CN119462833A

CN119462833A - 肿瘤抗原肽及其用途

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Publication number: CN119462833A
Application number: CN202411568539.7A
Authority: CN
Inventors: 沈良华; 王鹏然; 朱明�; 丁晓丹; 徐建; 马玲; 张岩; 宋献民; 马斌
Original assignee: Shanghai Kuaixu Biotechnology Co ltd; Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Kuaixu Biotechnology Co ltd; Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2023-11-21
Filing date: 2024-11-05
Publication date: 2025-02-18
Also published as: WO2025108140A1

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种肿瘤抗原肽及其用途。本发明提供肿瘤抗原肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。本发明提供肿瘤抗原肽可以被中国人群最高频的HLA亚型(HLA‑A*11:01)所递呈。此外，本发明通过体外刺激的方式，验证肿瘤抗原肽可以有效刺激出特异性T细胞，并成功获取特异性TCR元件。这为进一步开发靶向人TP53R248Q的TCR‑T疗法及治疗性疫苗等免疫疗法奠定直接基础。

Description

肿瘤抗原肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种肿瘤抗原肽及其用途。

背景技术

TP53是人类癌症中最常出现突变的抑癌基因之一¹。TP53基因会在约42％的癌症患者中发生突变，涉及癌症种类一半以上，而剩下的癌症类型则会频繁寻找其它方式来促进P53功能失活²。P53的主要突变类型包括错义突变、截断突变、框架内突变和剪接突变(TP53突变数据库，http://www-p53.iarc.fr/)。约80％的TP53突变是错义突变，错义突变会致使单氨基酸替换，例如R175H、R248Q、R273H等。有研究表明，获得性TP53 R248Q突变与治疗中疾病的复发、患者较差的治疗反应和对多种化疗药物的耐药性相关³。研究表明TP53-R248Q突变不仅导致肿瘤抑制功能的丧失，而且作为一种功能获得性突变，可促进小鼠模型中的肿瘤发生。TP53-R248Q突变也显示了细胞系中侵袭性行为的增加，已证明TP53-R248Q突变会导致更差的总生存率⁴。因此，靶向TP53-R248Q对于携带该突变的多种肿瘤的治疗具有重要意义。

近年来，免疫细胞治疗技术已经成为继手术治疗、放疗、化疗、小分子靶向治疗或单抗治疗后的肿瘤治疗新方法。代表性的为过继性T细胞疗法，它包括肿瘤浸润T细胞疗法(TIL)、嵌合抗原T细胞受体疗法(CAR-T)及工程改造T细胞受体疗法(TCR-T)。其中TCR-T疗法近年快速发展，有望为肿瘤治疗带来新的突破。它是采用基因工程技术将克隆的特异识别肿瘤抗原的TCR装载到自体或异体CD8+T细胞上，使其获得特异性杀伤肿瘤细胞能力的前沿免疫细胞治疗技术⁵。与CAR-T细胞仅能识别膜抗原相比，TCR-T细胞识别的抗原是由MHC提呈的抗原肽，因而可以靶向更广泛的抗原，包括胞内抗原和膜抗原；TCR-T细胞疗法在增加了T淋巴细胞的数量的同时，提高了T淋巴细胞对于肿瘤细胞的杀伤特异性，从而达到更好的肿瘤治疗效果。近期的临床研究展示了TCR-T对肿瘤患者具有良好的治疗效果，但由于肿瘤特异性抗原的个体特异性及TCR库的丰富性，获取特异性识别肿瘤新生抗原的TCR序列极具挑战性。

除了TCR-T之外，还有治疗性疫苗的开发，为肿瘤的治疗提供了新的方向。治疗性疫苗靶向肿瘤突变，将若干肿瘤新抗原以mRNA的形式串联，注射到患者体内，利用患者自身免疫系统，刺激出特异识别肿瘤新抗原的T细胞对肿瘤细胞进行杀伤清除，从而达到治疗的目的⁶。无论是TCR-T疗法还是治疗性疫苗的应用前提，均是鉴定出肿瘤新抗原。因此，若要开发出靶向TP53突变的新型免疫疗法，鉴定出包含TP53突变的肿瘤新抗原肽至关重要。

引用文献：

1 Kastenhuber,E.R.,Lowe,S.W.Putting p53 in Context.Cell,2017,170(6):1062-1078.

2 Bykov,V.J.N.,Eriksson,S.E.,Bianchi,J.,Wiman,K.G.Targeting mutantp53 for efficient cancer therapy.NatRev Cancer,2018,18(2):89-102.

