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CN118574641A - 用于制备靶向偶联物的亲水性四嗪官能化的负载物 - Google Patents

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CN118574641A CN202280089515.6A CN202280089515A CN118574641A CN 118574641 A CN118574641 A CN 118574641A CN 202280089515 A CN202280089515 A CN 202280089515A CN 118574641 A CN118574641 A CN 118574641A
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C·克勒
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Abstract

本发明涉及官能实体(负载物)与靶向剂的生物偶联领域，其中一个或多个负载物分子与靶向剂，例如单克隆抗体偶联，其中靶向剂特别是生物靶向剂，例如抗体药物偶联物(ADC)。更特别地，本发明涉及新型亲水性四嗪分子及其制备，所述四嗪允许负载物分子与靶向剂如单克隆抗体更有效地缀合。本发明还涉及用于制备相应官能化的负载物分子的特定四嗪中间体。本发明还涉及各种的偶联物(特别是生物偶联物)及其制备方法。本发明还涉及本发明的这些偶联物在医学中的用途、相应的药物组合物以及相应的诊断和分析试剂盒。

Description

用于制备靶向偶联物的亲水性四嗪官能化的负载物
技术领域
本发明涉及官能实体(负载物)与靶向剂的生物偶联领域，其中一个或多个负载物分子与靶向剂，例如单克隆抗体偶联，其中靶向剂特别是生物靶向剂，例如抗体药物偶联物(ADC)。更特别地，本发明涉及新型亲水性四嗪分子及其制备，所述四嗪允许负载物分子与靶向剂如单克隆抗体更有效地偶联。本发明还涉及用于制备相应官能化的负载物分子的特定四嗪中间体。本发明还涉及各种的偶联物(特别是生物偶联物)及其制备方法。本发明还涉及本发明的这些偶联物在医学中的用途、相应的药物组合物以及相应的诊断和分析试剂盒。
背景技术
ADC是一个备受关注的快速增长的肿瘤治疗类别，这反映在数量日益增长的获批准的ADC药物和越来越多的临床试验中。
各负载物与单克隆抗体(mAb)的所需偶联通常通过随机连接来完成。这通常导致现有ADC种类的非均质性，并且药物与抗体的比率(DAR)从完全未修饰的单克隆抗体到不利的大量连接的细胞毒性分子不等，这导致批次间差异的问题，并可能导致聚集和伴随的副作用，如快速清除、免疫原性或肝毒性。
克服这些限制的解决方案是通过位点特异性偶联方法生产均质ADC/放射免疫偶联物(RIC)。位点特异性连接方法为严格控制DAR、药物代谢动力学特性和生产均匀批次的给药药物提供了可能性。这也导致治疗指数的改善，因为消除了不希望的ADC种类的副作用。
每个ADC的另一个重要组成部分是用于连接负载物的接头。
通常，不可裂解的接头(仅在经蛋白酶体降解后释放载荷)和可裂解的接头(通过酶促、还原或酸性裂解释放母体药物)之间存在差异。此外，接头化学也影响实际释放的活性代谢物的性质。例如，亲水性的增加导致跨膜扩散速率的降低和细胞内滞留的增加，以及对癌细胞多药耐药机制的敏感性降低。
发明人已经报道了将用于点击反应的应变环辛烯-赖氨酸衍生物基因编码到蛋白中(T.Plass,S.Milles,C.Koehler,C.Schultz,E.A.Lemke,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3878-81)，并报道了可以与1,2,4,5-四嗪进行(应变促进)逆电子需求Diels-Alder环加成(IEDDA)的ncAA的合成和基因编码(T.Plass,S.Milles,C.Koehler,J.Szymański,R.Mueller,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4166-70；I.T.Plass,O.Schraidt,J.Szymański,J.A.G.Briggs,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,2245-9；E.Kozma,I.B.R.Varga,I.V.Aramburu,J.H.Kang,et al.,ChemBioChem 2016,17,1518-24；J.-E.Hoffmann,T.Plass,I.I.V.Aramburu,C.Koehler,et al.,Chem.Eur.J.2015,21,12266-70)。该GCE技术的扩展导致将这样的ncAA位点特异性地引入昆虫细胞产生的非糖基化免疫球蛋白中，并随后通过上述点击化学进行修饰(C.Koehler,P.F.Sauter,M.Wawryszyn,G.E.Girona,K.Gupta,et al.,Nat.Methods 2016,13,997-1000.)。
Mao等人在Angew.Chem Int Ed(2019),58,1106中描述通过含巯基促进剂进行不对称1,2,4,5-四嗪的有机催化和可放大的合成。特别地，通过应用3-巯基丙酸作为催化剂，在乙醇溶液中使2种不同的腈离析物与水合肼反应，然后用亚硝酸钠氧化，合成了一系列不对称取代的1,2,4,5-四嗪衍生物。一种特定的化合物是1,2,4,5-四嗪衍生物，其1位被甲基膦酸酯基团取代，6位被甲基取代。该膦酸酯前体通过Horner-Wadsworth-Emmons反应进一步衍生化以引入含有不同反式烯烃部分的侧链。
US2019247513A1公开了四嗪化合物和能够与所述四嗪进行逆电子需求DielsAlder反应的亲双烯体，以及它们在生物正交药物活化中的用途。特别地，化合物333和14.5至14.7涉及负载荧光负载物的四嗪衍生物，其通过各种化学性质的间隔子与四嗪核心间隔开，如基于芳基或肽基或烷基的间隔子以及基于聚氧烷基的亲水基团。
WO2020256544A1涉及以高点击偶联产率为特征的取代四嗪(tetrazine)。tartrazine核心连接到基于吡啶基的间隔子上，其本身通过戊二酰基(glutarly)连接到负载物R87(如细胞毒性药物)和/或聚氧烷基亲水基团上。
Mao等人(Angew.Chem Int Ed(2021),60 2393-2397)以及WO2020239039A1公开了四嗪化合物，其中能够形成化学键的亲水或化学部分(例如羧基、羟基或基于磷酸酯的基团)被基于烷基的间隔子与四嗪核心隔开。在这方面，Mao等人还描述了化合物，其中所述能够形成化学键的亲水或化学部分被荧光基团替代。
Shainyan,B.A等人(CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE,COLUMBUS,OHIO,US；Database accession no.1983:453711)涉及具有烷基砜基团作为对位取代基的四嗪。
WO2014081301A1公开了四嗪，其中四嗪核心通过基于芳基的间隔子连接到能够形成化学键的各种亲水或化学部分。
Oller-Salvia等人(Angew.Chem Int Ed(2018),57 2831-2834)涉及抗体药物偶联物领域，并公开了一种构建体，其中曲妥珠单抗通过逆电子需求Diels–Alder环加成而位点选择性地偶联至四嗪修饰的单甲基奥利斯他汀E(MMAE)。用于所述位点特异性偶联的四嗪柄由连接至四嗪核心的芳基部分组成。
Handula等人(Molecules 2021,26,4640)涉及在预靶向策略中使用生物正交反应，例如IEDDA反应。其公开了各种四嗪替代物作为合适的双烯，这些双烯的特征在于存在具有烷基和/或芳基间隔子的对位取代的四嗪核心。该公开的图2涉及基于各自的反应性对所述四嗪替代物的分类。
需要进一步改进1,2,4,5-四嗪衍生物，其允许1,2,4,5-四嗪官能化的负载物分子通过生物正交反应更有利地偶联到相应官能化的靶向分子上。特别地，需要进一步改进1,2,4,5-四嗪衍生物，其允许上述生物正交反应通过应变促进的逆电子需求Diels–Alder环加成(SPIEDAC)进行，而在任选缓冲的水环境中没有更大的空间位阻。更特别地，需要这样的四嗪衍生物，由于其增加的亲水性，其允许更多疏水负载物的偶联，并且在药理活性偶联物的情况下，这样的偶联物在体内提供更好的功能特征。
发明内容
上述问题令人惊讶地通过提供1,2,4,5-四嗪官能化的负载物分子而得到解决，所述官能化的负载物分子携带作为四嗪C取代基的小亲水基团(例如膦酸酯残基)。本发明能够在水性缓冲液中通过SPIEDAC容易地使用负载物进行生物正交生物偶联，而不需要可能破坏性的添加有机溶剂，因此可以使用敏感的生物试剂。这也有助于防止聚集并提高所形成的生物偶联剂的溶解度。由于其相对较小的尺寸，与较大的增溶单元(如PEG、糖苷等)相比，它不应表现出太多的空间位阻，并且允许连接最小尺寸的负载物。例如，偶联物中不一定需要大体积的PEG接头，这反过来又允许减小最终负载物或相应靶向偶联物的大小。在相同条件下，基于相应甲基四嗪基团的更小的负载物不能与抗体偶联。还观察到，以要求保护的方式增加亲水性允许提供与改善的药物动力学相关联的偶联物，特别是ADC，同时四嗪的亲水基团的较小尺寸使整个负载物被抗体更好地遮盖。
更特别地，通过提供携带膦酸酯基团的四嗪衍生物解决了上述问题，所述衍生物进一步携带允许与负载物分子偶联的化学部分，例如通过酰胺偶联或形成氨基甲酸酯。相应的四嗪官能化的负载物分子如下文所述的通式I所示；相应的四嗪官能化的中间体如下文所述的通式II所示。
附图说明
图1：TCO衍生物(位点特异性掺入在mAb中)与1,2,4,5-四嗪的IEDDA。
图2：曲妥珠单抗(Trastuzumab)A132TCO*-5的纯化：A：Superdex S200运行，B：对S200运行的第10-20级分进行考马斯染色的SDS-PAGE分析
图3：曲妥珠单抗A132TCO*-11的纯化：Superdex S200运行，B：对S200运行的第10-20级分进行考马斯染色的SDS-PAGE分析
图4：细胞毒性试验；显示的是曲妥珠单抗-5(＝化合物5)、曲妥珠单抗-11(＝化合物11)和曲妥珠单抗WT的测量结果。
具体实施方式
A.缩写
ADC＝抗体药物偶联物
APC＝抗体负载物偶联物
aq.＝水溶液
Bps＝碱基对
BCN＝2-氨基-6-(9-双环[6.1.0]壬-4-炔基甲氧基羰基氨基)己酸
BOC＝2-氨基-6-(叔丁氧羰基氨基)己酸，在实施例中“BOC”特指(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧羰基氨基)己酸＝Boc-L-Lys-OH＝N-α-叔丁氧羰基-L-赖氨酸
conc.＝浓缩的
DAR＝药物抗体比率
DCM＝二氯甲烷
DDQ＝2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌
DIPEA＝N,N-二异丙基乙胺
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
EDC＝1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺
eq.＝当量
EtOH＝乙醇
GCE＝遗传密码扩展
h＝小时
HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐，偶联剂
HOBt＝羟基苯并三唑
IEDDA＝逆电子需求Diels–Alder环加成
kDa＝千道尔顿
min＝分
MMAE＝单甲基奥利斯他汀E((S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲氨基)丁酰胺)丁酰胺)，抗肿瘤剂
MeOH＝甲醇
ncAA＝非典型氨基酸
NES＝核输出信号
NLS＝核定位信号
O-tRNA＝正交tRNA
O-RS＝正交RS
PBS＝磷酸盐缓冲盐水
PMSF＝苯甲基磺酰氟
PNP氯甲酸酯＝4-硝基苯基氯甲酸酯
POI＝目标多肽，
pRS＝原核RS
ptRNA＝原核tRNA
PylRS＝吡咯赖氨酰tRNA合成酶
PylRSAF＝包含氨基酸取代Y306A和Y384F的突变体M.mazei吡咯赖氨酰tRNA合成酶
RCF(rcf)＝相对离心力
RP-HPLC＝反相高效液相色谱
RS＝氨酰tRNA合成酶
RT＝室温/环境温度(20–25℃)
SCO＝2-氨基-6-(环辛-2-炔-1-基氧羰基氨基)己酸
SDS-PAGE＝十二烷基(sodecy)硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SPIEDAC＝应变促进的逆电子需求Diels–Alder环加成
5-TAMRA＝5-羧基四甲基罗丹明
5-TAMRA-OSu＝5-羧基四甲基罗丹明N-琥珀酰亚胺酯，荧光团
TCO＝反式环辛烯
TCO-Lys＝N-ε-((反式-环辛-4-烯-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸
TCO*-Lys＝N-ε-((反式-环辛-2-烯-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸
TCO#-Lys＝N-ε-((反式-环辛-3-烯-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸
TCO-E-Lys＝N6-((((R,E)-环辛-4-烯-1-基)氧基)羰基)-L-赖氨酸
TCO*A-Lys＝N6-((((S,E)-环辛-2-烯-1-基)氧基)羰基)-L-赖氨酸
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
TLC＝薄层色谱
tRNAPyl＝可以用吡咯赖氨酸通过野生型或修饰的PylRS进行酰化的tRNA，并且具有反密码子(用于将ncAA位点特异性掺入POI)，该反密码子优选是选择性密码子的反向互补物。
UNAA＝非天然氨基酸，ncAA的同义词
U6启动子＝正常情况下控制哺乳动物细胞中U6RNA(一种小核RNA)表达的启动子
UHPLC-MS＝超高效液相色谱/质谱
B.定义
B.1一般定义
除非本文另有定义，否则与本发明相关的科技术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应是清楚的，但是，如果有任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
如本文所用，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指以下状态：不含与本发明的化合物在其天然状态下通常与之相关联的化合物不同、不相似的化合物，使得“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”对象包含给定样品重量的至少0.5％、1％、5％、10％或20％，或至少50％或75％重量。在一实施方案中，这些术语是指包含给定样品重量的至少95、96、97、98、99或100％重量的本发明的化合物。如本文所用，当提及核酸或蛋白时，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”也指不同于天然存在的纯化或浓缩状态，例如在原核或真核环境中，例如在细菌或真菌细胞中，或在哺乳动物生物体中，尤其是人体中。任何高于自然发生的纯化或浓缩程度，包括(1)从其它相关结构或化合物中纯化，或(2)与在所述原核或真核环境中通常不相关的结构或化合物相关联，都属于“分离的”。本文所述的核酸或蛋白或核酸类别或蛋白类别可以根据本领域技术人员已知的多种方法和程序被分离，或与它们在自然界中通常不相关的结构或化合物相关联。
在本文提供的描述和所附权利要求的上下文中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。
类似地，“包含”和“包括”是可互换的，而并非意在限制。
还应当理解，在各实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方案可以替代地使用语言“基本上由......组成”或“由......组成”来描述。
术语“一种(个)或多种(个)”或类似术语“至少一种(个)”是指例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
当公开数值范围的下限和上限时，具体公开了落入该范围内的任何数值和包含的任何范围，包括其上限和下限。具体而言，本文公开的每个数值范围应被理解为是指落入更宽范围内的每个数值和更窄范围。
术语“大约”表示所述值的±25％的潜在变化，特别是±15％、±10％，更特别是±5％、±2％或±1％。
术语“基本上”描述约80至100％的数值范围，例如85-99.9％，特别是90至99.9％，更特别是95至99.9％，或98至99.9％，尤其是99至99.9％。
“主要地”是指在高于50％的范围内的比例，例如在51至100％的范围内，特别是在75至99.9％的范围内；更特别是85至98.5％，如95至99％。
如果本公开涉及不同偏好程度的特征、参数及其范围(包括一般的、未明确优选的特征、参数及其范围)，则除非另有说明，否则两个或多个这样的特征、参数及其范围的任何组合，无论它们各自的偏好程度如何，都包含在本说明书的公开内容中。
B.2化学定义
术语卤素在每种情况下表示氟、溴、氯或碘基团，特别是氟基团。
“烷基”是指具有1至6个，特别是1至4个或1、2或3个碳原子的直链或分支烷基基团。实例包括甲基、C1-C4烷基残基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基；正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基；正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。
“低级烷基”是指具有1、2、3或4个、特别是1或2个碳原子的直链或分支烷基基团。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基。
“烯基”是指包含单个化学碳-碳双键的具有2、3、4、5或6个碳原子的单不饱和烃基，例如乙烯基、烯丙基(2-丙烯-1-基)、1-丙烯-1-基、2-丙烯-2-基、甲基烯丙基(2-甲基丙-2-烯-1-基)等。
“低级烯基”是指包含单个化学碳-碳双键的具有2、3或4个碳原子的单不饱和烃基，例如乙烯基、烯丙基(2-丙烯-1-基)、1-丙烯-1-基、2-丙烯-2-基、甲基烯丙基(2-甲基丙-2-烯-1-基)等。
“炔基”和“低级炔基”与上述烯基或低级烯基类似，“炔基”和“低级炔基”表示包含单个化学碳-碳三键的单不饱和烃基。
“亚烷基”是指具有1至6个、特别是1至4个碳原子的直链或分支亚烷基。实例包括亚甲基、亚乙基、1,2-亚乙基、1,3-亚丙基、亚异丙基；1-4-亚丁基、1-5-亚戊基1-6-亚己基及其各自的分支类似物。
“低级亚烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或分支亚烷基。实例包括亚甲基、亚乙基，1,2-亚乙基、1,3-亚丙基、亚异丙基、1-4-亚丁基及其各自的分支类似物。
“烷氧基”是指式R-O-的基团，其中R是如上所定义的具有1至6个、特别是1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支烷基基团。非限制性实例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
“亚烷基氧基(alkyleneoxy)”是指式-R-O-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支亚烷基。
“低级亚烷基氧基”是指式-R-O-的基团，其中R是具有1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支低级亚烷基。实例包括亚甲基氧基、亚乙基氧基、1,2-亚乙基氧基、1,3-亚丙基氧基、亚异丙基氧基和1-4-亚丁基氧基。
“聚亚烷基氧基(polyalkyleneoxy)”是指包含至少两个(例如2至20个、2至15个、2至10个或2至5个)重复单元的部分，所述重复单元是共价连接的相同或不同(特别是相同的)具有至少两个碳原子的如上所定义的低级亚烷基氧基的重复单元。特别是具有2至20个、2至15个、2至10个或2至5个相同重复单元的亚乙基氧基和亚丙基氧基。
“烯氧基”是指式R-O-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支烯基。
“烷酰氧基”是指式R-(CO)-O-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支烷基基团。
“烷氨基羰氧基”是指式R-NH-(CO)-O-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个或1至3个碳原子的如本文所定义的直链或分支烷基基团。
“烷硫基”是指式R-S-的基团，其中R是具有1至4个、优选1至3个碳原子的如本文所定义的烷基基团。
“烷氨基”是指式R-NH-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个碳原子的如本文所定义的烷基基团。实例包括甲氨基、乙氨基、正丙氨基、异丙氨基、正丁氨基、2-丁氨基、异丁氨基、叔丁氨基等。
“二烷基氨基”是指式RR’N-的基团，其中R和R’各自独立地是具有1至6个、特别是1至4个碳原子的如本文所定义的烷基基团。实例包括二甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-乙基氨基等。
“烯基氨基”是指式R-NH-的基团，其中R是具有2至6个、特别是2至4个碳原子的如本文所定义的烯基基团。实例包括乙烯基氨基、烯丙基氨基(2-丙烯-1-基-氨基)、1-丙烯-1-基-氨基、2-丙烯-2-基-氨基、甲基烯丙基氨基(2-甲基丙-2-烯-1-基-氨基)等。
“N-烷基-N-烯基氨基”是指式RR’N-的基团，其中R是具有1至6个、特别是1至4个碳原子的如本文所定义的烷基基团，R’是具有2至6个、特别是2至4个碳原子的如本文所定义的烯基基团。实例包括N-甲基-N-乙烯基氨基、N-甲基-N-烯丙基氨基(N-甲基-N-2-丙烯-1-基氨基)、N-甲基-N-1-丙烯-1-基氨基、N-甲基-N-2-丙烯-2-基氨基、N-甲基-N-甲基烯丙基氨基(N-甲基-N-2-甲基丙-2-烯-1-基氨基)等。
“二烯基氨基”是指式RR’N-的基团，其中R和R’各自独立地是具有2至6个、特别是2至4个碳原子的如本文所定义的烷基基团。实例包括二乙烯基氨基、二烯丙基氨基(二(2-丙烯-1-基)氨基)、N-乙烯基-N-烯丙基氨基等。
“芳基”是指单价单环或多环芳族部分，特别是具有6至14个环碳原子的部分，特别是苯基、芴基、萘基和菲基。
“亚芳基”是指上述芳基的二价类似物，特别是1,2-、1,3-和1,4-亚苯基，
“卤素”是指F、Cl、Br或I；
除非另有说明，术语“取代基”选自卤素、C1-C4烷基、CN、CF3、羟基、-O-CF3、C1-C4烷氧基、C2-C4烷酰氧基、C1-C4烷氨基羰基氧基和C1-C4烷硫基；羧基和羧基-C1-C4烷基。
除非另有说明，术语“取代的”是指基团被1、2或3个、尤其1或2个取代基取代。
“连接子”在本发明的化合物的两个相邻结构基元之间形成，除非另有说明，否则是化学键，或者选自醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物(alkylene oxide)或任何可能方向的直链或分支聚亚烷基氧化物(polyalkyleneoxide)连接子。
“醚”连接子含有至少一个以下类型的基团:(-O-)。
“硫醚”连接子含有至少一个以下类型的基团:(-S-)。
“酰胺”连接子含有至少一个以下类型的基团:-C(＝O)N(R)-或–(R)N-C(＝O)-。
“氨基甲酸酯”连接子含有至少一个以下类型的基团:-O-C(＝O)-N(R)-或-N(R)-C(＝O)-O-。
“二氨基甲酸酯”连接子含有至少一个以下类型的基团:
-N(R)-C(＝O)O-R’-OC(＝O)-N(R)-
“碳酸酯”连接子含有至少一个以下类型的基团:-C(＝O)O-、–O-C(＝O)-、–O-C(＝O)O-或–O-C(＝O)-O-。
“肼”连接子含有至少一个以下类型的基团:-NH-NH-
“脲”连接子含有至少一个以下类型的基团:-N(R)-C(＝O)-N(R)-
“亚烷基氧化物”连接子含有至少一个以下类型的基团:-((CH2)n-O)-或-(O-(CH2)n)-，其中n＝1、2、3或4，特别是1或2。
“聚亚烷基氧化物”连接子含有相同或不同亚烷基氧化物基团的重复单元，所述亚烷基氧化物基团如上所定义，并且可以是直链或分支的，特别是直链的；例如-((CH2)n-O)m-或-(O-(CH2)n)m-，其中n＝1、2、3或4，特别是1或2；并且m＝2至20、2至15、2至10或2至5。
在上述特定连接子化学式中，残基R各自独立地表示H或低级烷基、低级烯基或低级烯基，特别是甲基或乙基；R’表示低级亚烷基或低级亚烯基；特别是亚甲基或亚乙基。
“可裂解基团”包括任何可被酶或化学裂解的基团，特别是在体内或体外条件下；酶促裂解可以通过例如蛋白酶的作用来实现；化学裂解可以通过例如S-S键的水解裂解或还原裂解来实现。
除非另有定义，根据本发明的“四嗪”基团表示由含有四个氮原子的六元芳环(分子式为-C2N4-)组成的残基，特别是衍生自1,2,4,5-四嗪或s-四嗪异构体，并通过3和6位的环碳与相邻基团相连。
“四嗪反应性基团”是能够与本文定义的四嗪基团进行化学反应(特别是通过所谓的“生物正交”或“点击反应”)的化学部分。特别地，这样的四嗪反应性基团选自亲双烯体。更特别地，其选自能够在生物环境中与四嗪基团反应的亲双烯体。作为非限制性实例，可以提及异腈基、降冰片烯基、双环壬炔基、环辛烯基、环辛炔基(cyclooctinyl)、环丙烯基、环丁炔基和螺己烯基及其立体异构体、烯基或烯丙基或二氢氮杂环丁二烯基。
“四嗪连接”是指反式环辛烯和s-四嗪在逆需求Diels Alder反应中的反应，随后是逆Diels Alder反应以消除氮(N2)。这样的类型的反应快速进行，允许在极低的浓度下进行生物分子修饰。
本文所述的化合物可以含有一种或多种不对称元素，例如立体中心、立体轴等，例如不对称碳原子，使得化合物可以以不同的立体异构形式存在。这些化合物可以是例如外消旋体或光学活性形式。包括纯化和混合物形式的所有立体异构体、非对映异构体、Z-和E-形式。因此，当以特定名称叙述一种化合物或叙述一类化合物时，所有这些形式都应包括在内。
本文所述的化合物也可以以一种以上的结构异构体形式存在，也称为构型异构体或区域异构体。这些分子的不同之处仅在于它们的原子或原子团的顺序不同，但具有相同的总分子式。
因此，除非另有说明，对于本文所述的每种化合物、生物分子和偶联物，任何这种潜在的立体或区域异构体形式或多于一种立体和/或区域异构体形式的混合物都在本发明的范围内。
“逆电子需求Diels–Alder(IEDDA)环加成”是缺电子双烯和富电子亲双烯体之间的反应，仅代表不同类型“生物正交反应”的一个例子。所用的双烯可以是1,2,4,5-四嗪或1,2,4-三嗪。亲双烯体包括各种分子，包括应变环烯烃，例如反式环辛烯(TCO、降冰片烯、环丙烯或氮杂环丁烯。其中，四嗪和TCO之间的反应是迄今为止报道的最快的，并且适用于体内应用(Smeek et al,Current Opinion in Chemical Biology Volume 60,February2021,Pages 79-88)。
术语“生物正交”是指可以在生命系统内部(即在水环境中)发生的不干扰天然的生物化学过程的任何化学反应。“四嗪连接”可以作为一种生物正交反应提及。生物正交化学通常分两步进行。首先，用生物正交官能团(也称为化学报道分子)修饰细胞底物，例如上述“四嗪反应性基团”之一。细胞底物包括例如免疫球蛋白，如天然或重组抗体等。化学报道分子不得显著改变底物的结构，以免影响其生物活性。在第二步中，引入含有互补官能团的探针，例如本文描述的四嗪基团，以反应并标记底物。
本发明的化合物的“酸或碱加成盐”尤其是与生理上可耐受的酸或碱的加成盐。生理学上可接受的酸加成盐可以通过用合适的有机或无机酸处理本发明的化合物的碱形式来形成。通过用合适的有机和无机碱处理，含有酸性质子的本发明的化合物可以转化为其无毒的金属或胺加成盐形式。本发明的化合物和盐还包括其水合物和溶剂加成形式，例如水合物、醇化物等。
“生理上可耐受的”酸或碱特别是那些被用于掺入第一和第二亲双烯体的系统(例如生物系统，例如用于制备具有反式环辛烯基或环辛炔基的多肽的翻译系统)所耐受的酸或碱，例如它们对活细胞基本上无毒。
“药物组合物”除了包含本发明的ADC之外，还包含一种或多种物质，例如选自药学上可接受的防腐剂、药学上可接受的着色剂、药学上可接受的保护胶体、药学上可接受的pH调节剂和药学上可接受的渗透压调节剂。这样的物质在现有技术中已有描述。下文提供了本发明的药物组合物的更详细描述。
如本文所用，术语“有效量”是指这样的治疗量：足以减轻或改善疾病或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，防止疾病进展，引起疾病消退，防止与疾病相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展，检测疾病，或增强或改善另一种疗法(例如，预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。
B.3生化定义
“多肽”是任何长度的氨基酸残基(天然的或非天然的，或其组合)的任何寡聚体，通常但不仅仅通过共价肽键连接。多肽可以来自任何来源，例如天然存在的多肽、通过重组分子遗传技术产生的多肽、来自细胞或翻译系统的多肽、或通过无细胞合成方法产生的多肽。多肽的特征在于其氨基酸序列，例如组成其的氨基酸残基的一级结构。如本文所用，多肽的氨基酸序列不限于全长序列，而是可以是部分或完整序列。此外，多肽不旨在根据具有或不具有任何特定的生物活性而受到限制。
如本文所用，术语“蛋白”与多肽同义。术语“肽”是指小多肽，例如但不限于2-25个氨基酸的长度。
在具体实施方案中，将氨基酸序列中掺入了至少一种ncAA的蛋白用于形成“靶向剂”。这样的靶向剂的主要目的是与特定“靶标”形成共价或非共价连接。靶向剂的第二个目的是将“负载物分子”靶向转运至所述靶标。为了实现所述第二个目的，所述靶向剂必须与至少一种“负载物分子”结合(可逆或不可逆)。为此目的，所述靶向剂被所述至少一种ncAA官能化。然后，携带所述至少一种ncAA的官能化的靶向剂可以通过所述ncAA残基的生物偶联与所述至少一种负载物分子连接。所述ncAA能够与负载物分子反应，所述负载物分子相应地携带相应的部分(在本例中为特定的四嗪部分)，所述相应的部分能够与靶向剂的所述ncAA残基反应。由此获得的生物偶联物允许将负载物分子转移至期望的靶标。
如本文所用，术语“将非天然氨基酸掺入”，例如掺入靶向多肽中，是指在靶多肽初级构建过程中(例如通过翻译或化学合成)将非天然氨基酸直接添加到生长中的多肽链中。
非天然氨基酸(“UNAA”)可以使用本领域已知的多种方法中的任何一种直接掺入靶向多肽中。尽管许多实施方案利用正交翻译系统作为直接掺入非天然氨基酸的途径，但也可以使用其他直接掺入方法(例如，体外翻译系统、固相合成等)。应当理解，在本文的典型实施方案中，非天然氨基酸优选地掺入靶多肽中，即在多肽构建过程中掺入，并且不通过翻译后化学衍生来添加。
在本文所述的某些实施方案中，使用“正交tRNA/氨酰tRNA合成酶对”，非天然氨基酸可以高效、高保真、位点特异性地掺入靶向多肽中。
术语“翻译系统”是指将氨基酸掺入生长中的多肽链(蛋白)所必需的组件。翻译系统的组件可以包括例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。翻译系统可以是体内或体外翻译系统。
“体外翻译系统”可以是无细胞翻译系统。无细胞翻译系统是通过获得mRNA翻译所需的蛋白因子(例如以细胞提取物的形式)然后在体外重建该反应来合成所需蛋白的系统。这样的无细胞系统及其用于蛋白合成的用途是本领域已知的。实例包括大肠杆菌(E.coli)提取物、小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物(Spirin and Swartz,Cell-free ProteinSynthesis,Wiley VCH Verlag,Weinheim,Germany,2008)。
