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CN117887691B - 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用 - Google Patents

一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用，属于基因工程技术领域，具体为一种透明质酸酶融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；一种酵母工程菌，为在酵母菌中导入透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；发明人将该融合蛋白酶的编码基因序列重组到毕赤酵母菌的基因组中得到毕赤酵母工程菌，发明人发现毕赤酵母工程菌不仅能够有效表达该融合蛋白，并且表达的融合蛋白具有较高的酶活性，而且具有两种酶的活性。

Description

一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用。
背景技术
透明质酸，(hyaluronan或hyaluronic acid,HA)又叫玻尿酸，是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的。透明质酸酶是可以降解透明质酸的一类酶，可高效制备低分子量的透明质酸寡糖。在市场应用方面，透明质酸酶可广泛应用于美容、医药器械、制剂、原料药等多种医药领域。
目前市面售卖的透明质酸酶多以提取法从动物睾丸中经提取获得，虽然已经建立了适合于医药领域成型的透明质酸酶提取制备工艺，并获得了具有酶活性的透明质酸酶蛋白，但该工艺的透明质酸酶的蛋白产量较低，提取中大量使用有机化学试剂，且生产成本较高，获得透明质酸酶往往工艺成本较高且操作繁琐，且在应用中可能有交叉感染动物病毒的风险。
国内外以生物手段制备透明质酸酶的研究已有一定成效，通过枯草芽孢杆菌、大肠杆菌制备透明质酸酶的研究已有报道，中国专利CN200810134513.6利用大肠杆菌表达获得具有酶活性的透明质酸酶蛋白，但表达产物位于菌体内，导致分离纯化工艺复杂，影响产量且增加了成本和污染风险；中国专利CN201410555212.6利用枯草芽孢杆菌进行透明质酸酶的制备，但枯草芽孢杆菌表达的拷贝数通常较少，相比酵母而言表达量更低，存在转化困难、遗传操作复杂等缺点。
工业生产需求对透明质酸酶的需求仍十分巨大，为实现透明质酸酶的工业化前景，市场对透明质酸酶的酶活力有了更高的期待，且通过发酵罐高密度发酵的透明质酸酶具有一定的价格和纯度优势，且酵母在医药、美容、食品等多重领域的认可度较高，更易被消费者接受。
传统的毕赤酵母表达透明质酸酶的工艺中，需要在甲醇的严格诱导下才能表达出透明质酸酶，然而在工厂的放大工艺中有一定的隐患：甲醇有毒易燃，需要进行防爆车间；消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；甲醇作为一种石油化学产品，不适合于一些食品领域添加剂的生产，随着石油危机的爆发，利用甲醇生产成本变高；甲醇代谢产生的H2O2，对发酵也有一定的影响。中国专利文献CN201310597818.1和CN202110245290.6，是利用甲醇作为诱导剂。
透明质酸的生物学功能和特异性应用取决于其分子质量，高分子透明质酸结构稳定，具有锁水性强、粘性高、流动性弱等优点，低分子透明质酸可保持关节润滑，长久保湿，在骨关节炎治疗中有显著疗效；小分子透明质酸能渗入真皮层，扩张毛细血管，在化妆品领域有着广泛应用。而透明质酸寡糖具有独特的生物学活性功能，如可以刺激成纤维细胞增殖、胶原合成以及选择性杀死癌细胞等作用，透明质酸寡糖在食品保健以及医药领域具有重要的应用前景，与物理法和化学法相比，用透明质酸酶进行水解的方法来制备不同聚合度的寡聚透明质酸具有反应温和、无毒无害、重复性好等优点。市场中以透明质酸酶进行酶法制备透明质酸寡糖的应用多从β(1-3)或β(1-4)糖苷键中的其中一种位置进行断裂，产生的水解产物绝大多数为偶数寡糖，如六糖、八糖等如中国专利申请CN103484513A、申请号202110937316.3。目前，未有成功案例使用一种酶进行奇数透明质酸寡糖的制备研究。
进一步的，现有技术中从β(1-3)和β(1-4)位点进行水解透明质酸时，需要两步添加两种酶液，且这两种酶液一为水解酶，另一种为提取法制备的裂解酶，该方法的缺点是，如果想制备这两种酶液，需要两次制备：发酵一次β(1-3)水解酶，再提取一次β(1-4)酶，较为繁琐，且提取法制备的β(1-4)酶，工艺繁琐，若直接购买，则价格昂贵，不适用于工厂大型应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用。
一种透明质酸酶融合蛋白，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
上述透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
一种酵母工程菌，所述酵母工程菌为在酵母菌中导入透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据本发明优选的，所述酵母菌为毕赤酵母菌。
一种Pichia pastoris HAase(an)-His-9K-GS115，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号是CCTCC NO：M20231485，保藏日期2023年08月15日。
