CN119570793B - 一种基因编辑抗病猪分子特征检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因编辑抗病猪分子特征检测方法及应用。本发明提供了一种CRISPR/Cas12a核酸检测体系，其包括核酸检测体系1；所述核酸检测体系1包括crRNA1；所述crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。本发明提供了基于CRISPR/Cas12a系统的针对AE26‑CAAS基因编辑抗病猪的检测方法，灵敏度高、特异性强、简便易行，便于现场快速检测，且经济、简便、高效、快速，为基因编辑抗病猪的商业化生产奠定基础。

Description

一种基因编辑抗病猪分子特征检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因编辑抗病猪分子特征检测方法及应用。

背景技术

基因编辑育种是未来动物育种的发展方向之一，美国、日本等国家已经先后批准GalSafe基因编辑猪、Madai红鲷鱼、22-seiki fugu虎皮河豚、PRLR-SLICK基因编辑牛等多种基因编辑动物上市。猪的pAPN蛋白是猪传染性肠胃炎病毒（transmissiblegastroenteritis virus, TGEV）进入细胞的关键受体。敲除或者对pAPN基因进行基因编辑可以使猪对TGEV具有完全抗性。目前，国内外已有多个团队成功制备出了pAPN基因编辑猪，且攻毒实验证实pAPN基因编辑可完全抵抗TGEV感染。

通过基因编辑技术获得了AE26-CAAS基因编辑猪，该猪的pAPN基因经过遗传修饰后，第二外显子发生26 bp碱基的缺失，使得pAPN基因在翻译时提前终止，不能生成有功能的APN蛋白，从而实现对猪传染性胃肠炎TGEV病毒的抵抗。

基因编辑动物的核酸检测是基因编辑动物及其产品监督、管理和产业化的前提，因此，需要寻找快速的针对AE26-CAAS基因编辑抗病猪检测的方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是如何快速准确检测AE26-CAAS基因编辑抗病猪。

为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了crRNA组，其包括crRNA1，

所述crRNA1结合靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

上述crRNA组靶向pAPN基因。

上文所述crRNA组中，所述crRNA1由转录模板1体外转录得到；

所述转录模板1为SEQ ID NO.5所示单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示单链DNA分子退火得到的产物。

上文所述crRNA组中，所述crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。

上文所述crRNA组中，所述crRNA还包括crRNA2，

所述crRNA2结合靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

上文所述crRNA组中，所述crRNA2由转录模板2体外转录得到；

所述转录模板2为SEQ ID NO.6所示单链DNA分子和SEQ ID NO.9所示单链DNA分子退火得到的产物。

上文所述crRNA组中，所述crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

第二方面，本发明提供了一种产品，包括第一方面中所述的crRNA1、Cas12a蛋白、用于特异性扩增各个结合靶点的引物对和单链DNA探针；

或，所述产品包括第一方面中所述的crRNA1和crRNA2、Cas12a蛋白、用于特异性扩增各个结合靶点的引物对和单链DNA探针；

和/或，所述单链DNA探针两端分别标记不同基团；

和/或，所述基团为荧光基团、淬灭基团和/或生物素。

上述单链DNA探针为长度在10-50 nt富含AT碱基的单链DNA。

上述单链DNA探针具体可以如下：

用于荧光检测的单链DNA探针两端分别标记荧光基团，和，淬灭基团；

用于试纸条检测的单链DNA探针两端分别标记荧光基团，和生物素。

上文所述产品中，所述引物对由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子和SEQ IDNO.14所示的单链DNA分子组成；

上文所述产品为试剂盒、试纸条或荧光检测系统。

所述产品具有如下任一功能：

B1）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪；

B2）鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有AE26-CAAS基因编辑序列；

B3）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的基因型。

第三方面，本发明提供了如下任一物质：

A1) 第二方面中所述的Cas12a蛋白和所述crRNA，或者二者形成的复合体；

A2) 第二方面中所述的Cas12a蛋白、所述crRNA1和所述crRNA2，或者各自与Cas12a蛋白形成的复合体组；

A2) 第二方面中所述的引物对。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的crRNA、第二方面所述产品在如下任一中的应用：