氨酰tRNA合成酶(RS)是一种能够用氨基酸或氨基酸类似物来酰化tRNA的酶。适宜地，本发明的方法中使用的RS能够用非天然氨基酸来酰化tRNA。
本发明的方法方便地利用“tRNA/氨酰tRNA合成酶(tRNA/RS)对”。优选地，本发明的方法中使用的tRNA/RS对与翻译系统正交。
本文所用术语“正交”是指被感兴趣的翻译系统(例如细胞)以降低的效率使用的分子(例如正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))。正交是指正交tRNA或正交氨酰tRNA合成酶不能像感兴趣的翻译系统的内源性氨酰tRNA合成酶或内源性tRNA那样发挥作用，或效率降低，例如效率低于20％、低于10％、低于5％或例如低于1％。例如，与内源性氨酰tRNA合成酶对内源性tRNA的酰化相比，感兴趣的翻译系统中正交tRNA被感兴趣翻译系统的任何内源性氨酰tRNA合成酶以降低的甚至为零的效率酰化。在另一实例中，与内源性氨酰tRNA合成酶对内源tRNA的酰化相比，正交氨酰tRNA合成酶对感兴趣的翻译系统中的任何内源tRNA以降低的甚至为零的效率酰化。
本发明的方法中使用的正交tRNA/RS对优选具有以下性质：O-tRNA优先通过O-RS被本发明的非天然氨基酸酰化。此外，正交对在感兴趣的翻译系统中起作用，例如，翻译系统使用非天然氨基酸酰化的O-tRNA，将本发明的非天然氨基酸掺入多肽链中。掺入以位点特异性方式发生，例如O-tRNA识别编码多肽的mRNA中的选择密码子，例如琥珀终止密码子。
术语“优先酰化”是指与内源tRNA或感兴趣的翻译系统的氨基酸相比，O-RS用非天然氨基酸酰化O-tRNA的效率为例如约50％效率、约70％效率、约75％效率、约85％效率、约90％效率、约95％效率或约99％或更高。然后以高保真度将非天然氨基酸掺入生长中的多肽链中，例如，对于给定的选择密码子以大于约75％的效率，对于给定选择密码子以大于约80％的效率，对给定选择密码子以大于约90％的效率，对于给定选择密码子以高于约95％的效率，或者对于给定选择代码子以大于大约99％或更高的效率。
术语“选择密码子”指在翻译过程中被O-tRNA识别而不被内源性tRNA识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择密码子，并在多肽的该位点掺入其氨基酸，例如非天然氨基酸。选择密码子可以包括例如无义密码子，例如终止密码子，例如琥珀、赭石和蛋白石密码子；四个或更多碱基密码子；源自天然或非天然碱基对的密码子等。对于给定的系统，选择密码子也可以包括天然三碱基密码子之一(即天然三联体)，其中内源系统不使用所述天然三联体，例如缺乏识别天然三联体的tRNA的系统，又例如天然三联体是罕用密码子的系统。
“反密码子”具有相应密码子的反向互补序列。
O-tRNA/O-RS对由O-tRNA(例如阻抑tRNA等)和O-RS组成。
“阻抑tRNA”是一种在给定的翻译系统中改变信使RNA(mRNA)阅读的tRNA。阻抑tRNA可以通读(read through)例如终止密码子、四碱基密码子或罕用密码子。
如本文所述，O-tRNA不被内源合成酶酰化，并且能够解码选择密码子。
O-RS识别O-tRNA，例如通过延伸的反密码子环，并优先用非天然氨基酸酰化O-tRNA。
本发明的方法中使用的tRNA和RS可以是天然存在的，或者可以通过来自多种生物体的天然存在的tRNA和/或RS的突变而获得。在各种实施方案中，tRNA和RS来自至少一种生物体。在另一实施方案中，tRNA来自第一生物体的天然存在的tRNA或突变的天然存在的tRNA，RS来自第二生物体的天然存在的RS或突变的天然存在的RS。
合适的tRNA/RS对可以选自突变体tRNA和RS的文库，例如基于文库筛选的结果。或者，合适的tRNA/RS对可以是从源物种导入翻译系统的异源tRNA/合成酶对。优选地，用作翻译系统的细胞不同于所述源物种。
例如，合适的正交O-tRNA可以衍生自古细菌，例如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌属(Halobacterium)例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌NRC-I(Halobacterium species NRC-I)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、Aeuropyrum pernix、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyruskandleri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)(Mm)、嗜气热棒菌(Pyrobaculumaerophilum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)(Ss)、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)等，或真细菌，例如大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermphilus)等，而正交O-RS可以来源于生物体或生物体的组合，例如古细菌，例如詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、嗜盐菌属例如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐菌NRC-J、闪烁古生球菌、激烈热球菌、堀越氏热球菌、Aeuropyrum pernix、海沼甲烷球菌、坎氏甲烷嗜热菌、马氏甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina bakeri)；Methanosarcina hafniense；嗜气热棒菌、深海热球菌、硫磺矿硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热原体、火山热原体等，或真细菌，例如大肠杆菌、嗜热栖热菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。在一实施方案中，真核来源，例如植物、藻类、原生生物、真菌、酵母，以及动物，例如哺乳动物、昆虫、节肢动物等，也可以用作O-tRNA和O-RS的来源。
例如在WO 02/085923和WO 02/06075中描述了进化tRNA/RS对的方法。
优选地，RS是能够用本发明的非天然氨基酸酰化tRNA的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(pylRS)。本发明的方法中使用的吡咯赖氨酰tRNA合成酶可以是野生型或基因工程化的pylRS。野生型pylRS的例子包括但不限于来自古细菌和真细菌的pylRS，例如马氏甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、Methanococcoides burtonii、嗜乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)和Desulfitobacterium hafniense。
吡咯赖氨酰tRNA合成酶(PylRS)是一种氨酰tRNA合成酶(RS)。RS是能够用氨基酸或氨基酸类似物来酰化tRNA的酶。有利地，本发明的PylRS具有酶活性，即能够用某种氨基酸或氨基酸类似物，优选用UNAA或其盐来酰化tRNA (tRNAPyl)。
术语“古细菌吡咯赖氨酰tRNA合成酶”(缩写为“古细菌PylRS”)是指PylRS，其中PylRS氨基酸序列的至少一个片段或整个PylRS氨基酸序列与来自古细菌的天然存在的PylRS的氨基酸序列或此类天然存在的PylRS的酶活性片段的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列相同性。
本发明的PylRS可以包含突变体古细菌PylRS或其酶活性片段。
通常，“突变体古细菌PylRS”或“突变的古细菌PylRS”与相应的野生型PylRS的不同之处在于包含一个或多个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。优选地，这些是改善PylRS稳定性、改变PylRS底物特异性和/或增强PylRS酶活性的修饰。下文更详细地描述了特别优选的“突变体古细菌PylRS”或“突变的古细菌PylRS”。
术语“核输出信号”(缩写为“NES”)是指一种氨基酸序列，该序列能够引导含有该序列的多肽(如本发明的含NES的PylRS)从真核细胞的细胞核中输出。所述输出被认为主要由Crm1(染色体维持蛋白1，也称为核输出蛋白1)介导。NES在本领域中是已知的。例如，数据库ValidNESs(http://validness.ym.edu.tw/)提供了实验验证的含NES蛋白的序列信息。此外，NES数据库，例如NESbase 1.0(www.cbs.dtu.dk/databased/NESbase-1.0/；参见LeCour et al.,Nucl Acids Res 31(1),2003)以及诸如NetNES(www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/；参见La Cour et al.,La Cour et al.,Protein Eng Des Sel17(6):527-536,2004)，NESpredictor(NetNES,http://www.cbs.dtu.dk/；参见Fu et al.,Nucl Acids Res41:D338-D343,2013；La Cour et al.,Protein Eng Des Sel 17(6):527-536,2004))和NESsential(与ValidNESs相结合的网络界面)的NES预测工具对公众可用。疏水性富含亮氨酸的NES是最常见的，代表了迄今为止最具特征的NES组。疏水性富含亮氨酸的NES是非保守基序，具有3或4个疏水性残基。这些NES中的许多包含保守的氨基酸序列模式LxxLxL(SEQID NO:111)或LxxxLxL(SEQ ID NO:112)，其中每个L独立地选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸氨基酸残基，并且每个x独立地选自任何氨基酸(参见La Cour etal.,Protein Eng Des Sel 17(6):527-536,2004)。
术语“核定位信号”(缩写为“NLS”，在本领域中也称为“核定位序列”)是指一种氨基酸序列，其能够引导含有该序列的多肽(例如野生型古细菌PylRS)进入真核细胞的细胞核。所述输出被认为是由含NLS的多肽与核输入蛋白(也称为核转运蛋白)的结合介导的，从而形成穿过核孔的复合物。NLS在本领域中是已知的。公众可以使用多种NLS数据库和NLS预测工具，例如NLSdb(参见Nair et al.,Nucl Acids Res 31(1),2003)、cNLS Mapper(www.nls-mapper.aib.keio.ac.jp；see Kosugi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.106(25):10171-10176,2009；Kosugi et al.,J Biol Chem 284(1):478-485,2009)、SeqNLS(参见Lin et al.,PLoS One 8(10):e76864,2013)和NucPred(www.sbc.su.se/～maccallr/nucpred/；参见Branmeier et al.,Bioinformatics 23(9):1159-60,2007)。
如上所定义的本发明的突变体古细菌PylRS可以通过去除任选存在于作为突变体来源的所述天然存在的PylRS中的NLS和/或通过引入至少一个NES来进一步修饰。天然存在的PylRS中的NLS可以使用已知的NLS检测工具如cNLS Mapper来识别。
当在真核细胞中表达时，从古细菌PylRS或其突变体中去除NLS和/或向其中引入NES可以改变如此修饰的多肽的定位，特别是可以避免或减少多肽在真核细胞细胞核中的积累。因此，相比于(仍然)包含NLS并且缺少NES因而与本发明的PylRS突变体不同的PylRS或PylRS突变体，在真核细胞中表达的本发明的PylRS突变体的定位可以改变。
当本发明的古细菌PylRS包含NES但(仍然)包含NLS时，NES是被优选选择的，使得NES的强度超过NLS，防止PylRS在真核细胞的细胞核中积累。
从野生型或突变体PylRS中去除NLS和/或向野生型或突变体PylRS中引入NES以获得本发明的PylRS不会消除PylRS的酶活性。优选地，PylRS酶活性保持在基本相同水平，即本发明的PylRS具有相应野生型或突变体PylRS的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的酶活性。
NES方便地位于本发明的PylRS或突变体PylRS内，使得NES具有功能。例如，NES可以连接到野生型或突变体古细菌PylRS的C端(例如最后一个氨基酸残基的C端)或N端(例如氨基酸残基1、N端甲硫氨酸和氨基酸残基2之间)。
WO2018/06948的公开内容公开了通过掺入NES和/或缺失NLS序列而修饰的突变的PylRS，在此明确引用并通过引用并入本文。
C.具体实施方案
下文描述的具有通式(I)的本发明的四嗪化合物用于制备偶联物，特别是生物偶联物。为此目的，式(I)化合物通过其官能四嗪部分与偶联配偶体(例如生物分子，特别是靶向分子，例如抗体分子)携带的合适的四嗪反应性第二官能团反应。
所述四嗪反应性官能团可以是例如环辛烯基或反式环辛烯基。
本发明提供体内或体外制备这样的多肽的方法。特别地，所述四嗪反应性官能团能够通过翻译掺入由包含一个或多个选择密码子的多核苷酸编码的多肽中。
本发明涉及以下主要方面及其具体实施方案。
1.本发明的第一方面
本发明的第一方面涉及通过特定的四嗪基团官能化的负载物分子，其适于与第二分子(特别是生物分子)偶联，所述第二分子携带能够与官能化的负载物分子的所述四嗪基团反应的对应官能团。
根据本发明的第一实施方案，本发明提供以下通式I的四嗪官能化的化合物，
其中
m为0或1，
n表示选自1和2的整数，
o为0或表示选自1或2的整数，
A表示可裂解的部分，
Sp1和Sp2各自独立地表示间隔子部分，
X表示自降解部分，
Y表示负载物残基(或载荷)，并且
Z表示亲水基团。
根据一具体实施方案，m是0。
根据另一具体实施方案，m是1。
根据另一具体实施方案，n是1。
根据另一具体实施方案，n是2。
根据另一具体实施方案，o是0。
根据另一具体实施方案，o是1。
根据另一具体实施方案，o是2。
根据另一具体实施方案，Sp1和Sp2不同。
根据另一具体实施方案，Sp1和Sp2相同。
m、n和o以及Sp1和Sp2的参数组合的具体例子是：
根据本发明的第二实施方案，第一实施方案的所述化合物通式I中的残基Z选自下列亲水基团之一：
a)含磷和/或硫的亲水部分Z，
特别是(R1O)2P(O)-、(R1aO)2P(O)-O-、(R2O)3P-O-、R3S(O)2-、(R4O)S(O)2O-或(R4aO)S(O)2-，
其中
残基R1至R4、R1a和R4a相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；
或者所述含磷和/或硫的亲水部分的盐形式，例如生理上可耐受的盐；
b)直链或分支的单或聚亚烷基氧化物部分Z，特别是选自直链部分-((CH2)x-O)y-R5、-(O-(CH2)x)y-H和-(O-(CH2)x)y-OR6，及其分支类似物；
其中
残基R5和R6各自独立地表示H或低级烷基，特别是H、甲基或乙基；
x各自独立地表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；并且
y各自独立地表示1至20的整数，特别是1至15、1至10或1至4；例如1、2、3或4
关于基团a):
根据一特定的实施方案，Z为(R1O)2P(O)-、(R1aO)2P(O)-O-或(R2O)3P-O-，更特别是(R1O)2P(O)-；
其中
残基R1；R2和R1a相同或不同，并且各自独立地表示H或甲基或乙基；
关于基团b):
根据另一具体实施方案，Z是直链单或聚亚烷基氧化物部分。
根据又一具体实施方案，Z选自直链部分-((CH2)x-O)y-R5、-(O-(CH2)x)y-H和-(O-(CH2)x)y-OR6，其中残基R5和R6各自独立地表示H、甲基或乙基；
根据又一具体实施方案，x各自独立地表示选自1或2的整数。
参数Z、m、n和o以及Sp1和Sp2的参数组合的具体例子是：
No. m n o Sp1/Sp2 Z
0 1 0 相同 (R1O)2P(O)-
0 2 0 相同 (R1O)2P(O)-
0 1 1 相同 (R1O)2P(O)-
0 2 1 相同 (R1O)2P(O)-
0 1 2 相同 (R1O)2P(O)-
0 2 2 相同 (R1O)2P(O)-
1 1 0 相同 (R1O)2P(O)-
1 2 0 相同 (R1O)2P(O)-
1 1 1 相同 (R1O)2P(O)-
1 2 1 相同 (R1O)2P(O)-
1 1 2 相同 (R1O)2P(O)-
1 2 2 相同 (R1O)2P(O)-
0 1 0 不同 (R1O)2P(O)-
0 2 0 不同 (R1O)2P(O)-
0 1 1 不同 (R1O)2P(O)-
0 2 1 不同 (R1O)2P(O)-
0 1 2 不同 (R1O)2P(O)-
0 2 2 不同 (R1O)2P(O)-
1 1 0 不同 (R1O)2P(O)-
1 2 0 不同 (R1O)2P(O)-
1 1 1 不同 (R1O)2P(O)-
1 2 1 不同 (R1O)2P(O)-
1 1 2 不同 (R1O)2P(O)-
1 2 2 不同 (R1O)2P(O)-
其中R1为H或低级烷基。
或者
或者
或者
No. m n o Sp1/Sp2 Z R1
0 1 0 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 0 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 1 1 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 1 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 1 2 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 2 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 0 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 0 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 1 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 1 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 2 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 2 相同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 1 0 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 0 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 1 1 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 1 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 1 2 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
0 2 2 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 0 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 0 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 1 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 1 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 1 2 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
1 2 2 不同 (R1O)2P(O)- 乙基
Z、m、n和o以及SP1和SP2的参数组合的进一步的具体例子是：
No. m n o Sp1/Sp2 Z
0 1 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 1 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 1 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 1 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 1 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 1 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
0 2 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 1 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
1 2 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6
其中
残基R6表示H或低级烷基，特别是H、甲基或乙基；
x表示选自1或2的整数；并且
y表示1至20的整数，特别是1至15、1至10或1至4；例如1、2、3或4，Z、x、y、R6、m、n和o以及SP1和SP2的参数组合的具体例子是：
或者
或者
No. m n o Sp1/Sp2 Z x y R6
0 1 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 1 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 1 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 0 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 1 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 2 相同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 1 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 1 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 1 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
0 2 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 0 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 1 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 1 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
1 2 2 不同 -(O-(CH2)x)y-OR6 1 1-20 甲基
或者
根据本发明的第三实施方案，前述任一实施方案的式I化合物的间隔子Sp 1不存在，或者更特别地选自
a)具有6至14个环碳原子的任选地单或多取代的单或多环芳香部分，特别是1,4-亚苯基，其中所述一个或多个任选存在的取代基各自独立地选自-Hal、-CHal3、-OH、-SH、-NR’2、-NO2、-CN、-C(＝O)R”、-C(＝O)OR”’、烷基、烯基、炔基和烷氧基；
其中
R’、R”和R”’各自独立地选自H和C1-C4烷基；
(M1部分)；
b)通式X的杂环残基
其中
环部分X1至X4中的一个、两个或三个表示N，其它的表示>CH；(M2部分)；
c)直链或分支的低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，其中n1为1至4的整数；更特别是亚甲基；(M3部分)；和
d)选自M1、M2和M3的至少两个相同，或更特别是不同的部分的组合。
关于M1部分：
根据一具体实施方案，M1部分是具有6个碳原子的单环非取代的芳香部分，特别是1,4-亚苯基，或
关于M2部分：
根据一具体实施方案，M2部分表示通式X的杂环残基，其中
环部分X1至X4中的一个或两个表示N，其它的表示>CH；
关于M3部分：
根据一具体实施方案，M3部分表示直链低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，其中n1是1或2的整数；更特别是亚甲基；
根据本发明的第四实施方案，前述任一实施方案的化合物(I)的间隔子Sp 2选自
a)具有6至14个环碳原子的任选地单或多取代的单或多环芳香部分，特别是1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基；其中所述一个或多个任选存在的取代基各自独立地选自-Hal、-CHal3、-OH、-SH、-NR’2、NO2、-CN、-C(＝O)R”、-C(＝O)OR”’、烷基、烯基、炔基和烷氧基；
其中
R’、R”和R”’各自独立地选自H和C1-C4烷基(M1部分)；
b)通式X的杂环残基
其中
环部分X1至X4中的一个、两个或三个表示N，其它的表示>CH；(M2部分)；
c)直链或分支的低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，
其中
n1为1至4的整数；更特别是亚甲基；(M3部分)；
d)直链或分支的聚亚烷基氧化物部分，特别是选自直链部分-((CH2)x1-O)y1-或-(O-(CH2)x1)y1-及其分支类似物；
其中
x1各自独立地表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；并且
y1各自独立地表示1至20的整数；特别是1至4；(M4部分)；
e)含杂原子部分，其选自
-N(R””)-；
-(CH2)x2-N(R””)-；
-N(R””)-(CH2)x3-C(O)O-；
-N(R””)-(CH2)x3-C(O)-；
-N(R””)-C(O)O-(CH2)x4-N(R””)-；
-N(R””)-C(O)-(CH2)x4-N(R””)-；
–(CH2)x4-C(O)-；和
–(CH2)x4-C(O)O-
其中
R””各自独立地选自H和C1-C4烷基
x2表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；
x3表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；并且
x4表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；
(M5部分)；或者
f)选自M1、M2、M3和M4的至少两个相同，或更特别是不同的部分的组合；或者选自M1、M2、M3、M4和M5的至少两个相同，或更特别是不同的部分的组合。
关于M1部分：
根据一具体实施方案，M1部分是具有6个碳原子的单环非取代芳香部分，特别是1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基，更特别是1,4-亚苯基，或者
关于M2部分：
根据一具体实施方案，M2部分表示通式X的杂环残基，其中
环部分X1至X4中的一个或两个表示N，其它的表示>CH；
关于M3部分：
根据一具体实施方案，M3部分表示直链低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，其中n1是1或2的整数；更特别是亚甲基；
关于M4部分：
根据一具体实施方案，4部分表示直链聚亚烷基氧化物部分，选自直链部分-((CH2)x1-O)y1-或-(O-(CH2)x1)y1-；
其中
x1各自独立地表示选自1或2的整数；并且
y1各自独立地表示2至20的整数；特别是2至4；
关于M5部分：
根据一具体实施方案，5部分表示-N(R””)-、-N(R””)-(CH2)x3-C(O)-或-(CH2)x2-N(R””)-
其中
R””各自独立地选自H和C1-C4烷基，更特别是H；并且
x2表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2。
根据本发明的第五实施方案，前述任一实施方案的化合物(I)的所述基团A是酶促或化学可裂解的接头基团，选自
a)肽基团，特别是二肽、三肽或四肽基团；
b)下式的二硫键基团：-(CR7R8)n2-S-S-(CR7R8)n2-X5-或X5′-(CR7R8)n2-S-S-(CR7R8)n2-X5-
其中
n2表示1至4的整数；
残基R7和R8各自独立地选自H或低级烷基，特别是甲基；或者两个残基R7和R8与它们所连接的碳原子一起形成环状C4-C8烷基基团；并且
X5部分选自–C(O)-和-O-；
X5′部分选自–C(O)-和-(O)C-(CH2)-NH-；
c)腙基团，其选自>C＝N-N(R9)-和-N(R9)-N＝C<
其中
R9为H或低级烷基；和
d)β-葡糖醛酸糖苷酶敏感的可裂解接头基团(葡糖苷酸接头基团)，特别地，其携带β-葡糖醛酸衍生的触发残基的接头基团；
根据其具体实施方案，可裂解接头是根据特征a)的肽基。
根据其另一具体实施方案，可裂解接头是根据特征d)的葡糖苷酸-接头基团。
根据本发明第六实施方案，前述任一实施方案的化合物(I)的所述自降解基团X选自
a)下式的p-氨基-苄醇(PAB)衍生的基团：
-NH-p-亚苯基-CH2-O-或-O-CH2-p-亚苯基-NH-或-NH-p-亚苯基-CH2-N+(R20)2-
b)-O-C(O)-O-；
c)-O-C(O)-NR10-(CR12R13)z-NR11-C(O)-O-或
-X1-C(O)-NR10-(CR12R13)z-NR11-C(O)-X2-
其中
z表示选自1至6的整数；特别是1至4；
R20各自独立地表示H或低级烷基基团；
R10和R11各自独立地表示H或低级烷基基团；
R12和R13各自独立地表示H、甲基或乙基，特别是H或甲基，尤其是H；并且
X1和X2各自独立地表示O、S或NR10
d)下式的亚甲基烷氧基氨基甲酸酯(MAC)型连接子
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(O)-，
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(S)-，
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(NR16)-，或
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(NR16-C(O)O)-
其中
R13、R14、R15和R16各自独立地表示H或低级烷基，特别是C1-C4烷基。
根据其具体实施方案，所述自降解基团X是根据特征a)的PAB衍生基团。
