溶液，10h后TLC检测反应完毕。过滤，水洗滤饼，干燥，然后在氯仿中重结晶得到关键中间体(E)-3-(4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈3，收率72％，熔点235-237℃。ESI-MS:m/z 342.4(M+1),364.2(M+Na).C₁₇H₁₂ClN₃OS(341.04).

称取化合物(E)-3-(4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈(0.34g,1.0mmol)，N-Boc-4-氨基哌啶(0.24g,1.2mmol)与碳酸钾(0.28g,2mmol)于5mL的二甲基亚砜中，然后120℃下反应12小时。待反应冷却到室温以后，慢慢地将反应液滴加到50mL水溶液中，搅拌，有大量的黄色固体生成。过滤，干燥得粗品。将该粗品溶于4mL二氯甲烷中，然后慢慢地向其中加入三氟乙酸(0.74mL,10mmol)，室温条件下搅拌6小时。向反应液中加入30mL水，用饱和的碳酸氢钠水溶液调PH为9，二氯甲烷萃取(3×10mL)，饱和食盐水水洗，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后进行快速柱层析分离得到白色固体即为2-(哌啶-4-胺)-4-(2,6-二甲基-4-氰基乙烯基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶4。收率71％，熔点123-125℃。ESI-MS:m/z 406.3(M+1).C₂₂H₂₃N₅OS(405.16).

实施例2：DK6-1的制备

称取化合物4-((2-(哌啶-4-胺)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(0.20g,0.5mmol)于10mL DMF中，室温条件下搅拌溶解后加入无水碳酸钾(0.14g,1.0mmol)与4-溴甲基苯磺酰胺(0.15g,0.6mmol)，室温条件下搅拌6h(TLC检测反应完毕)。减压蒸出溶剂，然后向残留底物中加入30mL乙酸乙酯，饱和食盐水溶液洗涤3次，每次10mL，分取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。快速柱层析分离得到目标化合物，进而在乙酸乙酯-石油醚体系中重结晶得到目标化合物DK6-1。收率：67％，熔点:205-207℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.78(d,J＝8.2Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.61(d,J＝13.6Hz,1H,ArCH＝),7.48-7.45(m,4H),7.35(d,J＝5.9Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),7.31(s,2H,SO₂NH₂),7.25(d,J＝6.0Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.07(s,1H,NH),6.43(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),3.72-3.70(m,1H),3.49(s,2H,N-CH₂),2.74-2.72(m,2H),2.08(s,6H),1.99-1.27(m,6H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.6,159.3,150.5,143.4,143.1,131.7,131.7,129.4,128.6,126.0,119.4,118.9,96.7,62.0,60.2,52.7,31.6,21.1,16.6,14.5.ESI-MS:m/z 575.3(M+1),597.5(M+Na).C₂₉H₃₀N₆O₃S₂(574.18).

实施例3：目标化合物的体外抗HIV活性测试实验

测试原理

化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑蓝)，可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度(A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC₅₀)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC₅₀)。

测试材料和方法

(1)HIV-1(III_B)、各种HIV-1耐药株：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究所提供。

(2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究院提供。

(3)MTT：购自美国Sigma公司。

(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。

(5)阳性对照药：依曲韦林。

(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度(A)值,计算出EC₅₀和CC₅₀。

(7)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶标仪中测定590nm下的吸光度值。

实验方法

在96孔细胞培养板上，加入50μL含1×10⁴MT-4细胞培养液，再分别加入20μL感染HIV-1的MT-4细胞混悬液(每毫升含100倍CCID₅₀)或者空白培养基(毒性测定)，然后加入不同浓度的待测化合物溶液或者阳性对照药物，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5％CO₂氛围，37℃下培养5天，向每个孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2小时，然后加入DMSO，使用酶标仪测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P％。同时设空白和药物对照组和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度(EC₅₀)。活性结果如图1所示。

实施例4：目标化合物的体外药代动力学实验

材料和仪器

色谱甲醇购自Sigma-Aldrich，肝素购自山东大学齐鲁医院，纯净水为哇哈哈集团生产。Eppendorf 5415D型离心机；Agilent 1200LC/MSD液相色谱质谱联用仪；移液枪(IKA)；大鼠灌胃针。健康雄性SD大鼠，体重220g，购自山东大学实验动物中心。动物在适宜条件下(温度：25±1℃，湿度60±5％)于饲养室饲养1周，期间自由进食和进水。实验前禁食12h，自由进水。实验完毕后所有动物均按照医药科学委员会动物实验职业道德的规定处死动物。

