CN110144309B - 一株低温乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
一株低温高产酸乳酸菌，涉及一种乳酸菌。本发明低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。本发明低温高产酸乳酸菌，适合北方低温秸秆微贮发酵条件且产酸量高，为高纬度、寒冷地区的秸秆微贮发酵的发展提供了良好的菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌。
背景技术
仅在黑龙江省，每年便会产生约为4千万吨的玉米秸秆，但当地农民却不能有效地利用秸秆，玉米秸秆的处理方式多为焚烧或随意丢弃，且这种处理方式会造成严重的环境污染(如雾霾的频发)和资源浪费。与此同时，黑龙江还是畜牧大省，仅牛就有约5百万头，但饲料化的秸秆量不仅不足，且质量不优。
很多事实表明，玉米秸秆用微贮发酵的方法发酵后，会变成一种含有酸香气味、牲畜爱食且易消化的粗饲料。这样的处理方法，在一定程度上不仅解决了上述问题，而且还会带来巨大的经济效益。而乳酸菌在微贮发酵的过程中，有很重要的作用，会直接影响微贮饲料制备的好坏。由于玉米秸秆自身所携带的乳酸菌数量较少，无法在微贮发酵过程中发挥作用，会严重影响微贮饲料的制备，因此需要额外添加乳酸菌才能保证生产出高品质的微贮饲料。
目前市售的微贮乳酸菌添加剂是常温乳酸菌，其最适生长温度一般都高于15℃，当气温低于此温度时，就会生长代谢迟缓，导致发酵延迟、甚至停滞，不适于黑龙江省玉米秸秆微贮饲料制备时的环境温度。而大面积修建发酵车间或提供持续供暖系统投入量大，不符合实际发展现状。因此，获得适应北方低温发酵条件的乳酸菌具有积极意义。
发明内容
本发明提供了一株低温高产酸乳酸菌，适合北方低温秸秆微贮发酵条件且产酸量高。
本发明低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。
本发明屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为圆形、单个或成对排列(如图2所示)。
本发明屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518在15℃条件下、发酵初期，便可将 pH值迅速下降至5.00左右，而且产酸量明显优于市售乳酸菌，特别是发酵24h总酸度。
本发明屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518可在NaCl浓度为0.16g/ml条件下生长。
本发明为高纬度、寒冷地区的秸秆微贮发酵的发展提供了良好的菌种资源。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518为屎肠球菌，属于肠球菌属(Enterococcus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.15833，保藏日期为2018年05月31日。
附图说明
图1是15℃环境下屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518和“KP”菌株72h内总酸度变化图。
图2是屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518的电子显微镜观察图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcusfaecium) Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。
本实施方式屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518分离自由内蒙古乌兰浩特市的八一牧场、园中园牧场和洪喜牧场苜蓿剪碎压实常温青贮发酵的青贮窖中。
筛选过程；
从内蒙古乌兰浩特市的八一牧场、园中园牧场和洪喜牧场购得苜蓿，将其剪碎压实，在1000吨的青贮窖中进行常温青贮发酵。在腐熟中后期，随机取回少量的青贮样品，用真空密封机塑封，保证厌氧环境，并置于冰盒中低温保存备用。
将低温保存的青贮饲料在2～3h内进行缓冻，随后分别进行以下操作：用电子天平随机称取5g样品，加入装有100mL无菌生理盐水的试剂瓶中，摇晃30s；在无菌条件下，采用10倍梯度稀释法，将青贮饲料的滤液稀释至103、104、105倍；用移液枪分别移取稀释了103、104、105倍的青贮饲料滤液各1mL，涂布到含有0.5％CaCO3的MRS固体培养基上，15℃下培养72h，观察菌落的生长情况。
在无菌条件下挑取所有培养基上，最先长出且周围出现较大溶钙圈的菌落，采用平板划线法获得单菌落，再将分离出的、具有典型乳酸菌性状的菌种转移到含有0.5％CaCO3的MRS固体培养基上，15℃下培养72h，多次重复这一过程。选择生长状况良好的菌株，对其进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，将革兰氏染色呈阳性反应、过氧化氢酶试验呈阴性反应且最先长出、溶钙圈大的菌株转接到MRS斜面固体培养基上保存备用。
