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CN119874789A - 一类叠氮前药化合物、制备方法及其应用 - Google Patents

一类叠氮前药化合物、制备方法及其应用 Download PDF

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杨金莹
高权
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冯桂珍
牟峙霖
岳思渊
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肖海琪
付臻鹏
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Abstract

本发明公开了一类叠氮前药化合物、制备方法及其应用，属于医药技术领域。本发明提供式(1)结构的叠氮前药化合物，其中，D来源于活性小分子。本发明叠氮前药化合物照射后的前药的转化率较高，同时检测到明显的原药/中间过渡态生成，表现出更好的药物释放性能；同时，相比原药具有更低的毒性。

Description

一类叠氮前药化合物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一类叠氮前药化合物、制备方法及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
目前通过化疗药物来治疗癌症仍被认为是最有效延长患者存活时间的治疗手段，但是由于癌细胞是由机体健康细胞突变而来，现有化疗药物的选择性很难将癌细胞与健康组织细胞相区分，所以在通过化疗药物治疗的时候很难在杀灭癌细胞的同时保证患者健康安全。为实现精准化疗，围绕前药激活策略的研究成为目前的热门方向之一。通过化学手段将毒性较大的药物分子中羧基、氨基、羟基等活性位点键合特定的保护基团，从而屏蔽其活性，降低毒性，给药后利用生物体肿瘤特异性内源环境或外源刺激引发的化学反应在肿瘤位置原位脱除保护基团，恢复其活性，最终实现药物的可控释放。该策略不仅可有效降低传统化疗过程中的毒副作用，克服母体药物的剂量限制，而且通过保护基团的设计、优化有望改善原药分子的生物利用度，延长血液循环时间，推动其在临床中的应用。
内源驱动的前药激活主要借助肿瘤特有的微环境，如肿瘤病变区域内过表达的酶、活性氧、谷胱甘肽以及较低的pH等。然而，这种依赖于肿瘤微环境的前药转化策略具有可调性差、种类少、药物过早释放等不容忽视的缺陷。为了规避内源性刺激的各种障碍，研究人员将目光投向非侵入式信号(如光、声、磁场等)介导的智能前药激活体系。这些外源性响应体系通过外加信号的能量输入作为控制药物释放的开关，精准的实现将低毒的小分子前药在患处转化成高毒性药物，最终杀死肿瘤细胞。相比传统直接的给药手段，非侵入式前药激活具有更好的生物安全性。但由于组织传统性差、材料制备困难、体系效率不佳等诸多因素限制，通过光、声等方式的前药激活治疗方法实际应用收到诸多阻碍，难以真正实现临床治疗。
相比之下，放射线具有优异的组织穿透性。在聚焦位点，放射线对水的化学电离作用产生大量的活性自由基，实现精准杀伤肿瘤细胞。目前，放射疗法已成为肿瘤的三大主要治疗手段之一。且现阶段用于医学放射治疗的X射线技术发展迅速，能够在亚毫米级别对肿瘤进行精准定位。因此，利用X射线介导的前药激活策略具有时空可控、剂量可控及组织穿透性好等优势，能更好地实现抗癌药物在肿瘤部位的可控释放，大幅减少对正常细胞的杀伤，在联合放化疗的基础上实现肿瘤精准治疗。相对于其它激活方式，X射线介导的前药激活体系研究较少，近五年才陆续出现相关报道。根据现有研究，X射线对前药的激活主要依赖于肿瘤部位经X射线照射之后表达上调的酶(如caspase-3)及水分子电离生成的羟基自由基(·OH)、氢自由基(·H)、水合电子(e- aq)等。尽管上述前药激活体系在体外激活及体内药效实验中获得了一定的效果，但是仍处于初期探索阶段，面临激活效率不稳定、原药适用范围受限等挑战。因此，针对多种具有广谱抗肿瘤活性的化疗药物进一步开发结构新颖、安全性好、可实现稳定激活的放疗响应前药激活体系十分必要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一类具有式(1)所示结构的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐：
式中，R1为一至四取代，具体选自如下任意一种或多种取代基：H、卤素(F、Cl、Br、I)，取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的C1-6烷氧基、-C(＝O)N(Ra)-(CHRb)-COORc；所述取代的取代基选自卤素原子、羟基、C1-6烷基和C1-6环氧基；Ra、Rb、Rc分别独立地选自H、C1-6烷基；
A为空键、-C(＝O)-，或者
D来源于活性小分子，所述活性小分子选自如下化合物或其药学上可接受的盐：柔红霉素(DAU)、阿霉素(DOX)、喜树碱(CPT)、丝裂霉素C(MMC)、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、蟾毒灵(BUF)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、吉西他滨(GEM)、雷西莫特(RES)、依喜替康(EXA)、紫杉醇(PTX)；R2、R3分别独立地选自：H、取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的芳基、-CH2-C(＝O)N(R4)CH2COOR5；芳基上的取代为一至四取代，芳基或C1-6烷基上的取代基选自如下任意一种或多种：卤素(F、Cl、Br、I)、叠氮基(-N3)；R4、R5分别独立的选自H、C1-6烷基；
并且，活性小分子为柔红霉素或者丝裂霉素C时，R2、R3不同时为H。
在本发明的一种实施方式中，所述芳基为苯环或者萘环。
在本发明的一种实施方式中，A为空键时，相应通式的结构为
在本发明的一种实施方式中，优选的：D为R2为H，R3为取代或未取代的苯基；取代基选自如下任意一种或多种：卤素(F、Cl、Br、I)、叠氮基(-N3)。
在本发明的一种实施方式中，优选的：D为R2为H，R3为-CH2-C(＝O)N(R4)CH2COOR5；R4、R5分别独立的选自H、C1-6烷基。
在本发明的一种实施方式中，优选的：D为R1为一至四取代取代基为H、卤素(F、Cl、Br、I)；进一步优选一至二卤素(F、Cl、Br、I)取代。
在本发明的一种实施方式中，D具体选自如下结构：
在本发明的一种实施方式中，所述其药学上可接受的盐包括无机盐或者有机盐；其中无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、钠盐、钙盐、钾盐、镁盐、银盐、锂盐。所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐、葡甲胺盐、氨丁三醇盐、二乙胺盐、赖氨酸盐、胆碱盐、精氨酸盐、特丁胺盐、N,N-二苄基乙二胺盐。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物还包含药用辅料。所述药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物还包含药物载体。所述药物载体选自微囊、微球、纳米粒和脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物的剂型包括：注射液、注射用冻干粉针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。
本发明还提供抗体-小分子药物偶联物，是将上述叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐与抗体偶联。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体-小分子药物偶联物的结构如下所示：
或者
其中，x为小分子药物与抗体的比例，x为3-5；Ab为曲妥珠单抗；R1、R2、R3、R4、Ra的定义同上。
有益效果：
本发明前药化合物照射后的峰面积显著降低、前药的转化率较高，同时检测到明显的原药/中间过渡态生成，表现出更好的药物释放性能。
此外，本发明前药化合物相比原药具有更低的毒性。
附图说明
图1为实施例4化合物的毒性结果对比图。
图2为实施例5化合物的毒性结果对比图。
