CN119751587A - 一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1及其应用，所述新抗原肺癌疫苗Fastkd1，包括一种肺癌新抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该新抗原肺癌疫苗可发挥良好的抗肿瘤效果。

Description

一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1及其应用

技术领域

本发明涉及一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1及其应用，属于新抗原技术领域。

背景技术

肺癌是全球范围内致死率最高的恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈现出年轻化的趋势。对于那些没有可操作性驱动基因突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者，以化疗为基础的联合疗法是首选的一线治疗方案。然而，由于化疗的显著毒性和副作用，许多患者无法承受化疗的负担，或者对化疗产生了强烈的抵抗，特别是在老年人或免疫系统功能较弱的患者群体中。在临床上，对于晚期NSCLC患者的非化疗联合治疗策略主要包括抗血管生成疗法和免疫疗法，例如贝伐珠单抗(BEV)联合免疫检查点抑制剂(ICIs)。但这些疗法的效果通常不如基于化疗的联合治疗。其中一个主要原因是，抗血管生成和免疫治疗后，大多数浸润到肿瘤组织的T细胞并非特异性地针对肿瘤。因此，如何在不显著增加毒性及副作用的前提下提高肿瘤特异性淋巴细胞的浸润，是提升无化疗治疗效果的关键策略。

肿瘤新抗原是肿瘤特异性抗原的一种，它们是在肿瘤发展过程中由基因变异产生的具有免疫原性的多肽类物质。这些新抗原可以与主要组织相容性复合体(MHC)结合，并展示在肿瘤细胞表面，从而激活免疫细胞进入肿瘤内部，增强肿瘤免疫疗法的效果。因此，基于肿瘤新抗原的治疗性疫苗具有高度的特异性和较低的毒性及副作用，适用于精确的肿瘤免疫治疗。然而，免疫抑制微环境(如肿瘤微环境中的血管生成和PD-L1高表达)仍会显著抑制新抗原肺癌疫苗诱导的肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤活性。因此，设计基于新抗原的肺癌疫苗以实现完全的抗肿瘤效果具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1及其应用，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种肺癌新抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1，包括上述的肺癌新抗原。

在一些实施例中，所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1还包括免疫佐剂。

在一些实施例中，所述免疫佐剂为Poly(I:C)和胸腺肽α1。

在一些实施例中，所述肺癌新抗原、Poly(I:C)和胸腺肽α1的质量比例为2：0.5-1.5：0.5-1.5。

一种所述的新抗原在制备治疗肺癌药物中的应用。

一种所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1在制备治疗肺癌的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提出了一种免疫原性肺癌新抗原肽，这种肽段具有独特的结构和功能特性，能够有效地激活机体的免疫系统。通过利用这种新型肺癌新抗原肽，可以开发出一种新型的肺癌疫苗LLCvac。这种疫苗在体内具有显著的免疫激活作用，能够激发机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。LLCvac疫苗通过诱导特异性免疫细胞的增殖和活化，能够有效识别并攻击肺癌细胞，从而达到预防和治疗肺癌的目的。这种新型疫苗的开发为肺癌的免疫治疗提供了新的思路和方法，具有重要的临床应用价值和市场潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为对小鼠肺癌细胞系LLC以及C57BL/6小鼠尾巴进行的全外显子组和转录组测序结果。

图2为肺癌新抗原Fastkd1的检测数据。其中，图2A展示了肺癌新抗原Fastkd1在体外干扰素(IFN)-γELISPOT检测中的结果，图2B则展示了新抗原肺癌疫苗Fastkd1在抗肿瘤效果评估中的表现。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例旨在提供一种新型的肺癌相关抗原，其具体的氨基酸序列可以在SEQ ID NO:1中找到。这种新抗原是通过全面的外显子组测序和转录组测序技术筛选出来的，从而确保了其在肺癌诊断和治疗中的潜在应用价值。