根据本发明第七实施方案，前述任一实施方案的化合物的所述负载物残基Y选自生物活性化合物；标记试剂，例如特别是染料、放射性标记、蛋白降解剂、光敏剂；和螯合剂。
根据本发明第八实施方案，前述任一实施方案的所述化合物对应于通式Ia的化合物
其中，连接子α、β、γ和δ各自独立地选自化学键或醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、羰基(特别是酮)、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子。
所述聚亚烷基氧化物连接子选自直链部分-((CH2)x1-O)y1-或-(O-(CH2)x1)y1-；
其中
x1各自独立地表示选自1或2的整数；并且
y1各自独立地表示2至20的整数；特别是2至4；
根据一具体实施方案，连接子α、β、γ和δ各自是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α、β、γ和δ是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子β是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子γ是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α和β各自是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α、β和γ各自是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α、β、γ各自是化学键，并且δ是醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、羰基(特别是酮)、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支聚亚烷基氧化物连接子。
根据另一具体实施方案，连接子α、β、γ各自是化学键，并且δ是酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、亚烷基氧化物或直链或分支聚亚烷基氧化物连接子。
所述聚亚烷基氧化物连接子选自直链部分-((CH2)x1-O)y1-或-(O-(CH2)x1)y1-；
其中
x1各自独立地表示选自1或2的整数；并且
y1各自独立地表示2至4的整数；
根据本发明的第九实施方案，前述任一实施方案的化合物的所述间隔子Sp1选自下列部分组合之一：
-M1-M3-、-M2-M3-、-M3-M1-或M3-M2-
其中
所述M1、M2、M3部分之间的连接子独立地选自化学键、醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼或脲，以及亚烷基氧化物或直链或分支聚亚烷基氧化物连接子。
在一具体实施方案中，所述M1、M2、M3部分之间的连接子各自是化学键。
根据本发明的第十实施方案，前述任一实施方案的化合物的所述间隔子Sp2选自下列部分组合之一
-M1-M3-、-M1-M4-、-M2-M3-、-M2-M5-、-M2-M4-、-M3-M1-、-M3-M2-、-M3-M4-、-M1-M3-M4-、-M1-M4-M3-、-M2-M3-M4-、-M2-M4-M3-、-M3-M2-M4-.-M3-M4-M2-或–M2-M5-M4-
其中
所述M1、M2、M3、M4和M5部分之间的连接子独立地选自化学键、醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼或脲，以及亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子。
在一具体实施方案中，所述M1、M2、M3、M4部分之间的连接子各自是化学键。
Sp1和Sp2中的基序M组合的具体例子在下表中提及(其中适用的间隔子部分可以以任何方向存在于式I化合物中)
含有Sp1和Sp2的基序M组合的式I化合物的具体例子在下表中提及(其中适用的间隔子部分可以以任何方向存在于式I化合物中)：
其中R1为H或低级烷基或者
或者
或者
或者
其中
残基R6表示H或低级烷基，特别是H、甲基或乙基；
x表示选自1或2的整数；并且
y表示1至20的整数，特别是1至15、1至10或1至4；例如1、2、3或4，或者
或者
或者
或者
2.本发明的第二方面
本发明的第二方面涉及偶联物，尤其是生物偶联物。它们通过至少一种本发明上述第一方面的通式(I)的官能化的负载物分子的反应形成，所述官能化是通过如上所定义的特定四嗪基团官能化。所述负载物分子适于与官能化的靶向剂，特别是官能化的生物分子偶联，所述官能化的靶向剂携带对应官能团，所述对应官能团能够在双正交化学反应中与官能化的负载物分子的所述四嗪基团反应。
根据本发明的第十一实施方案，提供一种偶联物(更特别的是生物偶联物)，其通过以下方式获得：使官能化的靶向剂与前述实施方案中任一项的式I的四嗪化合物反应，从而在所述官能化的靶向剂和所述式I的四嗪化合物之间形成共价连接。
根据本发明的第十二实施方案，第十一实施方案的所述官能化的靶向剂选自以下实体的相应官能化的形式：病毒、全细胞、噬菌体、脂质体、生物分子和低分子量或高分子量化合物、抗体、抗体衍生物、抗体片段、抗体(片段)融合物、酶、蛋白、肽、肽模拟物、碳水化合物、单糖、多糖、寡核苷酸或多核苷酸，特别是DNA、RNA、PNA和LNA分子、适配体、药物、糖蛋白、聚糖、脂质、聚合物、化疗剂、受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、甾体、毒素及其衍生物。在其具体实施方案中，靶向剂选自抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体(片段)融合物。
根据本发明的第十三实施方案，提供实施方案十一和十二中任一项的偶联物，其中所述官能化的靶向剂包含至少一个能够与所述式I化合物的所述四嗪部分反应的亲双烯部分作为官能团。
根据本发明的第十四实施方案，提供实施方案十一至十三中任一项的偶联物，其中所述官能化的靶向剂包含至少一个多肽序列，所述多肽序列在其氨基酸序列中具有至少一个非天然氨基酸残基，所述非天然氨基酸残基包含至少一个能够与所述式I化合物的所述四嗪部分反应的亲双烯体部分。
根据本发明的第十五实施方案，提供实施方案十一至十四中任一项的偶联物，其中所述官能化的生物分子是多克隆或单克隆免疫球蛋白分子，特别是单克隆抗体或其片段。
根据本发明的第十六实施方案，提供实施方案十一至十五中任一项的偶联物，其通过以下方式形成：式I的四嗪化合物与携带能够通过Diels-Alder型环加成反应进行反应的官能团的官能化的生物分子双正交生物偶联。所述官能团例如环辛炔基(cyclooctinyl)亲双烯体、反式环辛烯基亲双烯体、降冰片烯基亲双烯体、环丙烯基亲双烯体、环丁烯基亲双烯体、螺己烯基亲双烯体、BCN亲双烯体、氮杂环丁烯亲双烯体或烯烃。
根据本发明的第十七实施方案，提供实施方案十六的偶联物，其中能够通过Diels-Alder型环加成反应进行反应的所述官能团选自
(i)下式的反式环辛烯基亲双烯体基团：
其中
R1为氢、卤素、C1-C4烷基、(RaO)2P(O)O-C1-C4烷基、(RbO)2P(O)-C1-C4烷基、CF3、
CN、羟基、C1-C4烷氧基、-O-CF3、C2-C5烯氧基、C2-C5烷酰氧基、C1-C4烷氨基羰氧基或C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4烷基)氨基、C2-C5烯基氨基、C2-C5烯基-
C1-C4烷氨基或二(C2-C5烯基)氨基；并且
Ra、Rb独立地是氢或C2-C5烷酰氧基甲基；或
(ii)下式的环辛炔基亲双烯体基团:
其中
R2为氢、卤素、C1-C4烷基、(RcO)2P(O)O-C1-C4烷基、(RdO)2P(O)-C1-C4烷基、CF3、
CN、羟基、C1-C4烷氧基、-O-CF3、C2-C5烯氧基、C2-C5烷酰氧基、C1-C4烷氨基羰氧基或C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4烷基)氨基、C2-C5烯基氨基、C2-C5烯基-
C1-C4烷氨基或二(C2-C5烯基)氨基；并且
Rc、Rd独立地是氢或C2-C5烷酰氧基甲基。
3.本发明的第三方面
本发明的第三方面涉及制备生物偶联物的方法。
根据本发明的第十八实施方案，提供一种制备实施方案十一至十七中任一项的生物偶联物的方法。所述方法包括在水性、任选缓冲的反应介质中，使实施方案一至十中任一项所定义的四嗪化合物与携带亲双烯体官能团的官能化的生物分子反应，并在所述分子之间进行Diels-Alder型环加成反应。
4.本发明的第四方面
本发明的第四方面涉及某些四嗪中间体，例如可用于制备式I的四嗪化合物。
根据本发明的第十九实施方案，提供通式II的四嗪中间体，
其中
n3表示选自1或2的整数，
Sp1和Sp2如上所定义，
连接子α、β和γ各自独立地选自化学键或醚、硫醚、酯、酰胺、羰基(特别是酮)、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子；
Z表示含磷的亲水基团，特别是(R1O)2P(O)-、(R1a O)2P(O)-O-和(R2O)3P-O-；
其中
R1、R1a和R2相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；甚至更特别是H；
并且
R表示H，或能够形成化学键或能够形成醚、硫醚、酯，例如活性酯，如琥珀酰亚胺基酯或五氟苯基酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支聚亚烷基氧化物连接子的化学基团；并且任选地条件是R不表示化学保护基团，特别地不表示可裂解的保护基团，更特别地不为N-、O-或S-保护基团。
更特别地，R表示氨基或羧基；根据一具体实施方案，连接子α、β和γ各自是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子β是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子γ是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α和β各自是化学键。
根据另一具体实施方案，连接子α、β和γ各自是化学键。
根据另一具体实施方案，Z是(R1O)2P(O)-、(R1a O)2P(O)-O-和(R2O)3P-O-；
其中
R1、R1a和R2相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；甚至更特别是H；
在下文中，显示通式II化合物的特别优选的结构。在所述式中，残基R1各自独立地如上所定义。
在下表中，提供本发明通式II的合成中间体的具体例子:
5.本发明的第五方面
本发明的第五方面涉及制备某些四嗪中间体的方法。
根据本发明第二十实施方案，制备通式II四嗪中间体的方法，该方法包括以下步骤：
i.在水合肼的存在下，使通式III的第一氰基化合物与通式IV的第二氰基化合物反应
通式III的第一氰基化合物
Z-Sp1-CN
(III)
其中Z和Sp1如上所定义，其中任选地残基Z的任何羟基以被保护的形式提供，特别是(i.p.)烷氧基形式；
通式IV的第二氰基化合物
NC-Sp2-[R]n3
(IV)
其中R和Sp2和n3如上所定义；
ii.随后氧化，特别是氧化步骤1中形成的1,4-二氢-s-四嗪化合物，例如用选自以下的氧化剂：NaNO2、PhI(OAc)2、DDQ或空气氧化
iii.任选地分离获得的四嗪化合物；
和
iv.任选地将残基Z的羟基去保护。
根据其具体实施方案，步骤i)在没有催化剂的情况下进行。
根据其另一具体实施方案，步骤i)在催化剂存的情况下进行。
根据其另一具体实施方案，催化剂是含金属的催化剂，例如Zn(OTf)2。
根据另一具体实施方案，催化剂是无金属的催化剂。
根据另一具体实施方案，无金属催化剂是有机催化剂。
根据另一具体实施方案，有机催化剂是含硫催化剂。
根据另一具体实施方案，含硫催化剂选自3-巯基丙酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、2-氨基乙硫醇、1,3-丙二硫醇、巯基乙酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸，特别是3-巯基丙酸。
根据另一具体实施方案，反应步骤i)在肼化合物相对于式(III)和(IV)化合物摩尔过量，例如1至20倍摩尔过量的情况下进行。
根据又一具体实施方案，反应步骤i)在醇溶剂中进行，特别是乙醇。
根据又一具体实施方案，式(III)和(IV)化合物以1∶10至10∶1的摩尔比使用。
根据另一具体实施方案，反应步骤ii)在氧化剂相对于式(III)和(IV)化合物摩尔过量，例如1至20倍摩尔过量的情况下进行。
根据又一具体实施方案，步骤ii.的氧化剂是NaNO2。
根据又一具体实施方案，步骤ii.的氧化剂是PhI(OAc)2
根据又一具体实施方案，步骤ii.的氧化剂是空气。
6.本发明的其他方面
本发明的其它方面涉及本发明的偶联物、药物组合物以及包含其的诊断或分析试剂盒的医学用途。
根据本发明的第二十一实施方案，提供实施方案十一至十七中任一项所定义的偶联物，用于医药，特别地用于诊断和/或治疗。
根据本发明的第二十二实施方案，提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的至少一种如实施方案十一至十七中任一项所定义的偶联物。
根据本发明的第二十三实施方案，提供一种诊断或分析试剂盒，其包含至少一种如实施方案一至十中任一项所定义的四嗪化合物。
D.其他实施方案
1.亲水性四嗪中间体及其制备
通式II的四嗪中间体可以以类似于本领域众所周知的方法制备。在本文引用的各种出版物中可以找到合适的方法，所有这些出版物均通过引用全文并入本文。本文概述一些方法。
式II的四嗪中间体的金属催化的一锅合成可以按照Yang等人，Angew.Chem IntEd(2012),51,5222的公开进行。
Mao等在Angew.Chem Int Ed(2019),58,1106中描述通过含巯基促进剂的不对称1,2,4,5-四嗪的有机催化和可放大合成。
根据本发明的一特定方面，提供一种制备通式II的四嗪中间体的方法
通常，所述方法包括以下步骤:
i)在水合肼的存在下，使通式III的第一氰基化合物与通式IV的第二氰基化合物反应
通式III的第一氰基化合物
Z-Sp1-CN
(III)
其中Z和Sp1如上所定义，其中任选地残基Z的任何羟基以被保护的形式提供，特别是烷氧基形式。
通式IV的第二氰基化合物
NC-Sp2-[R]n3
(IV)
其中R和Sp2和n3如上所定义；
ii)随后氧化步骤i)的产物
iii)任选地分离获得的四嗪化合物；
和
iv)任选地将残基Z的任何任选被保护的羟基去保护。
更特别地，步骤i)在一锅反应中进行。为此目的，例如，提供通式(III)和(IV)的氰基离析物的溶液，其补充有肼化合物，特别是水合肼，并且任选地存在合适的催化剂。
具体的催化剂是酸性无金属有机催化剂巯基化合物，例如3-巯基丙酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、2-氨基乙硫醇、1,3-丙二硫醇、巯基乙酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸，特别是3-巯基丙酸。如3-巯基丙酸。可选的催化剂是含金属的催化剂，例如Zn(OTf)2。
步骤i)的反应在温度控制下进行，直至完成。随后，任何所得的二氢四嗪中间体可以被氧化。为此，可以使用常规氧化剂，特别是亚硝酸钠/HCl或硝酸。
如果需要，在合适的溶剂中提供所述氰基离析物的混合物。可以使用的典型溶剂选自极性有机溶剂，如THF和有机醇，特别是乙醇。
通常，式(III)和(IV)的化合物以1∶10至10∶1的摩尔比提供，例如1∶5至5∶1。更特别地，式III的化合物以1至10或1至5倍摩尔过量提供。
通常，肼化合物以相对于氰基离析物摩尔过量加入，例如以化合物(III)或(IV)的1至20或4至15倍过量加入。
通常，在催化中使用的酸催化剂，或者更特别地，它是相对于化合物(III)或(IV)的摩尔量。
通常，至少以其摩尔量，更优选以相对于肼化合物摩尔过量应用。
反应温度控制在–10至+10℃的范围内。
步骤ii.的氧化将步骤i)形成的二氢四嗪中间体转化成相应的四嗪。通常，在步骤i)的反应混合物中，或者在环境空气存在下，或者通过加入合适的氧化剂，例如NaNO2、对苯醌、DDQ或PhI(OAc)2进行反应。例如Selvaraj，R.等人在Tetrahedron Lett.2014；55(34):4795–4797中描述了PhI(OAc)2作为氧化剂
作为一个非限制性实例，两种不同的磷酸四嗪的制备通过以下方案说明(氧化步骤未明确显示)：
方案1:亲水性膦酸酯四嗪的合成
可选步骤iii.用于分离步骤ii.的产物，可以通过常规的纯化方法进行。应特别提及色谱法，如快速色谱法或HPLC。
本发明的方法还可以包括步骤iv.条件是应用式III的离析物，其中残基Z包含受保护的例如酯化的羟基，并且其旨在使用所产生的去保护形式的四嗪。保护酯化羟基的方法是众所周知的。作为非限制性实例，可以提及通过在有机溶剂中用三甲基溴硅烷处理来进行脱保护。
通过应用上述通用方法，可以合成甲基膦酸酯四嗪的特定衍生物。这些化合物含有允许与其它化学部分反应的官能团，例如通过酰胺偶联或形成氨基甲酸酯或酯键。这样的化学部分选自上述基团
Sp2间隔子部分(任选除了已经作为上述式IV反应物的一部分引入的Sp2部分之外)
A可裂解基团
X自降解(self-immolative)部分
Y负载物残基(载荷)
或其组合，例如
–A-X-Y、-A-Y、-X-Y、-A-X-X-Y、-X-X-Y
-Sp2–A-X-Y、-Sp2-A-Y、-Sp2-X-Y、-Sp2–A-X-X-Y
2.负载物分子Y
通常用作通式I的四嗪化合物的构成要素的负载物分子Y可以选自生物活性化合物、标记试剂和螯合剂。其非限制性实例在以下部分中给出。
2.1生物活性化合物
生物活性化合物包括但不限于以下物质：
根据本发明可应用的生物活性化合物包括但不限于：小有机分子药物、甾体、脂质、蛋白、适配体、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、类肽、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸、核苷、DNA、RNA、毒素、聚糖和免疫球蛋白。
可用于实施本发明的生物活性化合物的示例性种类包括但不限于激素、细胞毒素、抗增殖/抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗生素、细胞因子、抗炎剂、抗高血压剂、化学增敏剂、光敏化和放射增敏剂、抗艾滋病物质、抗病毒剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂。酶抑制剂、抗帕金森药物、神经毒素、通道阻断剂、细胞-细胞外基质相互作用调节剂，包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子、DNA、RNA或蛋白合成抑制剂、甾体和非甾体抗炎药、抗血管生成因子、抗阿尔茨海默病药物。
在一些实施方案中，生物活性化合物是低至中等分子量的化合物(例如，约200至5000Da、约200至约1500Da，优选约300至约1000Da)。
示例性的细胞毒性药物特别是那些用于癌症治疗的药物。这些药物通常包括DNA破坏剂、抗代谢物、天然产物及其类似物、酶抑制剂例如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂、DNA结合剂、DNA烷基化剂、辐射敏化剂、DNA嵌入剂、DNA裂解剂、微管稳定剂和去稳定剂、拓扑异构酶抑制剂。实例包括但不限于基于铂的药物、蒽环类药物、长春花类药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、紫杉烷类、lexitropsins、蝶啶类药物、双炔、鬼臼毒素、海兔毒素、美登木素、分化诱导剂和紫杉醇类。这些类别中特别有用的成员包括，例如，奥利斯他汀(auristatins)、美登素(maytansine)、美登木素(maytansinoid)、卡奇霉素(calicheamicin)、更生霉素(dactinomycin)、多卡霉素(duocarmycin)、CC1065及其类似物、喜树碱及其类似物、SN-38及其类似物；DXd、tubulysin M、念珠藻素(cryptophycins)、吡咯并苯二氮和吡咯并苯并二氮二聚体(PBD)、吡啶并苯并二氮(PDD)和吲哚并苯并二氮(IBD)(参见US20210206763A1)、氨甲蝶呤(methotrexate)、甲基叶酸(methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、DNA小沟结合剂、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、环氧长春碱(leurosine)、leurosideine、放线菌素、蒽环类(阿霉素、表柔比星、伊达比星、柔红霉素、PNU-159682(参见US10,288,745B2)及其类似物、丝裂霉素C、丝裂霉素A、caminomycin、氨基蝶呤、太利苏霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素和；鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷、长春碱、长春新碱、长春地辛、紫杉醇、泰索帝(taxotere)视黄酸、丁酸、N8-乙酰亚精胺(N8-acetyl spermidine)、星形孢菌素、秋水仙碱、喜树碱、埃斯帕霉素(esperamicin)、烯-二炔(ene-diyne)及其类似物、哈米特林(hemiasterlin)及其类似物。
其他示例性的药物类别是血管生成抑制剂、细胞周期进展抑制剂、P13K/m-TOR/AKT通路抑制剂、MAPK信号通路抑制剂、激酶抑制剂、蛋白伴侣抑制剂、HDAC抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号通路抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和蛋白降解剂(参见https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.0c00285)。
奥利斯他汀(auristatin)的例子包括海兔毒素10、单甲基奥利斯他汀E(MMAE)、奥利斯他汀F、单甲基奥利斯他汀F(MMAF)、奥利斯他汀F羟丙基酰胺(AF HPA)、奥利斯他汀F苯二胺(AFP)、单甲基奥利斯他汀D(MMAD)、奥利斯他汀PE、奥利斯他汀EB、奥利斯他汀EFP、奥利斯他汀TP和奥利斯他汀AQ。合适的奥利斯他汀也描述于美国；公开号2003/0083263、2011/0020343和2011/0070248；PCT申请；PCT申请公开号WO09/117531、WO2005/081711、WO04/010957；WO02/088172和WO01/24763，以及美国专利号7,498,298；6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,124,431；6,034,065；5,780,588；5,767,237；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,879,278；4,816,444；和4,486,414，其公开内容通过引用全文并入本文。
示例性的药物包括海兔毒素类(dolastatins)及其类似物，包括:海兔毒素A(美国专利号4,486,414)、海兔毒素B(美国专利号4,486,414)、海兔毒素10(美国专利号4,486,444,5,410,024,5,504,191,5,521,284,5,530,097,5,599,902,5,635,483,5,663,149,5,665,860,5,780,588,6,034,065,6,323,315)、海兔毒素13(美国专利号4,986,988)、海兔毒素14(美国专利号5,138,036)、海兔毒素15(美国专利号4,879,278)、海兔毒素16(美国专利号6,239,104)、海兔毒素17(美国专利号6,239,104)和海兔毒素18(美国专利号6,239,104)，以上各个专利都通过引用全文并入本文。
示例性的美登素、美登木素，例如DM-1和DM-4，或美登木素类似物，包括美登木醇(maytansinol)和美登木醇类似物，描述于美国专利号4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；5,208,020；5,416,064；5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,333,410；6,441,163；6,716,821和7,276,497。
其他例子包括mertansine和安丝菌素(ansamitocin)。明确包括二聚体和类似物的吡咯并苯二氮(PBD)，包括但不限于[Denny,Exp.Opin.Ther.Patents,10(4):459-474(2000)]、[Hartley et al.,Expert Opin Investig Drugs.2011,20(6):733-44],Antonowet al.,Chem Rev.2011,111(4),2815-64]。
卡奇霉素包括例如烯二炔类、埃斯培拉霉素(esperamicin)和美国专利号5,714,586和5,739,116中描述的那些。
多卡霉素及其类似物的例子包括CC1065、多卡霉素SA、多卡霉素A、多卡霉素B l、多卡霉素B2、多卡霉素CI、多卡霉素C2、多卡霉素D、DU-86、KW-2189、阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)、卡折来辛(carzelesin)、seco-adozelesin。其他例子包括在例如美国专利号5,070,092；5,101,092；5,187,186；5,475,092；5,595,499；5,846,545；6,534,660；6,548,530；6,586,618；6,660,742；6,756,397；7,049,316；7,553,816；8,815,226；US20150104407；2014年5月2日提交的61/988,011和2014年6月11日提交的62/010,972中描述的那些，以上各个利的公开全文并入本文。
示例性的长春花生物碱(vinca alkaloid)包括长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨，以及美国公开号2002/0103136和2010/0305149以及美国专利号7,303,749中公开的那些，其公开内容通过引用全文并入本文。
示例性的埃博霉素(epothilone)化合物包括埃博霉素A、B、C、D、E和F及其衍生物。合适的埃博霉素化合物及其衍生物描述于例如美国专利号6,956,036；6,989,450；6,121,029；6,117,659；6,096,757；6,043,372；5,969,145；和5,886,026；WO97/19086；以及WO98/08849；W098/22461；W098/25929；W098/38192；WO99/01124；WO99/02514；WO99/03848；WO99/07692；WO99/27890；和W099/28324；其公开内容通过引用全文并入本文。
示例性的念珠藻素(cryptophycin)化合物在美国专利号6,680,311和；6,747,021中描述；其公开内容通过引用全文并入本文。
示例性的铂化合物包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙铂、奥马铂、四铂(tetraplatin)。
示例性的DNA结合或烷基化药物包括CC-1065及其类似物、蒽环类抗生素、卡奇霉素、更生霉素、丝裂霉素、吡咯并苯二氮类等等。
示例性的微管稳定剂和去稳定剂包括紫杉烷化合物，例如紫杉醇、多西他赛、特沙他滨(tesetaxel)和卡巴他赛；美登木素、奥瑞他汀及其类似物、长春花生物碱衍生物、埃博霉素和念珠藻素。
示例性的拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱和喜树碱衍生物、喜树碱类似物和非天然喜树碱，例如CPT-11、SN-38、拓扑替康、9-氨基喜树碱、鲁比替康(rubitecan)、吉马替康(gimatecan)、karenitecin、silatecan、勒托替康(lurtotecan)、依喜替康、DXd、diflometotecan、贝洛替康(belotecan)、勒托替康和S39625。可用于本发明的其它喜树碱化合物包括例如在J.Med.Chem.,29:2358-2363(1986)；J.Med.Chem.,23:554(1980)；J.MedChem.,30:1774(1987)中描述的那些。
血管生成抑制剂包括但不限于MetAP2抑制剂、VEGF抑制剂、PIGF抑制剂、VGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、MetAP2抑制剂。示例性的VGFR和PDGFR抑制剂包括索拉非尼、舒尼替尼和伐他拉尼。示例性的MetAP2抑制剂包括烟曲霉醇类似物，意指包括烟曲霉素核心结构的化合物。
示例性的细胞周期进程抑制剂包括CDK抑制剂，例如BMS-387032和PD0332991；Rho-激酶抑制剂，例如AZD7762；极光激酶抑制剂，例如AZD1152、MLN8054和MLN8237；PLK抑制剂，例如BI 2536、BI6727、GSK461364、ON-01910；和KSP抑制剂，例如SB 743921、SB715992、MK-0731、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
示例性的P13K/m-TOR/AKT信号通路抑制剂包括磷酸肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、GSK-3抑制剂、ATM抑制剂、DNA-PK抑制剂和PDK-1抑制剂。
示例性的P13激酶在美国专利号6,608,053中公开，并且包括BEZ235、BGT226、BKM120、CAL263、demethoxyviridin、GDC-0941、GSK615、IC87114、LY294002、Palomid529、perifosine、PF-04691502、PX-866、SAR245408、SAR245409、SF1126、Wortmannin、XL147和XL765。
示例性的AKT抑制剂包括但不限于AT7867。
示例性MAPK信号通路抑制剂包括MEK、Ras、JNK、B-Raf和p38MAPK抑制剂。
示例性的MEK抑制剂公开在美国专利号7,517,944中，包括GDC-；0973、GSKl120212、MSC1936369B、AS703026、R05126766和R04987655、PD0325901、AZD6244、AZD8330和GDC-0973。
示例性的B-raf抑制剂包括CDC-0879、PLX-4032和SB590885。
示例性的B p38MAPK抑制剂包括BIRB 796、LY2228820和SB 202190。示例性的受体酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于AEE788(NVP-AEE 788)、BIBW2992(阿法替尼)、拉帕替尼、埃罗替尼(特罗凯)、吉非替尼(易瑞沙)、AP24534(波那替尼)、ABT-869(利尼伐尼)、AZD2171、CHR-258(多韦替尼)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)和Vatalinib。
示例性的蛋白伴侣抑制剂包括HSP90抑制剂。示例性抑制剂包括17AAG衍生物、BIIB021、BIIB028、SNX-5422、NVP-AUY-922和KW-2478。