图3为实施例6化合物的毒性结果对比图。
图4为实施例7化合物的毒性结果对比图。
图5为实施例9化合物的毒性结果对比图。
图6为实施例10化合物的毒性结果对比图。
图7为实施例12化合物的毒性结果对比图。
图8为实施例18化合物的毒性结果对比图。
图9为实施例27中ADC和裸抗的Maldi(飞行时间质谱)。
图10为实施例27中照射前XP-106-ADC001的ESI(高分辨蛋白质谱)。
图11为实施例27中照射(100Gy)后的ESI(高分辨蛋白质谱)。
图12为实施例27化合物的毒性结果对比图。
具体实施方式
在本发明中“C1-6烷基”是指分别为1至6个碳原子的饱和的直链或支链的单价烃基。实例包括，但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基和2-甲基-2-丙基。
在本发明中“C3-6环烷基”是指分别为3至6个碳原子的环烷基。
在本发明中“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子分别被相同的或者不同的取代基所取代。
术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性，刺激性，过敏反应等的盐，并具有合理的收益/风险比。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。
本发明涉及的HPLC测试过程包括：
HPLC涉及的色谱条件如下所示：
本发明涉及的照射参数条件：仪器为小动物X射线辐照仪，型号为RS2000-PRO-225，照射所选参数为225KV、17.7mA、位置放置为第五层、60-100Gy、所需时间9-15min。样品先溶于DMSO中加入适量表面活性剂Triton X-100后用纯水稀释浓度为10uM-20uM，配置好的液体放置玻璃瓶中超声5-10min，取1mL留样，剩下液体通氩气20min后密封，在常温下照射。
本发明涉及的中间体5((4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯基)甲基-4-硝基苯基碳酸酯)的制备：
相应的合成路线如下所示：
具体包括如下步骤：
第一步
操作：将5.5g五氟苯甲醛溶于50mLDMF中，在室温下加入叠氮基三甲基硅烷3.3g(1.05eq)，然后缓慢滴加四丁基氟化铵(1mol/L四氢呋喃溶液，10mol％)2.56mL，室温反应半个小时。
检测：TLC检测(PE:EA＝40:1)。
后处理：将反应液缓慢倒入500mL的水中，用石油醚/乙醚(10/1)萃取分液(110mLx3)，合并有机相后用饱和食盐水洗涤两次(150mL x 2)，用无水硫酸钠干燥，过滤，40℃旋蒸除去石油醚/乙醚(可回收)，再用油泵抽干后得到类白色固体5.5g。(无需纯化直接用于下一步)
第二步
操作：将5.5g 4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲醛溶于50mL甲醇中，溶解后在冰浴下降温至0℃，分次逐渐加入260mg硼氢化钠，加完后立即检测。
检测：TLC检测(PE:EA＝15:1)。
后处理：检测完后确认反应完全后立即淬灭，在冰浴下加入20mL稀盐酸溶液(1mol/L)和30mL水(有大量白色固体析出)，搅拌10min,45℃旋走甲醇(可回收)后再加入20mL稀盐酸溶液(1mol/L)和30mL水，搅拌10min(此时pH>1.5)，过滤，滤饼用30mL水冲洗，干燥，再用油泵抽干，得到白色固体产物5g。(无需纯化直接用于下一步)
第三步
操作：将5g 4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲醇溶于50mLDCM中，加入5.47g氯甲酸对硝基苯酯，在冰浴下冷却至0℃，加入0.5g DMAP后，缓慢滴加3.5mL三乙胺，在冰浴反应5-30min(检测为主)。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)。
后处理：检测反应基本反应完全后加入水(150mL)和50mLDCM萃取分液，用100mL稀盐酸溶液(0.4mol/L)洗涤有机相后再用100mL饱和碳酸钠溶液洗涤，有机相接着用水(100mLx 2)、饱和食盐水100mL洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，45℃旋蒸除去DCM(可回收)，再用油泵抽干，得到类白色固体粗品8.5g。
纯化：用50mLPE:EA＝100:1打浆2h,过滤干燥，用40mL乙醇在80℃完全溶解后撤掉热源，自然冷却10h(重结晶)，过滤，滤饼用5mL乙醇、20mL石油醚冲洗，再用油泵抽干后得到类白色固体中间体54.8g。(酸碱洗涤能洗掉一个杂质但另一个杂质TLC紫外下增强，重结晶前要TLC点板看产物是否为主点，可以用离心管尝试是否能重结晶。)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(d,J＝9.2Hz,2H),7.40(d,J＝9.2Hz,2H),5.40(s,2H).
本发明涉及的中间体13的制备：
N-(3-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorophenyl)-3-(((4-nitrophenoxy)carbonyl)oxy)propanoyl)-N-methylglycine连接子的制备方法：
第一步
操作:将2.0g 4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲醛溶于40mLDCM中，在室温下加入DIPEA2.58g、冰乙酸0.5g和TMSOTf4.05 g，室温反应两个小时。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)。
后处理:反应完全后无需纯化和后处理直接用于下一步。
第二步
操作:加入40mL乙醇，缓慢滴加2.25mLTFA，常温搅拌5min后在48℃旋干。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)。
后处理:用DCM助溶后湿法上样，柱层析(PE:EA＝1:0,10:1,5:1,3:1,1:1)，旋干，抽油泵2h后得到1.03g产物
第三步
操作:将1.03g compund 9溶于20mLDCM中，加入0.94mLTEA,0.8g compound 10,
1.52g DCC和0.6g HOBt，室温反应16h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)。
后处理:过滤，滤液旋干。
纯化：用DCM助溶后湿法上样，柱层析(PE:EA＝1:0,10:1,5:1,4:1,3.5:1)，旋干，抽油泵2h后得到1.2g产物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.55(dt,J＝10.0,2.8Hz,1H),4.33(t,J＝3.6Hz,1H),4.12–3.98(m,2H),3.03(d,J＝11.6Hz,2H),1.70–1.62(m,3H),1.47(s,9H).
第四步
操作:将1.2g compund 11溶于20mLDCM中，加入0.63g compound4,在冰浴下冷却至0℃，加入0.12g DMAP后，缓慢滴加0.55mL三乙胺，在冰浴反应30-60min(检测为主)。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)。
后处理:加入水(50mL)和30mLDCM萃取分液，用饱和食盐水洗涤，有机相旋干得到1.6g粗品。
第五步
操作:将1.6g compund 12(粗品)溶于6mL DCM中，缓慢滴加6mL TFA，室温反应2h。
检测：TLC检测(PE:EA＝5:1)和(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理:40℃旋干。
纯化：用DCM助溶后湿法上样，柱层析((DCM:MeOH＝1:0,100:1,80:1,40:1)，旋干，抽油泵2h后得到430mg产物(中间体13)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝9.2Hz,2H),7.38(d,J＝9.2Hz,2H),6.52(t,J＝7.2Hz,1H),4.14(t,J＝12.0Hz,2H),3.46(dd,J＝16.8,7.6Hz,2H),3.18–3.06(m,3H).