B1）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪；

B2）鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有AE26-CAAS基因编辑序列；

B3）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的基因型；

B4）制备鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的产品；

B5）制备鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有AE26-CAAS基因编辑序列的产品；

B6）制备鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的基因型的产品。

第五方面，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的方法，包括如下步骤：

C1）以待测样品的核酸作为模板，用第二方面中所述引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

C2）配制含有如下组分的CRISPR-Cas12a检测体系：所述PCR产物、第二方面中所述的Cas12a蛋白、第二方面中所述的crRNA中的crRNA1和第二方面中单链DNA探针；

C3）将所述CRISPR-Cas12a检测体系反应，检测反应产物，从而鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪；

在本发明的实施例中，

上文中，所述检测反应产物，从而鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪为如下E或F：

E、各个反应产物用酶标仪、荧光定量PCR仪等荧光检测仪器检测荧光强度：

若所述检测体系的反应产物的荧光强度极显著（P＜0.01）高于阴性对照体系的反应产物，则所述待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪；若所述检测体系1反应产物的荧光强度不显著（P>0.05）高于所述阴性对照体系的反应产物，则所述待测样品不来源于或候选不来源于AE26-CAAS基因编辑猪；所述阴性对照体系与所述检测体系不同仅为不添加crRNA1；

F、各个反应产物用胶体金试纸条（Cas12/13专用核酸胶体金检测试纸条（JY0301）北京立博泰业科技有限公司）检测：

若所述检测体系的反应产物检测的T和C线都显色或仅T线显色（阳性），则所述待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪；若所述检测体系1的反应产物检测的C线显色且T线不显色（阴性），则所述待测样品不来源于或候选不来源于AE26-CAAS基因编辑猪。

第六方面，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪基因型的方法，包括如下步骤：

D1）以待测样品的核酸作为模板，用第二方面中所述引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

D2）配制含有如下组分的CRISPR-Cas12a检测体系1和CRISPR-Cas12a检测体系2；

所述CRISPR-Cas12a检测体系1包括所述PCR产物、第二方面中所述的Cas12a蛋白、第二方面中所述的crRNA中的crRNA1和第二方面中单链DNA探针；

所述CRISPR-Cas12a检测体系2包括所述PCR产物、第二方面中所述的Cas12a蛋白、第二方面中所述的crRNA中的crRNA2和第二方面中单链DNA探针；

D3）将所述CRISPR-Cas12a检测体系1和所述CRISPR-Cas12a检测体系2分别反应，检测两个体系的反应产物鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪基因型。

上文中，检测两个体系的反应产物鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪基因型具体可以采用胶体金试纸条（Cas12/13专用核酸胶体金检测试纸条（JY0301）北京立博泰业科技有限公司）检测，具体如下：

若所述检测体系1的反应产物检测T和C线都显色或仅T线显色（阳性），且所述检测体系2的反应产物检测C线显色且T线不显色（阴性），则所述待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪纯合子；

若所述检测体系1的反应产物检测T和C线都显色或仅T线显色（阳性），且所述检测体系2的反应产物检测T和C线都显色或仅T线显色（阳性），则所述待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪杂合子。

上文中，所述待测样品为待测猪的耳朵或其他组织。

所述方法为非疾病诊断治疗目的。

本发明的实验证明，本发明提供了基于CRISPR/Cas12a系统的针对AE26-CAAS基因编辑抗病猪的检测方法，灵敏度高、特异性强、简便易行，便于现场快速检测，且经济、简便、高效、快速，为基因编辑抗病猪的商业化生产奠定基础。

附图说明

图1为AE26-CAAS基因编辑猪和pAPN基因野生型猪标准质粒测序结果。

图2为RPA引物扩增结果。

图3为靶向AE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因序列的crRNA活性检测结果。**表示与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01），ns表示与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

图4为靶向WT猪pAPN基因序列的crRNA活性检测结果。**表示与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01），ns表示与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

图5为靶向AE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因序列的RPA扩增灵敏度结果。

图6为靶向WT猪pAPN基因序列的RPA扩增灵敏度结果。

图7为靶向pAE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因序列的荧光检测灵敏度结果。**表示与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01），ns表示与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