示例性的HDAC抑制剂包括贝利司他(PXD101)、CUDC-101、Droxinostat、ITF2357(Givinostat，Gavinostat)、JNJ-26481585、LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)、LBH-589(Panobinostat)、MC1568、MGCD0103(Mocetinostat)、MS-275(Entinostat)、PCI-24781、Pyroxamide(NSC 696085)、SB939、曲古抑菌素(Trichostatin)A和伏立诺他(SAHA)。示例性的PARP抑制剂包括iniparib(BSI 201)、奥拉帕尼(AZD-2281)、ABT-888(Veliparib)、AG014699、CEP9722、MK 4827、KU-0059436(AZD2281)、LT-673、3-氨基苯甲酰胺、A-966492和AZD2461。
示例性的Wnt/Hedgehog信号通路抑制剂包括维莫德吉(vismodegib)、环巴胺和XAV-939。
示例性的RNA聚合酶抑制剂包括鹅膏毒素。示例性的鹅膏毒素包括α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素、η-鹅膏菌素、鹅膏无毒环肽(amanullin)、鹅膏无毒环肽酸(amanullic acid)、鹅膏酰胺(amanisamide)、amanon和前鹅膏无毒环肽(proamanullin)。
示例性的细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF。
作为特定药物的非限制性实例，可以提及奥利斯他汀、美登木素、PBD、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素
在另一实施方案中，使用如上所述的两种或多种不同药物的组合。
根据另一实施方案，生物活性化合物可以选自任何合成的或天然存在的化合物，其包含一个或多个天然的和/或非天然的、蛋白原性的和/或非蛋白原性的氨基酸残基，例如特别是寡肽或多肽或蛋白。
特定的此类化合物的组包括免疫球蛋白分子，例如抗体、抗体衍生物、抗体片段、抗体(片段)融合物(例如双特异性和三特异性mAb片段或衍生物)、多克隆或单克隆抗体，例如人、人源化、小鼠或嵌合抗体。
用于本发明的抗体的典型非限制性实例选自生物活性，特别是药理活性抗体分子。非限制性实例选自以下组:曲妥珠单抗、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、奥法妥木单抗(ofatumumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、ibritumomab、托西莫单抗(tositumomab)、帕妥珠单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、IGN101、INA01拉贝珠单抗(labetuzumab)、hua33、pemtumomab、奥戈伏单抗(oregovomab)、minretumomab(CC49)、cG250、J591、MOv-18、法妥珠单抗(farletuzumab)(MORAb-003)、3F8、ch14,18、KW-2871、hu3S193、lgN31 1、IM-2C6、CDP-791、埃达珠单抗(etaracizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、MM-121、AMG102、METMAB、SCH 900105、AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507、CP 751871、KB004、III A4、马帕木单抗(mapatumumab)、HGS-ETR2、CS-1008、地舒单抗(denosumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、F19、81C6、匹那妥珠单抗(pinatuzumab)、利法妥珠单抗(lifastuzumab)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、coltuximab、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、抗前列腺特异性膜抗原(anti-PSMA)、MLN-0264、ABT-414、米拉组单抗(milatuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿比妥珠单抗(abituzumab)、阿德木单抗、阿托珠单抗(afutuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomabpentetate)、amatuximab、anatumomab、阿奈妥单抗(anetumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、ascrinvacumab、阿替利珠单抗(atezolizumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利尤单抗(belimumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡罗单抗(capromab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、citatuzumab、西妥木单抗(cixutumumab)、clivatuzumab、考曲妥珠单抗(codrituzumab)、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、dallotuzumab、达雷妥尤单抗(daratumumab)、demcizumab、地宁妥珠单抗(denintuzumab)、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)、地洛妥单抗(derlotuximab)、地莫单抗(detumomab)、达妥昔单抗(dinutuximab)、曲齐妥单抗(drozitumab)、duligotumab、度伐利尤单抗(durvalumab)、dusigitumab、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、elgemtumab、emactuzumab、enavatuzumab、依米妥珠单抗(emibetuzumab)、恩诺单抗(enfortumab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗、法妥珠单抗、非拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、艾芦库单抗(icrucumab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、英度妥单抗(indusatumab)、伊奈利珠单抗(inebilizumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、来沙木单抗(lexatuzumab)、利洛托单抗(lilotomab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马吉妥昔单抗(margetuximab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米妥昔单抗(mirvetuximab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、莫塞妥莫单抗(moxetumomab)、nacolomab、naptumomab、那呐妥单抗(narnatumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗、纳武单抗(nivolumab)、nofetumomab、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法妥木单抗、奥拉单抗(olaratumab)、奥那妥组单抗(onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、oportuzumab、奥戈伏单抗、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、pankomab、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、pemtumomab、匹地利珠单抗(pidilizumab)、pintumomab、polatuzumab、普托木单抗(pritumumab)、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗、利妥木单抗(rilotumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙西妥珠单抗(sacituzumab)、沙马组单抗(samalizumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、sofituzumab、tacatuzumab、taplitumomab、他瑞妥单抗(tarextumab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、tetulomab、替西木单抗(ticilimumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗、托维妥单抗(tovetumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、伐达妥昔单抗(vadastuximab)、vandortuzumab、万替妥单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维森库单抗(vesencumab)、伏洛昔单抗、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、zatuxima，其组合及其衍生物，以及靶向CAI 25、CAI 5-3、CAI 9-9、L6、Lewis Y、Lewis X、α甲胎蛋白、CA 242、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生长因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、转铁蛋白受体、p97、MUCI、CEA、gplOO、MARTI、IL-2受体、CD20、CD52、CD33、CD22、人绒毛膜促性腺激素、CD38、CD40、粘蛋白、P21、MPG和Neu癌基因产物的其他单克隆抗体。
2.2标记试剂
根据本发明可以使用的标记试剂可以包含不会对四嗪部分的反应性产生负面影响的本领域已知的任何类型的标记物。
本发明的标记物包括但不限于染料(例如荧光、发光或磷光染料，例如丹酰、香豆素、荧光素、吖啶、罗丹明、硅-罗丹明，BODIPY或花青染料)、发色团(例如光敏色素、藻胆素、胆红素等)、放射性标记物(例如氢、氟、碳、磷、硫或碘的放射性形式，例如氚、氟-18、碳-11、碳-14、磷-32、磷-33、硫-33、硫化物-35、碘-123或碘-125)、MRI敏感自旋标记物、亲和标签(如生物素、His-tag、Flag-tag、strep-tag、糖、脂质、固醇、PEG接头、苄基鸟嘌呤、苄基胞嘧啶或辅因子)、聚乙二醇基团(例如，分支PEG、直链PEG、不同分子量的PEG等)、光交联剂(如对叠氮碘乙酰苯胺)、NMR探针、X射线探针、pH探针、IR探针、树脂、固体载体。
在一些实施方案中，示例性染料可以包括在光谱的近红外区域发出荧光的NIR造影剂。示例性的近红外荧光团可以包括发射波长(例如峰值发射波长)在约630至1000nm之间的染料和其他荧光团，例如，在约630至800nm之间、在约800至900nm之间、约900至1000nm之间、约680至750nm之间、约750至800nm、约800至850nm之间、约850至900nm之间、约900至950nm之间或约950至1000nm。发射波长(例如峰值发射波长)大于1000nm的荧光团也可用于本文所述的方法中。
在一些实施方案中，示例性荧光团包括7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、TEXAS REDTM(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、7-二乙氨基香豆素-3-羧酸、四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯、5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、6-[荧光素5-(和-6)-甲酰胺]己酸、N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a二氮杂-3-苯并二茚丙酸、曙红-5-异硫氰酸酯、赤藓红-5-异硫氰酸酯和CASCADETMblue乙酰叠氮化物(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)以及ATTO染料。
其他合适的荧光团例如描述在EP3572468A1中。另外的标记试剂是177镥、89锆(Zirkonium)、131碘、68镓、99m-Technecium、225锕、213铋(Bismut)、90钇、212铅、111铟、64铜、67铜、124碘、227钍和188铼。
2.3螯合剂
以下列出了典型适用的螯合剂及其简称；其相应的盐也是可应用的:
乙酰丙酮(ACAC)、乙二胺(EN)、2-(2-氨基乙基氨基)乙醇(AEEA)、二乙烯三胺(DIEN)、亚氨基二乙酸酯(IDA)、三乙烯四胺(TRIEN)、三氨基三乙胺、次氮基三乙酸(NTA)及其盐如Na3NTA或FeNTA、乙二胺三乙酸盐(TED)，乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐如Na2EDTA和CaNa2EDTA，二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸盐(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、草酸盐(OX)、酒石酸盐(TART)、柠檬酸盐(CIT)、丁二酮肟(DMG)、8-羟基喹啉、2,2'-联吡啶(BPY)、1,10-菲啰啉(PHEN)、二巯基琥珀酸(DMSA)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、水杨酸钠、甲氧基水杨酸盐、英国抗路易气剂或2,3-二巯基丙醇(BAL)、内消旋-2,3-二巯基琥珀酸(DMSA)、微生物分泌的铁载体，例如去铁胺(desferrioxamine)或去铁胺B，也称为Deferral(Novartis)，由链霉菌属菌(Streptomyces spp.)产生；去铁胺(DFO)，一种由毛链霉菌(Streptomyces pilosus)分泌的三异羟肟酸；植物化学物质如姜黄素类和麦根酸的衍生物，如3-羟基麦根酸和2′-脱氧麦根酸；合成的螯合剂，如布洛芬；邻苯二酚、异羟肟酸酯和羟基吡啶酮的衍生物，如异羟肟酸酯desferal和羟基吡啶酮去铁酮；去铁酮(L1或1,2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮)；D-青霉胺(DPA或D-PEN)，其为β-β-二甲基半胱氨酸或3-巯基-D-缬氨酸；四亚乙基四胺(TETA)或曲恩汀及其两种主要代谢产物N1-乙酰基三亚乙基四胺(MAT)和N1,N10-二乙酰基三亚乙基四胺(DAT)；羟基喹啉；氯碘羟喹，其是8-羟基喹啉的卤代衍生物；和5,7-二氯-2-[(二甲氨基)甲基]喹啉-8-醇(PBT2)
2.4光敏剂/蛋白降解剂
作为非限制性实例，通常可以提及PROTAC，但存在大量的不同的E3连接酶结合分子与特定靶向蛋白结合以降解(vgl WO2017201449A1)。(Maneiro,M.et al ACSChem.Biol.2020,15,6,1306–1312
3.负载物分子Y与亲水性四嗪的连接
3.1可裂解部分A
合适的可裂解部分A在现有技术中是众所周知的。
可参考：Bargh et al.,Chem Soc Rev 2019,48(16),4361-4374；Poreba,FEBS J2020,287(10),1936-1969和Salomon et al.,Mol Pharmaceutics 2019 16,(12),4817–4825；
作为进一步的实例，可以提及携带β-葡糖醛酸衍生的触发残基的β-葡糖苷酸接头。
其非限制性实例为：
或者
3.2自降解基团X
合适的自降解部分X在现有技术中是众所周知的。
可参考：Santi et al.,J Med Chem 2014,57(6),2303–2314；Alouane et al.,Angew Chem Int Ed 2015,54(26),7492-7509；和Kolakowski et al.,Angew Chem 2016,128(28),8080-8083
4.(生物)偶联物的形成
本发明的生物偶联物通过生物偶联提供，其中使合适地官能化的生物分子与式I的四嗪化合物反应，从而在所述官能化的生物学分子与所述四嗪之间形成共价连接。所述生物分子充当将负载物部分Y(式I的四嗪化合物的一部分)靶向特定感兴趣的位置(“靶标”)的“靶向剂”。根据这样的“靶标”的类型，可以选择相应的合适的“靶向剂”。一旦被靶向，则包含负载物部分的生物偶联物可以进一步作用于靶标或包含所述靶标的生物结构。
4.1靶向剂及其靶标
这样的靶向剂的主要目的是与特定“靶标”形成共价或非共价连接。靶向剂的第二个目的是将“负载物分子”靶向转运至所述靶标。为了实现所述第二个目的，POI必须与至少一种负载物分子结合(可逆或不可逆)。为此目的，所述POI必须通过引入所述至少一种ncAA而被官能化。然后，携带所述至少一种ncAA的官能化的POI可以通过所述ncAA残基的生物偶联与所述至少一种负载物分子连接。所述ncAA能够与负载物分子反应，所述负载物分子相应地携带能够与POI的所述至少一个ncAA残基反应的相应部分。由此获得的生物偶联物，即靶向剂，允许负载物分子转移到预期靶标。
例如，“靶标”可以是存在于生物体、组织或细胞中和/或其上的任何分子。这样的靶标对于特定的生物体、组织或细胞可能是非特异性或特异性的。靶标包括细胞表面靶标，例如受体、糖蛋白、聚糖、碳水化合物；结构蛋白，例如淀粉样蛋白斑块；丰富的细胞外靶标例如基质中，细胞外基质靶标例如生长因子和蛋白酶；细胞内靶标，例如高尔基体表面、线粒体表面、RNA、DNA、酶、细胞信号通路的成分；和/或异物，例如病原体，例如病毒、细菌、真菌、酵母或其部分。
靶标的实例包括化合物，例如其存在或表达水平与某一组织或细胞类型相关或其表达水平在某一病症中上调或下调的蛋白。
特别地，这样的靶标是一种蛋白，例如(内化或非内化)受体。
靶标可以选自人体或动物体内或病原体或寄生虫上的任何合适的靶标。
合适靶标的非限制性实例包括但不限于以下的组包括细胞组分如细胞膜和细胞壁、受体例如细胞膜受体、细胞内结构如高尔基体或线粒体、酶、受体、DNA、RNA、病毒或病毒颗粒、巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞、抗体、蛋白、碳水化合物、单糖、多糖、细胞因子、激素、甾体、生长抑素受体、单胺氧化酶、毒蕈碱受体、心肌交感神经系统、(例如白细胞上的)白三烯受体、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)、叶酸受体、凋亡标志物、(抗)血管生成标志物、胃泌素受体、多巴胺能系统、血清素能系统、GABA能系统、肾上腺素能系统、胆碱能系统、阿片受体、GPIIb/IIIa受体和其他血栓相关受体、纤维蛋白、降钙素受体、促吞噬肽受体、P-糖蛋白、神经降压素受体、神经肽受体、P物质受体、NK受体、CCK受体、σ受体、白细胞介素受体、单纯疱疹病毒酪氨酸激酶、人酪氨酸激酶、整合素受体、纤连蛋白靶标、AOC3、ALK、AXL、C242、CA-125、CCL11、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD15、CA15-3、CD18、CD19、CA19-9、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD31、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD72、CD74、CD79-B、CD80、CD105、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD174、CD227、CD326、CD340、VEGF/EGF和VEGF/EGF受体、VEGF-A、VEGFR2、VEGFR1、TAG72、CEA、MUC1、MUC16、GPNMB、PSMA、Cripto、Tenascin C、黑皮素-1受体、G250、HLA DR、ED-B、TMEFF2、EphB2、EphB4、EphA2、FAP、间皮素、GD2、GD3、CAIX、5T4、聚集因子、CTLA-4、CXCR2、FGFR1、FGFR2、FGFR 3、FGFR4、NaPi2b、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ErbB2、ErbB3、EpCAM、FLT3、HGF、HER2、HER3、HMI24、ICAM、ICOS-L、IGF-1受体、TRPV1、CFTR、gdNMB、CA9、c-KIT、c-MET、ACE、APP、肾上腺素能受体β2、Claudine 3、RON、RORl、PD Ll、PD-L2、B7-H3、B7-H4、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体、整合素、IFN-α、IFN-γ、IgE、IGF-1受体、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、干扰素受体、ITGB2(CD18)、LFA-1(CDl-la)、L-选择素、P-选择素、E-选择素、粘蛋白、肌肉生长抑制素、NCA-90、NGF、PDGFRα、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌、狂犬病、RANKL、呼吸道合胞病毒、Rh因子(Rhesus factor)、SLAMF7、鞘氨醇-1-磷酸、TGF-1、TGFβ2、TGFβ、TNFα、TRAIL-R1、TRAIL-R2、CTAA 16.88、波形蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)如MMP2、MMP9、MMP14、LDL受体、内皮联蛋白、聚唾液酸及其相应的凝集素。纤连蛋白靶标的一个例子是纤连蛋白的可变剪接额外结构域A (extra-domain-A，ED-A)和额外结构域B(extra-domain-B，ED-B)。基质中靶标的非限制性实例可在V.Hofmeister,D.Schrama,J.C.Becker,Cancer Immun.；Immunother.2008,57,1中找到，其内容通过引用并入本文。
更特别地，为了允许(特异性)靶向上述靶标，靶向剂可以包括包含ncAA官能化的肽序列的化合物。这些化合物包括但不限于抗体、抗体衍生物、抗体片段、抗体(片段)融合物(例如双特异性和三特异性mAb片段或衍生物)、蛋白、肽，例如奥曲肽及其衍生物、VIP、MSH、LHRH、趋化肽、铃蟾肽、弹性蛋白、肽模拟物、受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、甾体、毒素。
根据一特定的方面，靶标是受体，并且使用了能够与靶标特异性结合的靶向剂。合适的靶向剂包括但不限于这样的受体的配体或其一部分，其仍然与受体结合，例如在受体结合蛋白配体的情况下为受体结合肽。
蛋白性质的靶向剂的其他实例包括胰岛素、转铁蛋白、纤维蛋白原γ片段、血小板应答蛋白、claudin、载脂蛋白E、亲和体分子例如ABY-025、锚蛋白重复蛋白、锚蛋白重复蛋白、干扰素，例如α、β和γ干扰素、白细胞介素、淋巴因子、集落刺激因子和蛋白生长因子，例如肿瘤生长因子，例如α、β肿瘤生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、uPAR靶向蛋白、载脂蛋白、LDL、膜联蛋白V、内皮抑制蛋白和血管抑素。
用于靶向剂的肽分子如抗体的实例包括LHRH受体靶向肽、EC-1肽、RGD肽、HER2靶向肽、PSMA靶向肽、生长抑素靶向肽、铃蟾肽。靶向剂的其他实例包括脂质运载蛋白，例如anticalin。
一具体实施方案使用AffibodiesTM和多聚体及其衍生物。
在一具体实施方案中，抗体用于形成靶向剂。虽然源自IgG抗体的抗体或免疫球蛋白特别适合用于本发明，但可以选择任何类别或亚类的免疫球蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。合适地，免疫球蛋白属于IgG类，包括但不限于IgG亚类(IgG1、2、3和4)或能够特异性结合抗原上特定表位的IgM类。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼单域抗体、重组抗体、抗独特型抗体、多特异性抗体、抗体片段，例如Fv、VHH、Fab、F(ab)2、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、单链可变片段抗体(scFv)、串联/双scFv、Fc、pFc’、scFv-Fc、二硫键Fv(dsFv)、双特异性抗体(bc-scFv)如BiTE抗体、三特异性抗体衍生物例如tribody、骆驼抗体、微抗体、纳米抗体、表面重构抗体(resurfaced antibodies)、人源化抗体、全人抗体、单结构域抗体(sdAb，也称为NanobodyTM)、嵌合抗体、包含至少一个人恒定区的嵌合抗体、双亲和力抗体如双亲和力重定向蛋白(DARTTM)、以及多聚体及其衍生物，例如二价或多价单链可变片段(例如双ScFv、三ScFv)，包括但不限于微抗体、二聚体(diabody)、三聚体(triabody)、tribody、四聚体(tetrabody)等，以及多价抗体。参考[Trends in Biotechnology 2015,33,2,65],[Trends Biotechnol.2012,30,575-582]和[Cane.Gen.Prot.2013 10,1-18]以及[BioDrugs2014,28,331-343]，其内容通过引用并入本文。
“抗体片段”指结合其靶标的免疫球蛋白可变区的至少一部分，即抗原结合区。
其他实施方案使用抗体模拟物作为靶向剂，例如但不限于Affimer、Anticalin、Avimer、Alphabody、Affibody、DARPin和多聚体及其衍生物；参考[Trends inBiotechnology 2015,33,2,65]，其内容通过引用并入本文。
为免生疑问，除非另有说明，在本发明的上下文中，术语“抗体”意指包含本段中概述的所有抗体变体、片段、衍生物、融合物、类似物和模拟物。
在一优选的实施方案中，靶向剂选自衍生自抗体和抗体衍生物的试剂，例如抗体片段、片段融合物、蛋白、肽、肽模拟物。
在另一优选的实施方案中，靶向剂选自衍生自抗体片段、片段融合物和不含Fc结构域的其他抗体衍生物的试剂。
待进一步修饰以形成本发明的ncAA修饰的靶向剂的抗体分子的典型非限制性实例选自生物活性，特别是药理活性的抗体分子。非限制性实例选自以下组:曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、伊匹单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、奥法妥木单抗、吉妥珠单抗、本妥昔单抗、ibritumomab、托西莫单抗、帕妥珠单抗、阿德木单抗、IGN101、INA01拉贝珠单抗、hua33、pemtumomab、奥戈伏单抗、minretumomab(CC49)、cG250、J591、MOv-18、法妥珠单抗(MORAb-003)、3F8、ch14,18、KW-2871、hu3S193、lgN311、IM-2C6、CDP-791、埃达珠单抗、伏洛昔单抗、尼妥珠单抗、MM-121、AMG 102、METMAB、SCH 900105、AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507、CP 751871、KB004、III A4、马帕木单抗、HGS-ETR2、CS-1008、地舒单抗、西罗珠单抗、F19、81C6、匹那妥珠单抗、利法妥珠单抗、格巴妥木单抗、coltuximab、洛沃妥珠单抗、英达妥昔单抗、抗前列腺特异性膜抗原(anti-PSMA)、MLN-0264、ABT-414、米拉组单抗、雷莫芦单抗、阿巴伏单抗、阿比妥珠单抗、阿德木单抗、阿托珠单抗、喷替酸阿妥莫单抗、amatuximab、anatumomab、阿奈妥单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、ascrinvacumab、阿替利珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利尤单抗、比伐珠单抗、布隆妥珠单抗、坎妥珠单抗、卡罗单抗、卡妥索单抗、citatuzumab、西妥木单抗、clivatuzumab、考曲妥珠单抗、可那木单抗、达西珠单抗、dallotuzumab、达雷妥尤单抗、demcizumab、地宁妥珠单抗、迪妥昔珠单抗、地洛妥单抗、地莫单抗、达妥昔单抗、曲齐妥单抗、duligotumab、度伐利尤单抗、dusigitumab、依美昔单抗、依决洛单抗、elgemtumab、emactuzumab、enavatuzumab、依米妥珠单抗、恩诺单抗、依诺妥珠单抗、恩妥昔单抗、依帕珠单抗、厄妥索单抗、埃达珠单抗、法妥珠单抗、非拉妥珠单抗、芬妥木单抗、法兰妥单抗、伏妥昔单抗、加利昔单抗、加尼妥单抗、艾芦库单抗、伊戈伏单抗、伊玛鲁单抗、伊马曲单抗、英度妥单抗、伊奈利珠单抗、英妥木单抗、伊妥木单抗、艾萨妥昔单抗、来沙木单抗、利洛托单抗、林妥珠单抗、利瑞鲁单抗、卢卡木单抗、鲁妥珠单抗、马吉妥昔单抗、马妥珠单抗、米妥昔单抗、米妥莫单抗、莫格利珠单抗、莫塞妥莫单抗、nacolomab、naptumomab、那呐妥单抗、耐昔妥珠单抗、奈伐苏单抗、尼妥珠单抗、纳武单抗、nofetumomab、阿托珠单抗、奥卡妥珠单抗、奥法妥木单抗、奥拉单抗、奥那妥组单抗、昂妥昔珠单抗、oportuzumab、奥戈伏单抗、奥乐妥珠单抗、pankomab、帕萨妥珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕曲妥单抗、帕博利珠单抗、pemtumomab、匹地利珠单抗、pintumomab、polatuzumab、普托木单抗、奎利珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥木单抗、罗妥木单抗、沙西妥珠单抗、沙马组单抗、沙妥莫单抗、瑟瑞妥单抗、司妥昔单抗、sofituzumab、tacatuzumab、taplitumomab、他瑞妥单抗、替妥莫单抗、替妥木单抗、tetulomab、替西木单抗、替加珠单抗、托西莫单抗、托维妥单抗、曲美木单抗、西莫白介素单抗、乌妥昔单抗、乌洛鲁单抗、乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、伐达妥昔单抗、vandortuzumab、万替妥单抗、伐努赛珠单抗、伐立鲁单抗、维妥珠单抗、维森库单抗、伏洛昔单抗、沃瑟妥珠单抗、伏妥莫单抗、扎芦木单抗、zatuxima，其组合及其衍生物，以及靶向CAI 25、CAI 5-3、CAI 9-9、L6、Lewis Y、Lewis X、α甲胎蛋白、CA 242、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生长因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、转铁蛋白受体、p97、MUCI、CEA、gplOO、MARTI、IL-2受体、CD20、CD52、CD33、CD22、人绒毛膜促性腺激素、CD38、CD40、粘蛋白、P21、MPG和Neu癌基因产物的其他单克隆抗体。