本发明涉及的中间体22的制备：
连接子4-叠氮-3,5-二氟苯甲醇的制备方法：
合成方法:
第一步
操作:将2.0g compound 19溶于20mL无水DMF，加入1.73g TMSN3，然后在0℃滴加入1.25mLTBAF，于室温反应24h。
检测：TLC检测(PE:EA＝10：1)。
后处理和纯化:将反应液缓慢倒入500mL的水中，用石油醚/乙醚(10/1)萃取分液(110mL x 3)，合并有机相后用饱和食盐水洗涤两次(150mL x 2)，用无水硫酸钠干燥，过滤，40℃旋蒸除去石油醚/乙醚(可回收)，再用油泵抽干后得到类白色固体2.2g。
第二步
操作:将250mg 4-叠氮-3,5-四氟苯甲醛溶于10mL甲醇中，溶解后在冰浴下降温至0℃，分次逐渐加入11mg硼氢化钠，加完后立即检测。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)。
后处理:检测完后确认反应完全后立即淬灭，在冰浴下加入4mL稀盐酸溶液(1mol/L)和20mL水(有大量白色固体析出)，搅拌10min,45℃旋走甲醇(可回收)后再加入20mL稀盐酸溶液(1mol/L)和30mL水，搅拌10min(此时pH>1.5)，过滤，滤饼用30mL水冲洗，干燥，再用油泵抽干，得到白色固体产物250mg。
第三步
操作:将134.8mg 4-叠氮-3,5-四氟苯甲醇溶于5mL DCM中，加入190.89mg氯甲酸对硝基苯酯，在冰浴下冷却至0℃，加入13.5mg DMAP后，缓慢滴加0.15mL三乙胺，在冰浴反应30-60min(检测为主)。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)。
后处理和纯化:后处理加水淬灭，注意控制低温，乙酸乙酯萃取。柱层析纯化。
实施例1
叠氮前药XP-101-DAU-000的制备：
合成方法：
操作：在室温下将60mg(4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯基)甲基-4-硝基苯基碳酸酯(中间体5)溶于4mL无水DMF，随后加入分子筛与25μL三乙胺，搅拌10min。将30mg柔红霉素盐酸盐溶于4mL无水DMF，并加入25μL三乙胺，加入上述溶液；在氮气保护下于室温反应19-24h。
检测：用TLC(5％甲醇：DCM)监测反应。
后处理：用水稀释,EtOAc萃取,饱和NaHCO3溶液与水洗涤,无水Na2SO4干燥，旋蒸浓缩。
纯化：最后，用闪式色谱柱(5％MeOH:EtOAc)纯化得到35mg砖红色产物，即为叠氮前药XP-101-DAU-000。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.99(s,1H),13.29(s,1H),8.17–7.94(m,1H),7.79(t,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),5.49(d,J＝3.6Hz,1H),5.26(s,1H),5.11(s,2H),4.42(s,1H),4.21(d,J＝6.0Hz,1H),4.08(s,3H),3.87(s,1H),3.65(s,1H),3.24(d,J＝18.8Hz,1H),3.01–2.83(m,3H),2.41(s,2H),2.30(d,J＝14.8Hz,1H),2.11(dd,J＝14.8,3.9Hz,1H),1.89(d,J＝13.6Hz,2H),1.80–1.70(m,1H),1.33–1.23(m,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C35H30F4N4O12Na,[M+Na]+:797.16886,found:797.16913.
HPLC检测：原药分子DAU的HPLC出峰时间为17.284min。照射前后前体药物(prodrug)的峰面积(HPLC 254nm)减少32.4％(100Gy,20uM)，产生的新峰较杂。
涉及的转化率＝(照射前前药的峰面积-照射后前药的峰面积)/照射前前药的峰面积。
实施例2
前药XP-104-CPT-000的制备：
合成方法：
操作：将105mg喜树碱溶于1mL无水DCM，加入150mg氯甲酸对硝基苯酯，冰浴冷却至0℃，搅拌10min。
将37mg DMAP溶于1mL无水DCM，滴入反应体系，继续搅拌10min，将反应体系取出冰浴，室温搅拌反应2h。
检测：用TLC检测喜树碱是否反应完全。
后处理：加入EtOAc稀释，用0.1M HCl洗涤，用水洗涤，用Na2SO4干燥，旋蒸浓缩。
纯化：最后，用闪式色谱柱(EtOAc)纯化得到目标产物。
操作：在室温下将65mg喜树碱-4-硝基苯基碳酸酯与100mg 4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲醇溶于3mL无水DCM，搅拌10min。将24mg DMAP与30μL三乙胺溶于1mL无水DCM，缓慢滴加入上述溶液；在氮气保护下于室温反应24h。
检测：用TLC监测反应。
后处理：用水稀释，EtOAc萃取，饱和NaHCO3溶液，0.1M盐酸与饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥,旋蒸浓缩。
纯化：最后，用闪式色谱柱(EtOAc)纯化产物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.86(t,J＝7.7Hz,1H),7.70(dt,J＝10.6,5.3Hz,2H),7.53(dd,J＝5.6,3.3Hz,1H),5.72(d,J＝17.3Hz,1H),5.42(d,J＝17.3Hz,1H),5.34–5.27(m,2H),4.30(t,J＝6.7Hz,2H),2.37(td,J＝14.8,7.3Hz,1H),2.23(ddd,J＝25.4,16.4,9.0Hz,1H),1.07(t,J＝7.5Hz,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C28H17O6N5F4Na,[M+Na]+:618.10072,found:618.10070.
HPLC检测：原药分子CPT的HPLC出峰时间为18.442min。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少95.5％(100Gy,10uM)，产生原药CPT峰和连接子峰compound 3-a(HPLC254nm出峰时间为17.0min)。。
其中，compound 3-a的结构为
细胞内毒性检测
将相应细胞以4000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度的XP-104-CPT-000及原药CPT给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如表1所示。对于不同细胞，前药XP-104-CPT-000的IC50都显著低于原药CPT。
实施例3
前药XP-106-MMAE-000的制备：
合成方法：
操作:将150mg MMAE溶于0.5mL无水DMF，加入140mg(4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯基)甲基-硝基苯基碳酸酯，然后加入60mg HOBt和滴加150uL三乙胺，于室温反应24h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在40℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(DCM:MeOH＝20:1)。最后获得产物(205mg,84.3％yield)性状为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(dd,J＝19.2,12.6Hz,5H),6.51(d,J＝12.8Hz,2H),5.43–5.11(m,3H),4.96(s,1H),4.70(s,2H),4.40–3.99(m,6H),3.86(dd,J＝31.2,17.4Hz,2H),3.65–3.26(m,9H),3.12–2.74(m,6H),2.40(dt,J＝24.0,15.2Hz,3H),2.29–2.14(m,2H),2.01(d,J＝24.0Hz,4H),1.85(s,2H),1.26(s,3H),1.06–0.77(m,20H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C47H68O9N8F4Na,[M+Na]+:987.49376,found:987.49377.
HPLC检测：原药分子MMAE的HPLC出峰时间为17.018min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少83.2％(100Gy,10uM)，产生新峰有中间态XP-106-MMAE-000-cp1，原药MME(220nm)和连接子峰compound 3_a。
其中，
实施例4
前药XP-107-BUF-000的制备：
合成方法：
操作:将100mg蟾毒灵溶于1mL无水DCM，加入120mg对硝基苯基氯甲酸酯，在0℃下加入38mg DMAP和60uL TEA，于室温反应24h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷助溶后湿法柱层析分离(PE:EA＝1:0,5:1,3:1,1:1)。最后获得产物compound 7(110mg,77.1％yield)性状为白色固体。
操作:将60mg compound 7溶于2mL无水DCM，加入28mg(4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯基)甲醇，加入26mg DMAP和40uL TEA，于室温反应48h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(PE:EA＝1:1)。最后获得产物XP-107-BUF-000(50mg,72.5％yield)性状为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(dd,J＝9.6,2.5Hz,1H),7.23(d,J＝2.0Hz,1H),6.26(d,J＝9.6Hz,1H),5.23(s,2H),5.00(s,1H),2.46(dd,J＝9.2,6.4Hz,1H),2.26–2.13(m,1H),2.12–1.98(m,2H),1.99–1.81(m,3H),1.80–1.63(m,5H),1.57(d,J＝3.6Hz,3H),1.49(d,J＝3.6Hz,1H),1.45–1.14(m,8H),0.92(d,J＝18.0Hz,3H),0.70(s,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C32H36O6N3F4,[M+H]+:634.25348,found:634.25378.