3Pan,M.,Jiang,C.,Tse,P.,Achacoso,N.,Alexeeff,S.,Solorzano,A.V.,Chung,E.,Hu,W.,Truong,T.G.,Arora,A.,Sundaresan,T.,Suga,J.M.,Thomas,S.,Habel,L.A.TP53 Gain-of-Function and Non-Gain-of-FunctionMutations AreDifferentially Associated With Sidedness-Dependent Prognosis in MetastaticColorectal Cancer.

J Clin Oncol,2022,40(2):171-179.

4Ng,J.W.,Lama,D.,Lukman,S.,Lane,D.P.,Verma,C.S.,Sim,A.Y.R248Qmutation--Beyond p53-DNAbinding.Proteins,2015,83(12):2240-2250.

5Rosenberg,S.A.,Restifo,N.P.Adoptive cell transfer as personalizedimmunotherapy for human cancer.

Science,2015,348(6230):62-68.

6Saxena,M.,van der Burg,S.H.,Melief,C.J.M.,Bhardwaj,N.Therapeuticcancer vaccines.Nat Rev Cancer,

2021,21(6):360-378.

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肿瘤抗原肽及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽包含如下特征中的一种或多种：

1)所述肿瘤抗原肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段；

2)所述肿瘤抗原肽为包含与1)中所述的肽段相比，具有至少80％的序列相似性，且具有或部分具有1)中所述的肿瘤抗原肽活性的肽段。

优选地，所述肿瘤抗原肽能被特异性结合TP53 R248Q突变肿瘤细胞的抗体识别。

本发明还提供一种重组核酸分子，所述重组核酸分子编码前述肿瘤抗原肽。

本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含前述重组核酸分子。

本发明还提供一种细胞，所述细胞含有前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子或如前述重组表达载体。

本发明还提供前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞在制备如下任一产品中的用途：

1)HLA多聚体产品；

2)TCR-T产品；

3)肿瘤疫苗产品；

4)肿瘤治疗产品。

本发明还提供一种分离的TCR-T细胞的制备方法，所述制备方法为：将负载前述肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞与T细胞共培养，即获得所述分离的TCR-T细胞。

本发明还提供一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞中的一种或多种。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞及药学上的辅料或治疗佐剂。

如上所述，本发明的一种肿瘤抗原肽及其用途，具有以下有益效果：

本发明利用建立的稳定表达HLA-A*11:01的K562细胞株，将串联的TP53突变候选抗原肽导入细胞后，通过HLA抗体免疫沉淀HLA-抗原肽复合物，进行质谱测定分析，鉴定出包含TP53 R248Q突变位点的短肽，并证实其可以被中国人群最高频的HLA亚型(HLA-A*11:01)所递呈。此外，本发明通过体外刺激的方式，验证其可以有效刺激出特异性T细胞，并成功获取特异性TCR元件。这为进一步开发靶向人TP53 R248Q的TCR-T疗法及治疗性疫苗等免疫疗法奠定了直接基础。

附图说明

图1显示为本发明的肿瘤抗原肽质谱测定的流程及分析结果。

图2显示为本发明的肿瘤抗原肽诱导产生的T细胞的分选及单细胞测序结果示意图。

图3显示为本发明的肿瘤抗原肽所制备TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外结合实验结果示意图。

图4显示为本发明的肿瘤抗原肽所制备TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外激活实验结果示意图。

图5显示为本发明的肿瘤抗原肽所制备TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外细胞因子释放实验的结果示意图。

