CN119372335B

CN119372335B - 猪acsl3基因启动子区snp标记及其在猪抗prrsv育种的应用

Info

Publication number: CN119372335B
Application number: CN202411711115.1A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 吴贤梦; 周翔; 陆思羽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Filing date: 2024-11-27
Publication date: 2025-10-14
Anticipated expiration: 2044-11-27

Abstract

本发明提供了猪ACSL3基因启动子区SNP标记及其在猪抗蓝耳病育种的应用。利用全基因组重测序数据，对ACSL3基因启动子区的SNPs进行分析，发现猪ACSL3基因启动子上三个单核苷酸变异与猪蓝耳病抗病性相关，并发现CCA单倍型能够提高群体对猪蓝耳病的抗病性，进而可以利用该分子标记实施个体的早期选择，用于辅助选育猪抗蓝耳病品种。本发明为猪抗PRRSV的遗传改良提供了可靠的分子标记，对猪抗病育种具有重要意义。

Description

猪ACSL3基因启动子区SNP标记及其在猪抗PRRSV育种的应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种猪ACSL3基因启动子区SNP标记及其在猪抗PRRSV育种的应用。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV)引起的以各年龄段猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病。PRRSV基因组具有高度易变性和易重组的特点导致疫苗免疫无法有效抑制其传播。抗病育种在遗传水平增强宿主对PRRSV的抗病力，从根本上抑制PRRSV流行。

脂肪酸在生理过程发挥重要作用，参与众多脂质的形成，包括三酰基甘油和胆固醇酯的形成、磷脂等结构脂的形成、转化为醇或醛、加碳延伸或减碳缩短、插入或去除双键或与蛋白质共价结合(Kuwata H and Hara S2019,Quan J et al 2021,Soupene E andKuypers FA 2008)。游离脂肪酸进入上述代谢过程前都必须在脂酰辅酶A合成酶(Acyl-coenzyme A synthetases，ACSs)家族成员催化下，与辅酶A形成硫酯键转化为脂肪酸的活化形式。随着多物种基因组测序的完成，使用高度保守的氨基酸序列基序检测到26个已证实的ACS家族成员(Watkins PA et al 2007)。其中，脂酰辅酶A合成酶家族中的长链酰基辅酶A合成酶ACSL是合成长链脂肪酸的关键酶。ACSL家族通常含有ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6五个成员，各成员在生物体内分布部位不尽相同，但都具有活化长链脂肪酸的功能。ACSL3也被称作ACS3，主要位于脂肪生成细胞的外围以及内质网胞质中(Kassan A etal 2013,Poppelreuther M et al2012)。ACSL3对月桂酸、肉豆蔻酸、二十碳五烯酸乙酯有较高的底物特异性，可以优先活化饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸(Fujino et al 1996)。

随着对ACSL3研究的深入，发现其生物学作用广泛。Li等人发现ACSL3可通过GPX4-ACSL3轴在脑损伤后的铁死亡过程中作为负调节因子发挥重要作用(Li M et al 2022)。使用靶向siRNA干扰Huh7细胞中的ACSL3表达后，脂蛋白主要成分载脂蛋白B的分泌受到抑制，脂蛋白迅速降解，HCV病毒粒子在宿主细胞中的分泌也受到抑制(Nchoutmboube JA etal2013)。Yao等人通过使用靶向ACSL3的siRNA处理细胞后发现脊髓灰质炎病毒的复制效率显著下调(Yao H and Ye J 2008)。此外，ACSL3在不同类型癌症的不同发展阶段中也具有相对复杂的功能，如在癌变早期参与脂质的合成与沉积、在乳腺癌与前列腺癌晚期增加脂质利用等(Tang Y et al 2018,Wright et al 2017)。

目前还未见有猪ACSL3基因启动子区SNP标记介导猪蓝耳病抗病性的相关报道。因此，研究ACSL3基因的SNPs，鉴定其与蓝耳病抗病性之间的关系，为分子标记辅助育种提供有利的理论依据，方便快速地选育出抗PRRSV个体。