本发明的实施例旨在提供一种新型的抗原肺癌疫苗，名为Fastkd1，该疫苗包含了一种特定的肺癌新抗原。

在某些具体的实施方式中，这种新抗原肺癌疫苗Fastkd1还进一步包括了免疫佐剂的成分。在这些实施方式中，免疫佐剂可以是Poly(I:C)和胸腺肽α1这两种成分。具体而言，在某些实施例中，肺癌新抗原、Poly(I:C)和胸腺肽α1这三种成分的质量比例可以设定为2：0.5-1.5：0.5-1.5，这样的比例有助于增强疫苗的免疫效果，从而更有效地激发机体对肺癌的免疫反应。

本发明的实施例旨在提供一种新型抗原在开发用于治疗肺癌的药物方面的应用。具体来说，本发明的实施例涉及一种特定的新抗原肺癌疫苗Fastkd1。这种新抗原疫苗Fastkd1通过激活人体免疫系统，能够有效地识别并攻击肺癌细胞，从而在治疗肺癌方面展现出潜在的临床应用价值。

此外，该疫苗的开发过程充分考虑了安全性和有效性。通过精确筛选和验证，确保了新抗原的特异性和免疫原性，从而降低了疫苗可能引发的自身免疫反应或其他不良反应的风险。同时，该疫苗的生产工艺也经过了严格的质量控制，确保了疫苗的纯度和稳定性，进一步保障了其临床应用的安全性。此外，这种新抗原疫苗的研发也为肺癌的个性化治疗提供了新的思路和可能，有望为更多肺癌患者带来福音。

实施例1

细胞系培养与鉴定

小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)是由位于中国的苏州北纳保藏中心(BNCC)提供的。这些细胞系在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(由Gibco品牌提供)中进行培养。培养条件设定为37℃的温度和5％的二氧化碳浓度。这些细胞系已经经过了全面的验证流程，并在过去一年内通过短串联重复序列(STR)分析进行了详细的鉴定，以确保其身份的准确性。

在实验开始之前，为了确保细胞系没有支原体污染，研究人员使用了PCR支原体检测试剂盒(MycoSEQ支原体检测试剂盒，由Thermo Fisher Scientific公司提供)对细胞系进行了检测。这一检测步骤是为了确保实验数据的准确性和可靠性，避免因支原体污染导致的实验误差。通过这一系列严格的检测和验证流程，研究人员可以更加有信心地使用这些细胞系进行后续的实验研究。

新抗原识别与免疫原性验证

为了开发针对肺癌细胞系的肿瘤新抗原疫苗，我们首先对小鼠肺癌细胞系LLC和C57BL/6小鼠的尾巴进行了全外显子组和转录组测序，目的是为了识别这些细胞系中潜在的新抗原突变。这一过程在图1A中得到了展示。通过这些测序数据，我们总共鉴定出了762个高质量的LLC体细胞突变，这些突变在与C57BL/6基因组进行对比时被发现。在这些突变中，有224个在RNA水平上通过LLC转录组数据分析被发现表达，具体标准为变异等位基因频率大于或等于10％，读深大于或等于20，以及相应基因每百万转录本数大于或等于1。基于这些数据，我们进一步利用八种不同的MHC结合亲和力预测算法，包括NetMHCpan、NetMHC、NetMHCcons、PickPocket、MHCflurry、SMM、SMMPMBMC和MHCnuggetsI，来预测这些突变与MHCI(LLC细胞和C57BL/6小鼠：H-2Kb等位基因)的结合亲和力。结果显示，有60个突变产生的短肽具有高结合亲和力到MHC(H-2Kb等位基因，所有MHC结合亲和力预测算法的中位结合亲和力百分位排名小于或等于2％)，这些短肽被认为是潜在的肿瘤新抗原突变。