根据本发明的另一具体实施方案，选择靶标和靶向剂以实现组织或疾病的特异性或增强的靶向，所述组织或疾病例如癌症、炎症、感染、心血管疾病，例如血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧部位，例如中风、肿瘤、心血管疾病、脑疾病、凋亡、血管生成、器官和报道基因/酶。这可以通过选择具有组织、细胞或疾病特异性表达的靶标来实现。
举例来说，对于给定的细胞群体，靶向剂特异性结合或复合细胞表面分子，例如细胞表面受体或抗原。靶向剂与受体特异性结合或复合后，药物将进入细胞。
如本文所用,“特异性结合或复合”或“靶向”细胞表面分子、细胞外基质靶标或另一靶标的靶向剂优选通过分子间力与靶标结合。例如，配体可优先与解离常数(KD或Kd)小于约50nM、小于约5nM或小于约500pM的靶标结合。
4.3亲双烯体
为了能够共价结合通式I四嗪化合物，靶向剂(特别是生物分子)通常必须被官能化。
官能化方法是本领域众所周知的。
适合与四嗪部分反应的不同种类的亲双烯体在本领域中是众所周知的。通常，多环(more-cyclic)或多环(poly-cyclic)，特别是单环和双环不饱和亲双烯体是适用的。
这样的亲双烯体能够通过Diels-Alder型环加成反应进行反应，例如环辛炔基亲双烯体、反式环辛烯基亲双烯体、降冰片烯基亲双烯体、环丙烯基亲双烯体、环丁烯基亲双烯体、螺己烯基亲双烯体、BCN亲双烯体或氮杂环丁烯亲双烯体。
它们在现有技术中被描述(其公开内容通过引用并入本文)，例如：
Oliveira,B.L.et al,Chem Soc Rev 2017,46,4895；
Kozma,E.,ChemBioChem 2017,18,486；
Siegl,S.J.et al,Chem Eur J 2018,24,2426；
Ramil,C.P.et al,J Am Chem Soc 2017,139,13376
Liu,K,et al Chem Comm,2017,53,10604
欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)名义的WO2015/107064A1。
WO2012104422A1
US2013137763A1
4.4生物正交生物偶联
根据本发明，靶向剂可以使用合适的翻译系统，特别是体内翻译系统来制备，所述靶向剂特别是包含多肽部分的靶向剂，包含一个或多个UNAA残基。体内翻译系统可以是细胞，例如原核或真核细胞。细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)；真菌细胞，例如酵母细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或甲基营养型酵母；植物细胞或动物细胞，例如昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如HEK细胞或HeLa细胞。用于多肽表达的真核细胞可以为单细胞，或为多细胞生物体的一部分。
所应用的细胞系统包含(例如，加入)至少一种非天然氨基酸或其盐，其对应于待制备的靶向剂的UNAA残基。该细胞系统还包含：
(i)本发明的PylRS和tRNAPyl，其中PylRS能够(优选地为选择性地)用UNAA或其盐来酰化tRNAPyl；和
(ii)编码靶向剂的多核苷酸，其中被UNAA残基占据的靶向剂任何位置由密码子(例如选择密码子)编码，该密码子是tRNAPyl的反密码子的反向互补。
培养细胞系统以允许翻译靶向剂，编码多核苷酸(ii)，从而产生靶向剂。
为了制备靶向剂，根据本发明的方法，步骤(b)中的翻译可以通过在合适的条件下培养细胞系统来实现，优选在UNAA或其盐存在下(例如，在含有UNAA或盐的培养基中)培养一段时间，该时间适合于在细胞的核糖体上进行翻译。根据编码靶向剂的多核苷酸(以及任选的PylRS、tRNAPyl)，可能需要通过添加诱导转录的化合物来诱导表达，例如阿拉伯糖、异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或四环素。编码靶向剂的mRNA(包含一个或多个密码子，是tRNAPyl包含的反密码子的反向互补)被核糖体结合。然后，通过在由密码子编码的位置逐步连接氨基酸和UNAA来形成多肽，所述密码子由各自的氨酰tRNA识别(结合)。因此，UNAA被掺入到靶向剂中由密码子编码的位置，该密码子是tRNAPyl包含的反密码子的反向互补。
细胞系统可包含编码本发明的PylRS的多核苷酸序列，其允许细胞表达PylRS。同样，tRNAPyl可由细胞系统基于细胞包含的编码tRNAPyl的多核苷酸序列产生。编码多核苷PylRS的多核苷酸序列和编码tRNAPyl的多核苷酸序列可以位于同一多核苷酸上，也可以位于不同的多核苷酸上。
因此，在一实施方案中，本发明提供生产包含一个或多个UNAA残基的靶向剂的方法，其中该方法包括以下步骤:
(a)提供包含多核苷酸序列的细胞系统，该多核苷酸序列编码:
-至少一种本发明的PylRS，
-至少一种可被PylRS酰化的tRNA (tRNAPyl)，和
-至少一种靶向剂，其中被UNAA残基占据的靶向剂的任何位置由密码子编码，该密码子是tRNAPyl的反密码子的反向互补；和
(b)允许细胞系统在UNAA或其盐的存在下翻译多核苷酸序列，从而产生PylRS、tRNAPyl和POI。
通过将编码PylRS、tRNAPyl和靶向剂的多核苷酸序列引入(宿主)细胞，可以制备用于制备靶向剂的细胞系统，所述细胞系统包含一个或多个本文所述的非天然氨基酸残基。所述多核苷酸序列可以位于同一多核苷酸上或不同的多核苷酸上，并且可以通过本领域已知的方法(例如，使用病毒介导的基因递送、电穿孔、显微注射、脂质体转染等)引入细胞中。
翻译后，根据本发明制备的靶向剂可以任选地根据本领域通常已知的程序回收和纯化至部分或基本上均质。除非靶向剂分泌到培养基中，否则回收通常需要细胞破碎。细胞破碎方法是本领域众所周知的，包括物理破碎，例如通过超声处理、液体剪切破碎(例如通过French press)、机械方法(例如利用搅拌机或研磨机的方法)或冻融循环，以及使用破坏脂质-脂质、蛋白-蛋白和/或蛋白-脂质相互作用的试剂(例如去污剂)的化学裂解，以及物理破碎技术和化学裂解的组合。从细胞裂解物或培养基中纯化多肽的标准程序也是本领域众所周知的，包括例如硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱提取、柱层析、亲和柱层析、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析、凝集素层析、凝胶电泳等。如果需要，可以使用蛋白复性步骤来制备正确折叠的成熟蛋白。在需要高纯度的最终纯化步骤中，可以使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其他合适的方法。针对本发明的多肽来制备的抗体可用作纯化试剂，即用于多肽的基于亲和力的纯化。多种纯化/蛋白折叠方法是本领域众所周知的，包括例如Scopes,Protein Purification,Springer,Berlin(1993)；和Deutscher,Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification,Academic Press(1990)；和其中引用的参考文献中描述的那些。
如上所述，本领域技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化后，多肽可以具有不同于相关多肽所需构象的构象。例如，原核系统产生的多肽通常通过暴露于离散剂进行优化，以实现正确的折叠。在从例如大肠杆菌(E.coli)来源的裂解物中纯化的过程中，表达的多肽任选变性，然后复性。这是通过例如将蛋白溶解在离散剂如盐酸胍中来实现的。通常，有时需要变性和减少表达的多肽，然后使多肽重新折叠成优选的构象。例如，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白可以添加到感兴趣的翻译产物中。还原、变性和复性蛋白的方法是本领域技术人员熟知的。多肽可以在含有例如氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。
这样制备的靶向剂然后可以通过与上述通式I的四嗪化合物反应转化成相应的生物偶联物。
5.药物组合物
本发明的偶联物或生物偶联物，例如APC，特别是本发明的ADC(即活性剂或活性成分)通常以“药物组合物”的形式给出，其由治疗和/或预防有效量或诊断有效量的至少一种这样的活性成分或其药学上可接受的盐和任选的至少一种药学上可接受的赋形剂组成。
所述药物组合物可以通过合适的给药途径递送，例如通过口服、直肠、经粘膜、局部、眼用、耳用或肠道给药；肠胃外给药，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，视情况而定。
根据所述组合物的性质或给药方式和剂型，所述至少一种另外的药物赋形剂可以不同。
“赋形剂”是与活性成分一起配制的物质，其被包括用于不同的目的，例如用于长期稳定、填充含有少量有效活性成分的固体制剂(因此通常被称为“增容剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，或者用于增强最终剂型中活性成分的治疗效果，例如促进药物吸收、降低粘度或提高溶解度。赋形剂在药物组合物的生产过程中也是有用的，除了有助于体外稳定性例如防止在预期的保质期内变性或聚集之外，还有助于活性物质的处理，例如通过促进粉末流动性或不粘性质。合适赋形剂的选择不仅取决于给药途径和剂型，还取决于特定的活性成分和其他因素。
赋形剂可选自以下类别：免疫佐剂、抗粘附剂、粘合剂、包衣、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和载体。
赋形剂的非限制性例子包括稀释剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂，如乳化聚合物，例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆，抗氧化剂；抗刺激剂、螯合剂和稳定盐，例如氯化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐和硝酸盐、悬浮剂、抗菌剂或抗真菌剂。此外，可以使用缓冲剂，例如低分子量有机酸和相应盐的缓冲系统，或无机缓冲物质，例如磷酸盐缓冲剂。其他合适的成分也可从相关的药理学标准文献中获知。此外，各种组分的比例将根据所用具体组分的性质而变化，并且是本领域技术人员公知的(雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceuticalscience("Handbook of Pharmaceutical Excipients",2nd Edition,(1994),由AWade和PJ Weller编辑，或在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro编辑，1985)上。
本文所用的药物组合物可以以“剂型”或“单位剂量”的形式存在，并且可以包含一种或多种APC，特别是本文所述的ADC。因此，本文所用的药物组合物可以例如提供在单位剂量中混合在一起的两种活性剂，或者提供在剂型中组合的两种活性剂，其中活性剂是物理分离的。
此外，可以在靶向药物递送系统中施用药物组合物，例如，在用内皮细胞特异性抗体包被的脂质体中。
本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制造，例如通过常规的混合、溶解、乳化、封装、包埋或其组合。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与患者的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的风险/效益比相称的其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本发明包括活性成分的所有“药学上可接受的盐形式”。药学上可接受的盐是其中反离子对化合物的生理活性或毒性没有显著贡献并且作为药理学等效物起作用的那些盐。这些盐可以根据普通的有机技术，使用市售试剂来制备。一些阴离子盐形式包括乙酸盐、醋硬脂酸盐(acistrate)、苯磺酸盐、溴化物、氯化物、柠檬酸盐、富马酸盐、葡糖醛酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、碘化物、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和昔萘酸盐(xinofoate)。一些阳离子盐形式包括铵、铝、苄星、铋、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、锂、镁、甲葡胺、4-苯基环己胺、哌嗪、钾、钠、氨丁三醇和锌。
“治疗有效量”和/或“预防有效量”是指当给予人类或非人类患者时，提供任何治疗和/或预防益处的有效量。更特别地，“治疗有效量”是本文公开的活性成分或两种或多种这样的活性成分的组合的量，其完全或部分抑制疾病的发展或至少部分缓解疾病的一种或多种症状。
“诊断有效量”是指能够有效地从患者获得关于疾病状态或进展的有诊断价值的信息的量。
治疗益处可以是改善患病患者的症状，例如有效减轻患病患者症状的量。在某些情况下，患者可能不会出现患者正在接受治疗的病症的症状。因此，化合物的预防有效量也是足以对疾病、紊乱或病症的任何体征提供显著积极作用的量，例如足以显著降低疾病症状发生的频率和严重性的量。
治疗有效量也可以是预防有效的量。
本文所用的“患者”是指人类或非人类，特别是人类、动物。
“剂型”是本文所述的一种或多种活性剂的任何给药单位(“单位剂量”)。
术语“治疗”是指:(i)预防可能易患疾病、紊乱和/或病症但尚未被诊断为患有该疾病、紊乱或病症的患者发生该疾病、紊乱或病症；(ii)抑制疾病、紊乱或病症，即阻止其发展；和(iii)缓解疾病、紊乱或病症，即引起疾病、紊乱和/或病症的消退。特别地，它包括预防性或治疗性治疗或其组合。
剂量的“频率”可以根据所用的化合物和所治疗的特定感染类型而变化。每天一次的剂量方案是可能的。其中活性剂每天给药几次，例如2至10次，如2、3、4、5、6、7、8、9或10次的剂量方案有时可能更有帮助。
然而，应当理解，任何特定患者的特定剂量水平和频率将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和接受治疗的患者特定疾病的严重程度。通常可以使用适用于正在治疗或预防的病症的分析来监测患者的治疗或预防效果，这对于本领域的普通技术人员来说是熟悉的。
根据本发明的药物组合物的具体实例是液体形式的制剂，例如溶液、悬浮液和乳液，并且包含治疗有效量的至少一种APC，特别是如上所定义的ADC组分，任选地与至少一种如上所定义的另外的药学上可接受的赋形剂一起，并且可以通过任何合适途径给药。
根据本发明的药物组合物的其它实例是固体形式的制剂，例如散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒。
在考虑了本文提供的公开内容之后，对于本领域技术人员来说将变得显而易见的许多可能的变化也落入本发明的范围内。
以下实施例仅是说明性的，并不旨在限制本文所述实施方案的范围。
实施例
A)材料和方法
试剂购自商业供应商，无需进一步纯化即可使用。所有的溶剂，包括无水溶剂，都是从商业来源获得的。对空气和水敏感的试剂和反应通常在氩气氛下进行。
通过在Merck硅胶板60F254上的TLC或通过UHPLC-MS监测反应进程。TLC检测通过254nm紫外光或高锰酸钾染色进行。
使用硅胶(0.060-0.200mm)、KP-Sil柱在Biotage Isolera One纯化系统上进行快速色谱纯化。
制备HPLC纯化在Agilent Infinity 1260系列设备上进行，该设备由Agilent1260制备泵、1260制备自动进样器、1260馏分收集器和1260多波长检测器VL组成。所用的制备柱是Waters X-Bridge Prep C18柱:5μm；19x150mm，使用H2O和乙腈(两者都含有0.1％的TFA)作为溶剂的线性梯度进行操作。
在室温下，在Bruker Avance(400MHz)NMR系统上记录核磁共振谱。化学位移(δ)以百万分率(ppm)给出，耦合常数(J)以赫兹(Hz)给出，裂分用标准缩写进行报告。
UHPLC-质谱分析在Agilent Infinity 1290系列设备上进行，该设备由一个Agilent1290四元泵、一个1290采样器、一个1290恒温柱室和一个配备有四极杆LC/MS 6120和Infinity 1260ELSD的1290二极管阵列检测器VL+组成。所用的分析柱是Acquity UPLCBEH C18柱:1.7μm；2.1x50mm，使用H2O和乙腈(两者都含有0.1％的TFA)作为溶剂的线性梯度进行操作。
B)化合物的合成
实施例1 ((6-(4-(氨基甲基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二乙酯(1)的 合成
向4-氨基甲基-苯甲腈(169mg,1.00mmol,1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(651μL,709mg,4.00mmol,4.00eq)的乙醇(0.5mL)溶液中加入3-巯基丙酸(87.0μL,106mg,1.00mmol,1.00eq)，然后在0℃下加入一水合肼(776μL,801mg,16.0mmol,16.0eq)。混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(1.38g，20.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1MHClaq将其酸化至pH约为3。
通过HPLC纯化得到粉红色油状的1(300mg),其直接用于下一步。
实施例2((6-(4-(氨基甲基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(2)的合成
在0℃下，向1(300mg)的DMF溶液中加入三甲基溴硅烷(530μL，614mg，4.01mmol，5.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后用甲醇和H2O稀释，蒸发溶剂。
通过HPLC纯化得到2，为粉红色粉末(30.0mg，两步收率为8％)。
实施例3 4-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酸(3)的合成
向4-氰基苯甲酸(588mg,4.00mmol,1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(2.60mL,2.84g,16.0mmol,4.00eq)的乙醇(2mL)溶液中加入3-巯基丙酸(348μL,424mg,4.00mmol,1.00eq)，然后在0℃下加入一水合肼(3.10mL,3.20g,64.0mmol,16.0eq)。混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(5.52g，80.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。过滤出粉红色沉淀，用0.1M HClaq洗涤。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1)纯化，得到3，为粉红色粉末(304mg，22％)。
实施例4 2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚胺基)-3H-呫吨-9-基)-5-((4-(6-(膦 酰基甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)氨基甲酰基)苯甲酸盐(4)的合成
向2(5.00mg，17.8μmol，1.00eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入DIPEA(12.4μL，9.20mg，71.2μmol，4.00eq)和5-TAMRA-OSu(10.3mg，19.6μmol，1.10eq)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将粗反应混合物通过HPLC直接进行纯化。
通过HPLC纯化得到4，为红棕色粉末(4.0mg，32％)。
实施例5((6-(4-(((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S, 2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧 基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧 代丁-2-基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(5)的合成
向3(5.57mg，15.8μmol，1.00eq)的溶液中加入DIPEA(6.88μL，5.11mg，39.5μmol，2.50eq)和HATU(9.01mg，23.7μmol，1.50eq)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。然后加入MMAE(12.5mg，17.4μmol、1.10eq)并在室温下将混合物搅拌过夜。用二氯甲烷稀释，用H2O洗涤，干燥有机相，减压蒸发溶剂。
将粗产物溶解在DMF(0.5mL)中，并在0℃下加入三甲基溴硅烷(10.4μL，12.1mg，79.0μmol，5.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过HPLC直接进行纯化。
通过HPLC纯化得到5，为粉红色粉末(5.0mg，2步收率为32％)。
实施例6 2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四 嗪-3-基)苯甲酸酯(6)的合成
向3(100mg，284μmol，1.00eq)的二氯甲烷(2.8mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(49.0mg，426μmol，1.50eq)和EDC盐酸盐(81.6mg，426μmol，1.50eq)，并将混合物在室温下搅拌1小时。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1)纯化，得到6，为粉红色固体(118mg，93％)。
实施例7(4-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酰基)-L-缬 氨酰-L-丙氨酸(7)的合成
向6(118mg，263μmol，1.00eq)的DMF(2.6mL)溶液中加入H-Val-Ala-OH(74.1mg，394μmol，1.50eq)和NEt3(72.8μL，525μmol，2.00eq)，并在室温下搅拌混合物。用二氯甲烷稀释，用H2O和1M HClaq洗涤。将有机相干燥，并在减压下蒸发溶剂。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1→10:1)纯化，得到7，为粉红色固体(135mg，98％)。
实施例8((6-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨 基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二乙酯 (8)的合成
向7(116mg，222μmol，1.00eq)的DMF(2.2mL)溶液中加入对氨基苄醇(41.0mg,333μmol,1.50eq)、HATU(127mg,333μmol,1.50eq)和DIPEA(96.7μL,555μmol,2.50eq)，并在室温下搅拌混合物。用二氯甲烷稀释，用H2O和1M HClaq洗涤。将有机相干燥，并在减压下蒸发溶剂。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1→10:1)纯化，得到8，为粉红色固体(131mg，94％)。
实施例94-((S)-2-((S)-2-(4-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)苯甲酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(9)的合成
向8(131mg，209μmol，1.00eq)的二氯甲烷(2.1mL)溶液中加入PNP氯甲酸酯(63.1mg，313μmol，1.50eq)和DIPEA(54.5μL,313μmol,1.50eq)并在室温下搅拌该混合物。3小时后，加入20mg PNP氯甲酸酯并将该混合物再搅拌1小时。用二氯甲烷稀释并用饱和NaHCO3aq洗涤。将有机相干燥，并在减压下蒸发溶剂。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1→10:1)纯化，得到9，为粉红色固体(101mg，61％)。
实施例10 4-((S)-2-((S)-2-(4-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)苯甲酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1- ((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代 丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代 丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(10)的合成
向9(20.0mg，25.2μmol，1.00eq)和MMAE(18.1mg，25.20μmol，1.00eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入吡啶(0.1mL)、HOBt一水合物(0.773mg，5.05μmol，0.200eq)以及DIPEA(4.39μL，25.2μmol，1.00eq)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将其用二氯甲烷稀释并用H2O洗涤。将有机相干燥，并在减压下蒸发溶剂。
将粗产物10(34.0mg，98％)直接用于下一步骤。
实施例11((6-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)- 12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基- 3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2, 13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代 丁-2-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(11)的合成
向粗品10(34.0mg，24.8μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(32.7μL，248μmol，10.0eq)，并将混合物在室温下搅拌过夜。用MeOH和H2O稀释，混合物直接通过HPLC进行纯化。
通过HPLC纯化得到11(2.1mg，6％)，为粉红色固体。
实施例12((6-(4-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪- 3-基)甲基)膦酸(12)的合成
在0℃下，向6(30.8mg，68.5μmol，1.00eq)的二氯甲烷(0.7mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(27.1μL，206μmol，3.00eq)，并将混合物在该温度下搅拌3小时。加入DMF(0.7mL)，将混合物在室温下搅拌3天。用MeOH和H2O稀释，并在减压下蒸发溶剂。
通过HPLC纯化得到12，为粉红色粉末(17.4mg，65％)。
实施例13((6-(4-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-(((((2S)-1-(((14S,32S,33R,2S,4S, 10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮 杂-1(6,4)-噁嗪烷-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯并环十四烷-10,12-二烯-4-基)氧基)-1- 氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基- 1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(13)的合成
向H-Val-Ala-PAB-美登木素28(12.5mg，12.9μmol，1.00eq)和12(11.2mg，28.4μmol，2.20eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入NEt3(16.1μL，116μmol，9.00eq)，并将混合物在室温下搅拌过夜。用HClaq稀释，混合物直接通过HPLC进行纯化。
通过HPLC纯化得到13(7.8mg，48％)，为粉红色粉末。
实施例14 5-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)间苯二甲酸(14) 的合成
向5-氰基间苯二甲酸(287mg,1.50mmol,1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(972μL,6.00mmol,4.00eq)的EtOH(1.5mL)溶液中加入3-巯基丙酸(131μL,1.50mmol,1.00eq)，然后在0℃下加入一水合肼(1.17mL,24.0mmol,16.0eq)。混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(2.07g，30.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为1。过滤出粉红色沉淀，用0.1M HClaq洗涤。
粗产物14(594mg)不经进一步纯化直接用于下一步骤。
实施例15双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5- 四嗪-3-基)间苯二甲酸酯(15)的合成
向14(594mg，1.50mmol，1.00eq)的二氯甲烷(15mL)混合物中加入N-羟基琥珀酰亚胺(691mg，6.00mmol，4.00eq)和EDC盐酸盐(1.15g，6.00mol，4.00eq)，并在r.t.下搅拌混合物。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1)纯化，得到15，为粉红色固体(750mg，2步收率为85％)。
实施例16 1,1'-(5-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)-1,3-亚 苯基)双(1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧杂-2-氮杂二十九烷-29-酸)(16)的合成
