CN118995558A - 可降解甲基汞的胶红酵母菌株的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可降解甲基汞的胶红酵母菌株的选育方法，属于生物技术技术领域。通过野外采样和定向筛选获得了安全且具有高甲基汞抗性与甲基汞去除降解能力的胶红酵母菌株，在富集培养基中添加甲基汞的方法、得到耐甲基汞的天然胶红酵母菌株。本发明发现并确定胶红酵母菌株对甲基汞的代谢功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，涉及一种可降解甲基汞的胶红酵母菌株及其选育方法。
背景技术
高毒性甲基汞是当前环境中严重威胁人类健康的一种汞污染物，截止2021年，全球每年因甲基汞摄入导致死亡人数高达29000人，直接经济损失超过1179亿美元。汞污染的修复方法有传统的物理、化学和生物修复。土壤中汞的物理、化学修复方法有改土、热脱附法、淋洗法、化学法、稳定化固化法等，水环境中汞污染修复手段有絮凝、活性炭吸附、离子交换、化学还原、膜过滤等，这些方法都能有效去除水环境中的汞污染。然而这些传统的修复手段具有成本效益低、材料回收与再生困难，易造成二次污染等缺陷，无法适应当前社会绿色化、低碳化的可持续发展需求。
生物修复是利用生物体(细菌、藻类、真菌、植物)的催化能力、酶(粗或纯化提取物)及其生物质化合物或其他衍生物用于受污染介质中吸收、降解或转化无机或有机汞，从而消除、灭活或减弱这些Hg的环境影响。微生物具有繁殖能力强，生长迅速，比表面积高等诸多优势，与其他生物体相比，微生物修复是一种具有极高成本效益，符合当前社会绿色、低碳的可持续发展需求的甲基汞治理手段，但当前已有的用于甲基汞修复的微生物资源多存在生物安全性低、甲基汞降解能力较低等方面的问题，这也使得开发安全的、可高效降解甲基汞的微生物资源成为汞污染生物治理亟待解决的关键核心问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有的技术存在的上述问题，提供一种可降解甲基汞的胶红酵母菌株的选育方法，发现并确定胶红酵母菌株对甲基汞的代谢功能。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种可降解甲基汞的胶红酵母菌株，其特征在于，通过野外采样和定向筛选获得了安全且具有高甲基汞抗性与甲基汞去除降解能力的胶红酵母Rm4。
在富集培养基中添加甲基汞的方法、得到耐甲基汞的天然胶红酵母菌株。
检测甲基汞对所得胶红酵母菌株的最小抑菌浓度与最小致死浓度，为胶红酵母菌株在进行甲基汞降解应用提供依据。
传统物理及化学的甲基汞修复手段有成本效益低、材料回收与再生困难，易造成二次污染等缺陷，无法适应当前社会绿色化、低碳化的可持续发展需求。而已知的具有甲基汞降解功能的微生物多为恶臭假单胞菌、亚硒酸盐还原菌等，他们都存在生物安全性低，甲基汞抗性与降解效率低等方面问题，因此，在甲基汞治理领域的应用中受到严重限制。
附图说明
图1是野生菌株ITS序列鉴定胶图。
图2是株红色菌株的ITS序列比对图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
YPD培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨和葡萄糖，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖；自然pH。
固体培养基由添加20g/L琼脂粉制成，其余成分以及浓度与液体培养基相同。
实施例1、野外样品采集与野生胶红酵母菌株的分选鉴定
一、野外样品采集与菌体富集
1.1、野外样品采集
本研究的样品在2023年3月到2022年11月之间采集，主要来自于自然森林环境(树皮、土壤、树叶、树枝、果实、腐木等)。所采集的森林环境来源的样品需要富集培养，将样品采集于15mL离心管中，采集的样品总量在离心管的8mL刻度以下。
1.2、菌体富集