图8为靶向WT猪pAPN基因序列的荧光检测灵敏度结果。**表示与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01），ns表示与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

图9为AE26crRNA体系检测猪核酸样品。

图10为WTcrRNA体系检测猪核酸样品。

图11为AE26crRNA体系和WTcrRNA体系联合检测猪核酸样品分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下结合具体实施例说明本发明，这些实施例仅是范例，不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

下述实施例中使用的主要试剂：

LbCas12a蛋白（EDE0005-2000）购自广州艾迪基因科技有限责任公司；10×LbCas12a Cleavage Buffer（EDE0005-B）购自广州艾迪基因科技有限责任公司；组织DNA提取试剂盒（DP304-03）购自天根生化科技有限公司；EX Taq酶（RR001Q）购自Takara公司；CloneSmarter TOPO克隆载体试剂盒（C5865-50）购自中美泰和生物技术（北京）有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞（B528413-0100）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成；T7体外转录试剂盒（AM1354）由Invitrogen公司生产的；单链DNA荧光探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；单链DNA胶体金试纸探针（EDN-THD02）购自广州艾迪基因科技有限责任公司；Cas12/13专用核酸检测试纸条（JY0301）购自北京立博泰业科技有限公司；TWistAmp Basic试剂盒（TABS03KIT）购自北京立博泰业科技有限公司。

主要仪器如下：PCR仪（C1000 TouchTM，BIO-RAD）；台式高速冷冻离心机（HeraeusMultifuge X1R，Thermo）；细菌培养箱（MIR-254，SANYO）；涡旋振荡仪（SA8，Stuart-equipment）；电子称量天平（Sartorius SQP，赛多利斯科学仪有限公司）；凝胶成像系统（BIO-RID，Universal HoodⅡ）；恒温水浴锅（HHS-21-4，常州诺基仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（QuantStudio™5，Thermo Scientific）。

下述实施例中的AE26-CAAS基因编辑猪按照如下方法制备：

DKO猪与野生型大白猪（来自天津市宁河原种猪场，以下也称为pAPN基因野生型猪（wild type，WT））配种，生产子代猪，从子代猪中进行基因型检测，选择仅具有pAPN基因26bp缺失的子代猪，即为AE26-CAAS猪。

上述基因型检测的方法如下：

提取子代猪耳缘皮肤或者尾巴皮肤组织的基因组DNA，用pAPN-PCR-F（5`-TACCCAGTTCAGTGACCTTCGTC-3`）引物和pAPN-PCR-R(5`-TGCTCGGCATTCTTGTTCTTCT-3`)进行PCR扩增并进行凝胶电泳检测。

电泳检测显示得到长度260 bp的单个条带的样品为2条同源染色体上pAPN单基因编辑且是26bp缺失的基因型，命名为AE26-CAAS基因编辑猪纯合子。

电泳检测显示得到长度286 bp和260 bp的两个条带的样品的为1条同源染色体上pAPN单基因编辑且是26bp缺失的基因型，另一条为野生型pAPN基因，命名为AE26-CAAS基因编辑猪杂合子。

电泳检测显示得到长度286 bp的单个条带的样品的为2条同源染色体上为野生型pAPN基因，命名为pAPN基因野生型猪或野生型猪。

AE26-CAAS基因编辑猪纯合子与pAPN基因野生型猪相比，两条同源染色体中仅pAPN基因（genbank号：NM_214277，提交日为2024-6-2）的第二外显子第82-107位（genbank号NM_214277所示pAPN基因核苷酸序列的第82-107位）缺失（26bp碱基），其他基因不变。

AE26-CAAS基因编辑猪杂合子与pAPN基因野生型猪相比，1条同源染色体中仅pAPN基因（genbank号：NM_214277，提交日为2024-6-2）的第二外显子第82-107位（genbank号：NM_214277所示pAPN基因核苷酸序列的第82-107位）缺失（26bp碱基），其他基因不变；另一条同源染色体与pAPN基因野生型猪相同。