图6显示为本发明的肿瘤抗原肽所制备TP53-R248Q-TCR-T细胞的特异性检测的结果示意图。

图7显示为本发明的肿瘤抗原肽所制备TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外肿瘤杀伤实验的结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤抗原肽可以被特异性结合TP53 R248Q突变肿瘤细胞的抗体识别。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤抗原肽还可以包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列相似性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的肿瘤抗原肽活性的肽段。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤抗原肽可以为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、添加或保守突变一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的多肽，该多肽的氨基酸序列可以与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％的序列相似性。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤抗原肽还包含在N端或C端添加的标签肽段。更具体地，所述肿瘤抗原肽的两端添加一个或多个能够在体内或体外通过酶解切除的标签肽段得到，由于经酶解切除后，仍能够得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。

在一些具体实施方式中，所述标签肽段选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签中的一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤抗原肽还可以在包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示肽段的基础上进行一种或多种修饰。更具体地，所述修改选自如下方式中的一种或多种：与抗体、载体、配体、白蛋白、Fc片段的偶联或融合，磷酸化修饰、PEG化修饰、酰胺化修饰、糖基化修饰和生物素化修饰。

在一些具体实施方式中，所述重组核酸分子可由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成。

在一些具体实施方式中，所述重组表达载体还包含表达调控元件。更具体地，所述表达调控元件选自以下的一种或多种：启动子、转座子、增强子、polyA元件、LTR元件、ITR元件、WPRE元件和SV40元件。

本发明还提供一种细胞，所述细胞含有前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子或前述重组表达载体。

在一些具体实施方式中，所述细胞为表达或制备肿瘤抗原肽的细胞。具体地，所述表达或制备肿瘤抗原肽的细胞选自动物细胞(如CHO、COS、N2A、人宫颈癌细胞如HELA或人胚胎肾细胞如HEK293T)、植物细胞、细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如Sf9)中任一种。更具体地，所述细胞为人细胞。

在一些具体实施方式中，所述细胞为表面负载肿瘤抗原肽的细胞。具体地，所述表面负载肿瘤抗原肽的细胞为抗原呈递细胞。优选地，所述抗原呈递细胞细胞选自单核细胞、树突状细胞、B细胞、朗格汉斯细胞或肿瘤细胞的病毒感染的靶细胞中的一种或多种。

1)HLA多聚体产品；

2)TCR-T产品；

3)肿瘤疫苗产品；

4)肿瘤治疗产品。

在一些具体实施方式中，所述TCR-T产品为分离的TCR-T细胞。

在一些具体实施方式中，所述抗原呈递细胞为单核细胞或树突状细胞。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤疫苗还包含免疫佐剂。更具体地，所述免疫佐剂选自放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂中的一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自于鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病或慢性成髓细胞性白血病中的一种或多种。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞及药学上可接受的辅料。所述药物组合物可通过全身途径或局部途径施用，选自内耳施用、眼科施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂中的一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述药物组合物还包含治疗佐剂。更具体地，所述治疗或治疗佐剂佐剂选自放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂中的一种或多种。

所述辅料包括各种赋形剂和稀释剂，这些辅料并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。所述辅料包含无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)或粘合剂。所述辅料还包含其它低分子量的多肽、血清白蛋白、甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸、多糖、单糖、甘露糖醇或山梨糖醇。所述辅料用于注射的水溶液时选自生理盐水、葡萄糖等渗溶液、D-山梨糖醇等渗溶液、D-甘露糖等渗溶液、D-甘露或糖醇等渗溶液。所述注射的水溶液包含增溶剂。所述增溶剂选自醇(乙醇)、多元醇(丙二醇或PEG)和/或非离子表面活性剂(吐温80或HCO-50)。本发明所提供的药物组合物中，前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞为单一有效成分，也可以与其他一种或多种对于肿瘤治疗有用的活性组分进行组合，构成联合制剂。所述活性组分为其他各种用于治疗肿瘤的药物。所述药物组合物中活性组分的含量为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，前述肿瘤抗原肽、前述重组核酸分子、前述重组表达载体或前述细胞和药所述物组合物的活性成分的施用量依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述组合物的施用量为1～1000mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～200mg/kg/day、200～500mg/kg/day、或大于500mg/kg/day。

本发明还提供一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法为包括向受试者施用前述肿瘤疫苗或前述药物组合物。