上述酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列SEQ ID NO.5以同源重组的手段插入至pPIC9K载体中的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-HAase-Fus；
(2)将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列SEQ ID NO.5以同源重组的手段插入pGAPZαA载体中，得到重组质粒pGAPZαA-HAase-Fus；
(3)使用限制性内切酶SalI对步骤(1)得到的重组质粒pPIC9K-HAase-Fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus；
(4)使用限制性内切酶AvrII对步骤(2)得到的重组质粒pGAPZαA-HAase-Fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入步骤(3)获得工程菌P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus的感受态细胞中，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus。
根据本发明优选的，步骤(3)中，毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
根据本发明优选的，步骤(3)中，利用MD培养基培养后，在含遗传霉素G418的培养基进行筛选。
根据本发明优选的，步骤(4)中，利用含博来霉素的培养基进行筛选。
上述酵母工程菌、Pichia pastoris HAase(an)-His-9K-GS115在制备透明质酸酶融合蛋白中的应用，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述酵母工程菌、Pichia pastoris HAase(an)-His-9K-GS115在降解透明质酸中的应用。
上述酵母工程菌、Pichia pastoris HAase(an)-His-9K-GS115在生产奇数透明质酸寡糖中的应用。
根据本发明优选的，所述奇数透明质酸寡糖包括三糖、五糖、七糖、九糖。
本发明的有益效果如下：
1、本发明首次将水蛭透明质酸酶与山大齿猛蚁透明质酸酶融合形成了一种新酶，即融合蛋白酶，发明人将该融合蛋白酶的编码基因序列重组到毕赤酵母菌的基因组中得到毕赤酵母工程菌，发明人发现毕赤酵母工程菌不仅能够有效表达该融合蛋白，并且表达的融合蛋白具有较高的酶活性，而且具有两种酶的活性，能够同时从β(1-3)和β(1-4)位点进行水解，有效降解透明质酸产生奇数透明质酸寡糖，包括三糖、五糖、七糖、九糖等。
2、本发明还构建了一株高产透明质酸酶融合蛋白的毕赤酵母工程菌，进一步提高了融合蛋白的酶活，摇瓶阶段达153386U/mL，发酵罐进行高密度发酵后，酶活达到1243462.72U/mL，同时，该高产透明质酸酶融合蛋白重组菌株既可以用甲醇进行诱导，也可以使用甘油进行诱导，在工业化生产中可选择不同的诱导剂进行发酵；甘油诱导的方式可大大提高实际操作中的安全性，同时可以降低对环境的危害。
3、发明人还发现毕赤酵母工程菌与毕赤酵母对照菌的生长速度几乎一样，即将融合蛋白酶的编码基因序列重组到毕赤酵母菌的基因组中，进行表达，没有影响毕赤酵母的生长。
4、本发明构建的透明质酸酶融合蛋白能够为体外制备低分子透明质酸提供新的策略，实现了利用毕赤酵母重组转化子分泌表达透明质酸酶的策略，为重组透明质酸酶的工业化生产奠定了基础，可以大量生产获得亲水性好、结构完整、功能优异的透明质酸酶蛋白，并用作化妆品、医疗美容等产品的原料；本发明制备得到的奇数透明质酸寡糖，不仅丰富了寡糖结构的多样性，而且对于开展不同结构类型的透明质酸寡糖与疾病的发生、发展的关系等具有十分重要的意义。
附图说明
图1为pPIC9K-HAase-Fus的PCR扩增结果图；
图中：M为5000bp的DNA标记物；1为使用载体通用引物进行PCR检验的结果。
图2为4g/L遗传霉素筛选结果图。
图3为发酵上清液聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图；
图中：M为250kDa蛋白质分子量标记物；1为摇瓶诱导48h上清；2为摇瓶诱导96h上清。
图4为纯化后聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图；
图中：M为250kDa蛋白质分子量标记物；1为纯化后的融合蛋白。
图5为P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus酵母菌的透明质酸酶融合蛋白3L发酵罐发酵透明质酸酶酶活检测结果图。
图6为1g/L博来霉素筛选结果图。
图7为聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图；
图中：M为250kDa蛋白质分子量标记物；
1为空白对照GS115发酵上清液；
2为甲醇法诱导重组透明质酸酶融合蛋白P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus发酵上清液；
3为甲醇法诱导高产重组透明质酸酶融合蛋白P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus发酵上清液；
4为甘油法诱导高产重组透明质酸酶融合蛋白P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus发酵上清液。
图8为甲醇诱导P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus的酵母菌的透明质酸酶融合蛋白3L发酵罐发酵透明质酸酶酶活检测结果图。