HPLC检测：原药分子BUF的HPLC出峰时间为21.813min。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少72.3％(100Gy,10uM)，有少量原药BUF和连接子compound 3_a产生。
细胞内毒性检测
将相应细胞以4000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值，
具体的结果如表4及图1所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例5
前药XP-107-BUF-004
合成方法：
操作:将120mg compound 5溶于5mL无水DCM，加入40mg Piperazine和56uLTEA，于室温反应2h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷助溶湿法柱层析分离(PE:EA＝1:0,0:1)、(EA:MeOH＝20:1,10:1,5:1)加千分之一的氨水。最后获得产物6(92.2mg,92％yield)性状为白色固体。
操作:将40mg compound 7溶于2mL无水DCM，加入29mg compound 6和40uLTEA，于室温反应24h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(DCM:MeOH＝30:1)，得到的白色固体再用(PE:EA＝1:1,1mL)超声洗涤，过滤。最后获得产物XP-107-BUF-004(30mg,50.1％yield)性状为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(dd,J＝9.6,2.5Hz,1H),7.25(s,1H),6.29(d,J＝9.6Hz,1H),5.25(s,2H),5.06(s,1H),3.75(d,J＝7.2Hz,1H),3.49(s,8H),2.56–2.41(m,1H),2.22(d,J＝12.4Hz,2H),2.07(t,J＝10.8Hz,2H),1.92(dd,J＝17.2,7.2Hz,2H),1.76(dd,J＝25.2,11.9Hz,4H),1.57–1.14(m,12H),0.97(s,3H),0.72(s,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C37H44O7N5F4,[M+H]+:746.31714,found:746.31757.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.077min。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少48.6％(100Gy,10uM)，第一次100Gy照射没有新峰，连续照射两次100Gy后220nm有少量原药3-2-3和连接子compound 3_a产生。
细胞内毒性检测
将相应细胞以4000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如表4及图2所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例6
前药XP-102-DOX-001
合成方法：
操作:把阿霉素(50.0mg,0.09mmol,1.0eq)和compound 13(60mg)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中。在冰浴下，把三乙胺(0.04mL)加入到反应液里。反应液在0℃下反应24h。
检测：TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示原料1阿霉素已经反应完，有两个极性很接近的新点产生。
后处理和纯化:用0.2um滤膜过滤，制备HPLC分离，得到峰1(21.882min)，峰2(22.279min)过不干净(有两根峰，异构体)，用峰1(21.882min)做实验。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C40H37O16N5F4Na,[M+Na]+:942.20636,found:942.20648.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为16.265min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少46.2％(100Gy,10uM)，但无明显新峰。
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育24h；24h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图3所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例7
前药XP-102-DOX-002的制备
合成方法:
操作:将27mg compound 14溶于5mL无水DCM，加入22mg对硝基苯基氯甲酸酯，在0℃下加入3mg DMAP和15uLTEA，于室温反应2h。
检测：TLC检测(PE:EA＝5:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(PE:EA＝3:1)。
最后获得产物compound 15(14mg)性状为白色固体。
操作:将20mg DOX溶于0.5mL无水DMF，加入18mg compound 15，在0℃下加入3mgHOBt和15uL TEA，于室温反应24h。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝10:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(DCM:MeOH＝10:1)。最后获得产物XP-102-DOX-002(5mg)性状为砖红色固体。
HPLC显示两根峰，有异构。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C41H34O13N4F4Na,[M+Na]+:889.19507,found:889.19537.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为16.265min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少62.1％(100Gy,10uM)，产生两根新峰XP-102-DOX-002-cp1(22.884；23.132min)。
其中，
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育24h；24h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图4所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例8
前药XP-102-DOX-004的制备
合成方法:
操作:将70mg compound 16溶于0.5mL无水DCM，加入45mg compound 4，在0℃下加入7mg DMAP和24uL TEA，于室温反应1-2h。
检测：TLC检测(PE:EA＝5:1)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(DCM:MeOH＝20:1)。最后获得产物compound 17性状为砖红色固体。
操作:将20mg DOX溶于0.5mL无水DMF，加入27mg compound 17，在0℃下加入3mgHOBt和18uL TEA，于室温反应24h。
检测：TLC检测(EA)
后处理和纯化:在37℃下旋干，重新用二氯甲烷溶解后硅胶大板分离(DCM:MeOH＝20:1)。最后获得产物XP-102-DOX-004性状为砖红色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C41H29O13N7F8Na,[M+Na]+:1002.15878,found:1002.15906.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为16.265min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少20.4％(100Gy,10uM)，产生多个小新峰且吸收很弱。
实施例9
前药XP-106-MMAE-001
合成方法:
操作:将73mg MMAE溶于2mL无水DMF，加入90mg compound 12，然后加入30mg HOBt和滴加70uL三乙胺，于室温避光反应24h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在30℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解湿法上样，柱层析(正己烷：乙酸乙酯＝1:0,1:1,0:1)后换(乙酸乙酯：甲醇＝20:1)。最后获得产物(11mg,85％yield)性状为白色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C56H83O12N9F4Na,[M+Na]+found:1172.59924.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(d,J＝15.2Hz,1H),7.61–7.32(m,5H),6.80–6.68(m,1H),6.37(s,2H),4.99(s,1H),4.71(s,2H),4.36–3.90(m,7H),3.76(d,J＝4.8Hz,2H),3.65–3.22(m,9H),3.23–2.72(m,12H),2.55–1.98(m,9H),1.59–1.14(m,17H),1.16–0.68(m,17H).