在一些具体实施方式中，所述方法为：经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管、通过灌洗或通过灌注来给受试者施用前述肿瘤疫苗或前述药物组合物。

在一些具体实施方式中，所述施用的量为1-1000mg/kg/day。具体地，所述施用的量为1-3mg/kg/day、3-5mg/kg/day、5-10mg/kg/day、10-20mg/kg/day、20-30mg/kg/day、30-40mg/kg/day、40-60mg/kg/day、60-80mg/kg/day、80-100mg/kg/day、100-200mg/kg/day、200-500mg/kg/day、或500mg-1000mg/kg/day。

在一些具体实施方式中，所述方法的对象可以为哺乳动物；优选地，所述方法的对象为人。

本申请中，术语“肽段”、“肽”也可为“多肽”、“蛋白”或“蛋白质”，其皆为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。多肽可以从天然来源分离，可以通过重组技术从真核或原核宿主产生并且可以是合成方法的产物。

本申请中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变(例如，氨基酸的置换、插入和/或缺失)，如保守置换。具体地，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

本申请中，术语“序列相似性”也可称为“序列同一性”通常是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

本申请中，术语“疫苗”通常是将病原微生物(如细菌等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防疾病的免疫制剂。

本申请中，术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。

本申请中，术语语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本申请公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。

本申请中，术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请中所用序列信息如下：

SEQ ID No.1

SCMGGMNQR

实施例1肿瘤抗原肽的筛选与鉴定

1.抗原肽预测

从人P53突变数据库中整理出目前发现的所有P53点突变，结合中国人群HLA亚型分布特点，选择最高频的前10位HLA亚型，利用在线预测工具NetMHCpan(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/)进行抗原肽的预测。选取％ELRANK<2的结果为候选抗原肽。

2.候选抗原肽的质谱鉴定

1)将上述选定的候选抗原肽，根据其氨基酸序列将突变位点置于中间位置，截取25个氨基酸的短肽。将多个抗原肽进行串联，抗原肽之间加上G₃S连接肽。最后将其克隆到真核表达载体中；

2)利用K562细胞稳转单一HLA基因，建立稳定表达HLA(以HLA-A*11:01为例)的细胞株。将上述构建好的表达候选抗原肽的载体电转表达单一HLA亚型的细胞，48小时后收取细胞，PBS清洗后离心冻存备用；

3)将上述收集的细胞裂解后，利用HLA抗体(w6/32)进行免疫共沉淀处理。将抗体拉下的组分进行质谱上机分析。质谱结果进行蛋白序列搜库或从头测序算法分析其序列。

按上述实验过程(图1A)表达候选TP53突变抗原肽的载体电转HLA-A*11:01稳转株后，获得的质谱测定分析结果如图1B所示，即最终获取包含TP53 R248Q突变的肿瘤抗原肽序列如SEQ ID No.1所示。本申请中所用肿瘤抗原肽可以在已知具体氨基酸序列的基础上通过化学合成方式获得。

实施例2肿瘤抗原肽在治疗性疫苗开发中的应用

2.1肿瘤抗原肽诱导特异性结合TP53 R248Q突变的T细胞产生

2.1.1体外诱导健康供者单核细胞(monocytes)定向分化为树突状细胞(Dendriccell,DC)

(1)Lymphoprep密度梯度离心法获取健康供者/患者血液中PBMCs(或复苏已冻存的PBMCs)，10ml 1640medium(Gbico)重悬后，350g，5min离心后去除上清，加入适量DCmedium(Stem cell)重悬PBMCs至5×10⁶cells/ml密度。

(2)移液器吸取上述2ml PBMCs悬液至6孔板中，细胞数目为1×10⁷cells perwell。将6孔板放置于37℃，5％ CO₂培养箱中培养2h。轻轻旋转6孔板，直到一层薄薄的非粘附细胞在孔中心悬浮。轻轻倾斜平板，然后小心地吸出培养基和结块的非贴壁细胞，而不干扰贴壁细胞。

(3)每孔沿侧壁轻轻加入3ml含终浓度为1×DC Differentiation Supplement的DC medium(Stem cell)，将6孔板放置于37℃，5％ CO₂培养箱中培养3d。