为了验证这些潜在新抗原的免疫原性，我们从排名前20的潜在新抗原突变中选择了一个突变长肽，即Fastkd1-W447S，进行合成并进行了免疫原性评估。随后，我们将这个突变长肽与免疫佐剂Poly(I:C)混合，在第0天、第4天和第8天分别对C57BL/6小鼠的侧腹部进行皮下免疫。在初次免疫后的第14天，这些免疫小鼠被处死，脾脏T细胞被分离出来进行体外干扰素(IFN)-γELISPOT检测，结果如图2A所示。

从图2A中可以看出，这种合成的突变长肽能够在各自突变长肽脉冲化的自体成熟树突状细胞(DCs)的刺激下诱导T细胞产生强大的免疫反应。为了进一步确定该突变长肽是否与其相应的野生型肽具有免疫交叉反应性，我们将突变肽和野生型肽分别形成池，并与Poly(I:C)混合进行免疫和治疗小鼠，如前所述。然后，突变肽和相应的野生型肽分别与自体DCs脉冲化，用于下游的ELISPOT分析。正如预期的那样，这种新抗原肽与野生型相比没有显著的免疫原性交叉反应。这些结果表明，这种肽能够在C57BL/6小鼠中引发强大的靶向免疫反应，并可被识别为LLC的新抗原。

通过测序分析，我们确定了突变长肽Fastkd1-W447S的氨基酸序列为DLVVYLMRSIQSDLVCL(SEQ ID NO:1)。而野生型Fastkd1-WT的氨基酸序列为DLVVYLMRWIQSDLVCL(SEQ ID NO:2)。这一序列差异正是我们所关注的新抗原突变所在。

为了评估抗肿瘤效果，我们采用了体内肿瘤模型进行实验。实验中，我们选取了6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为实验对象。通过向这些小鼠体内注射LLC细胞，我们成功建立了用于实验的肿瘤模型。具体来说，我们通过在小鼠的右腋下皮下注射2×10^6个LLC细胞，成功建立了皮下肺癌模型。为了监测肿瘤的生长情况，我们安排了一名操作员每三天使用卡尺在两个垂直方向上对肿瘤进行测量。通过测量得到的长直径(A)和短直径(B)，我们使用公式V＝AB2/2来计算肿瘤的体积。当肿瘤体积增长至50-80mm₃时，我们将这个时间点定义为实验的第0天。随后，我们将小鼠随机分为三组，每组包含6只小鼠，并开始对它们进行治疗。

在实验组中，我们使用了一种含有已鉴定突变的新抗原肽——新抗原肽疫苗(Fastkd1-W447S)。每只小鼠接种了100微克/肽，并且这种疫苗与优化的临床可用双重免疫佐剂[50μg Poly(I:C)+50μg胸腺素α-1(ZadaxiN，Sciclone制药，美国)]结合使用。从实验的第0天开始，我们每四天对小鼠进行一次皮下注射，共进行三次。对照组的小鼠在同一时间段内也接受了治疗，但注射的是磷酸盐缓冲液(ctrl)和野生型新抗原肽疫苗(Fastkd1-WT)。野生型新抗原肽疫苗(Fastkd1-WT)组同样与双重免疫佐剂[50μg Poly(I:C)+50μg胸腺素α-1(ZadaxiN，Sciclone制药，美国)]结合使用。实验结果如图2B所示。

根据图2B的结果显示，新抗原肽疫苗(Fastkd1-W447S)展现了显著的抗肿瘤效果。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种肺癌新抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种新抗原肺癌疫苗Fastkd1，其特征在于，包括权利要求1所述的肺癌新抗原。

3.根据权利要求2所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1，其特征在于，还包括免疫佐剂。

4.根据权利要求3所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1，其特征在于，所述免疫佐剂为Poly(I:C)和胸腺肽α1。

5.根据权利要求4所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1，其特征在于，所述肺癌新抗原、Poly(I:C)和胸腺肽α1的质量比例为2：0.5-1.5：0.5-1.5。

6.一种权利要求1所述的新抗原在制备治疗肺癌的药物中的应用。

7.一种权利要求2至5任一项所述的新抗原肺癌疫苗Fastkd1在制备治疗肺癌的药物中的应用。