操作:将100mg compound 18溶于5mL无水DCM，在0℃下滴加溶于1mLDCM的0.3mLTMSOTf，于冰浴下避光反应1h，监测未反应完在补加0.2mLTMSOTf再反应半个小时。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在0℃下用NaHCO3溶液淬灭反应(pH<5)，加入10mLDCM，萃取，有机相用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。重新用二氯甲烷溶解湿法上样，柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝1:0,100:1,20:1,10:1,1:1)，旋干，DCM溶解用滤膜过滤(除硅胶)。用正己烷：乙酸乙酯(20:1)打浆2h,离心得到固体(60mg,63.1％yield)性状为白色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C52H75O12N9F4Na,[M+Na]+,found:1116.53931.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.018min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少72.7％(100Gy,10uM)，产生中间态XP-106-MMAE-001cp1、原药MMAE和连接子峰compound 13-a。
其中，XP-106-MMAE-001cp1、连接子峰compound 13-a的结构如下所示：
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育24h；24h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图5所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例10
前药XP-106-MMAE-002
合成方法:
操作:将20mg MMAE溶于0.5mL无水DMF，加入14mg compound 15，然后加入3mgHOBt和滴加10uL三乙胺，于室温反应24h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在40℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(EA)。最后获得产物XP-106-MMAE-002(20mg)性状为白色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C53H72O9N8F4Na,[M+Na]+,found:1041.5437.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.018min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少13.1％(100Gy,20uM)，产生中间态XP-106-MMAE-002cp1和原药MMAE。
其中，中间态XP-106-MMAE-002cp1的结构如下所示：
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育24h；24h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图6所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例11
前药XP-106-MMAE-004
合成方法:
操作:将30mg MMAE溶于0.5mL无水DMF，加入27mg compound 17，然后加入3mgHOBt和滴加18uL三乙胺，于室温反应24h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在40℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(EA)。最后获得产物XP-106-MMAE-004性状为白色固体。HRMS(ESI):m/z Calcd for C53H67O9N11F8Na,[M+Na]+:1176.48877,found:1176.48889.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.018min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少99.0％(100Gy,20uM)，产生中间态XP-106-MMAE-004cp1和原药MMAE。
其中，中间态XP-106-MMAE-004cp1的结构如下所示：
实施例12
前药XP-106-MMAE-005
合成方法:
操作:将34.46mg MMAE溶于0.5mL无水DMF，加入20mg compound 22，然后加入10mgHOBt和滴加8uL三乙胺，于室温避光反应24h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:在40℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂为纯EA。最后获得产物XP-106-MMAE-005(40mg,89.7％yield)性状为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(dd,J＝57.2,8.0Hz,1H),7.55-7.30(m,3H),6.91(d,J＝8.8Hz,1H),6.50(d,J＝9.2Hz,1H),5.32(d,J＝19.2Hz,1H),5.16-4.91(m,2H),4.69(d,J＝7.6Hz,2H),4.37–4.23(m,1H),4.16(s,1H),4.08(s,1H),3.84(d,J＝8.0Hz,1H),3.58-3.17(m,5H),3.06-2.62(m,4H),2.49-2.30(m,2H),2.03(dd,J＝31.6,21.7Hz,3H),1.85(s,1H),1.37-1.17(m,7H),1.09–0.94(m,3H),0.91-0.67(m,7H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C47H70O9N8F2Na,[M+Na]+:951.51260,found:951.51257.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.018min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少99.0％(100Gy,10uM)，产生中间态XP-106-MMAE-005cp1和原药MMAE。
其中，中间态XP-106-MMAE-005cp1的结构如下所示：
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图7所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例13
前药XP-107-BUF-001
合成方法：
操作:将20mg compound 3-2-3溶于0.5mL无水DCM，加入20mg compound 13，然后加入20uL三乙胺，于室温反应24h。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝10:1)。
后处理和纯化:在37℃下，把DCM旋干，用HPLC制备进行纯化。最后获得产物(5mg,84.3％yield)性状为白色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C42H51 O10N6F4,[M+Na]+:875.35973,found:875.36023.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.077min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少69.1％(100Gy,20uM)，产生连接子compound13-a、中间态XP-107-BUF-001cp1和原药3-2-3。
实施例14
前药XP-104-CPT-002
合成方法：
操作:将106mg compound 6溶于2mL无水DCM和1mL DMF，加入48.5mg compound21，然后加入8mg DMAP和滴加35uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理和纯化:在37℃下，先旋干DCM后用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用柱层析进行纯化，最后获得产物XP-104-CPT-002(54mg)性状为类白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(s,1H),8.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.89–7.83(m,1H),7.69(t,J＝7.2Hz,1H),7.25(s,1H),6.97–6.88(m,2H),5.71(d,J＝17.2Hz,1H),5.38(d,J＝17.2Hz,1H),5.30(s,2H),5.08–4.99(m,2H),2.27(dt,J＝15.2,7.6Hz,1H),2.20–2.12(m,1H),1.02(t,J＝7.6Hz,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C28H20O6N5F2,[M+Na]+:560.13762,found:560.13812.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为18.442min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少63.1％，产生原药CPT和中间态XP-104-CPT-002cp1。
实施例15
前药XP-104-CPT-004
合成方法：
将2-氨基-5-氟苄醇(50.0mg,1.0eq)溶解在5M盐酸(2.0mL)中，置于冰浴下搅拌。向反应液中缓慢滴加亚硝酸钠(27.0mg,1.1eq)水溶液，10分钟后，将叠氮化钠(92.0mg,4.0eq)水溶液缓慢加入反应液中，并于冰浴下搅拌1小时。反应完成后，用碳酸氢钠调碱至pH～8，并用乙酸乙酯萃取，将萃取有机相旋干(温度<35℃)。用prep-TLC(EA:PE＝1：1)进行纯化，得到产品2-叠氮-5-氟苄醇(50.0mg,84％Yield)为棕黄色固体。
操作:将中间体6(100mg,1.0eq.)溶解在干燥的DCM(3mL)和DMF(0.5mL)中，在冰浴下加入TEA(82μL,3.0eq)，DMAP(10mg，0.1eq)和2-叠氮-5-氟苄醇(40mg,1.1eq)，并于室温下搅拌24小时。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理和纯化:在37℃下，把反应液旋干DCM后通过prep-TLC(EA)进行纯化，得到产品(6mg，5％Yield)为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(s,1H),8.26(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.88(t,J＝7.2Hz,1H),7.71(t,J＝7.6Hz,1H),7.34(d,J＝5.6Hz,1H),7.15(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.09(dd,J＝8.8,4.5Hz,1H),7.04–6.97(m,1H),5.73(d,J＝17.2Hz,1H),5.42(d,J＝17.2Hz,1H),5.33(s,2H),5.12(d,J＝2.0Hz,2H),2.35–2.30(m,1H),2.24–2.16(m,1H),1.04(t,J＝7.6Hz,3H).
LCMS(ESI):m/z found:542.3.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为18.544min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少58.1％(100Gy,10uM)，产生原药CPT。
实施例16
前药XP-104-CPT-005
合成方法:
操作:将80mg compound 6溶于5mL无水DCM，加入27.9mg compound 27，然后加入5.7mg DMAP和滴加26uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理和纯化:在37℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(DCM:MeOH＝10:1)，最后获得产物XP-104-CPT-005(44mg)性状为类白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(s,1H),8.23(d,J＝8.6Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.93–7.83(m,1H),7.76–7.66(m,1H),7.33(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(s,2H),6.92(d,J＝8.4Hz,1H),5.70(d,J＝17.2Hz,1H),5.49–5.28(m,3H),5.09(d,J＝14.4Hz,2H),2.32–2.10(m,2H),1.01(t,J＝7.6Hz,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C28H22O6N5,[M+Na]+:524.15756,found:524.15680.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为18.490min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少68.1％(100Gy,10uM)，产生原药CPT。