向15(300mg，508μmol，1.00eq)的DMF(5mL)混合物中加入NEt3(140，μL，103mg，1.02mmol，2.00eq)和1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸(449mg，1.02mmol，2.0eq)，并在r.t.下搅拌混合物。用H2O稀释，混合物直接通过HPLC进行纯化。
通过HPLC纯化得到16，为粉红色油状物(83mg，13％)。
实施例17 2-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)乙酸(17)的合成
向氰基乙酸(3.40g，40.0mmol，4.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(1.62mL，10.0mmol，1.00eq)的EtOH(10mL)溶液中加入3-巯基丙酸(871μL，10.0mmol，1.00eq)，然后在0℃下加入一水合肼(7.76mL，160mmol，16.0eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(13.8g，200mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为1。用EtOAc萃取，干燥有机相，减压蒸发溶剂。
通过两次快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 50:1→10:1和20:1→10-1)纯化，得到17，为粉红色油状物(260mg，9％)。
实施例18((6-(5-氨基吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二乙酯(18)的 合成
向5-氨基-2-吡啶腈(1.20g,10.1mmol,1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(6.52mL,7.14g,40.3mmol,4.00eq)的EtOH(10mL)溶液中加入3-巯基丙酸(878μL,1.07g,10.1mmol,1.00eq)，然后在0℃下加入一水合肼(7.82mL,8.07g,161mmol,16.0eq)。混合物在室温下搅拌过夜。
通过旋转蒸发除去溶剂，并通过反相快速色谱纯化残余物。含有二氢四嗪中间体的级分在空气中氧化过夜，然后蒸发溶剂，得到粗产物18。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1)纯化，得到18，为暗红色固体(555mg，17％)。
实施例19((6-(5-氨基吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(19)的合成
在0℃下，向18(78.0mg，241μmol，1.00eq)的二氯甲烷/DMF(2:1,3mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(159μL，184mg，1.20mmol，5.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后用甲醇和H2O稀释，蒸发溶剂。
通过HPLC纯化得到19，为红粉色粉末(36.0mg，56％)。
实施例20((6-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)甲基)膦酸二乙酯(20)的合成
将4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)苯甲腈(980mg，3.17mmol，5.00eq)、氰甲基膦酸二乙酯(103μL，112mg，634μmol，1.00eq)、一水合肼(1.54mL，1.59g，31.7mmol)和Zn(OTf)2(11.5mg，31.7μmol，0.0500eq)的混合物在60℃下搅拌30分钟。然后加入NaNO2(875mg，12.7mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。用DCM萃取，并蒸发溶剂。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 40:1→10:1)纯化，得到20，为暗粉红色油(9.0mg，3％)。
实施例21((6-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)甲基)膦酸(21)的合成
在0℃下，向20(9.0mg，17.5μmol，1.00eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(11.6μL，87.5μmol，5.00eq)，并将混合物在室温下搅拌90分钟。用MeOH和H2O淬灭反应，并直接对混合物进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到21，为暗粉红色油状物(1.7mg，21％)。
实施例22 4-(6-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氧杂三十九烷 基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酸(22)的合成
向2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氧杂四十烷-40-腈(1.20g,2.00mmol,1.00eq)和4-氰基苯甲酸(1.18g,8.00mmol,4.00eq)在EtOH(2mL)中的混合物加入3-巯基丙酸(174μL，212mg，2.00mmol，1.00eq)。然后在0℃下加入一水合肼(1.55mL，1.60g，32.0mmol，16.0eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(5.52g，80.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。用DCM萃取，并蒸发溶剂。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH 20:1→10:1)纯化，得到22，为粉红色油状物(352mg，23％)。
实施例23 4-((S)-2-((S)-2-(4-(6-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38- 十三氧杂三十九烷基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄 基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷- 2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚 烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨 基甲酸酯(23)的合成
向H-Val-Ala-PAB-MMAE(27)(11.0mg，10.6μmol，1.00eq)的溶液中加入22(9.86mg，12.7μmol，1.20eq)、HATU(6.05mg，15.9μmol，1.50eq)和DIPEA(4.62μL，3.42mg，26.5μmol)，并在室温下搅拌混合物1小时。将粗反应混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到23，为粉红色粉末(3.9mg，20％)。
实施例24((6-(4-(氨基甲基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸氢乙酯(24) 的合成
向4-氨基甲基-苯甲腈(169mg，1.00mmol，1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(1.62mL，1.77g，10.0mmol，10.0eq)的混合物中加入一水合肼(2.43μm，2.50g，50.0mmol，50.0eq)以及Zn(OTf)2(18.2mg，50.0μmol，0.0500eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入NaNO2(1.38g，20.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。
通过HPLC纯化得到24，为粉红色粉末(26.1mg，30％)。
实施例25((6-(4-(氨基甲基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(25)的合成
在0℃下，向24(94.0mg，272μmol，1.00eq)的DMF溶液中加入三甲基溴硅烷(382μL，416mg，2.72mmol，10.0eq)。混合物在室温下搅拌5小时。然后用MeOH和H2O稀释，并蒸发溶剂。
通过HPLC纯化得到2，为粉红色粉末(26.1mg，30％)。
实施例26 4-(6-(膦酰基甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酸(26)的合成
向4-氰基苯甲酸(649mg，4.37mmol，1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(3.15mL，3.45g，30.0mmol，6.86eq)的溶液中加入一水合肼(7.28mL，7.51g，150mmol，34.3eq)以及Zn(OTf)2(54.5mg，150μmol，0.0500eq)。将混合物在室温下搅拌4小时。然后加入NaNO2(5.52g，80.0mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。过滤粉红色沉淀物并用0.1M HClaq洗涤以提供3和4-(6-((乙氧基(羟基)膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲酸的粗混合物。
在0℃下向粗沉淀物的DMF溶液中加入三甲基溴硅烷(2.64mL，3.06g，20.0mmol，5.00eq)。混合物在室温下搅拌5小时。然后用MeOH和H2O稀释，并蒸发溶剂。
通过HPLC纯化得到26，为粉红色粉末(64.5mg，5％)。
实施例27H-Val-Ala-PAB-MMAE的合成(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基) 丙酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟 基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲 基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2- 基)(甲基)氨基甲酸酯)(27)
向Fmoc-Val-Ala-PAB-PNP(34.1mg，50.1μmol，1.00eq)和MMAE(36.0mg，50.8μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入吡啶(0.25mL)、HOBt(0.768mg，5.01μmol，0.100eq)和DIPEA(8.73μL，6.48mg，50.1μmol，1.00eq)，混合物在室温下搅拌8小时。在完全转化后，加入哌啶(0.125mL)并将混合物再搅拌5分钟，然后直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到27(44.3mg，85％)，为白色固体。
实施例28H-Val-Ala-PAB-美登木素的合成((14S,32S,33R,2S,4S,10E,12E,14R)- 86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷- 3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯并环十四烷-10,12-二烯-4-基N-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基- 3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯)(28)
向Fmoc-Val-Ala-PAB-PNP(41.0mg，63.0μmol，1.00eq)和美登木素(42.9mg，63.0％μmol，1.00eq)的DMF(0.6mL)溶液中加入吡啶(0.28mL)、HOBt(0.965mg，6.30μmol，0.100eq)和DIPEA(10.9μL，8.14mg，63.0μmol、1.00eq)，混合物在室温下搅拌8小时。在完全转化后，加入哌啶(0.15mL)并将混合物再搅拌5分钟，然后直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到28(25.8mg，42％)，为白色固体。
实施例29(6-氰基吡啶-3-基)膦酸二乙酯(29)的合成
向亚磷酸二乙酯(567μL，608mg，4.40mmol，1.10eq)、NEt3(610μL，445mg，4.40mmol，1.10eq)和Pd(PPh3)4(231mg，200μmol，0.0500eq)的混合物中加入5-溴-2-氰基吡啶(732mg，4.00mmol，1.00eq)和1mL甲苯，并将混合物在90℃下搅拌1小时。
通过快速色谱法(环己烷/EtOAc 1:1)纯化得到29，为无色油状物(650mg，68％)。
实施例30 3-(6-(4-(羟基(甲氧基)膦酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)丙酸(30) 的合成
向(4-氰基苯基)膦酸二甲酯(54.0mg，256μmol，1.00eq)和3-氰基丙酸(87.0mg，878μmol，3.43eq)的EtOH(0.26mL)溶液中加入一水合肼(170μL，176mg，3.51mmol，13.7eq)，然后加入3-巯基丙酸(19.1μL，23.3mg，220μmol，0.859eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入亚硝酸钠(303mg，4.39mmol，20.0eq)，并通过滴加1M HClaq将溶液酸化。用EtOAc(3x)萃取，合并有机相用硫酸钠干燥并减压蒸发。
通过反相快速色谱法(0-50％MeOH在H2O中)纯化得到30，为粉红色固体(40.4mg，49％)。
实施例31 3-(6-(4-膦酰基苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)丙酸(31)的合成
在0℃下，向30(15.4mg，47.5μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(31.3μL，36.4mg，237μmol，5.00eq)。将混合物在室温下搅拌30分钟。加入水并直接对混合物进行纯化。
通过反相快速色谱法(0-50％MeOH在H2O中)纯化得到31，为粉红色固体(12.3mg，83％)。
实施例32(4-(6-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)-1,2,4,5-四 嗪-3-基)苯基)膦酸(32)的合成
向31(9.50mg，30.6μmol，1.00eq)的DMF(0.3mL)溶液中加入NEt3(5.09μL，3.72mg，36.8μmol，1.20eq)和N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)(11.1mg，36.8％μmol，1.20eq)。将混合物在室温下搅拌。1.5小时后，再加入10mg TSTU和4μL NEt3，并将混合物再搅拌30分钟。用水稀释，并通过HPLC直接纯化混合物。
通过HPLC纯化得到32，为粉红色固体(2.2mg，18％)。
实施例33 2-(6-(膦酰基甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)乙酸(33)的合成
在0℃下，向17(30.0mg，103μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(136μL，158mg，1.03mmol，10.0eq)。将混合物在室温下搅拌3.5小时。加入水并通过HPLC直接对混合物进行纯化。
通过HPLC纯化得到33，为粉红色固体(2.8mg，12％)。
实施例34(4-(6-(5-氨基嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)膦酸二乙酯(34) 的合成
向(4-氰基苯基)膦酸二乙酯(398mg，256μmol，2.00eq)和2-氰基-5-氨基嘧啶(100mg，833μmol，1.00eq)的EtOH(0.8mL)溶液中加入一水合肼(646μL，667mg，13.3mmol，16.0eq)，然后加入3-巯基丙酸(218μL，265mg，2.50mmol，3.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。用水稀释反应物，并用二氯甲烷(2x)萃取。将合并的有机相用硫酸钠干燥并减压蒸发。
将残余物溶解在5mL二氯甲烷中，并加入150mg对苯醌，将混合物搅拌5分钟并直接进行柱色谱。
通过快速色谱法(二氯甲烷/MeOH，梯度为20:1至10:1)纯化，得到34，为橙棕色油状物(139mg，43％)。
实施例35(4-(6-(5-氨基嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)膦酸(35)的合成
在0℃下，向34(22.8mg，58.9μmol，1.00eq)的DMF(0.6mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(155μL，180mg，1.18mmol，20.0eq)。将混合物在室温下搅拌2小时。加入水并搅拌混合物5分钟。滤出形成的沉淀物并用水和丙酮洗涤。
分离35，为红色固体(2.8mg，12％)。
实施例36(6-(6-(5-氨基吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)膦酸二乙 酯(36)的合成
向29(240mg，999μmol，1.00eq)和2-氰基-5-氨基吡啶(476mg，4.00mmol，4.00eq)的EtOH(1mL)溶液中加入一水合肼(775μL，800mg，13.3mmol，16.0eq)，然后加入3-巯基丙酸(87.1μL，106mg，999μmol，1.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入1mL DMF以溶解形成的沉淀物，并将混合物在60℃下搅拌4h。通过反相柱色谱法直接对混合物进行纯化。
将分离的二氢四嗪化合物(9.9mg)溶于0.5mL DMF/MeOH中，加入2.7mg对苯醌并将混合物搅拌5分钟。通过HPLC直接纯化混合物。
通过HPLC纯化得到36，为橙色固体(7.3mg，2％)。
实施例37(6-(6-(5-氨基吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)膦酸(37) 的合成
在0℃下，向36(3.8mg，9.81μmol，1.00eq)的DMF(0.1mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(12.9μL，15.0mg，98.1μmol、10.0eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后加入12μL TMS-Br，并将混合物在室温下搅拌5小时。然后加入20μL TMS-Br，并将混合物在室温下搅拌6小时。加入水并通过HPLC直接对混合物进行纯化。
通过HPLC纯化得到37，为橙色固体(1.8mg，55％)。
实施例38(6-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)甘氨 酸(38)的合成
向(6-氰基吡啶-3-基)甘氨酸(340mg，1.92mmol，1.00eq)和氰甲基膦酸二乙酯(621μL，680mg，3.84mmol，2.00eq)的EtOH(2mL)溶液中加入一水合肼(1.49mL，1.54g，30.7mmol，16.0eq)，然后加入3-巯基丙酸(502μL，611mg，5.76mmol，3.00eq)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后在减压下除去挥发性组分，并通过反相柱色谱纯化残余物。
将分离的二氢四嗪化合物(320mg)溶于10mL DMF/MeOH中，加入108mg对苯醌，并将混合物搅拌5分钟。
通过柱色谱法直接对混合物进行纯化，得到35mg产物38。另外分离的混合级分通过HPLC进行纯化。
通过HPLC纯化得到38，为红色固体(130mg，18％)。
实施例39(6-(6-(膦酰基甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)甘氨酸(39)的合 成
在0℃下，向38(35.0mg，91.5μmol，1.00eq)的DMF(1mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(109μL，126mg，824μmol，9.00eq)。将混合物在室温下搅拌4小时。加入水并搅拌混合物30分钟。用EtOAc萃取，水相冻干。将所得油从丙酮中沉淀并过滤。
分离39，为红色固体(30.0mg，90％)。
实施例40Boc-Val-Cit-PAB-MMAE的合成4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)- 3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷- 1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)- 3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(40)
向Boc-Val-Cit-PAB-PNP(18.0mg，27.9μmol，1.00eq)和MMAE(20.0mg，2.79μmol)的DMF(0.25mL)溶液中加入吡啶(0.125mL)、HOBt(0.428mg，2.79μmol，0.100eq)和DIPEA(4.86μL，3.61mg，27.9μmol，1.00eq)，混合物在室温下搅拌2天。然后，将混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到40(25.2mg，74％)，为白色固体。
实施例41H-Val-Cit-PAB-MMAE的合成4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)- 5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)- 1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基- 5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代 丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(41)
向40(25.2mg，20.6μmol，1.00eq)的二氯甲烷(0.8mL)溶液中加入三氟乙酸(0.2mL)，混合物在室温下搅拌15分钟。然后减压除去溶剂。
通过HPLC纯化得到41(17.0mg，73％)，为白色固体。
实施例42 4-((S)-2-((S)-2-(2-((6-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四 嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1- (((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨 基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基) (甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯 (42)的合成
向41(17.0mg，15.1μmol，1.00eq)的DMF(0.3mL)溶液中加入38(5.79mg，15.1μmol，1.00eq)、EDC(3.48mg，18.2μmol，1.20eq)和NEt3(3.15μL，2.30mg，22.7μmol，1.50eq)，并在室温下将混合物搅拌4小时。然后加入另外的10mg 38、8mg EDC和8μL NEt3，并将混合物再搅拌4小时。将混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到42(2.4mg，11％)，为浅红色固体。
实施例43((6-(5-((2-(((S)-1-(((S)-1-((4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁 基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2- 甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧 代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3- 甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦 酸(43)的合成
向42(2.4mg，1.61μmol，1.00eq)的DMF(0.1mL)溶液中加入TMS-Br(10.6μL，12.3mg，80.7μmol，50.0eq)，并将混合物在室温下搅拌2天。加入水并用EtOAc萃取混合物。将水相冷冻干燥。
分离43，为浅红色固体(1mg，43％)。
实施例44(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11- ((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1- 甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3, 6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡 喃-2-羧酸(44)的合成
向MMAE(19.6mg，27.4μmol，1.00eq)和β-D-葡糖苷酸-PNP-碳酸酯(25.0mg，2.74μmol、1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入吡啶(0.25mL)、HOBt(0.419mg,2.74μmol,0.100eq)和DIPEA(4.77μL,27.4μmol,1.00eq)。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入1M NaOHaq(0.274mL，274μmol，10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。通过HPLC直接对反应混合物进行纯化。
通过HPLC纯化得到44(17.0mg，55％)。
实施例45(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基- 5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3', 4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H- 吡喃-2-羧酸(45)的合成
向依喜替康甲磺酸盐(14.5mg，27.4μmol，1.00eq)和β-D-葡糖苷酸-PNP-碳酸酯(25.0mg，2.74μmol、1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入吡啶(0.25mL)、HOBt(0.419mg,2.74μmol,0.100eq)和DIPEA(4.77μL,27.4μmol,1.00eq)。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入1MNaOHaq(0.274mL，274μmol，10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。通过HPLC直接对反应混合物进行纯化。
通过HPLC纯化得到45(3.0mg，13％)。
实施例46 4-((S)-4-氨基-2-((S)-2-((S)-2-氨基丙酰胺基)丙酰胺基)-4-氧代 丁酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟 基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲 基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2- 基)(甲基)氨基甲酸酯(46)的合成
向MMAE(28.1mg，39.1μmol，1.00eq)和Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP(30.0mg，3.91μmol、1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入吡啶(0.25mL)、HOBt(0.598mg，3.91μmol，0.100eq)和DIPEA(6.81μL，39.1μmol、1.00eq)。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入1M NaOHaq(0.391mL,391μmol,10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。通过HPLC直接对反应混合物进行纯化。
通过HPLC纯化得到46(16.6mg，38％)。
实施例47(3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S, 2R)-1-羟基-1-苯丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙 基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12-三氧代-2-氧杂-15,16-二硫杂-5,8,11-三氮杂 十九烷-19-酸(47)的合成
向3,3'-二硫代二丙酸(29.3mg，139.3μmol，2.00eq)和HATU(26.5mg，69.6μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入DIPEA(12.1μL，69.6μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入MMAE(50.0mg，69.6μmol，1.00eq)和DIPEA(12.1μL，69.6μmol，1.00eq)，将反应混合物在RT下搅拌过夜，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到47(43.0mg，68％)。
实施例48(2-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)乙基)氨基甲酸 叔丁酯(48)的合成