复筛：
在无菌条件下，将初步筛选的菌株与作为对照的“KP”菌株分别取1接种环，置于灭过菌的MRS液体培养基中，摇晃混匀，并用封口膜以及皮筋密封瓶口，形成厌氧环境，随后置于恒温培养箱中，并设置温度参数为15℃进行培养，定期(每隔24h)检测产酸情况，用酸度计测定72h内其pH值和酸度变化，选择产酸量最大的菌株，并命名为“Ef0518”。
MRS培养基的配方如表所示：
表1
上述“KP”菌株为黑龙江科蓬生物科技有限公司市售的乳酸菌冻干粉制剂用30℃左右的蒸馏水进行活化，随后无菌条件下，对其进行多次转接培养，最后选取生长状况良好的菌株，转接到MRS斜面固体培养基中备用。
Ef0518为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为圆形、单个或成对排列。
在15℃条件下，“Ef0518”菌株和“KP”菌株的pH整体都呈下降趋势；“Ef0518”菌株的pH变化明显，在72h内由6.89下降到5.28；相比之下，作为对照的“KP”菌株，其 pH下降趋势略趋于平缓，在72h内，pH仅由7.06下降到6.87。
在15℃条件下，“Ef0518”菌株和“KP”菌株的总酸度总体上都平稳增长(如图1所示)，“Ef0518”菌株的总酸度明显比对照“KP”菌株的总酸度值大，通过计算可知，“Ef0518”菌株在24h、48h、72h时的总酸度整体都比对照的“KP”菌株提高了50％以上，且在24h时，其总酸度提高最高，为95％。
鉴定：
将菌株“Ef0518”送往广州艾基生物技术有限公司进行16S rDNA测序，Ef0518”菌株的16S rDNA序列总长度为1392bp，经过BLAST对比分析，“Ef0518”的16S rDNA序列与肠球菌属(Enterococcus)中的屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐久肠球菌 (Enterococcusdurans)的序列相似性最高，故可确定“Ef0518”为肠球菌属(Enterococcus)。
结合生理生化检测结果(如表2所示)，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》确定“Ef0518”为肠球菌属(Enterococcus)中的屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
表2
实施例1
培养基低温产酸对比试验：
将屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518、屎肠球菌B5-2(“优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响”，《草业学报》，2016年4月)以及“KP”菌株(黑龙江科蓬生物科技有限公司市售的乳酸菌冻干粉制剂)活化后均制成浓度为5×106cfu/g的菌种液；再将屎肠球菌Ef0518、屎肠球菌B5-2和“KP”菌株的菌种液分别取 1ml接种于50ml灭过菌的pH值为6.2的MRS液体培养基中，摇晃混匀，并用封口膜以及皮筋密封瓶口，形成厌氧环境，随后置于恒温培养箱中，并设置温度参数为15℃进行培养，定期检测MRS液体培养基pH值如表3所示。
表3
| 0h | 12h | 24h | 48h | 72h | |
| 屎肠球菌Ef0518 | 6.2 | 5.79 | 5.58 | 4.65 | 4.61 |
| 屎肠球菌B5-2 | 6.2 | 5.83 | 5.61 | 5.57 | 5.58 |
| “KP”菌株 | 6.2 | 5.97 | 5.75 | 5.54 | 5.46 |
本发明屎肠球菌Ef0518在15℃低温条件下具有更为优异的产酸效果。
实施例2
养基秸秆低温产酸对比试验：
将屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518、屎肠球菌B5-2以及“KP”菌株活化后均制成浓度为5×106cfu/g的菌种液；再将屎肠球菌Ef0518、屎肠球菌B5-2和“KP”菌株的菌种液分别用灭菌喷壶均匀喷洒于切碎的玉米秸秆上并混匀，菌种液喷洒量为50ml菌种液/1kg玉米秸秆。然后置于15℃的恒温环境中进行发酵。分别在青贮第3、7、15、30 天取样；于青贮第30天时将剩余青贮袋打开暴露于氧气中，分别在开袋后第1、3、7、15、 30天取样，测定玉米秸秆的pH值。检测结果如表4所示。
表4
Claims (1)
1.一株低温乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。
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