向装有采集样品的离心管中加入YPD液体富集培养基(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物、200μg/mL氯霉素、终浓度为1mg/L的甲基汞)到13mL刻度左右，28℃静置培养3天左右。富集过程中，保持培养基浸润基物，敲击管壁，反转管身，排出基物中的气泡，以免影响后续观察和诱发霉菌的生长。根据产生的气泡数量调整培养时间和稀释梯度，富集结束后可以按照10-1到10-6间选择三个合适的梯度，吸取100μL富集后培养液，稀释到适当稀释倍数，吹匀后均匀涂布在含有氯霉素的YPD固体培养基上，在28℃培养箱内静置培养2-3天。
二、野生胶红酵母菌株的分选与鉴定
2.1、野生胶红酵母菌株的分选
选择稀释梯度最合适的平板，一般整个平板上单菌落总数量为30-300个左右为宜。常见的胶红酵母菌落形态为橘红色或红色，表面带有油光，边缘光滑的单菌落，但是自然界的酿酒酵母形态变化较多，也有一些会展现为褶皱状或者絮状的单菌落，外观不同的菌落鉴定后也可能为同种菌株。在挑选单菌落时，主要选择光滑、橘红色或红色的单菌落，同时保证每个平板上不同菌落形态的单菌落至少要选择一个以上。每个样品依据平板上菌落的多样性挑选适量的单菌落，挑取3株以上，划线到YPD固体培养基上培养2天后鉴定。
2.2、野生胶红酵母菌株ITS序列的PCR
挑取划线所得的单菌落溶解于装有3mL的YPD培养基的试管，置于摇床中28℃，220rpm条件下培养24h。吸取20μL培养的菌液加入装有20μL浓度为10mmol/L的NaOH溶液的PCR管中，98℃加热15分钟后，放在冰上降温，获得用于PCR的DNA模板，取500μL的剩余新鲜菌液加入装有500μL 60％甘油的冻存管中记录好编号，-80℃保存。使用NL14引物(D1/D2区)与ITS14(ITS区)引物对上一步得到的DNA模板进行分子鉴定。具体反应体系、PCR程序和引物信息如下：
反应体系：普通2x PCR Mix 11μL，无菌水11μL，模板1μL，正反引物各1μL。引物信息如下：
ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC
2.3、PCR反应产物的电泳检测与测序
制备1％的琼脂糖凝胶，吸取2μL PCR扩增原液置于点样孔，电泳仪调整电压至280V，电泳时间为20min。电泳后用溴化已锭浸泡染色30min以上，观察琼脂糖凝胶在紫外灯照射下的成像，参照maker与目标片段长度(ITS片段大小均为600bp左右)，初步判断是否扩增出所需片段。所得检测合格的剩余样品PCR扩增原液送交测序公司(擎科生物)，使用自动测序仪获得供试菌株的PCR扩增片段。
实施例2、野生胶红酵母菌株对甲基汞的抗性
一、甲基汞最小抑菌浓度测定(MIC)
由于前期菌株筛选的过程中采用的甲基汞添加浓度为1mg/L，因此，最小抑菌浓度实验选取的最小甲基汞添加浓度为1mg/L。将平板上的胶红酵母单菌落挑入装有3ml的YPD培养基的试管中，于28℃、200rpm条件下摇床活化24h，取30μL活化好的菌液转接至3ml的YPD培养基中，于28℃、200rpm条件下摇床培养24h。以1％的接菌量将菌液接入分别含有0mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，5mg/L，6mg/L，7mg/L，8mg/L，9mg/L，10mg/L甲基汞的YPD培养基中，另添加未接入菌液的YPD培养基的对照组，于28℃、200rpm条件下摇床培养24h，OD600与对照组接近的最小甲基汞添加量即为甲基汞对胶红酵母的最小抑菌浓度。
二、甲基汞最小杀菌浓度测定(MBC)
取10μL上述高于最小抑菌浓度添加量的实验样品涂至YPD固体平板上于28℃培养箱静置培养48h后，菌落数少于5个的最低甲基汞添加浓度即为甲基汞对胶红酵母的最小杀菌浓度。
根据上述测定方法测定甲基汞对筛选得到的4株胶红酵母野生菌株的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度进行测定，结果如下表所示，Rm4对甲基汞的抗性最强，甲基汞对其最小抑菌浓度为3mg/L，最小致死浓度为6mg/L。