将N-(2-氰基乙基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,2.94mmol,1.00eq)、氰甲基膦酸二乙酯(950μL,5.88mmol,2.00eq)和3-巯基丙酸(768μL,8.813mmol,3.00eq)的EtOH/DMF(1:1,10mL)溶液中加入一水合肼(2.28mL,47.0mmol,16.0eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入NaNO2(4.99g，58.8mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3。滤出形成的沉淀物，并用乙酸乙酯萃取水相。合并有机层用Na2SO4干燥并减压蒸发。通过反相柱色谱纯化得到48(360mg，33％)。
实施例49((6-(2-氨基乙基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二乙酯(49)的合成
向48(160mg，0.426mmol，1.00eq)的DCM(2ml)溶液中加入TFA(328μl，4.26mmol，10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。减压除去溶剂。
蒸发产生粗品49(192mg)，作为粗产物，用于后续反应。
实施例50((6-(2-氨基乙基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(50)的合成
在0℃下，向粗品49(100mg，257μmol，1.00eq)的DMF(5.1mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(32.7μL，1.28mmol，5.00eq)，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入水并减压蒸发溶剂。通过反相色谱法纯化(H2O/MeOH,0-50％,10g Sfaer C18)
通过反相色谱纯化得到50(12.5mg，22％)。
实施例51((6-(5-氨基嘧啶-2-基)-1,4-二氢-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二 乙酯(51)的合成
将5-氨基-2-嘧啶腈(200mg,1.67mmol,1.00eq)、氰甲基膦酸二乙酯(0.539mL,3.33mmol,2.00eq)和3-巯基丙酸(435μL,5.00mmol,3.00eq)的EtOH/DMF(1:1,5mL)溶液加入一水合肼(1.29mL,26.6mmol,16.0eq)中，并将混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂。通过反相柱色谱纯化得到混合级分。通过快速色谱法纯化含有产物的合并的级分。
通过快速色谱法(MeOH在DCM中，从0％至15％的梯度)纯化得到51(97.0mg，18％)。
实施例52((6-(5-氨基嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸二乙酯(52)的 合成
向51(97.0mg，296μmol，1.00eq)的THF/MeOH(9:1,3mL)溶液中加入对苯醌(39.4mg，365μmol，1.23eq)，并将混合物在RT下搅拌5分钟。用DCM稀释，并通过加入H2O和饱和NaHCO3水溶液终止反应。用EtOAc(3x)萃取，合并有机相用硫酸钠干燥，减压蒸发溶剂。
通过快速色谱法(MeOH在DCM中，从0％至30％的梯度)纯化得到52(33.0mg，34％)。
实施例53((6-(5-氨基嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(53)的合成
在0℃下，向52(100mg，307μmol，1.00eq)的DMF(1mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(203μL，1.54mmol，5.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水并减压蒸发溶剂。通过反相柱色谱纯化得到53(36.0mg，44％)。
实施例54((6-(5-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3- (((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)- 2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12-三氧代-2-氧杂-15,16-二硫杂-5,8, 11-三氮杂十九烷-19-酰胺基)嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(54)的合成
向47(10.0mg，13.2μmol，1.00eq)和HATU(4.17mg，11.0μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三乙胺(1.5μL，11.0。μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入53(4.60mg，13.2μmol，1.20eq)和三乙胺(1.53μL，11.0μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到54(5.0mg，39％)。
实施例55 2-(2-((6-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3- 基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酸(55)的合成
向18(64.8mg，200μmol，1.00eq)和二甘醇酐(27.8mg，240μmol，1.20eq)的DMF(2mL)溶液中加入4-(二甲基氨基)吡啶(2.44mg，20.0μmol，0.100eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到55(72.0mg，82％)，为粉红色油状物。
实施例56 4-((6-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基) 氨基)-4-氧代丁酸(56)的合成
将18(60.0mg，185μmol，1.00eq)和琥珀酸酐(22.2mg，222μmol，1.20eq)的CHCl3(0.4mL)的溶液在60℃下搅拌过夜。反应混合物用DCM稀释。滤出粉红色沉淀物并用DCM洗涤。
分离56(69.0mg，88％)，为粉红色固体。
实施例57(2-((6-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基) 氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(57)的合成
在0℃下，向N-Boc-甘氨酸(486mg，2.78mmol，2.00eq)的THF(5mL)溶液中加入N-甲基吗啉(763μL,6.94mmol,5.00eq)和氯甲酸异丁酯(360μL，2.78mmol，2.00eq)。将混合物搅拌5分钟。然后在0℃下加入18(450mg，1.39mmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水和EtOAc，分离各相，并用EtOAc(2x)萃取水相。合并有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，并减压蒸发溶剂。
通过反相色谱纯化得到57(300mg，45％)。
实施例58((6-(5-(2-氨基乙酰胺基)吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸 (58)的合成
在0℃下，向57(200mg，415μmol，1.00eq)的DMF(1mL)溶液中加入三甲基溴硅烷(274μL，2.08mmol，5.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入MeOH和水，并减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到58(66.0mg，49％)。
实施例59((6-(5-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3- (((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)- 2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12,19-四氧代-2-氧杂-15,16-二硫杂-5, 8,11,20-四氮杂二十二烷-22-氨基)吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(59)的合 成
向47(10.0mg，11.0μmol，1.00eq)和HATU(4.17mg，11.00μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三乙胺(1.53μL，11.0μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入58(5.35mg，13.2μmol，1.20eq)和三乙胺(1.53μL，11.0μmol，1.00eq)，将混合物在RT下搅拌过夜，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到59(1.7mg，13％)。
实施例60(2-((2-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)嘧啶-5-基) 氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(60)的合成
在0℃下，向N-Boc-甘氨酸(255mg，1.46mmol，2.00eq)的THF(5mL)溶液中加入N-甲基吗啉(0.401mL，3.64mmol，5.00eq)和氯甲酸异丁酯(0.189mL,1.46mmol,2.00eq)，将混合物搅拌5分钟。然后加入52(237mg，0.729mmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水和EtOAc，分离各相，并用EtOAc(2x)萃取水相。合并有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，并减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到60(152mg，43％)。
实施例61((6-(5-(2-氨基乙酰胺基)嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸 二乙酯(61)的合成
在RT下，向60(130mg，0.269mmol，1.00eq)的DCM(2mL)溶液中加入TFA(208μl，2.70mmol，10.0eq)，并将混合物搅拌过夜。减压除去溶剂。
蒸发得到61(79mg，59％)。
实施例62((6-(5-(2-氨基乙酰胺基)嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸 (62)的合成
在0℃下，向61(67.0mg，135μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入TMS-Br(178μL,1.35mmol,10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入MeOH和水，并减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到62(92mg)，为与DMF的混合物。该产物被这样用于随后的反应。
实施例63((6-(5-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3- (((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)- 2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12,19-四氧代-2-氧杂-15,16-二硫杂-5, 8,11,20-四氮杂二十二烷-22-氨基)嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(63)的合 成
向47(10.0mg，11.0μmol，1.00eq)和HATU(4.17mg，11.00μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三乙胺(1.53μL，11.0μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入62(5.37mg，13.18μmol，1.20eq)三乙胺(1.53μL，11.0μmol，1.00eq)，将混合物在RT下搅拌过夜，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到63(1.2mg，9％)。
实施例64(6-(6-(5-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)- 3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1- 基)-2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12-三氧代-2-氧杂-15,16-二硫杂- 5,8,11-三氮杂十九烷-19-酰胺基)吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)膦酸(64) 的合成
向47(2.75mg，3.02μmol，1.00eq)和HATU(1.15mg，3.02％μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三乙胺(0.42μL，3.02％μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入37(1.00mg，3.02μmol，1.00eq)和三乙胺(0.42μL，3.02μmol，1.00eq)，将混合物在RT下搅拌过夜，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到64(1mg，27％)。
实施例65(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2- ((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代 丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧 杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-(3-(3-(6-(4-膦酰基苯基)-1,2,4-5-四嗪-3-基)丙酰胺 基)丙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(65)的合成
向32(2.00mg，4.91μmol，1.00eq)和44(4.44mg，3.93μmol，0.800eq)的DMF(0.3mL)溶液中加入三乙胺(0.753μL，5.40μmol，1.10eq)，混合物在RT下搅拌3小时，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到65(4.4mg，63％)。
实施例66(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基- 10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2- b]喹啉-1-基)氨基甲酰)氧基)甲基)-2-(3-(4-(6-(膦酰基甲基)-1,2,4-5-四嗪-3-基)苯 甲酰胺基)丙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(66)的合成
向12(0.928mg，2.36μmol，1.00eq)和45(2.00mg，2.35μmol，1.00eq)的溶液中加入三乙胺(0.362μL，2.60μmol，1.10eq)，在RT下搅拌3小时，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到66(0.6mg，23％)。
实施例67((6-(4-(((S)-1-(((S)-1-(((S)-4-氨基-1-((4-((5S,8S,11S,12R)- 11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)- 1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基- 3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基) 氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲 基)膦酸(67)的合成
向12(1.40mg，3.56μmol，1.00eq)和46(4.00mg，3.5％μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入三乙胺(0.545μL，3.91μmol，1.10eq)，在RT下搅拌3小时，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到67(1.0mg，20％)。
实施例68 3-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)丙酸(68)的合成
在50℃下，将3-氰基丙酸(400mg，4.04mmol，1.00eq)、氰甲基膦酸二乙酯(2.61mL，16.1mmol，4.00eq)和3-巯基丙酸(1.06mL，12.1mmol，3.00eq)的EtOH(1mL)溶液加入至一水合肼(3.13mL，64.6mmol，16.0eq)，将混合物在该温度下搅拌5小时。然后将反应混合物冷却至0℃，加入NaNO2(6.86g，80.7mmol，20.0eq)的H2O溶液，并通过滴加1M HClaq将其酸化至pH约为3，滤出形成的沉淀物，并用EtOAc(2x)萃取水相。将合并的有机相用Na2SO4干燥，并减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到混合级分。合并含有产物的级分，在减压下蒸发溶剂，将残余物溶于水(5mL)中。过滤形成的沉淀物，并将滤液冷冻干燥。
分离68(140mg，11％)，为粉红色油状物。
实施例69 2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四 嗪-3-基)丙酸酯(69)的合成
向68(120mg，0.394mmol，1.00eq)和TSTU(142mg，0.473mmol，1.20eq)的DCM(0.5mL)溶液中加入DIPEA(82.4μL,0.473mmol,1.20eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂。
通过反相柱色谱纯化得到69(88.0mg，56％)。
实施例70 4-((S)-4-氨基-2-((S)-2-((S)-2-(3-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)- 1,2,4,5-四嗪-3-基)丙酰胺基)丙酰胺基)丙酰胺基)-4-氧代丁酰胺基)苄基((S)-1- (((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨 基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基) (甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯 (70)的合成
向69(1.43mg，3.56μmol，1.00eq)和46(4.00mg，3.55μmol，1.00eq)的DMF(0.3mL)溶液中加入三乙胺(0.992μL，7.12μmol，2.00eq)，混合物在室温下搅拌3小时，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到70(1.8mg，36％)。
实施例71(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2- ((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代 丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧 杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-(3-(3-(6-((二乙氧基膦酰基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)丙酰胺基)丙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(71)的合成
向69(1.56mg，3.89μmol，1.10eq)和45(4.00mg，3.54μmol，1.00eq)的DMF(0.3mL)溶液中加入三乙胺(0.986μL，7.08μmol，2.00eq)，混合物在室温下搅拌3小时，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到71(1.2mg，24％)。
实施例72((6-(3,5-双(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯基)-1,2,4,5- 四嗪-3-基)甲基)膦酸(72)的合成
在0℃下，向15(135mg，229μmol，1.00eq)的DMF(2.2mL)溶液中加入TMS-Br(151μL,1.14mmol,5.00eq)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水和MeCN，并通过反相柱色谱法直接对混合物进行纯化。
通过反相柱色谱纯化得到72(11.2mg，9％)，为粉红色固体。
实施例73((6-(3,5-双(((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷- 1-基)-2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12-三氧代-2,15,18,21,24,27, 30,33,36-九氧杂-5,8,11-三氮杂三十八烷-38-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)甲基)膦酸二乙酯(73)
向16(23.3mg，18.7μmol，1.00eq)和MMAE(32.3mg，45.0μmol，2.40eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入HATU(21.4mg，56.2μmol，3.00eq)和三乙胺(13.0μL，93.7μmol，5.00eq)，混合物在RT下搅拌2小时。然后加入水，并将混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到73(22.5mg，45％)，为粉红色油状物。
实施例74((6-(3,5-双(((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷- 1-基)-2-氧代乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12-三氧代-2,15,18,21,24,27, 30,33,36-九氧杂-5,8,11-三氮杂三十八烷-38-基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3- 基)甲基)膦酸(74)的合成
在0℃下，向73(22.0mg，8.32μmol，1.00eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入TMS-Br(11.0μL，83.2μmol、10.0eq)，并将混合物在RT下搅拌6小时。随后加入20μL TMS-Br，将混合物搅拌过夜。然后加入40μL TMS-Br，将混合物搅拌8天。加入水，通过HPLC直接纯化混合物。
通过HPLC纯化得到74(3.5mg，16％)，为粉红色粉末。
实施例75((6-(3,5-双((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲 基)膦酸二乙酯(75)的合成
向1,2-二氨基乙烷(44.8μL，671μmol，6.00eq)的DMF(0.6mL)溶液中加入15(66.0mg，112μmol，1.00eq)的DMF(0.6mL)溶液，并将混合物在RT下搅拌15分钟。然后加入0.5mL 1M HClaq，并通过HPLC直接纯化混合物。
通过HPLC纯化得到75(8.0mg，15％)，为粉红色油状物。
实施例76((6-(3,5-双((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲 基)膦酸(76)的合成
在0℃下，向75(8.00mg，16.7μmol，1.00eq)的DMF(0.2mL)溶液中加入TMS-Br(44.0μL，333μmol，20.0eq)，并将混合物在RT下搅拌2小时。加入水，通过HPLC直接纯化混合物。
通过HPLC纯化得到76(4.0mg，57％)，为粉红色固体。
实施例77 3-((3-(((S)-1-(((14S,16S,32R,33S,2S,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14- 羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷杂-3(2, 3)-环氧乙烷杂-8(1,3)-苯杂环十四烷-10,12-二烯-4-基)氧基)-1-氧代丙-2-基)(甲基) 氨基)-3-氧代丙基)二硫烷基)丙酸(77)的合成
向3,3'-二硫代二丙酸(19.4mg，92.3μmol，2.00eq)和HATU(17.5mg，46.1μmol，1.00eq)的DMF(0.5mL)溶液中加入DIPEA(8.04μL,46.1μmol,1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入美登木醇-丙氨酸(30.0mg，46.1μmol，1.00eq)和DIPEA(8.04μL，46.1μmol，1.00eq)，将反应混合物在RT下搅拌过夜，并直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到77(15.2mg，68％)。
实施例78((6-(5-(3-((3-(((S)-1-(((14S,16S,32R,33S,2S,4S,10E,12E,14R)-86- 氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷杂- 3(2,3)-环氧乙烷杂-8(1,3)-苯杂环十四烷-10,12-二烯-4-基)氧基)-1-氧代丙-2-基)(甲 基)氨基)-3-氧代丙基)二硫烷基)丙酰胺基)嘧啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸 (78)的合成
向77(8.00mg，9.50μmol，1.00eq)和HATU(3.61mg，9.55μmol，1.00eq)的DMF(0.50mL)溶液中加入三乙胺(1.32μL，9.50μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入53(3.82mg，14.25μmol，1.50eq)和三乙胺(1.32μL，9.50μmol，1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到78(与游离77的混合物)(3.20mg(75％纯度)，22％)。
实施例79((6-(2-(3-((3-(((S)-1-(((14S,16S,32R,33S,2S,4S,10E,12E,14R)-86- 氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷杂- 3(2,3)-环氧乙烷杂-8(1,3)-苯杂环十四烷-10,12-二烯-4-基)氧基)-1-氧代丙-2-基)(甲 基)氨基)-3-氧代丙基)二硫烷基)丙酰胺基)乙基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)膦酸(79)的 合成
向77(7.20mg，8.55μmol，1.00eq)和HATU(3.25mg，8.55％μmol，1.00eq)的DMF(0.50mL)溶液中加入三乙胺(1.19μL,8.55μmol,1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌1小时。然后加入50(3.82mg，14.25μmol，1.50eq)和三乙胺(1.19μL，8.55μmol、1.00eq)，并将混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物直接进行HPLC纯化。
通过HPLC纯化得到79(0.90mg，10％)。
C)ADC的制备和细胞毒性测定
制备实施例1曲妥珠单抗A132TCO*A的制备
利用基于杆状病毒的转导系统在昆虫细胞(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞，Sf21)中表达曲妥珠单抗A132TCO*A。因此，将曲妥珠单抗重链的基因克隆到pACEBac DUAL质粒(例如WO 2017/093254中所述)中的第一个多克隆位点中，该基因在位置A132处含有琥珀终止密码子并在C末端有6-His标签。曲妥珠单抗轻链的基因在没有进一步修饰的情况下被克隆到质粒的第二个多克隆位点中。
将得到的质粒pACEBacDUAL曲妥珠单抗heavy A132TAG-6His-light转化到携带Bacmid的DH10MultiBac-TAG细胞中，所述Bacmid在Bacmid主链中具有NES-PylRSAF的表达盒(例如在WO2018/069481中所描述)以及U6(Sf21)-tRNAPyl(例如在WO 2017/093254中所描述)。这样的转化导致质粒整合到Bacmid DNA中。在制备Bacmid-DNA后，用Bacmid-DNA转染昆虫细胞(Sf21细胞)。三天后，收获V0-病毒并用于转导新一批Sf21细胞，从而产生V1-病毒。该病毒用于转导大量表达培养物(升规模)。加入TCO*A-Lys后，表达进行4天。这些细胞是在使用Beckman转子(JLA 8.1000)4℃下500rcf下1小时收获的。
将细胞重悬于裂解缓冲液(4x PBS，0.2mM TCEP，1mM PMSF，5mM咪唑，pH 8)中，并在冰上超声处理30秒三次。在经过一个小时的固定角度转子(JA 25.50，Beckman)在4℃、27143.1RCF的离心步骤后，将澄清的裂解物在4℃的摇床上与镍珠孵育1小时。将镍珠收集在聚丙烯(PP)柱(Qiagen，目录号：34964)中，并用含有10nM咪唑的裂解缓冲液洗涤。在裂解缓冲液中使用500mM咪唑从镍珠洗脱曲妥珠单抗。将洗脱级分上样到在缓冲液(0.02MNa2PO4,0.15M NaCl,pH 7.2)中平衡的MabSelect PrismA柱上。在用缓冲液A洗涤步骤后，使用最高100％的缓冲液B(0.1M柠檬酸钠，pH 3.2)梯度从柱上洗脱曲妥珠单抗。收集级分，所述级分含有用于中和洗脱样品的1M Tris pH 10。在SDS-PAGE上分析组分后，将含有曲妥珠单抗的组分合并并使用amicon过滤装置(30kDa截止值)浓缩。使用在1xPBS缓冲液中平衡的Superdex S200(10/30)柱进一步纯化样品。收集级分并在SDS-PAGE上进行分析。在浓缩相应的级分后，将样品用于标记细胞毒性负载物。