发明内容

本发明通过比较PRRSV人工感染资源群体的抗病个体与易感个体遗传和基因表达差异，选择ACSL3作为抗蓝耳病候选基因，通过寻找猪ACSL3基因启动子区域的遗传变异，挖掘与猪蓝耳病抗病性相关的分子标记及其检测方法，并应用于猪遗传育种，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗蓝耳病个体的选育提供基因标记和技术方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，提供一种ACSL3基因中与猪蓝耳病抗病性相关的分子标记，其为核苷酸序列为SEQ ID NO.1。所述分子标记是通过对PRRSV人工感染资源群体的全基因组重测序，获得测序数据，对ACSL3基因启动子区域内所有SNPs进行提取，确定猪ACSL3基因启动子区域的三个连锁程度高的SNP位点，即15:124741207、15:124741301和15:124741312(猪参考基因组为Sscrofa11.1)可能与猪蓝耳病抗病性相关。本领域技术人员应当理解，在本发明中，任何包括SEQ ID NO.1所示序列的第1223位碱基、第1317位碱基或第1328位碱基之一的片段均可以作为分子标记，优选地包含这三个位点的片段。因而本发明分子标记其为核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的片段，该片段至少包括SEQ ID NO.1所示序列的第1223位碱基、第1317位碱基或第1328位碱基之一，优选地包含第1223位碱基、第1317位碱基和第1328位碱基这三个位点的片段。

进一步，本发明结合频率分布和连锁不平衡分析，提取位于ACSL3启动子区的三个变异位点，即15:124741207、15:124741301和15:124741312作为候选位点。其中三个候选位点的变异类型鉴定如下：所述15号染色体上124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变。

进而，根据15:124741207、15:124741301和15:124741312三个变异位点的强连锁事实，针对相应三个SNP位点的优势单倍型CCA和GTC分别构建双荧光素酶载体并利用不同细胞进行表达试验，结果发现CCA单倍型的双荧光素酶活性显著降低。

最后，根据CCA单倍型和GTC单倍型对ACSL3基因启动子活性的调控，使得CCA单倍型引起ACSL3基因表达量的降低，针对ACSL3基因不同干扰靶点设计siRNA，结果发现干扰ACSL3基因的表达能够抑制PRRSV增殖。

据此，本发明提供一种分子标记方法，所述分子标记位于猪参考基因组第15号染色体上124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变，检测这三个位点，这三个位点的CCA单倍型为优势单倍型。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的SNP分子标记在猪抗蓝耳病遗传育种中的应用。所述SNP位点为位于猪参考基因组第15号染色体上124741312位的SNP位点；所述猪参考基因组为Sscrofa11.1，124741312位的SNP位点为A>C突变。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的SNP分子标记的检测方法，包括以下步骤：

以待测猪基因组DNA为模板，通过PCR扩增ACSL3基因启动子区片段，然后对位于所述ACSL3基因启动子区的SNP位点的基因型进行鉴定，所述SNP位点为位于猪参考基因组第15号染色体上124741207位、124741301位、124741312位的SNP位点中的一个或多个；所述猪参考基因组为Sscrofa11.1，124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变(即所述SNP位点为15:124741207G>C、15:124741301C>T、15:124741312A>C中的一个或多个)。

优选的，所述PCR的扩增引物设计模板可以参考以下区域：15:124739985-15:124741985。

第四方面，本发明提供一种用于特异性扩增待测猪ACSL3基因启动子区与猪PRRSV抗病性相关的SNP位点并鉴定相应位点基因型的引物，所述SNP位点为位于猪参考基因组第15号染色体上的第124741207位、第124741301位和/或第124741312位的SNP位点，所述猪参考基因组为Sscrofa11.1。

优选地，所述扩增引物设计模板可以参考以下区域：15:124739985-15:124741985。在本发明的一个实施方式中，所述引物的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2、3所示的序列。