图9为甘油诱导P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus的酵母菌的透明质酸酶融合蛋白3L发酵罐发酵透明质酸酶酶活检测结果图。
图10为LC-MS进行寡糖检测图；
图中的质荷比558.2059处为透明质酸三糖C19H29NO18的[M-H]-峰。
图11为LC-MS进行寡糖检测图；
图中的质荷比937.6176处为透明质酸五糖C33H51N3O28的[M-H]-峰。
图12为LC-MS进行寡糖检测图；
图中的质荷比1302.4556处为透明质酸七糖C46H70N4O39的[M-H]-峰。
图13为LC-MS进行寡糖检测图；
图中的质荷比1667.1687处为透明质酸九糖C59H89N5O50的[M-H]-峰。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容，均按本领域现有常规技术；未详加说明的实验材料、试剂均为普通市售产品。
毕赤酵母GS115，上海泽叶生物科技有限公司有售，为普通市售产品。
YDP培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量水。
初始表达培养基BMGY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO411.8g/L，无氨基酸酵母氮源YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L，余量水。
诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO411.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇10mL/L，余量水。
BMGY培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×104g/L，甘油40g/L，余量水。
BSM培养基：甘油40g/L，K2SO4 18g/L，KOH 4.13g/L，85％H3PO4 26.7mL/L，CaSO4·2H2 O 0.93g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，4.4mL/L过滤除菌的PTM1，余量水。
PTM1配方：CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.09g/L，MnSO4·H2O 3g/L，H3BO3 0.02g/L，MoNa2O4·2H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.92g/L，ZnCl2 20g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，生物素0.2g/L，H2SO4 5.0mL/L，余量水。
实施例1
设计重组融合蛋白及其编码基因
1.重组融合蛋白分子设计
利用NCBI网站获取水蛭透明质酸酶(GenBank:KJ026763)的氨基酸序列1和山大齿猛蚁透明质酸酶(GenBank:FX985505.1)的氨基酸序列2，分别分析其各自信号肽区域，将无信号肽部分节选出来，将其CDS编码区的序列使用氨基酸序列(GGGGS)3柔性信号肽对两段基因序列进行连接，拼接成为一段包括起始密码子的836个氨基酸的全新透明质酸酶序列。
2.重组透明质酸酶融合蛋白理论性质
重组透明质酸酶融合蛋白分子量为94.84kDa、等电点为8.56；重组透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
实施例2
融合蛋白表达系统的构建
选用柔性linker序列如SEQ ID NO.2所示：
GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT对这两种基因进行连接。
设计linker的插入引物，将对SEQ ID NO.2设计的引物插入至两段基因之间进行连接：
正向引物如SEQ ID NO.3所示：
引物F1：acgtcgaagcctgtaagaagGGTGGTGGTGGTTCTGGTGG
反向引物如SEQ ID NO.4所示：
引物R1：tgtggagaagaacctctcaaAGTCTTAGAACCACCACCACCAGA
设计后的总基因序列如SEQ ID NO.5所示。
依据毕赤酵母的亲好性，对该蛋白序列进行密码子优化后得到重组融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，将重组融合蛋白核苷酸序列委托华大基因公司进行全基因合成，采用诺唯赞无缝克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)进行同源重组，选用EcoRI和NotI作为酶切位点克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，而后转化至E.coilDH5α中，并进行质粒提取。得到重组表达载体pPIC9K-HAase-Fus(FUS指的是融合，HAase指的是透明质酸酶)，经PCR验证及DNA测序比对，见图1，目的质粒构建成功。
反应体系如下：
PCR反应体系：重组融合蛋白DNA模板1μL(约20ng)；PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL；引物F2(10μM)1μL；引物R2：(10μM)1μL；添加ddH2O至50μL。