实施例17
前药XP-106-MMAE-008
合成方法:
将对叠氮苯甲醇(35mg，0.23mmol，1.0eq)溶于无水DCM中，将compound4(55.6mg，0.27mmol，1.2eq)溶于DCM中，在冰浴条件下加入反应瓶，冰浴搅拌五分钟后依次缓慢滴加DMAP(3.5mg，10％，0.5ml)的二氯甲烷溶液，TEA(47.8uL,0.34mmol,1.5eq)的0.5mL二氯甲烷溶液，反应10min，PE:EA＝1:1监测反应，产物Rf在0.8左右。直接刮大板纯化，得到白色固体产物(53mg，yield:73.4％)。
操作:将MMAE(43.8mg，0.06mmol，1.0eq)溶于无水DMF中，溶清，呈无色透明，加入中间体28(23mg，0.073,1.2eq)，溶液变黄色。加入HOBt的DMF溶液(10mg，30％，0.5ml)，反应液呈浅黄色，加入TEA(10uL,1.2eq)，反应液颜色加深，呈淡黄色。避光常温过夜反应。
检测：TLC纯EA监测反应后判断反应完成。
后处理和纯化:在38℃下，油泵旋走DMF，用少量DCM重新溶解上大板。纯EA跑大板纯化，得到12.8mg白色固体产物(yield：23.5％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50–7.31(m,5H),7.00(d,J＝7.6Hz,2H),6.53(s,2H),6.32–6.18(m,1H),5.39–5.29(m,1H),5.11(d,J＝26.4Hz,3H),4.95(s,1H),4.68(s,3H),4.39–3.98(m,6H),3.86(s,2H),3.65–3.27(m,9H),3.18–2.84(m,7H),2.83–2.70(m,2H),2.39(d,J＝21.2Hz,4H),2.19(d,J＝20.4Hz,4H),1.98(d,J＝44.8Hz,6H),1.84(s,4H),1.13–0.93(m,9H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C47H72O9N8Na,[M+Na]+:915.53145,found:915.53156.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.043min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少69.1％(100Gy,10uM)，产生原药MMAE。
实施例18
前药XP-106-MMAE-009
合成方法:
操作:将50mg compound 29溶于5mL乙醇:水(7:3)，加入40mg碘化亚铜，NaN327.3mg和7.4mg L-Proline,在氩气下滴加入2.5mgNaOH(溶在10mL乙醇:水(7:3))，于70℃反应2h。
检测：LCMS监测。
后处理和纯化:冷却后的混合物用乙酸乙酯和水萃取(如果底物有羧酸基，反应混合物应在提取前酸化至pH＝1)。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取两次。结合的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。粗品往后投下一步。
操作:将70mg compound 30溶于2mL无水DCM，加入79mg compound 31a，然后加入89.61mg DCC,58.7mg HOBt和203uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)。
后处理和纯化:旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(PE:EA＝1:1)，最后获得18.8mg的黄色油状产物。
操作:将18.8mg compound 31溶于1mL无水DCM，加入23.5mg compound 31a，然后在0℃下加入1mg DMAP和滴加17uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)。
后处理和纯化:用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(PE:EA＝1:1)，最后获得6mg产物黄色固体。
操作:将5mg MMAE溶于5mL无水DMF，加入6mg compound 32，然后加入1.89mg HOBt和滴加2uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(EA100％)。
后处理和纯化:在37℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(EA100％)，最后获得产物XP-106-MMAE-009(4.5mg)性状为类白色固体。
LCMS(ESI):m/z found:1065.0.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.025min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少73.34％(60Gy,10uM)，产生原药MMAE。
细胞内毒性检测
将相应细胞以10000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，并计算化合物IC50值。
具体的结果如图8所示。对于不同细胞，前药的IC50都显著低于原药。
实施例19
前药XP-108-GEM-000
合成方法:
操作：将吉西他滨(100mg)溶于DMF(2mL)中，于室温下加入咪唑(28mg)，三乙胺(58μL)和二甲基叔丁基硅基氯(143mg)，在室温下搅拌过夜。
检测：TLC检测(EA)。
后处理:把反应液的DMF旋干，用NaHCO3溶液淬灭反应，EA萃取(10mLx 3),合并有机相，用饱和食盐水洗涤(20mLx 2)，无水硫酸钠干燥，过滤，40℃旋蒸除去EA，再用纯EA爬板纯化，得到产品compound 33为白色固体(57mg，30％yield)。
操作：将compound 33(57mg)溶于DCM(1mL)中，于室温下加入三乙胺(16μL)和3(50mg)，在室温下搅拌过夜。
检测：TLC检测(EA:PE＝1:3)。
后处理:将反应液直接爬大板纯化，得到产品compound 34(47mg,54％yield)为无色油状液体。
操作：将compound 34(47mg)溶于THF(1mL)中，于室温下加入四丁基氟化铵(0.2μL)并搅拌20min
检测：TLC检测(MeOH:DCM＝1:10)。
后处理及纯化:将反应液直接爬大板纯化，得到产品XP-108-GEM-000(20mg，61％yield)为白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.02(s,1H),8.24(d,J＝7.6Hz,1H),7.05(d,J＝7.6Hz,1H),6.31(d,J＝6.4Hz,1H),6.16(t,J＝7.6Hz,1H),5.37–5.18(m,2H),4.27–4.10(m,1H),3.89(d,J＝8.4Hz,1H),3.85–3.75(m,1H),3.71–3.55(m,1H),1.38–1.18(m,2H).
LCMS(ESI):m/z Calcd for C17H13O6N6F6,[M+H]+:511.1,found:511.2.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为4.559min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少36.58％(100Gy,10uM)，产生原药GEM。该HPLC方法的时间为15min.
实施例20
前药XP-111-Res-000
合成方法:
操作：将44mg的4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苄基(4-硝基苯基)碳酸酯溶于5mLDMF,加入溶于5mLDMF的30mg 1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇，搅拌5min，加入13mg的HOBt后，将38μL的三乙胺用5ML的DMF稀释，于室温反应16h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:使用EA萃取，在40℃下，先用水泵把EA旋干，再油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(EA:PE＝50:1)。最后获得产物,性状为白色固体。
LCMS(ESI):m/z Calcd for C25H23F4N7O4,[M+H]+:562.4,found:562.4.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.6Hz,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,1H),5.29(s,2H),4.91(s,2H),3.52(dd,J＝13.6,6.8Hz,2H),1.15(dd,J＝10.8,3.6Hz,6H),1.12(d,J＝6.0Hz,3H).
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为15.1min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少97.6％(100Gy,10uM)，产生原药RES和连接子3-a。
实施例21
前药XP-111-Res-001
合成方法:
操作：将35.8mg的compound 28溶于5mL DMF,加入溶于5mLDMF的30mg 1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇，搅拌5min，加入13mg的HOBt后，将76μL的三乙胺用5mL的DMF稀释，于室温反应16h。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:使用EA萃取，在40℃下，先用水泵把EA旋干，再油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(EA:PE＝50:1)。最后获得产物,性状为白色固体。
LCMS(ESI):m/z Calcd for C25H27N7O4,[M+H]+:490.4,found:490.4.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.67–7.60(m,1H),7.54(d,J＝12.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝8.0Hz,2H),5.18(s,2H),3.53(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H),1.19(s,3H),1.13(dd,J＝7.6,6.4Hz,6H).
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为15.1min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少64.3％(100Gy,10uM)，产生原药RES。
实施例22
前药XP-105-MMC-001
合成方法:
操作:将100mg compound 13溶于2mL无水DCM，加入59mg MMC，然后加入30mg HOBt和滴加19.9uL三乙胺，于室温反应16h。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理和纯化:在37℃下，用油泵把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶大板进行纯化，洗脱剂比例(DCM:MeOH＝10:1)，最后获得产物XP-105-MMC-001(57.2mg)性状为紫色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.08(s,2H),6.58(d,J＝58.4Hz,2H),6.08(ddd,J＝29.2,14.0,7.2Hz,1H),4.91(dd,J＝10.8,4.8Hz,1H),4.77(td,J＝10.8,4.4Hz,1H),4.32–4.20(m,1H),3.99–3.78(m,2H),3.78–3.63(m,2H),3.55–3.48(m,4H),3.15–3.08(m,3H),2.92(d,J＝12.4Hz,1H),2.71(s,1H),1.65(d,J＝5.6Hz,3H),1.23(s,1H).
LCMS(ESI):m/z Calcd for C28H27O10N8F4,[M+H]+:711.2,found:711.4.