上述DKO猪为CD163和pAPN两个基因同时敲除的基因编辑猪，且pAPN基因具有5bp缺失和26bp缺失两种基因型，pAPN基因经过遗传修饰后，第二外显子发生26 bp碱基的缺失，使得pAPN基因在翻译时提前终止，不能生成有功能的APN蛋白，从而实现对猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine，TGEV）的抵抗。

DKO猪记载在如下文献中，在文献中的名称为double-gene-knockout （DKO）pigs，文献为Xu K, Zhou Y, Mu Y, Liu Z, Hou S, Xiong Y, Fang L, Ge C, Wei Y,Zhang X, Xu C, Che J, Fan Z, Xiang G, Guo J, Shang H, Li H, Xiao S, Li J, LiK. CD163 and pAPN double-knockout pigs are resistant to PRRSV and TGEV andexhibit decreased susceptibility to PDCoV while maintaining normal productionperformance. Elife. 2020 Sep 2;9:e57132. doi: 10.7554/eLife.57132.

实施例1、用于检测AE26-CAAS基因编辑猪的RPA-CRISPR/Cas12a核酸检测体系

一、crRNA的获得

1、标准质粒构建

使用组织DNA提取试剂盒提取AE26-CAAS基因编辑猪纯合子以及pAPN基因野生型猪（wild type，WT，野生型猪）猪耳组织DNA，使用如下表1所示引物进行扩增pAPN基因第二外显子打靶位点上下游序列，得到PCR产物。

表1为扩增pAPN基因的引物

PCR反应体系为表2：

表2为PCR反应体系

PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，36个循环；72℃ 5 min。

将PCR产物胶回收纯化，纯化后产物分别连接到pClone-EZ-TOPO载体（中美泰和生物技术(北京)有限公司，C5865-50）中，测序验证后得到基因编辑猪pAPN基因标准质粒pClone-EZ-TOPO-AE26以及野生型猪pAPN基因标准质粒pClone-EZ-TOPO-WT。

pClone-EZ-TOPO-AE26为将AE26-CAAS基因编辑序列（SEQ ID NO.16）替换pClone-EZ-TOPO载体的TOPO I位点得到的载体。

pClone-EZ-TOPO-WT为将野生型序列（SEQ ID NO.17）替换pClone-EZ-TOPO载体的TOPO I位点得到的载体。

上述基因编辑序列与野生型序列相比，为将野生型序列第487-512位缺失得到的序列。

两种质粒测序结果如图1所示，图1A为AE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因标准质粒测序结果，图1B为野生型猪pAPN基因标准质粒测序结果。

2、crRNA靶点设计

根据AE26-CAAS基因编辑猪和pAPN基因野生型猪的pAPN基因第二外显子打靶位点上下游40 bp范围内的DNA序列，查找符合LbCas12a识别要求的序列，再根据序列GC含量、序列互补性等规则筛选出3个候选靶位点，其中AE26crRNA-T1至AE26crRNA-T2为针对基因编辑抗病猪AE26-CAAS筛选出的候选靶位点，WTcrRNA-T1为针对pAPN基因野生型猪（wildtype，WT，野生型）筛选出的候选靶位点，具体如表3所示。

表3为候选靶位点的crRNA

3、特异性crRNA体外转录模板制备

根据候选靶位点序列，添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG）（Chen J S etal. Science,2018,360(6387):436-439.）、crRNA repeat区模板序列（TAATTTCTACTAAGTGTAGAT）形成表4所示的特异性crRNA体外转录模板正链DNA序列（SEQ IDNO.4-6），根据正链DNA序列互补配对形成负链DNA序列（SEQ ID NO.7-9）。

表4为特异性crRNA体外转录模板正链和负链

合成正、负链DNA单链，以退火的方式制备特异性crRNA体外转录模板，在PCR管中配制如下表5退火反应体系：

表5为退火反应体系

将PCR管放置于PCR仪中，95℃孵育10 min，而后立即关闭PCR仪，使双链在室温下缓慢降温，90 min后置于冰上孵育5 min。退火后产物，即为crRNA体外转录模板，可用于crRNA体外转录。