(4)Day 5时，在不更换培养基的情况下，每孔加入30μl 100×DC MaturationSupplement(Stem cell)至培养基中。将6孔板放置于37℃，5％ CO₂培养箱中诱导成熟2d。

(5)移液器吹打和重悬孔板底部细胞以收取成熟树突状细胞即Mature DC，将收集的Mature DC转移至15毫升离心管，通过显微镜检查孔板底部，以确保全部Mature DC已被完全收获。

2.1.2DC细胞荷载TP53-R248Q抗原肽后与自体CD8+T细胞共刺激培养

(1)向上述15ml离心管(Mature DC)中加入5μg/ml氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的TP53-R248Q肿瘤抗原肽。用Parafilm密封盖子，放入MACSmix旋转器中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中旋转结合4h。

(2)Lymphoprep密度梯度离心法获取健康供者/患者血液中PBMCs(或复苏已冻存的PBMCs)，10ml 1640medium重悬后，350×g，8min离心后去除上清，使用EasySepTM HumanCD8 Positive Selection Kit分离PBMCs中的CD8+T细胞。

(3)mature DC与TP53-R248Q-peptide孵育完成后，使用辐照仪以4000rad(40Gy)剂量辐照负载TP53-R248Q肿瘤抗原肽的mature DCs。

(4)负载TP53-R248Q-peptide的mature DCs辐照结束后，以DC细胞:CD8+T细胞为1:2.5的比例进行体外刺激。以每孔2ml加入12孔板中，随后将12孔板放置在37℃，5％ CO₂细胞培养箱中孵育过夜。

(5)后续每2-3天进行半量换液，至Day14时，再制备经辐照的负载TP53-R248Q-peptide的mature DCs，加入上述(4)中与培养体系中的细胞进行第二轮体外刺激。

(6)Day28时收集共刺激体系中的细胞，随后开始FACS染色，首先加入10μlHLA-A:1101-TP53-R248Q-Tetramer-PE，混匀后RT避光孵育20min，孵育结束后加入5μlCD8a-APC，混匀后4℃避光孵育20min，孵育结束后FACS buffer洗涤三次后，400μl含1×DAPI工作液的FACS buffer重悬细胞后转移至FACS小管，设置好各单色对照，未染色对照，同型对照后，上机流式各组别CD8+/Tetramer(％)比例检测、实验组。

2.1.3TP53-R248Q-specific-T细胞的分选及单细胞TCR测序

(1)健康供者的CD8+T细胞经过自体TP53-R248Q-peptide-loaded DCs两轮体外刺激后图2A，收集共刺激体系中的细胞进行流式分析，具体流式结果如图2B所示，健康供者的CD8a+/Tetramer+T比例为0.14％，分群明显。表明TP53-R248Q-specific-TCR-T细胞在两轮体外刺激中得到了特异性的扩增。随后使用流式分选型细胞仪将共培养体系中CD8+/tetramer+T细胞进行特异性分选，随后送往晶能生物进行10×Genomics的单细胞TCR+转录组测序，以获取CD8+/tetramer+T细胞的TCR序列及转录组学特征。

(2)单细胞测序完成后，对排名前四的TCR进行转录组学特征分析，其中分析得出的该细胞群的TCR测序结果及频次排名的结果如图2C所示。随后将其中频次最高的TCR序列进行优化；将TCR序列进行人源的密码子优化，提高TCR的表达量，最终获得的编码TP53-R248Q-TCR；利用P2A及Furin-cleavage使得TCR的α与βchain能在慢病毒表达载体中同时表达。

2.1.4制备表达特异性结合TP53-R248Q突变T细胞受体的T细胞

(1)将上述所得优化的的TP53-R248Q-TCR构建慢病毒表达载体(图3A-B)，随后进行TP53-R248Q-TCR的慢病毒包装，病毒包装的具体操作如下：将293T细胞消化传代，转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。Opti-MEM需在37度水浴中预热，Fugene-HD转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下：含目的TCR的pHR-SFFV-TCR-Puro质粒：10ug；pMD2.G(包膜质粒)：5ug；pSPAX2(核心酶)：7.5ug。opti-MEM补足至1mL后，混匀；加入56ul Fugene-HD转染试剂，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。随后收集48h和72h病毒上清,收集后4000rpm，5min，取上清经过0.45um滤膜(PES材质)过滤后使用。分别于病毒包装后的48h与72h收集TP53-R248Q-TCR的慢病毒液。