制备实施例2曲妥珠单抗-TCO*A-5的制备
将10nmol曲妥珠单抗A132TCO*A在1xPBS中与40nmol膦酸酯-四嗪-MMAE(5)在37℃下以600rpm振荡孵育1小时。在过滤装置(Amicon过滤装置，30kDa截止值)中用1x PBS洗涤反应混合物以除去任何未反应的药物之后。使用在1x PBS中平衡的Superdex IncreaseS200柱，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化ADC(图2A)。收集的级分通过SDS-PAGE进行分析，用考马斯蓝染色(图2B)。将含有ADC的级分合并并在Amicon过滤装置中浓缩。
制备实施例3曲妥珠单抗-TCO*A-11的制备
将10nmol曲妥珠单抗A132TCO*A在1xPBS中与40nmol膦酸酯-四嗪-Val-Ala-PAB-MMAE(11)在37*C°下以600rpm振荡孵育1小时。在过滤装置(Amicon过滤装置，30kDa截止值)中用1x PBS洗涤反应混合物以除去任何未反应的药物之后。使用在1x PBS中平衡的Superdex Increase S200柱，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化ADC(图3A)。收集的级分通过SDS-PAGE进行分析，用考马斯蓝染色(图3B)。将含有ADC的级分合并并在Amicon过滤装置中浓缩。
D)细胞毒性测定
测定实施例1细胞毒性测定
在应用ADC前两天，将乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞以5000细胞/孔接种在黑色96细胞板中。将不同ADC或Ab(作为阴性对照)的浓度调节至5μM。制备0-100nM范围内的系列稀释液。从96孔板中吸出培养基，并用ADC或Ab的稀释液替换。作为ADC，曲妥珠单抗A132TCO*A-5和曲妥珠单抗A132TCO*A-11进行了测试，同时也测试了未经任何修饰的曲妥珠单抗WT。孵育5天后，从培养箱中取出平板，室温下温热30分钟，向每个孔中加入100μl2.0Cell(Promega)。将平板在摇床上以50rpm振荡2分钟，并在RT下孵育10分钟。然后使用读板器读出发光信号。将发光信号相对于时间点0nM(阴性对照)的测量值进行归一化。图4中的曲线图显示了两种ADC和曲妥珠单抗WT在不同浓度(单位为M)下的归一化发光信号。
本说明书中交叉引用的任何文件的内容均通过引用并入。

Claims (18)

1.通式(I)的四嗪化合物
其中
m为0或1，
n表示选自1和2的整数，
o为0或表示选自1或2的整数，
A表示可裂解的接头部分，
Sp1和Sp2各自独立地表示间隔子部分，
X表示自降解部分，
Y表示负载物残基(载荷)，并且
Z表示含磷和/或硫的亲水基团；
特别是选自(R1O)2P(O)-、(R1aO)2P(O)-O-、(R2O)3P-O-、R3S(O)2-、(R4O)S(O)2O-和(R4aO)S(O)2-，
其中
残基R1至R4、R1a和R4a相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；甚至更特别是H；
或者所述含磷和/或硫的亲水部分的盐形式。
2.权利要求1所述的化合物，其中Z选自以下的亲水基团之一：
(R1O)2P(O)-、(R1aO)2P(O)-O-和(R2O)3P-O-，
其中
残基R1、R2和R1a相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；甚至更特别是H；
或者所述含磷的亲水部分的盐形式。
3.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中
间隔子Sp 1不存在，或者更特别地选自
a)任选地单取代或多取代的具有6到14个环碳原子的单环或多环的芳香部分，特别是1,4-亚苯基，
其中
所述一个或多个任选存在的取代基各自独立地选自-Hal、-CHal3、-OH、-SH、-NR’2、NO2、-CN、--C(＝O)R”、-C(＝O)OR”’、烷基、烯基、炔基和烷氧基；
其中
R’、R”和R”’各自独立地选自H和C1-C4烷基
(M1部分)；
b)通式X的杂环残基
其中
环部分X1至X4中的一个、两个或三个，更特别地一个或两个，表示N，并且其它的表示>CH；
(M2部分)；
c)直链或分支的低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，
其中
n1为1至4的整数；更特别是亚甲基；
(M3部分)；和
d)选自M1、M2和M3的至少两个相同，或更特别是不同的部分的组合；
和/或
其中间隔子Sp 2选自
a)任选地单取代或多取代的具有6到14个环碳原子的单环或多环的芳香部分，特别是1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基；或下式的单环部分
更特别是1,4-亚苯基，
其中
所述一个或多个任选存在的取代基各自独立地选自-Hal、-CHal3、-OH、-SH、-NR’2、NO2、-CN、-C(＝O)R”、-C(＝O)OR”’、烷基、烯基、炔基和烷氧基；
其中
R’、R”和R”’各自独立地选自H和C1-C4烷基
(M1部分)；
b)通式X的杂环残基
其中
环部分X1至X4中的一个、两个或三个，更特别地一个或两个，表示N，并且其它的表示>CH；
(M2部分)；
c)直链或分支的低级亚烷基，特别是–(CH2)n1-，其中n1为1至4的整数；更特别是亚甲基；
(M3部分)；
d)直链或分支的聚亚烷基氧化物部分，特别是选自直链部分-((CH2)x1-O)y1-或-(O-(CH2)x1)y1-及其分支类似物；
其中
x1各自独立地表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；并且
y1各自独立地表示1至20的整数；特别是1至4；
(M4部分)；
e)含杂原子部分，其选自
-N(R””)-；
-(CH2)x2-N(R””)-；
-N(R””)-(CH2)x3-C(O)O-；
-N(R””)-(CH2)x3-C(O)-；
-N(R””)-C(O)O-(CH2)x4-N(R””)-；
-N(R””)-C(O)-(CH2)x4-N(R””)-；
–(CH2)x4-C(O)O-；和
–(CH2)x4-C(O)-
其中
R””各自独立地选自H和C1-C4烷基
x2表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；
x3表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2；并且
x4表示选自1、2、3或4的整数；特别是1或2。
(M5部分)；或者
f)选自M1、M2、M3、M4和M5的至少两个相同，或更特别是不同的部分的组合。
4.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述接头基团A为选自以下的酶促或化学可裂解的接头基团
a)肽基团，特别是二肽、三肽或四肽基团；
b)下式的二硫键基团：-(CR7R8)n2-S-S-(CR7R8)n2-X5-或X5′-(CR7R8)n2-S-S-(CR7R8)n2-X5-
其中
n2表示1至4的整数，
残基R7和R8各自独立地选自H或低级烷基，特别是甲基；或者两个残基R7和R8与它们所连接的碳原子一起形成环状C4-C8烷基基团；并且
X5部分选自–C(O)-和-O-；
X5′部分选自–C(O)-和-(O)C-(CH2)-NH-；
c)腙基团，其选自>C＝N-N(R9)-和-N(R9)-N＝C<
其中
R9为H或低级烷基；和
d)β-葡糖醛酸糖苷酶敏感的可裂解接头基团，特别地，携带β-葡糖醛酸衍生的触发残基的接头基团。
5.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述自降解基团X选自
a)下式的p-氨基-苄醇衍生的基团：
-NH-p-亚苯基-CH2-O-或-O-CH2-p-亚苯基-NH-或-NH-p-亚苯基-CH2-N+(R20)2-
b)-O-C(O)-O-；
c)-O-C(O)-NR10-(CR12R13)z-NR11-C(O)-O-或
-X1-C(O)-NR10-(CR12R13)z-NR11-C(O)-X2-
其中
z表示选自1至6的整数；特别是1至4；
R20各自独立地表示H或低级烷基基团；
R10和R11各自独立地表示H或低级烷基基团；
R12和R13各自独立地表示H、甲基或乙基，特别是H或甲基，尤其是H；并且
X1和X2各自独立地表示O、S或NR10
d)下式的亚甲基烷氧基氨基甲酸酯(MAC)型连接子
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(O)-，
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(S)-，
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(NR16)-，或
-OC(O)-NR13-C(R14R15)-(NR16-C(O)O)-
其中
R13、R14、R15和R16各自独立地表示H或低级烷基，特别是C1-C4烷基。
6.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中
所述负载物残基Y选自生物活性化合物、标记剂，例如特别是染料、放射性标记物和荧光团、蛋白降解剂，特别是适用于蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)的负载物、光敏剂和螯合剂。
7.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Sp1选自以下部分组合之一：
-M1-M3-
-M2-M3-
-M3-M1-
-M3-M2-
其中
所述M1、M2、M3部分之间的连接子独立地选自化学键、醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼或脲，以及亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子；
和/或
其中Sp2选自以下部分组合之一：
-M1-M3-
-M1-M4-
-M2-M3-
-M2-M4-
-M2-M5-
-M3-M1-
-M3-M2-
-M3-M4-
-M1-M3-M4-
-M1-M4-M3-
-M2-M3-M4-
-M2-M4-M3-
-M3-M2-M4-
-M3-M4-M2-
-M2-M5-M4-
其中
所述M1、M2、M3、M4和M5部分之间的连接子独立地选自化学键、醚、硫醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼或脲，以及亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子。
8.一种偶联物，其通过以下方式获得：使官能化的靶向剂与前述权利要求中任一项所述的四嗪化合物反应，从而在所述官能化的靶向剂与所述式I的四嗪化合物之间形成共价连接；
特别地，其中所述官能化的靶向剂选自病毒、完整细胞、噬菌体、脂质体、生物分子和低分子量或高分子量化学化合物，特别是抗体、抗体衍生物、抗体片段、抗体(片段)融合物、酶、蛋白、肽、肽模拟物、碳水化合物、单糖、多糖、寡核苷酸或多核苷酸，特别是DNA、RNA、PNA和LNA分子、适配体、药物、糖蛋白、聚糖、脂质、聚合物、化疗剂、受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、甾体、毒素及其衍生物。
9.权利要求8所述的偶联物，其中
所述官能化的靶向剂包含至少一个能够与所述式I化合物的所述四嗪部分反应的亲双烯部分作为官能团。
10.权利要求8或9中任一项所述的偶联物，其中
所述官能化的靶向剂包含至少一个多肽序列，所述多肽序列在其氨基酸序列中具有至少一个非天然氨基酸残基，所述非天然氨基酸残基包含至少一个能够与所述式I化合物的所述四嗪部分反应的亲双烯体部分；特别地，其中所述官能化的生物分子是多克隆或单克隆免疫球蛋白分子，特别是单克隆抗体或其片段。
11.权利要求8至10中任一项所述的偶联物，
所述偶联物通过以下方式形成：式I的四嗪化合物与携带能够通过Diels-Alder型环加成反应进行反应的官能团的官能化的生物分子生物双正交生物偶联。
12.权利要求11所述的偶联物，其中所述能够通过Diels-Alder型环加成反应进行反应的官能团选自
(i)下式的反式环辛烯基亲双烯体基团：
其中
R1为氢、卤素、C1-C4烷基、(RaO)2P(O)O-C1-C4烷基、(RbO)2P(O)-C1-C4烷基、CF3、CN、羟基、C1-C4烷氧基、-O-CF3、C2-C5烯氧基、C2-C5烷酰氧基、C1-C4烷氨基羰氧基或C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4烷基)氨基、C2-C5烯基氨基、C2-C5烯基-C1-C4烷氨基或二(C2-C5烯基)氨基；并且
Ra、Rb独立地是氢或C2-C5烷酰氧基甲基；或
(ii)下式的环辛炔基亲双烯体基团：
其中
R2为氢、卤素、C1-C4烷基、(RcO)2P(O)O-C1-C4烷基、(RdO)2P(O)-C1-C4烷基、CF3、CN、羟基、C1-C4烷氧基、-O-CF3、C2-C5烯氧基、C2-C5烷酰氧基、C1-C4烷氨基羰氧基或C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4烷基)氨基、C2-C5烯基氨基、C2-C5烯基-C1-C4烷氨基或二(C2-C5烯基)氨基；并且
Rc、Rd独立地是氢或C2-C5烷酰氧基甲基。
13.一种制备权利要求8至12中任一项所述的生物偶联物的方法，
所述方法包括在水性、任选缓冲的反应介质中，使权利要求1至7中任一项所定义的四嗪化合物与携带亲双烯官能团的官能化的生物分子反应，并在所述分子之间进行Diels-Alder型环加成反应。
14.通式(II)的四嗪中间体
其中
n3表示选自1或2的整数；
Sp1和Sp2如上所定义，
连接子α、β和γ各自独立地选自化学键或醚、硫醚、酯、酰胺、羰基，特别是酮、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支的聚亚烷基氧化物连接子；
Z表示含磷的亲水基团，特别是(R1O)2P(O)-、(R1aO)2P(O)-O-和(R2O)3P-O-；
其中
R1、R1a和R2相同或不同，并且各自独立地表示H或低级烷基，特别是甲基或乙基；甚至更特别是H；
并且
R表示H，或能够形成化学键或能够形成醚、硫醚、酯，例如活性酯，如琥珀酰亚胺基酯或五氟苯基酯，酰胺、氨基甲酸酯、二氨基甲酸酯、碳酸酯、肼、脲、亚烷基氧化物或直链或分支聚亚烷基氧化物连接子的化学基团；更特别地，R表示氨基或羧基；并且任选地条件是R不表示化学保护基团，特别地不表示可裂解的保护基团，更特别地不表示N-、O-或S-保护基团。
15.一种制备通式II的四嗪中间体的方法，所述方法包括以下步骤:
a)在(iii)的存在下，使(i)与(ii)反应
(i)通式III的第一氰基化合物
Z-Sp1-CN
(III)
其中
Z和Sp1如上所定义，其中任选地残基Z的任何羟基以被保护的形式提供，
特别是烷氧基形式；
(ii)通式IV的第二氰基化合物
NC-Sp2-[R]n3
(IV)
其中
R和Sp2和n3如上所定义；
(iii)水合肼
b)随后氧化；
c)任选地分离获得的四嗪化合物；和
d)任选地将残基Z的羟基去保护。
16.权利要求8至12中任一项所定义的偶联物，用于医药，特别地用于诊断和/或治疗。
17.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的至少一种如权利要求8至12中任一项所定义的偶联物。
18.一种诊断或分析试剂盒，其包含至少一种如权利要求1至7中任一项所定义的四嗪化合物。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024263272A2 (en) * 2023-06-20 2024-12-26 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods and systems for sensitive and multiplexed analysis of biological samples using cleavable fluorphores and 'click' chemistry
WO2025166249A1 (en) * 2024-01-31 2025-08-07 Oregon State University Tetrazine amino acids and methods for their production and use

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4486444A (en) 1983-06-20 1984-12-04 Merck & Co., Inc. (Hydroxybenzoyl)thiophenesulfonamide and acyl derivatives thereof for the topical treatment of elevated intraocular pressure
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
DE4006203C1 (zh) 1990-02-28 1991-05-02 Rehm Schweisstechnik Gmbh & Co., 7321 Wangen, De
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5886026A (en) 1993-07-19 1999-03-23 Angiotech Pharmaceuticals Inc. Anti-angiogenic compositions and methods of use
DE69434136T2 (de) 1993-10-01 2005-12-01 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin-derivate
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6548530B1 (en) 1995-10-03 2003-04-15 The Scripps Research Institute CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
EP1186606B2 (de) 1995-11-17 2011-09-07 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Epothilon-Derivate, ihre Herstellung und Verwendung
US5969145A (en) 1996-08-30 1999-10-19 Novartis Ag Process for the production of epothilones and intermediate products within the process
JP2001500851A (ja) 1996-08-30 2001-01-23 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト エポシロンの製造法および製造過程中に得られる中間生産物
US6680311B1 (en) 1996-08-30 2004-01-20 Eli Lilly And Company Cryptophycin compounds
ES2312695T3 (es) 1996-11-18 2009-03-01 Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf) Epotilones e y f.
JP4579351B2 (ja) 1996-12-03 2010-11-10 スローン−ケッタリング インスティトュート フォア キャンサー リサーチ エポチロンの合成とその中間体及びその類似物並びにその使用
US6441186B1 (en) 1996-12-13 2002-08-27 The Scripps Research Institute Epothilone analogs
DE69832158T2 (de) 1997-02-25 2006-08-10 Arizona Board Of Regents, Tempe Isolierung und strukturelle aufklärung der kryostatischen linearen und cyclo-depsipeptide dolastatin 16, dolastatin 17, und dolastatin 18
CA2281105A1 (en) 1997-02-25 1998-09-03 Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf) Epothilones with a modified side chain
US6117659A (en) 1997-04-30 2000-09-12 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6605599B1 (en) 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
AU8542898A (en) 1997-07-16 1999-02-10 Schering Aktiengesellschaft Thiazole derivatives, method for their production and use
DK1005465T3 (da) 1997-08-09 2007-11-05 Bayer Schering Pharma Ag Nye epothilon-derivater, fremgangsmåde til fremstilling heraf og deres farmaceutiske anvendelse
US6365749B1 (en) 1997-12-04 2002-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of ring-opened epothilone intermediates which are useful for the preparation of epothilone analogs
EP1042327B1 (en) 1997-12-04 2003-09-17 Bristol-Myers Squibb Company A process for the reduction of oxiranyl epothilones to olefinic epothilones
US6096757A (en) 1998-12-21 2000-08-01 Schering Corporation Method for treating proliferative diseases
US20020103136A1 (en) 1998-03-05 2002-08-01 Dong-Mei Feng Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6121029A (en) 1998-06-18 2000-09-19 Novartis Ag Genes for the biosynthesis of epothilones
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
EP2289549A3 (en) 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6956036B1 (en) 2000-03-17 2005-10-18 Alcon, Inc. 6-hydroxy-indazole derivatives for treating glaucoma
US6608053B2 (en) 2000-04-27 2003-08-19 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Fused heteroaryl derivatives
US6412611B1 (en) 2000-07-17 2002-07-02 Magnetar Technologies, Ltd Eddy current brake system with dual use conductor fin
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6660742B2 (en) 2000-09-19 2003-12-09 Taiho Pharmaceutical Co. Ltd. Compositions and methods of the use thereof achiral analogues of CC-1065 and the duocarmycins
US6747021B2 (en) 2000-10-02 2004-06-08 Eli Lilly And Company Cryptophycin compound
JP2005500974A (ja) 2000-10-13 2005-01-13 ザ ユニバーシテイ オブ ミシシッピー エポシロン類及び関連類似体の合成
JP2004537984A (ja) 2001-04-19 2004-12-24 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を生産するための方法及び組成物
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
CA2802205C (en) 2002-07-31 2016-01-19 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
EP3858387A1 (en) 2003-11-06 2021-08-04 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JP4490703B2 (ja) 2004-02-26 2010-06-30 出光興産株式会社 ポリカーボネートの製造方法
NO2842575T3 (zh) 2008-03-18 2018-02-24
KR20120057588A (ko) 2009-05-28 2012-06-05 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가변 속도 방출 링커를 포함하는 폴리알 약물 접합체
EP2480230A4 (en) 2009-09-24 2015-06-10 Seattle Genetics Inc DR5 Ligand-HEILMITTELKONJUGATE
EP2522369A1 (en) * 2011-05-09 2012-11-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Pretargeting kit, method and agents used therein
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
US20150297741A1 (en) 2012-11-22 2015-10-22 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Bio-orthogonal drug activation
CA2926586C (en) 2013-10-11 2020-04-07 Mersana Therapeutics, Inc. Polymeric scaffold based on phf for targeted drug delivery
US10519101B2 (en) 2014-01-14 2019-12-31 European Molecular Biology Laboratory Trans-cyclooctene amino and hydroxy acids and their use in multiple cycloaddition reactions for labeling of molecules
US20180339985A1 (en) 2015-08-21 2018-11-29 Femtogenix Limited Pdd compounds
EP3384021A1 (en) 2015-11-30 2018-10-10 European Molecular Biology Laboratory Means and methods for preparing engineered proteins by genetic code expansion in insect cells
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
EP3474901B1 (en) 2016-06-27 2025-08-06 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Cleavable tetrazine used in bio-orthogonal drug activation
US10667180B2 (en) 2016-07-05 2020-05-26 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Methods and devices for managing access priority of a wireless device
EP3309260A1 (en) 2016-10-14 2018-04-18 European Molecular Biology Laboratory Archaeal pyrrolysyl trna synthetases for orthogonal use
US10288745B2 (en) 2017-04-27 2019-05-14 GM Global Technology Operations LLC Methods and systems for optimal vehicle positioning using global positioning receivers from parked fleet
ES2976491T3 (es) 2018-05-24 2024-08-02 Philipps Univ Marburg Colorantes de cianina y su uso para la tinción in vivo de microorganismos
CN112010817A (zh) 2019-05-31 2020-12-01 四川大学华西医院 一种制备四嗪类化合物的方法及其应用
IL289094A (en) 2019-06-17 2022-02-01 Tagworks Pharmaceuticals B V Tetrazines for increasing the speed and yield of the "click release" reaction

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022404647A1 (en) 2024-06-13
JP2024546769A (ja) 2024-12-26
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