第五方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的SNP分子标记的检测试剂盒。包括用于特异性扩增待测猪ACSL3基因启动子区的SNP位点并鉴定相应SNP位点基因型的引物，所述SNP位点为位于猪参考基因组第15号染色体上124741207位、124741301位、124741312位的SNP位点中的一个或多个；所述猪参考基因组为Sscrofa11.1，124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变(即所述SNP位点为15:124741207G>C、15:124741301C>T、15:124741312A>C中的一个或多个)。

第六方面，本发明提供了一种利用上述SNP标记辅助选育抗PRRSV优势猪的方法，在育种时优选SNP分子标记为CCA单倍型，能够提高群体对PRRSV的抗病性。具体地，包括通过所述分子标记检测选择CCA单倍型为双亲或者单亲进行杂交育种，选择具有CCA单倍型的后代进行繁育。

本发明的有益效果在于：

本发明通过基因组重测序方法，在PRRSV人工感染资源群体寻找并发现了与抗PRRSV相关的ACSL3基因启动子区变异位点15:124741312A>C及与其连锁程度高的变异位点15:124741207G>C和15:124741301C>T；通过鉴定这些位点的基因型可以确定与抗PRRSV相关位点的突变基因携带情况，并利用相应位点的分子标记快速筛选出用于构建抗PRRSV优良种群的个体，为进行早期选育，提高育种效率提供了检测技术手段。

附图说明

图1为群体ACSL3基因启动子区SNP连锁程度分析热图。

图2为群体ACSL3基因启动子区SNP单倍型频率。

图3为ACSL3不同单倍型启动子报告基因载体测序结果部分序列。

图4为SNPs对ACSL3启动子转录活性的影响。

图5为干扰ACSL3表达后蛋白表达量及灰度值分析。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的目的和技术方案，下面将对实施例和附图进行简单的介绍，进一步对本发明进行详细说明。所述实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

全基因组重测序方法分析猪ACSL3基因的启动子区域

1.收集86头PRRSV人工感染试验试验个体的新鲜全血，利用红细胞裂解液分离白细胞，通过苯酚氯仿法提取白细胞DNA，送至测序公司进行全基因组测序。

2.利用BWA软件对猪参考基因组11.1进行全基因组序列比对。

3.利用GATK和Beagle等软件检测所有样本的所有SNP位点，并进行注释。

4.对ACSL3基因启动子区域(默认范围为上游2kb)内所有SNP进行提取，共提取了30个SNP位点，将所提取到的SNP导入Haploview软件进行SNP间的连锁不平衡程度进行分析。发现ACSL3基因第27、28、29个SNP位点构成一个LD模块(图1)，单倍型分别为CCA、GCA、GCC、GTC，频率分别为0.450、0.211、0.203、0.118(图2)。

抗病个体中主要存在的单倍型为CCA(81.8％)，易感个体中主要的单倍型为CCA(42.9％)和GTC(42.9％)(表1)。

表1抗病个体与易感个体ACSL3启动子单倍型分布

实施例2

猪ACSL3基因启动子区域SNP位点对基因表达的影响

1.在全基因组测序数据中，挑选CCA和GTC个体，作为PCR模版进行扩增(表2)。

表2引物序列信息

2.选取包含第27、28和29位SNP位点的区域作为目的片段，采用同源重组的方法将目的片段与pGL3-basic载体质粒进行连接，利用引物将同源序列插入目的片段两侧(表3)。

表3ACSL3双荧光素酶质粒构建基本信息

3.引用上述引物在个体中进行PCR扩增，PCR反应体系如表4所示，总体积为50μL。

表4PCR反应体系

PCR反应程序如下：

98℃2min

98℃10s

4.PCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，150V电压下电泳20min。随后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit,Vazyme)进行回收。

5.pGL3-basic载体质粒经KpnI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后，与目的片段进行连接，转化，单克隆挑菌过夜培养，并送至测序公司检测序列是否正确(图3)。