4、特异性crRNA体外转录

采用Invitrogen公司生产的T7体外转录试剂盒（AM1354），在PCR管中配置转录体系如下表6:

表6为特异性crRNA体外转录体系

将转录体系置于37℃培养箱中过夜孵育。用NEB生产的RNA纯化回收试剂盒进行crRNA的回收。

回收后的crRNA序列如下表7:

表7为crRNA序列

<b>名称</b>	<b>序列(5′-3′)</b>	<b>长度</b>
			AE26crRNA-F1（SEQ ID NO.10）	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACAUUUCCAAGGCCCUGGGCGGC	45 bp
AE26crRNA-F2（SEQ ID NO.11）	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAGGCCCUGGGCGGCCGUGG	42 bp
			WTcrRNA-F1（SEQ ID NO.12）	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAGGCCCUGGGCAUCCUGGG	41 bp

二、设计并筛选RPA引物

根据猪pAPN基因第二外显子打靶位点上下游序列，设计RPA扩增引物，候选RPA引物序列如下表8：

表8为RPA扩增引物

RPA反应体系如下表9：

表9为RPA反应体系

RPA反应条件如下：

37℃恒温反应30 min。

以3.2×10¹⁰copies/μL的AE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因标准质粒pClone-EZ-TOPO-AE26为模板，分别用上述表8所示的各个引物的对（F和R）、表9所示的体系和RPA反应条件进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。

将各个引物对的RPA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，图中Papn-PRA-1表示pAPN-RPA-1F/pAPN-RPA-1R，依此类推，可以看出，pAPN-RPA-4F/R扩增效果好。

选择扩增效果较好的引物pAPN-RPA-4F（SEQ ID NO.13）和pAPN-RPA-4R（SEQ IDNO.14）作为RPA扩增引物。

三、RPA-CRISPR/Cas12a核酸检测体系的建立和crRNA的筛选

表10中DNA探针为6-FAM基团、BHQ1基团双标记的单链DNA荧光探针，序列为6-FAM-TTATT-BHQ1。按照以下表10所示的组分配制CRISPR/Cas12a荧光检测体系：

表10为CRISPR/Cas12a荧光检测体系

其中，RPA产物是分别以标准质粒pClone-EZ-TOPO-AE26以及pClone-EZ-TOPO-WT为DNA模版进行RPA扩增得到的。按照上述体系配制AE26crRNA-F1、AE26crRNA-F2以及WTcrRNA-F1检测体系，每个检测体系设立3个技术重复，并设立无crRNA的阴性对照（NC）。将配置好的检测体系在Q5定量PCR仪中37℃反应60分钟，设置每30秒检测一次荧光强度。

结果如图3所示，AE26crRNA-F1对AE26-CAAS序列和WT序列均具有切割效应，激发反式切割活性，均产生与NC组相比具有极显著差异（p<0.01）的荧光，无法特异性识别AE26-CAAS序列，因此AE26crRNA-F1无法用于区分AE26-CAAS和WT样品。而AE26crRNA-F2只特异性靶向切割AE26-CAAS序列，均产生与NC组相比具有极显著差异（p<0.01）的荧光可以特异性识别AE26-CAAS序列，因此AE26crRNA-F2可用于区分AE26-CAAS和WT样品。

图4显示WTcrRNA-F1能特异性的对WT序列具有切割效应，激发反式切割活性，产生与NC组相比具有极显著差异（p<0.01）的荧光，而不能对AE26-CAAS序列进行切割。因此WTcrRNA-F1可以特异性识别WT序列，可用于区分AE26-CAAS和WT样品。

四、AE26-CAAS基因编辑猪RPA-CRISPR/Cas12a核酸检测体系方法的建立

1、RPA扩增

提取待测样品的DNA作为模板，用pAPN-RPA-4F/R引物按照表9所示的体系和RPA反应条件进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。