表甲基汞对不同胶红酵母菌株的最小抑菌浓度与最小致死浓度
实施例3、胶红酵母菌株Rm4对甲基汞的去除与降解
一、胶红酵母甲基汞孵育样品制备
1.1胶红酵母菌体孵育培养
吸取30μL保藏的胶红酵母甘油菌液接入装有3ml的YPD培养基的试管中，于28℃、200rpm条件下摇床活化24h，取500μL活化好的菌液转接至50ml的YPD培养基中，于28℃、200rpm条件下摇床培养24h。将制备好的菌液摇匀分装至无菌的大试管中，每支4.9mL，分别加入总体积为100μL的不同浓度的甲基汞溶液，使得整个体系的甲基汞终浓度分别为0.1mg/L，1mg/L和5mg/L，28℃、200rpm条件下摇床孵育24h或48h。
1.2待测样品收集
利用高速离心机5000×g离心5min富集菌体，保留上清液；取5mL PBS溶液重悬洗涤菌体，5000×g离心5min富集菌体，分别保留上清液和菌体。
二、不同样品甲基汞含量测定
2.1样品处理
用1mL 25％KOH/CH3OH重悬细胞后倒入消解管中，随后向1.5mL离心管中加入1mL25％KOH/CH3OH，涡旋5s，将溶液倒入消解管中，重复4遍，最后向消解管中加入5mL 25％KOH/CH3OH。取300μL培养基至消解管中，随后加入10mL 25％KOH/CH3OH。将上述样品置于石墨消解仪上，95℃消解150min后，将消解液转移至15mL离心管中，并用甲醇定容至10mL，向40mL棕色样品瓶中加入36mL超纯水(Milli-Q)后，移取300μL消解液于样品瓶中，加入0.3mL2mol/L醋酸缓冲液和50μL1％NaBEt4后迅速用超纯水补满样品瓶，拧紧瓶盖。运用全自动烷基汞分析仪测定样品中的甲基汞，通过标准曲线进行浓度计算。培养基与洗脱液中的甲基汞也采用全自动烷基汞分析仪测定与计算。
甲基汞标准曲线制作：将甲基汞标准品(德国DR.E hrenstorfer公司)溶解于甲醇中，配制成浓度分别为0mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的标准溶液，每浓度设三个重复，采用全自动烷基汞分析仪测定不同浓度相应的峰面积，通过甲基汞浓度与峰面积的平均值绘制标准曲线
甲基汞(mg/L)＝(峰面积+32766)/53791
结果如表所述，胶红酵母对低、中、高三种不同浓度的甲基汞条件下，甲基汞去除率均超过80％，转化率超过30％，其中100μg/L浓度甲基汞条件下孵育48小时后，甲基汞的转化率达到了95.63％，去除率达到了98.97％。
表100μg/L甲基汞孵育条件下的转化与去除
表1mg/L甲基汞孵育条件下的转化与去除
表5mg/L甲基汞孵育条件下的转化与去除
本项目中所筛选到的具备高浓度甲基汞抗性与高效甲基汞去除与转化能力的胶红酵母，可以在5mg/L的甲基汞浓度的环境中维持较强的甲基汞代谢水平，具有重要的应用前景。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (5)
1.一种可降解甲基汞的胶红酵母菌株的选育方法，其特征在于，野外采集和富集培养得到胶红酵母菌株群，利用在富集培养基中添加甲基汞的方法得到耐甲基汞的所述胶红酵母菌株。
2.一种胶红酵母菌株的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的胶红酵母菌株进行甲基汞的降解。
3.根据权利要求2所述的胶红酵母菌株的应用，其特征在于，检测甲基汞对权利要求1所述的胶红酵母菌株的最小抑菌浓度与最小致死浓度，为所述胶红酵母菌株在甲基汞降解应用提供依据。
4.根据权利要求2所述的胶红酵母菌株的应用，其特征在于，在小于甲基汞最小致死浓度的情况下利用所述胶红酵母菌株对甲基汞进行降解。
5.根据权利要求2所述的胶红酵母菌株的应用，其特征在于，在小于甲基汞最小抑菌浓度的情况下利用所述胶红酵母菌株对甲基汞进行降解。
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