HPLC显示有两根峰，存在差向异构。
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为14.105min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少81.0％；85.5％(60Gy,10uM)，但未产生相应的原药MMC和连接子3-a。
实施例23
前药XP-103-SN38-003
合成方法:
将二氟叠氮苄醇(500mg,1.0eq)溶解在干燥的DCM(10mL)中，向其中加入吡啶(110μL，0.5eq)，并置于45℃油浴锅上搅拌，向其中缓慢滴加三溴化磷(50μLx 3)，并回流3小时，TLC检测原料反应完全，将反应液冷却至室温并加入异丙醇，搅拌十分钟。向反应液中加入饱和NaHCO3淬灭，EA(10mLx 3)萃取，合并有机相并旋干，得到产物(620mg,crude)为棕色油状液体。
操作:将SN-38(50mg,1.0eq)溶解在干燥的DCM(2mL)和DMF(2mL)中，加入40mgcompound 35，向搅拌的反应液中加入K2CO3(18mg)，室温搅拌24小时。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝10:1)。
后处理和纯化:向反应液中加入DMSO使其完全溶解，过滤取滤液制备，得到产物(4mg,5％Yield)为黄色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.11(d,J＝9.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝9.2Hz,2H),7.28(s,1H),6.58(d,J＝61.2Hz,2H),5.59–5.17(m,5H),3.29–3.08(m,2H),2.03–1.83(m,2H),1.34–1.27(m,3H),0.87(dd,J＝15.6,8.0Hz,3H).
LCMS(ESI):m/z Calcd for C29H24O5N5F2,[M+Na]+:560.2,found:560.3.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为17.852min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少30.2％(60Gy,10uM)，产生原药SN-38和中间态XP-103-SN38-003cp1。
实施例24
前药XP-104-CPT-008
合成方法:
操作:将喜树碱(40mg,1.0eq)溶解在干燥的DCM(2mL)和DMF(2mL)中，加入35mgcompound 35，向搅拌的反应液中加入K2CO3(18mg)，60℃搅拌3小时。
检测：TLC检测(DCM:MeOH＝10:1)。
后处理和纯化:向反应液中加入DMSO使其完全溶解，过滤取滤液制备，得到产物(3.5mg，5％Yield)为白色固体。
LCMS(ESI):m/z Calcd for C29H24O5N5F2,[M+Na]+:560.2,found:560.3.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为18.480min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少61.3％(60Gy,10uM)，产生中间态XP-104-CPT-008cp1。
实施例25
前药XP-109-EXA-000
合成方法:
操作:将依喜替康(30mg,1.0eq)溶解在干燥的DMF(1mL)中，加入31.9mgcompound5，向搅拌的反应液中加入19.1uLTEA，室温搅拌16小时。
检测：TLC检测(PE:EA＝1:1)。
后处理和纯化:向反应液中加入DMSO使其完全溶解，过滤取滤液制备，得到产物(23mg，48.9％Yield)为白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.76(d,J＝10.8Hz,1H),7.30(s,1H),6.50(s,1H),5.43(s,2H),5.30–5.06(m,4H),2.37(s,2H),2.18(s,3H),1.86(dd,J＝16.8,7.2Hz,2H),1.23(s,2H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C32H22O6N6F5,[M+Na]+:681.15265,found:681.15359.
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为15.155min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少82.8％(100Gy,10uM)，但是没有产生新峰。
实施例26
前药XP-113-PTX-000的制备
合成方法：
操作:将紫杉醇(15mg，0.017mmol)溶于1ml二氯甲烷中，加入DMAP(1mg，0.05mmol)，三乙胺(3uL，0.021mmol)，最后加入compound 5(8.1mg，0.021mmol)，常温搅拌过夜。
检测：TLC监测(PE:EA＝2：1)，紫杉醇几乎反应完全，原料二过量剩余少量，判断反应完成。
后处理和纯化:在37℃下旋干，旋走溶剂DCM，使用DMF配样过制备，得到9mg产物。
LCMS(ESI):m/z Calcd for C55H52O16N4F4,[M+H]+:1101.3,found:1101.4.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.17–8.11(m,2H),7.74–7.69(m,2H),7.61(t,J＝7.6Hz,1H),7.50(dd,J＝14.4,7.6Hz,3H),7.44–7.34(m,7H),6.87(d,J＝9.6Hz,1H),6.33–6.24(m,2H),5.99(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),5.69(d,J＝7.2Hz,1H),5.45(d,J＝2.8Hz,1H),5.28(d,J＝14.8Hz,2H),4.98(d,J＝8.0Hz,1H),4.44(dd,J＝10.8,6.8Hz,1H),4.32(d,J＝8.4Hz,1H),4.21(d,J＝8.4Hz,1H),3.82(d,J＝7.0Hz,1H),2.62–2.36(m,7H),2.27–2.16(m,4H),2.08–1.84(m,5H),1.69(s,3H),1.25(d,J＝4.0Hz,6H).
HPLC检测：原药分子的HPLC出峰时间为23.94min左右。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少33.2％(60Gy,10uM)，产生原药PTX和连接子峰compound 3_a。
实施例27
一种抗体-小分子药物偶联物，结构如式XP-106-ADC001所示：
其中，x为小分子药物与抗体的比例，x为3-5，Ab为曲妥珠单抗。
具体的制备过程包括：
(1)按照实施例9制备得到XP-106-MMAE-001，然后进行如下酯化过程：
操作:将100mg XP-106-MMAE-001(化合物A)溶于2mL无水DMF，加入DMAP(2.0eq),TEA(2.0eq),DSC(2.0eq)，于室温避光反应5min，酯化得到化合物B。
检测：TLC检测(EA)。
后处理和纯化:用0.22um滤膜过滤后直接过制备HPLC，旋干得到固体(30mg)性状为白色固体。
HRMS(ESI):m/z Calcd for C56H78O14N10F4Na,[M+Na]+1213.55276,found:1213.55286.
(2)ADC合成：
操作:将5mg曲妥珠单抗溶于5mL ddH2O，加入500uLPBS，再缓慢滴加溶于DMA的化合物B溶液(1.2mg化合物B溶于400uLDMA)，于室温避光反应16h。
后处理和纯化:用滤膜过滤后直接超滤(30K、内管为4mL的超滤管，转速2500-3000g，3-5min，次数为150次)。
本实施例合成得到的抗体偶联药物XP-106-ADC001经过ADC和裸抗的质谱中分子量对比得到x＝(152615.48-148304.325)/1076.5＝4.0。其中，ADC和裸抗的Maldi(飞行时间质谱)如图9所示。
照射前XP-106-ADC001的ESI(高分辨蛋白质谱)如图10所示。把XP-106-ADC001溶于水中(经Nanodrop测得浓度为0.624mg/mL，加水稀释到浓度为0.2mg/mL)，通氩气除去氧气后密封，经过小动物辐照仪机器(RS2000Pro-225)照射(100Gy)后的ESI(高分辨蛋白质谱)，如图11所示。和照射前的ADC高分辨质谱的ESI Full ms对比得出：经X射线照射(100Gy)后有MMAE原药(m/z＝718.5127)产生。
细胞内毒性检测
将相应细胞以4000每孔的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度的曲妥珠单抗、ADC、以及辐照后的ADC给药处理，并继续恒温孵育72h；72h后将原培养基吸出并用PBS清洗细胞3次，每孔加入稀释的CCK-8溶液(与培养基比例为1：10)100μL，恒温孵育2h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值，如图12所示。
对比例1
前药XP-102-DOX-000的制备：
合成方法：
操作：在室温下将60mg(4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯基)甲基-4-硝基苯基碳酸酯溶于4mL无水DMF，随后加入分子筛与25uL三乙胺，搅拌10min。将60mg阿霉素盐酸盐溶于4mL无水DMF，并加入25μL三乙胺，加入上述溶液；在氮气保护下于室温反应19-24h。
检测：用TLC(5％甲醇:DCM)监测反应.