2、CRISPR/Cas12a检测AE26-CAAS基因编辑猪

1）CRISPR/Cas12a荧光检测

将上述RPA扩增产物和AE26crRNA-F2按照表10所示的体系进行配置CRISPR/Cas12a荧光检测体系，得到AE26crRNA-F2荧光检测体系；

将上述RPA扩增产物和WTcrRNA-F1按照表10所示的体系进行配置CRISPR/Cas12a荧光检测体系，得到WTcrRNA-F1荧光检测体系。

将上述各个检测体系设立3个技术重复，并设立无crRNA的阴性对照（NC）。

将配置好的检测体系在Q5定量PCR仪中37℃反应60分钟。

将上述各个荧光检测体系的反应产物用Q5定量PCR仪实时检测荧光强度。

若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物的荧光强度极显著(P值<0.01)高于阴性对照体系的反应产物，则待测样品含有或候选含有AE26-CAAS基因编辑序列，或该待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪；若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物的荧光强度不显著（P>0.05）高于阴性对照体系的反应产物，则待测样品不含有或候选不含有AE26-CAAS基因编辑序列，或该待测样品不来源于或候选不来源于AE26-CAAS基因编辑猪。

上述阴性对照体系与AE26crRNA-F2检测体系不同的仅为不添加crRNA。

上述AE26-CAAS基因编辑猪为AE26-CAAS基因编辑猪纯合子或AE26-CAAS基因编辑猪杂合子。

2）CRISPR/Cas12a试纸条检测

将上述RPA扩增产物和AE26crRNA-F2按照表11所示的体系进行配置CRISPR/Cas12a试纸条检测体系，得到AE26crRNA-F2试纸条检测体系；

将上述RPA扩增产物和WTcrRNA-F1按照表11所示的体系进行配置CRISPR/Cas12a荧光检测体系，得到WTcrRNA-F1试纸条检测体系。

表11中DNA探针为Biotin基团、6-FAM基团双标记的单链DNA试纸条探针，序列为6-FAM-TTTTTTTATTTTTTT（SEQ ID NO.15）-C6Biotin。

表11为CRISPR/Cas12a试纸条检测体系

按照上述体系配制AE26crRNA-F2以及WTcrRNA-F1试纸条检测体系，并设立无crRNA的阴性对照（NC）。

将上述各个检测体系设立3个技术重复，并设立无crRNA的阴性对照（NC）。

将配置好的检测体系在PCR仪中37℃反应30分钟，得到反应产物（反应液）。

将上述各个试纸条检测体系的反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测。

打开管盖，将试纸条结合垫端插入反应液中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润（约需1～2 min，外界环境温度较低时，如冬季，会降低吸水速度，判读区浸润时间将会延长）。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。

若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物检测T线显色或者C线和T线显示（阳性），则待测样品含有或候选含有AE26-CAAS基因编辑序列，或该待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪；若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物检测C线显色且T线不显色（阴性），则待测样品不含有或候选不含有AE26-CAAS基因编辑序列，或该待测样品不来源于或候选不来源于AE26-CAAS基因编辑猪。

3、CRISPR/Cas12a检测AE26-CAAS基因编辑猪基因型

将上述2的2）中的各个试纸条体系的反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测。

根据试纸条显色情况直接读取检测结果。

若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物检测为阳性（AE26crRNA-F2反应体系的产物T线显色或者C线和T线显示），且WTcrRNA-F1检测体系的反应产物检测为阴性（WTcrRNA-F1反应体系的产物C线显色且T线不显色），则待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪纯合子；

若AE26crRNA-F2检测体系的反应产物检测为阳性（AE26crRNA-F2反应体系的产物T线显色或者C线和T线显示），且WTcrRNA-F1检测体系的反应产物检测也为阳性（WTcrRNA-F1反应体系的产物T线显色或者C线和T线显示），则待测样品来源于或候选来源于AE26-CAAS基因编辑猪杂合子。

上述AE26-CAAS基因编辑猪RPA-CRISPR/Cas12检测体系包括：AE26crRNA-F2和/或WT26crRNA-F1、pAPN-RPA-4F引物、pAPN-RPA-4R引物、LbCas12a蛋白、单链DNA探针。