引物F2：5'-gctgaagcttacgtagaattcATGAAGGAAATCGCTGTCACTATTG-3'SEQ IDNO.6；
引物R2：5'-aaggcgaattaattcgcggccgcTTAATGCAAGGTAAACTTCTTAATAGCTG-3'SEQID NO.7。
PCR反应程序：98℃，3min；98℃10s，55℃10s，72℃40s，38个循环；72℃5min；4℃保存；以此程序获得目的基因。
同源重组体系：基因2μL(约100ng)；载体2μL(约160ng)；5×CE II Buffer4μL，Exnase II 2μL；添加ddH2O至20μL；反应条件：37℃30min。
选取限制性内切酶SalI对重组质粒pPIC9K-HAase-Fus进行线性化，对其产物进行纯化后，以电转化的手段转化至制备的P.pastoris GS115表达宿主感受态细胞中，涂布于组氨酸缺陷型MD平板，以筛选阳性转化子。将组氨酸缺陷型MD平板中生长的单菌落挑菌至含4mg/mL遗传霉素G418的YPD平板，用含4mg/mL遗传霉素G418的YPD平板筛选出高拷贝重组透明质酸酶融合蛋白基因的P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus菌株，见图2。
实施例3
重组透明质酸酶融合蛋白基因的P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus菌株的摇瓶发酵
摇瓶发酵步骤如下：挑取P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus菌株接种于50mL的YPD培养基，30℃、200rpm培养24h，制得种子液。将种子液按体积分数10％的接种量转接于50mL的初始表达培养基BMGY中，以使得菌体富集，于30℃，200rpm培养24h。
离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体后更换至40mL诱导表达培养基BMMY，于30℃、200rpm培养，每隔24h向发酵摇瓶中添加体积分数1％的甲醇(含有1.2％(v/v)PTM1)，直至诱导表达96h。
酶活检测方法：将0.8mL的HA(透明质酸，120wDa)溶液与0.1mL上清液和0.1mL的PBS(pH＝7)混合，37℃水浴15min进行反应，而后立即煮沸5min停止反应，冷却后立即测定540nm波长下的吸光度。据此计算摇瓶发酵的该重组透明质酸酶的酶活为95352U/mL。
进行聚丙烯酰胺凝胶检测：取摇瓶发酵上清液，与5×聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液充分混匀，100℃煮沸10min。室温冷却后将3组样品以及蛋白质分子量标记物分别进行加样，将电泳槽置于冰上，150V电泳50min后，将凝胶至于清水中洗涤15min，而后放入考马斯亮蓝染色液中，室温摇床振荡染色15min；将凝胶放入清水中，室温50rpm摇床振荡进行脱色，次日蛋白条带清晰，进行分析。
经聚丙烯酰胺凝胶检测目的蛋白分子量在预测大小94.84kDa处有明显蛋白产生，见图3；对该蛋白进行纯化后，再次进行聚丙烯酰胺凝胶检测，如图4条带单一，表明该94.84kDa处产生的蛋白条带确为目的蛋白，验证了此重组菌株可以诱导表达透明质酸酶。
实施例4
重组透明质酸酶融合蛋白基因的P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus菌株发酵罐水平的高密度发酵
将P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus的酵母菌单菌落从平板上挑菌至50mLYPD液体培养基中进行菌种活化，30℃、200rpm培养24h，待液体浑浊后行镜检，菌株形态确认无误后即获得一级种子液。
按体积分数10％接种量将一级种子液转接到装液量100mL BMGY培养基中，30℃，200rpm，培养24后，进行镜检，菌株形态确认无误后即获得二级种子液。
将此二级种子液按体积分数10％的接种量接种到3L的发酵罐中，发酵罐初始装1LBSM培养基，发酵的初始温度控制在30℃，使用氨水调节pH为5.5，初始搅拌转速为500rpm，通气量为2.0vvm，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在20％以上。
发酵20小时左右，待BSM培养基中的甘油耗尽时(使用生物传感分析仪进行检测)，此时开始流加含有1.2％(v/v)PTM1的甘油以促进菌体二次生长，通过溶氧关联，进行12小时的甘油流加，将溶氧维持在20％～30％。溶氧再次迅速回升时，再次使用生物传感分析仪进行检测，待流加的甘油耗尽后，进行饥饿培养1小时，而后使用含有1.2％(v/v)PTM1的甲醇进行诱导，设置温度22℃、转速1000r，以甲醇5mL/h为诱导起点，监测溶氧变化，将甲醇与溶氧关联，通过流加甲醇将溶氧维持在20％～30％，发酵120h，每隔12小时取样测定酶活，在第96小时时，酶活力达到最高741638.37U/mL，见图5。
实施例5
高产重组透明质酸酶融合蛋白基因的工程酵母菌株的构建
将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列SEQ ID NO.5，采用诺唯赞无缝克隆试剂盒(ClonExpress IIOne Step Cloning Kit)进行同源重组，选用EcoRI和NotI作为酶切位点克隆到pGAPZαA载体中，转化至E.coil DH5α中，经菌检及测序验证所构建的pGAPZαA-HAase-Fus序列正确后，获得重组表达质粒pGAPZαA-HAase-Fus。
反应体系如下：