后处理：用水稀释,EtOAc萃取,饱和NaHCO3溶液与水洗涤,无水Na2SO4干燥,旋蒸浓缩.
纯化：最后，用闪式色谱柱(5％MeOH:EtOAc)纯化得到50mg固体产物，即为前药XP-102-DOX-000。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ14.02(s,1H),13.31(s,1H),8.17–7.95(m,1H),7.80(dd,J＝24.8,16.8Hz,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),5.52(s,1H),5.33(s,1H),5.15(s,1H),4.78(s,1H),4.52(s,1H),4.14(d,J＝14.8Hz,2H),3.89(s,1H),3.68(s,1H),3.33(d,J＝17.6Hz,1H),3.11–2.86(m,3H),2.36(d,J＝13.6Hz,1H),2.21(d,J＝10.8Hz,1H),2.05(d,J＝15.2Hz,1H),1.93–1.70(m,2H),1.35–1.24(m,3H),0.88(d,J＝20.4Hz,3H).
m/z[M+Na]+:813.17.
HPLC检测：原药分子DOX的HPLC出峰时间为16.265min。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少52.4％(100Gy,10uM)，产生的新峰不是原药峰。
对比例2
前药XP-105-MMC-000的制备：
合成方法：
操作：将4.8g(4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯基)甲基-硝基苯基碳酸酯溶于35mLDMF，加入3.46g丝裂霉素C，搅拌10min，将5.2mL三乙胺用30mLDMF溶解，缓慢加入反应体系，于室温反应48h。
检测：TLC检测(PE:EA＝10:1)和(DCM:MeOH＝20:1)。
后处理：将反应液倒入500mL水中，搅拌10min后过滤，滤饼用100mL水冲洗，干燥，再用油泵抽干，得到紫色色固体粗品5.38g。
纯化：粗品用100mL乙酸乙酯打浆过夜，过滤，滤饼用10mL乙酸乙酯冲洗，再用油泵抽干后得到紫色固体4.4g(HNMR和HPLC显示干净)。打浆母液倒入300mL的正己烷中(有固体析出)，过滤，滤饼干燥后用40mL乙酸乙酯继续打浆过夜。打浆完后过滤，滤饼用10mL乙酸乙酯冲洗，再用油泵抽干后得到紫色固体0.24g(HNMR和HPLC显示干净)，剩下母液旋干得到残渣0.5g(TLC显示产物含量70％和约30％的原料丝裂霉素C)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.32–5.10(m,3H),4.86(dd,J＝10.8,4.7Hz,1H),4.61(s,2H),4.45(d,J＝13.2Hz,1H),4.14(dt,J＝14.6,9.2Hz,1H),3.67(dd,J＝11.2,4.8Hz,1H),3.57–3.41(m,2H),3.31(dd,J＝4.4,1.6Hz,1H),3.19(s,3H),1.76(s,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C23H20F4N7O7,[M+H]+:582.13547,found:582.13579.
HPLC检测：原药分子MMC的HPLC出峰时间为14.105min。照射前后prodrug的峰面积(HPLC 254nm)减少67.5％(100Gy,10uM)，产生连接子峰compound 3-a(HPLC 254nm出峰时间为17.0min)。
其中，compound 3-a的结构为
对比例3
前药XP-102-DOX-010
合成方法:
操作:把阿霉素(20mg,1.00eq)和compound 5(13mg)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中。室温下，把三乙胺(0.03mL)加入到反应液里。反应液在室温下反应24hr。
检测：TLC(DCM:MeOH＝10:1,Rf＝0.40)显示有新点产生。
后处理和纯化:在35℃下，把N,N-二甲基甲酰胺旋干，重新用二氯甲烷溶解并且用硅胶板进行纯化，洗脱剂比例(DCM:MeOH＝10:1)。最后获得产物XP-102-DOX-010(5.5mg,20％yield)性状为红色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.99(s,1H),13.28(s,1H),8.07(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.8Hz,1H),5.56(d,J＝3.2Hz,1H),5.43–5.31(m,4H),5.23(d,J＝18.4Hz,1H),4.80(s,1H),4.11(s,3H),3.91(d,J＝4.8Hz,1H),3.74(s,1H),3.52(d,J＝3.6Hz,1H),3.31(d,J＝19.0Hz,1H),3.07(d,J＝19.0Hz,1H),2.83(d,J＝11.2Hz,1H),2.47(d,J＝14.8Hz,2H),2.15(dd,J＝14.6,3.8Hz,1H),2.05(d,J＝12.8Hz,2H),1.81(dd,J＝17.2,8.4Hz,2H),1.41(d,J＝7.6Hz,3H).
HRMS(ESI):m/z Calcd for C42H32O13N4F9,[M+H+]:917.18167,found:917.18190.
照射前XP-102-DOX-010已分解，产生新峰，不稳定。
各前药的照射释药结果如表1所示：
表1
可见，本发明实施例化合物照射后，前药峰面积显著降低，同时检测到明显的前药/中间过渡态生成，相比对比例1-2的前药分子表现出更好的药物释放性能。
各前药的细胞毒性结果如表2-5所示。其中，前药/原药的IC50比值越高，说明前药的细胞毒性更低。
表2
表3
表4
表5
以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权利要求书所界定的保护范围之内。

Claims (10)

1.一类具有式(1)所示结构的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐：
式中，R1为一至四取代，具体选自如下任意一种或多种取代基：H、卤素，取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的C1-6烷氧基、-C(＝O)N(Ra)-(CRb)-COORc；所述取代的取代基选自卤素原子、羟基、C1-6烷基和C1-6环氧基；Ra、Rb、Rc分别独立地选自H、C1-6烷基；
A为空键、-C(＝O)-，或者
D来源于活性小分子，所述活性小分子选自如下化合物或其药学上可接受的盐：柔红霉素、阿霉素、喜树碱、丝裂霉素C、一甲基澳瑞他汀E、蟾毒灵、7-乙基-10-羟基喜树碱、吉西他滨、雷西莫特、依喜替康、紫杉醇；R2、R3分别独立地选自：H、取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的芳基、-CH2-C(＝O)N(R4)CH2COOR5；芳基上的取代为一至四取代，芳基或C1-6烷基上的取代基选自如下任意一种或多种：卤素、叠氮基；R4、R5分别独立的选自H、C1-6烷基；
并且，活性小分子为柔红霉素或者丝裂霉素C时，R2、R3不同时为H。
2.根据权利要求1所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述芳基为苯环或者萘环。
3.根据权利要求1所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，A为空键时，相应通式的结构为
4.根据权利要求1所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D具体选自如下结构：
5.根据权利要求1所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D为时，R2为H，R3为取代或为取代的苯基；取代基选自如下任意一种或多种：卤素、叠氮基。
6.根据权利要求1所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D为时，R2为H，R3为-CH2-C(＝O)N(R4)CH2COOR5；R4、R5分别独立的选自H、C1-6烷基。
7.根据权利要求1-6任一项所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述其药学上可接受的盐包括无机盐或者有机盐；其中无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、钠盐、钙盐、钾盐、镁盐、银盐、锂盐。所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐、葡甲胺盐、氨丁三醇盐、二乙胺盐、赖氨酸盐、胆碱盐、精氨酸盐、特丁胺盐、N,N-二苄基乙二胺盐。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-7任一项所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，还包含药用辅料；所述药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
10.一种抗体-小分子药物偶联物，其特征在于，是将权利要求1-7任一项所述的叠氮前药化合物或其药学上可接受的盐与抗体偶联。
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