6.用Omega公司的Plasmid Midi Kit去内毒素质粒提取试剂盒，按照说明书进行操作，提取双荧光素酶表达载体质粒，用于不同细胞的转染。

7.293T和PK15^CD163细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的完全培养基进行培养，在37℃、5％CO₂培养箱生长至80～90％汇合度。传代至24孔细胞培养板中，显微镜下观察单层细胞汇合度达到70-80％时进行瞬时转染，转染参考Lipofectamine^TM2000试剂说明书。将空载质粒、内参质粒和重组载体分别稀释到50μLOpti-MEM培养基中，轻轻混匀；同时将适量Lipo2000也稀释到50μLOpti-MEM培养基中，混匀，静置孵育5min；混合均匀以上两者，静置孵育20min；293T和PK15^CD163细胞用PBS洗净，加入500μLOpti-MEM培养基，向清洗后的细胞孔中滴加100μL上述转染混合物，轻轻摇动培养板，将其混合均匀；6h后换液，换成含有2％胎牛血清的维持培养基，继续培养24h后收细胞，进行双荧光素酶活性检测。

8.每孔加入1×Passive Lysis Buffer(用PBS稀释5×Passive Lysis Buffer)100μL，室温下水平摇床振荡30min使细胞充分裂解。取10μ细胞裂解液到96孔板中，先加入50μL萤火虫荧光素酶底物Luciferase Assay Substrate(使用Luciferase Assay BufferII稀释)，使用EnSpire多模式读板仪测定萤火虫荧光素酶活性值，记录并保存数据。再加入50μL海肾素荧光素酶底物1×Stop&Substrate(使用Stop&Buffer稀释50×Stop&Substrate，现用现配)，使用EnSpire多模式读板仪测定海肾素荧光素酶活性值，记录并保存数据。

9.用GraphPad Prism 10进行绘图和统计分析，数据用平均数±标准误表示，*<0.05为差异显著，**<0.01为差异极显著。

10.结果发现，在293T和PK15^CD163细胞中CCA单倍型对ACSL3基因启动子活性均显著低于GTC单倍型对ACSL3基因启动子的活性(图4)。

通过上述实验分析可以知道，对于本发明分子标记(序列表SEQ ID NO.1)而言CCA单倍型能够有效降低ACSL3的表达，对于调控ACSL3的表达具有重要作用。

实施例3

干扰ACSL3基因表达对抑制PRRSV增殖的影响

1.针对ACSL3基因不同干扰靶点各设计3条siRNA，如表5所示。

表5ACSL3基因siRNA序列

2.PK15^CD163细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的完全培养基进行培养，在37℃、5％CO₂培养箱生长至80～90％汇合度。传代至6孔细胞培养板中，显微镜下观察单层细胞汇合度达到70～80％时进行瞬时转染，转染参考Lipofectamine^TM2000试剂说明书。将NC和siRNA分别稀释到200μLOpti-MEM培养基中，轻轻混匀；同时将适量Lipo2000也稀释到200μL Opti-MEM培养基中，混匀，静置孵育5min；混合均匀以上两者，静置孵育20min；PK15^CD163细胞用PBS洗净，加入2mLOpti-MEM培养基，向清洗后的细胞孔中滴加400μL上述转染混合物，轻轻摇动培养板，将其混合均匀；6h后换液，换成含有2％胎牛血清的维持培养基，培养24h后再感染PRRSV 48h。

3.弃去细胞培养液，PBS洗涤细胞，吸净PBS，加入细胞裂解液(每孔200μL)，将细胞培养板放在冰上裂解30min，保证充分裂解。用细胞刮刀刮取裂解后的细胞，将其移入1.5mL离心管中，12000rpm/min离心10min，弃去粘性核酸物质，剩余的即为蛋白样品。在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸10min使蛋白变性，-20℃冰箱保存。