实施例2、AE26-CAAS基因编辑猪CRISPR/Cas12a核酸检测体系灵敏度分析

分别用去核酸酶的ddH₂O稀释AE26-CAAS基因编辑猪pAPN基因标准质粒pClone-EZ-TOPO-AE26和pAPN基因野生型猪pAPN基因标准质粒pClone-EZ-TOPO-WT分别至3.2×10¹⁰、3.2×10⁹、3.2×10⁸、3.2×10⁷、3.2×10⁶、3.2×10⁵、3.2×10⁴、3.2×10³、3.2×10²、3.2×10¹、3.2×10⁰copies/μL浓度。

分别以梯度浓度的pClone-EZ-TOPO-AE26质粒和pClone-EZ-TOPO-WT质粒为模板，采用前述RPA引物（pAPN-RPA-4F/R）和条件进行RPA扩增，电泳检测RPA产物。

AE26-CAAS标准质粒pClone-EZ-TOPO-AE26质粒RPA扩增结果见图5。在质粒浓度为3.2×10²copies/μL时电泳条带亮度已比较微弱，质粒浓度更低时，结果不可见。

WT标准质粒pClone-EZ-TOPO-WT质粒RPA扩增结果见图6。在质粒浓度为3.2×10²copies/μL时电泳条带亮度已非常微弱，质粒浓度更低时，结果不可见。

以上述RPA产物为检测模板，采用AE26crRNA-F2荧光检测体系和WTcrRNA-F1荧光检测体系进行CRISPR/Cas12a荧光检测。

检测体系和反应条件见实施例1的四。

AE26crRNA-F2荧光检测体系和WTcrRNA-F1荧光检测体系的荧光强度检测结果分别见图7和图8，当标准质粒浓度为3.2×10²copies/μL时，检测结果与阴性对照相比仍有数量级的差别，且荧光强度存在极显著差异（P<0.01）。表明AE26crRNA-F2体系和WTcrRNA-F1体系的检测灵敏度为3.2×10²copies/μL，灵敏度较高。

实施例3、利用AE26-CAAS基因编辑猪RPA-Cas12a核酸检测体系检测猪核酸样品

采用本发明提供的AE26-CAAS基因编辑猪核酸检测体系分pAPN基因野生型猪、AE26-CAAS基因编辑猪、其他基因编辑猪（MSTN基因编辑猪），检测该体系是否能准确识别AE26-CAAS基因编辑猪样品。

上述核酸样本均为提取各个猪的基因组DNA。

按照表9组分配制RPA扩增体系，将配置好的扩增体系在恒温仪中37℃反应30分钟。

合成Biotin基团、6-FAM基团双标记的单链DNA试纸条探针，序列为6-FAM-TTTTTTTATTTTTTT（SEQ ID NO.15）-C6Biotin。按照表11以下组分配制CRISPR/Cas12a检测体系，按照上述体系配制AE26crRNA-F2试纸条检测体系以及WTcrRNA-F1试纸条检测体系，并设立无crRNA的阴性对照（NC）。

将配置好的试纸条检测体系在恒温仪中37℃反应60分钟，得到反应产物（反应液）。

反应液用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测，根据试纸条显色情况直接读取检测结果。

结果如图9和图10所示，图9中，每个试纸条上方的数字表示样品编号，以AE26crRNA-F2为crRNA的RPA-Cas12a检测体系在检测AE26-CAAS基因编辑猪纯合子、AE26-CAAS基因编辑猪杂合子、pAPN基因野生型猪（野生猪）、其他基因编辑猪核酸样本时，不含AE26-CAAS基因编辑序列的核酸样本（野生猪、其他基因编辑猪核酸样本）检测结果与阴性对照结果一致，为C线显色，T线无显色反应，呈现阴性结果。含AE26-CAAS基因编辑序列的核酸样本（AE26-CAAS基因编辑纯合子猪、AE26-CAAS基因编辑杂合子猪）检测结果为C线和T线均显色，呈阳性结果。表明AE26crRNA-F2体系结合胶体金试纸可以准确检测出含AE26-CAAS基因编辑序列的核酸样本。