PCR反应体系：重组融合蛋白DNA模板1μL(约20ng)；PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL；引物F3(10μM)1μL；引物R3：(10μM)1μL；添加ddH2O至50μL。
引物F3：5'-agagaggctgaagctgaattcATGAAGGAAATCGCTGTCACTATTG-3'SEQ IDNO.8；
引物R3：
5'-tgttctagaaagctggcggccgcTTAATGCAAGGTAAACTTCTTAATAGCTG-3'SEQ IDNO.9。
PCR反应程序：98℃，3min；98℃10s，55℃10s，72℃40s，38个循环；72℃5min；4℃保存；以此程序获得目的基因。
同源重组体系：基因2μL(约100ng)；载体2μL(约160ng)；5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL；添加ddH2O至20μL；反应条件：37℃30min。
重组质粒pGAPZαA-HAase-Fus经限制性内切酶AvrII线性化后电转入P.pastorisGS115/pPIC9K-HAase-Fus的感受态细胞中，重组转化子经1g/L博来霉素的YPD平板进行筛选(如图6)得到高拷贝透明质酸酶融合蛋白基因的组合菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus。
P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus也称为Pichiapastoris HAase(an)-His-9K-GS115，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M 20231485，保藏日期2023年08月15日。
实施例6
高产重组透明质酸酶融合蛋白基因的工程酵母菌株的摇瓶发酵
对实施例5获得的高产菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus按照实施例3的方法进行摇瓶水平的发酵培养，使用DNS法(按照实施例3中的酶活检测方法)测定酶活为153386U/mL。
将摇瓶的发酵上清液进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析，此高产菌株的蛋白条带(泳道3)与对照菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus的蛋白条带(泳道2)，泳道3的条带大小明显要大于泳道2，该高产菌株的蛋白表达量显著高于P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus，见图7。
纯甘油摇瓶发酵步骤如下：挑取单克隆接种于50mL的YPD培养基，30℃、200rpm培养24h，制得种子液。将种子液按体积分数10％的接种量转接于50mL的初始表达培养基BMGY中，以使得菌体富集，于30℃，200rpm培养96h。
纯甘油培养组合菌株发酵上清液聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳结果，见图7。泳道4所示，在理论分子量94.84kDa左右有一条明显的蛋白条带，说明了该组合菌株既能够以甲醇为碳源，也能够以甘油为碳源生产透明质酸酶。
实施例7
高产透明质酸酶融合蛋白的工程酵母菌株发酵罐水平的高密度发酵
对实施例5获得的高产菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus以甲醇为碳源的高密度发酵以实施例4的方式进行。发酵结果见图8，在第96h测得酶活为1243462.72U/mL。
以甘油为碳源高密度发酵：将P.pastoris GS115/pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus的酵母菌单菌落从平板上挑菌至50mLYPD液体培养基中进行菌种活化，30℃、200rpm培养24h，待液体浑浊后行镜检，菌株形态确认无误后即获得一级种子液。
按体积分数10％接种量将一级种子液转接到装液量100mL BMGY，30℃，200rpm，培养24后，进行镜检，菌株形态确认无误后即获得二级种子液。
将此二级种子液按体积分数10％的接种量接种到3L的发酵罐中，发酵罐初始装1LBSM培养基，发酵的初始温度控制在30℃，使用氨水调节pH为5.5，初始搅拌转速为500rpm，通气量为2.0vvm，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在20％以上。发酵过程中通过自动添加氨水将pH控制在5.5；待BSM培养基中的甘油耗尽时(使用生物传感分析仪进行检测)，此时开始流加甘油，加入含有1.2％(v/v)PTM1的70％(v/v)甘油，控制溶氧DO在20％以上，发酵120h。发酵结果见图9，按照实施例3中的酶活检测方法，在第96h测得酶活为510254.34U/mL。
实施例8
透明质酸奇数寡糖制备及检测
将分子量为5～10wDa的透明质酸粉末，以40mg/mL的浓度溶解于去离子水中，过夜充分溶解。加入终浓度为5000U/mL的融合蛋白酶液(实施例7中甲醇诱导制备的上清液)，在37℃温度下分别静置酶解：酶解12h，得到产物三糖；酶解10h，得到产物五糖；酶解8h，得到产物七糖；酶解4h，得到产物九糖。通过100℃沸水淬灭反应后的溶液通过0.22μm滤膜过滤。