4.根据碧云天公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)说明书检测所有样品的蛋白浓度。

5.制备好聚丙烯酰胺凝胶后，将其移入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液。用移液器贴壁吸取样品，插至加样孔中缓慢加入样品。80V电泳30min，120V电泳1h后终止电泳，进行转膜。按照蛋白Maker大小将目的基因所在的区域切下，置于转膜液中。将PVDF膜切成和胶的大小一致，置于甲醇中浸泡3min，转膜液中浸泡5min。按照滤纸、胶、膜、滤纸的顺序夹在一起放入转膜槽中，250mA转膜1h。将膜置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭2h。封闭结束后，用TBST轻轻冲洗PVFD膜2次，置于稀释好的一抗中，4℃过夜孵育。一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次10min。室温下将膜在稀释后的二抗中孵育2h，TBST将膜洗涤3次，每次10min。将显影液A和B两种试剂等体积混合，加到膜上静置1min，放入化学发光成像分析仪中进行拍照保存。

6.用Image J对蛋白条带进行灰度值计算。用GraphPad Prism 10进行绘图和统计分析，数据用平均数±标准误表示，*<0.05为差异显著，**<0.01为差异极显著。

7.Western Blot结果显示，与NC组相比，转染ACSL3siRNA组ACSL3蛋白表达显著下调，PRRSV N蛋白水平随之显著下调(图5)。

由实施例1和2可以看出，在育种中，针对分子标记(序列表SEQ ID NO.1)选择CCA单倍时能够显著下调ACSL3蛋白的表达，进而提高PRRSV的抗性，在PRRSV感染时能促使PRRSV N蛋白水平随之显著下调，实现抗猪蓝耳病的作用。

基于以上，可以将本发明的分子标记用于猪的辅助育种，即抗蓝耳病猪的辅助育种。本领域技术人员可以基于本发明所公开的分子标记，通过对包含SEQ ID NO.1序列第1223位碱基、第1317位碱基或第1328位碱基之一片段的测序确定其基因型，或者通过特异性引物扩增相关序列，进行针对相关位点进行酶切再经凝胶电泳鉴别基因型。

在辅助育种时，选择本发明分子标记CCA单倍型的亲本进行繁育，选择包含CCA单倍型性状的子代。

Claims

1.一种检测ACSL3基因中与猪PRRSV抗病性相关的分子标记的方法在猪标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述分子标记为位于猪参考基因组第15号染色体上的第124741207位、第124741301位和第124741312位的SNP位点，所述124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变，检测这三个位点，这三个位点的CCA单倍型为优势单倍型，所述选择育种是猪抗蓝耳病品种的选育，所述猪参考基因组为Sscrofa11.1。

2.与猪PRRSV抗病性相关的候选基因组区域SNP的检测方法在猪标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：以待测猪基因组DNA为模板，通过PCR扩增ACSL3基因启动子区片段，对位于所述ACSL3基因启动子区的以下SNP位点的基因型进行鉴定：位于猪参考基因组第15号染色体上的第124741207位、第124741301位和第124741312位的SNP位点，所述124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变，所述三个位点的CCA单倍型为优势单倍型，所述选择育种是猪抗蓝耳病品种的选育，所述猪参考基因组为Sscrofa11.1。

3.用于特异性扩增待测猪ACSL3基因启动子区与猪PRRSV抗病性相关的SNP位点并鉴定相应位点基因型的引物或含有所述引物的试剂盒在猪标记辅助选择育种中的应用，所述SNP位点为位于猪参考基因组第15号染色体上的第124741207位、第124741301位和第124741312位的SNP位点，述124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变，所述三个位点的CCA单倍型为优势单倍型，所述选择育种是猪抗蓝耳病品种的选育，所述猪参考基因组为Sscrofa11.1。

4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，其引物的序列为序列表SEQ ID No.2、3所示的序列。

5.一种猪抗蓝耳病品种的选育方法，其是选择猪参考基因组第15号染色体上124741207位的SNP位点为G>C突变，124741301位的SNP位点为C>T突变，124741312位的SNP位点为A>C突变，选这三个位点的CCA单倍型猪进行选育，所述猪参考基因组为Sscrofa11.1。