(2)TP53-R248Q-TCR慢病毒颗粒感染Jurkat T细胞，加入10μg/ml polybrene，800×g，90min，30℃进行离心感染。离心结束后置于细胞培养箱中，37℃，5％ CO₂培养24h，随后更换新鲜的1640培养基进行培养。

(3)加入20ul CD3/28beads(Genscript)与20ng/ml IL-2于健康供者的CD8+T细胞中，激活T细胞48h后，加入10μg/ml polybrene，进行TP53-R248Q-TCR慢病毒的第一轮感染，离心结束后于细胞培养箱中，37℃，5％ CO₂培养24h。随后进行TP53-R248Q-TCR慢病毒的第二轮感染。

2.2肿瘤抗原肽所诱导T细胞的结合特异性鉴定

上述TP53-R248Q-TCR慢病毒感染Jurkat T细胞或primary CD8+T结束后48h，吸取TP53-R248Q-TCR-Jurkat T细胞或TP53-R248Q-TCR-T细胞，经FACS buffer洗涤两次后，加入HLA-A:1101-TP53-R248Q-Tetramer-PE与CD8a-APC抗体染色。

对上述制备的TP53-R248Q-TCR-T细胞进行mTCRβC+/HLA-A*11:01-TP53-R248Q-Tetramer染色，流式结果显示Tetramer+/mTCRβC+Jurkat T及CD8+/Tetramer+primary CD8+T(图3C)细胞分群明显。该结果显示此次体外筛选并鉴定的TP53-R248Q-TCR可在Jurkat T细胞系及primary CD8+T中正常表达，并可与HLA-A:1101-TP53-R248Q-Tetramer特异性结合。

实施例3肿瘤抗原肽在制备TCR-T中的应用

3.1TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外激活实验

TP53-R248Q-TCR-T细胞的体外激活实验即IFNγ-Elispot实验包含如下步骤：

(1)体外将供者自体monocytes定向分化DC细胞，同实施例2中将DC分别荷载TP53-R248-WT或TP53-R248Q抗原肽段，将上述中制备TP53-R248Q-TCR-T细胞与负载有TP53-R248-WT或TP53-R248Q抗原肽段的DC进行体外共培养；

(2)体外共培养24h后，弃去细胞，然后用200μl DPBS清洗5遍以完全去除细胞，往培养体系中加入100μl，1μg/ml检测抗体7-B6-1-biotin，37℃孵育2h。随后用加入100μl链霉亲和素-HRP(streptavidin-HRP)(3420-2H,MABTECH)，室温孵育1h。

(3)200μl DPBS清洗5遍后，加入底物100μl TMB至每孔，直至孔中出现完整的斑块(spots)，随后加入无菌水中断显色进程。

结果如图4所示，负载有TP53-R248Q抗原肽段的DC可在体外特异性激活TP53-R248Q-TCR-T细胞，激活后TP53-R248Q-TCR-T细胞的IFNγ表达水平显著增高(图4A-C)，而负载有TP53-R248-WT抗原肽段的DC对TP53-R248Q-TCR-T细胞无明显激活作用(图4B-C)，故此结果表明本次筛选、鉴定所得TP53-R248Q-TCR可特异性识别TP53-R248Q抗原肽段。

3.2TP53-R248Q-TCR-T体外细胞因子释放检测

(1)本实施例通过慢病毒感染及流式分选的方法，分别制备了表达该名供者的HLA-A*11:01亚型的K562细胞。

(2)通过K562-A*11:01对照细胞或荷载TP53-R248Q突变多肽后与供者自体的TP53-R248Q-TCR-T共培养24h后，进行IFN-γ/TNF-α/IL-2/GZMB的流式实验检测。