试验方法

10只雄性SD大鼠随机分成2组，每组5只。给药前禁食12h，自由饮水。DK6-1单次口服剂量为20mg/kg，在给药前以70％的PEG400和30％的生理盐水配制成给药制剂。灌胃后分别在5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h和14h，经锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样置于肝素化的离心管中，2200g离心15min后，取上清血浆样品保存于-20℃备用。对DK6-1进行尾静脉注射试验，剂量2mg/kg。注射后分别在2min、5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h和8h，经锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样处理同前。

用LC-MS分析方法进行血浆样品中DK6-1浓度的分析测定。使用DAS 2.0药代动力学程序的非房室模型对测定的血浆药-时数据进行拟合分析，计算主要药代动力学参数C_max、AUC、T_max、T_1/2、MRT、CL等参数，并绘制出平均血药浓度-时间曲线。按照如下公式进行生物利用度的计算：

F(％)＝[AUC(po)×Div]/[AUC(iv)×Dpo]×100％

AUC：曲线下面积；D：给药剂量(mg/kg)

实验结果如表1所示。

表1.DK6-1的成药性评价

实施例5：hERG抑制活性实验

实验材料

(1)稳定表达hERG通道的HEK293细胞培养于35mm培养皿中，放置于37℃/5％CO₂培养箱中至少24h后用于实验。

(2)全细胞膜片钳实验所用细胞外液和细胞内液的成分如下表2所示。

表2全细胞膜片钳实验所用细胞外液和细胞内液的成分表

实验方法

(1)待测液配制：用适量DMSO溶解待测化合物DK6-1，配制成浓度为10mM储存液，放置于-20℃条件下备用。实验时，用细胞外液将储存液配置成实验用所需浓度。

(2)电生理记录：将培养皿用细胞外液清洗两次后放置于倒置显微镜载物台上。然后在室温下进行膜片钳实验，选用尖端电阻为3～5MΩ的硼硅玻璃微电极。

(3)电压刺激方案和电流记录：全细胞记录模式后，将膜电位钳制在-80mV，每隔20s给予细胞+50mV去极化电压刺激，2s后复极化至-50mV，持续3s后即可引出hERG尾电流。去极化电压刺激前，先给予细胞-50mV复极化电压(50ms)，此时记录的电流作为计算hERG尾电流的基线。只有达到记录标准的细胞才会被应用于待测化合物的检测。加入化合物前，hERG尾电流在细胞外液中至少稳定记录3min。灌流给药后当hERG尾电流幅值变化小于<5％时，被认为药物作用达到稳态。如果电流在6min内未达到稳态，则亦结束该浓度化合物检测。

(4)检测标准：需同时满足以下条件：实验中膜电阻大于1000MΩ、初始电流大于300pA、全细胞记录模式建立后串联电阻小于12MΩ、漏电流少于离子通道电流的10％(-80pA为最大值)

(5)数据分析：数据采集和分析使用pCLAMP 10.1软件程序。选取加入化合物前电流处于稳态的4～5个扫描值，计算峰值平均值，作为对照电流幅值。选取加入化合物后电流处于稳态的4～5个扫描值，计算峰值平均值，作为电流被抑制后的剩余幅值。待测化合物对hERG电流的抑制率根据以下方程进行计算：％抑制率＝[1-(电流剩余幅值)/(对照电流幅值)]×100

依据上述计算方法得到DK6-1多个浓度对hERG电流的抑制率后，使用logistic方程对数据进行拟合，得到DK6-1的IC₅₀值。结果如图2所示。

Claims

1.一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1，或其药学上可接受的盐，其特征在于具有如下所示的结构：

2.如权利要求1所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1，其特征在于所述化合物的药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。

3.如权利要求1所述的噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂DK6-1的制备方法，其特征在于步骤如下：

以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与2,6-二甲基-4-羟基苯甲醛发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2与氰甲基磷酸二乙酯经Wittig-Horner反应生成中间体3，中间体3在N,N-二甲基甲酰胺中与N-Boc-4-氨基哌啶反应并随后在三氟乙酸条件下脱Boc基团保护生成关键中间体4；最后中间体4在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸钾做碱的条件下，与4-溴甲基苯磺酰胺反应生成目标产物DK6-1；

试剂及条件:(i)2,6-二甲基-4-羟基苯甲醛，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-30℃；(ii)氰甲基磷酸二乙酯，叔丁醇钾，四氢呋喃，0℃；(iii)①N-Boc-4-氨基哌啶，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，120℃；②二氯甲烷，三氟乙酸，20-30℃；(iv)4-溴甲基苯磺酰胺，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-30℃。

4.一种如权利要求1所述噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。

5.一种药物组合物，包含权利要求1所述噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。