将产物进行液相色谱-质谱分析，色谱条件：使用Q ExactiveTMPlus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪，色谱柱使用HYPERSIL GOLDTM VanquishTM C18 Column(1.9μm,2.1×100mm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，流速为0.3mL/min，柱温为30℃。质谱条件：采用双喷流电喷雾离子源，负离子模式扫描，以高纯氮气作为雾化电离气，设置干燥气温度350℃，流速11L/min，雾化气压45psi，鞘气温度、流速设置与干燥气相同，毛细管电压4kV，碎片电压120V，锥孔电压60V，射频电压峰值(Octopole RF peak,radio frequency)为750V。仪器使用前以调谐液对仪器进行校正，使用过程中不间断加入参比液进行质量校准。
结果下图所示，具体如下：
图10中的质荷比558.2059处为透明质酸三糖C19H29NO18的[M-H]-峰；
图11中的质荷比937.6176处为透明质酸五糖C33H51N3O28的[M-H]-峰；
图12中的质荷比1302.4556处为透明质酸七糖C46H70N4O39的[M-H]-峰；
图13中的质荷比1667.1687处为透明质酸九糖C59H89N5O50的[M-H]-峰。
本发明首次将水蛭透明质酸酶与山大齿猛蚁透明质酸酶的基因进行融合设计，形成了一种新酶，即透明质酸融合蛋白酶，发明人发现毕赤酵母工程菌不仅能够有效表达该融合蛋白，并且表达的融合蛋白具有较高的酶活性，而且具有两种酶的优势，能够同时从透明质酸的β(1-3)和β(1-4)位点进行水解，有效降解透明质酸产生奇数透明质酸寡糖，包括三糖、五糖、七糖、九糖等。
本发明提供的高产透明质酸酶融合蛋白的毕赤酵母工程菌，明显提高了融合蛋白的酶活，摇瓶阶段达153386U/mL，发酵罐进行高密度发酵后，酶活达到1243462.72U/mL，同时，该高产透明质酸酶融合蛋白重组菌株既可以用甲醇进行诱导，也可以使用甘油进行诱导，在工业化生产中可选择不同的诱导剂进行发酵；甘油诱导的方式可大大提高实际操作中的安全性，同时可以降低对环境的危害。

Claims (12)

1.一种透明质酸酶融合蛋白，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
3.一种酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌为在酵母菌中导入透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母菌为毕赤酵母菌。
5.一种毕赤酵母（Pichia pastoris），命名为Pichia pastoris HAase（an）-His-9K-GS115，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号是CCTCC NO：M 20231485，保藏日期2023年08月15日。
6.权利要求3或4所述酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
（1）将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列SEQ ID NO5以同源重组
的手段插入至pPIC9K载体中的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-HAase-Fus；
（2）将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列SEQ ID NO.5以同源重组
的手段插入pGAPZαA载体中，得到重组质粒pGAPZαA-HAase-Fus；
（3）使用限制性内切酶SalI对步骤（1）得到的重组质粒pPIC9K-
HAase-Fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌P. pastoris/pPIC9K-HAase-Fus；
（4）使用限制性内切酶AvrII对步骤（2）得到的重组质粒pGAPZαA-
HAase-Fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入步骤（3）获得工程菌P.pastoris/pPIC9K-HAase-Fus的感受态细胞中，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌P .pastoris /pPIC9K-HAase-Fus/pGAPZαA-HAase-Fus。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，利用MD培养基培养后，在含遗传霉素G418的培养基进行筛选。
9.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，利用含博来霉素的培养基进行筛选。
10.权利要求3或4所述酵母工程菌、权利要求5所述Pichia pastoris HAase（an）-His-9K-GS115在制备透明质酸酶融合蛋白中的应用，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
11.权利要求3或4所述酵母工程菌、权利要求5所述Pichia pastoris HAase（an）-His-9K-GS115在降解透明质酸中的应用。
12.权利要求3或4所述酵母工程菌、权利要求5所述Pichia pastoris HAase（an）-His-9K-GS115在生产奇数透明质酸寡糖中的应用；
所述奇数透明质酸寡糖为三糖、五糖、七糖、九糖。
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