结果表明TP53-R248Q-TCR-T特异性识别由HLA-A*11:01所递呈的TP53-R248Q突变多肽，并显著分泌IFN-γ细胞因子(图5A-D)，而mTCRβ阴性的CD8⁺T细胞则无细胞因子的分泌情况，上述结果进一步显示本次鉴定的TP53-R248Q-TCR序列特异性优良，间接证明了R248Q抗原肽具备免疫原性。

3.3R248Q突变肽段的特异性检测

通过体外结合及激活实验，本实施例中验证了TP53-R248Q-TCR-T可特异性识别由HLA-A*11:01递呈的TP53-R248Q突变肽段，TP53-R248Q-TCR-T识别后可特异性泌细胞因子。随后，本实施例中将抗原肽段“SCMGGMNQR”的突变氨基酸Q位置进行体外的激活实验检测，流式结果表明仅抗原肽段“SCMGGMNQR”肽段可特异性激活TP53-R248Q-TCR-T细胞，并上调CD137和CD69的表达(图6A-B)。

3.4TP53-R248Q-TCR-T体外杀伤实验

(1)同实施例2中TP53-R248Q-TCR-T的制备，将体外通过慢病毒感染T细胞或K562-A1101细胞分别构建TP53-R248Q-TCR-T效应细胞与K562-A1101-TP53-R248Q靶细胞。

(2)使用celltrace violet对K562靶细胞或对照细胞进行标记，常温避光孵育15min后进行FACS洗涤，1000rpm，5min去除上清后加入完全培养基进行重悬计数。

(3)随后以效靶比5:1将TP53-R248Q-TCR-T细胞与K562-A1101对照细胞或K562-A1101-TP53-R248Q靶细胞分别加入至96孔板中进行共培养24h。

(4)收集96孔板中的细胞后进行FACS洗涤，1000rpm，5min去除上清后加入APC-Cy7-Live/dead染料对死细胞进行染色，经洗涤后使用流式检测培养体系中国CelltraceViolet+/APC-Cy7+的细胞比例。

上述实验结果如图7A-B所示，TP53-R248Q-TCR-T可在体外高效的杀伤靶细胞，其杀伤效率较primary CD8+T细胞有显著性的提高(P<0.0001)。体外杀伤实验结果表明本次筛选、鉴定所得TP53-R248Q-TCR可特异性识别并杀伤表达HLA-A1101-R248Q的靶细胞。该结果同样说明本次鉴定的R248Q抗原肽(SCMGGMNQR)具有强免疫原性，可特异性激活T细胞，由此鉴定的R248Q-TCR-T可对靶细胞进行特异性识别及杀伤。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.一种肿瘤抗原肽，其特征在于，所述肿瘤抗原肽包含如下特征中的一种或多种：

1)所述肿瘤抗原肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段；

2.根据权利要求1所述的肿瘤抗原肽，其特征在于，所述肿瘤抗原肽能被特异性结合TP53R248Q突变肿瘤细胞的抗体识别。

3.一种重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子编码如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的重组核酸分子。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽、如权利要求3所述的重组核酸分子或如权利要求4所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为表达或制备肿瘤抗原肽的细胞；或，所述细胞为为表面负载肿瘤抗原肽的细胞。

7.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽、如权利要求3所述的重组核酸分子、如权利要求4所述的重组表达载体或如权利要求5或6所述的细胞在制备如下任一产品中的用途：

1)HLA多聚体产品；

2)TCR-T产品；

3)肿瘤疫苗产品；

4)肿瘤治疗产品。

8.一种分离的TCR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将负载如权利要求1或2所述肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞与T细胞共培养，即获得所述分离的TCR-T细胞。

9.一种肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗包含如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽、如权利要求3所述的重组核酸分子、如权利要求4所述的重组表达载体或如权利要求5或6所述的细胞中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的肿瘤疫苗，其特征在于，所述，所述肿瘤选自于鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病或慢性成髓细胞性白血病中的一种或多种。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽、如权利要求3所述的重组核酸分子、如权利要求4所述的重组表达载体或如权利要求5或6所述的细胞中及药学上的辅料或治疗佐剂。