图10中，以WTcrRNA-F1为crRNA的RPA-Cas12a检测体系在AE26-CAAS基因编辑纯合子猪、AE26-CAAS基因编辑杂合子猪、野生猪、其他基因编辑猪核酸样本时，不含WT序列的样本（AE26-CAAS基因编辑纯合子猪）与阴性对照结果一致，为C线显色，T线无显色反应，呈阴性结果。含WT序列的样本（AE26-CAAS基因编辑杂合子猪、野生猪、其他基因编辑猪）检测结果为C线和T线均显色，呈阳性结果。表明WTcrRNA-F1体系结合胶体金试纸可以准确检测出含WT序列的核酸样本。

联合使用AE26crRNA-F2和WTcrRNA-F1检测体系即可准确判断猪核酸样品的基因型。如图11所示，当AE26crRNA-F2体系检测结果为阳性，而WTcrRNA-F1体系检测结果为阴性，表明核酸样品是AE26-CAAS基因编辑猪纯合子的样品；当AE26crRNA-F2体系检测结果为阳性，而WTcrRNA-F1体系检测结果也为阳性，表明核酸样品是AE26-CAAS基因编辑猪杂合子的样品；当AE26crRNA-F2体系检测结果为阴性，而WTcrRNA-F1体系检测结果为阳性，表明核酸样品是野生型样品。

因此，利用本发明提供的AE26crRNA-F2、WTcrRNA-F1等crRNA以及检测方法，可以快速、高灵敏度、高特异性的判断AE26-CAAS基因编辑猪的基因型，可应用于AE26-CAAS基因编辑猪的检测、繁殖、生产、监管等多个方面。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.crRNA组，其包括crRNA1，

所述crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。

2.根据权利要求1所述的crRNA组，其特征在于：所述crRNA组还包括crRNA2；所述crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

3.一种产品，包括权利要求1中所述的crRNA1、Cas12a蛋白、用于特异性扩增结合靶点的引物对和单链DNA探针；

或，所述产品包括权利要求2中所述的crRNA1和crRNA2、Cas12a蛋白、用于特异性扩增各个结合靶点的引物对和单链DNA探针；

和，所述单链DNA探针两端分别标记不同基团；

和，所述基团为荧光基团、淬灭基团和/或生物素。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：

所述引物对由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成。

5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品为试剂盒、试纸条或荧光检测系统。

6.如下任一物质：

A1)权利要求3中所述的Cas12a蛋白和所述crRNA1，或者二者形成的复合体；

A2)权利要求3中所述的Cas12a蛋白、所述crRNA1和所述crRNA2，或者各自与Cas12a蛋白形成的复合体组。

7.权利要求1-2任一所述的crRNA或权利要求3-5任一所述产品在如下任一中的应用：

B1）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪；

B2）鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有AE26-CAAS基因编辑序列；

B3）鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的基因型；

B4）制备鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的产品；

B5）制备鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有AE26-CAAS基因编辑序列的产品；

B6）制备鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的基因型的产品。

8.一种鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪的方法，包括如下步骤：

C1）以待测样品的核酸作为模板，用权利要求3或4中所述引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

C2）配制含有如下组分的CRISPR-Cas12a检测体系：所述PCR产物、权利要求6中所述的Cas12a蛋白、权利要求6中所述的crRNA中的crRNA1和权利要求3中单链DNA探针；

C3）将所述CRISPR-Cas12a检测体系反应，检测反应产物，从而鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪。

9.一种鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪基因型的方法，包括如下步骤：

D1）以待测样品的核酸作为模板，用权利要求4中所述引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

D2）配制含有如下组分的CRISPR-Cas12a检测体系1和CRISPR-Cas12a检测体系2；

所述CRISPR-Cas12a检测体系1包括所述PCR产物、权利要求6中所述的Cas12a蛋白、权利要求6中所述的crRNA中的crRNA1和权利要求3中单链DNA探针；

所述CRISPR-Cas12a检测体系2包括所述PCR产物、权利要求6中所述的Cas12a蛋白、权利要求6中所述的crRNA中的crRNA2和权利要求3中单链DNA探针；

D3）将所述CRISPR-Cas12a检测体系1和所述CRISPR-Cas12a检测体系2分别反应，检测两个体系的反应产物鉴定或辅助鉴定AE26-CAAS基因编辑猪基因型。