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CN116622590B - 一株源自昆虫的降解联苯菊酯的谷氨酸杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株源自昆虫的降解联苯菊酯的谷氨酸杆菌，属于微生物菌种领域。本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445，筛选自抗性品系灰茶尺蠖幼虫肠道中，具有独特的基因组特征、生长和表型特征、生理生化特征、联苯菊酯的利用和降解特征；特别地，能够降解联苯菊酯。基于表型特征、生理生化、化学组分、分子生物学的多相分类鉴定，确定谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445为谷氨酸杆菌；该菌具有降解农药联苯菊酯的能力，可为灰茶尺蠖的生物防治奠定基础，为解决农残问题提供新的菌株资源。

Description

一株源自昆虫的降解联苯菊酯的谷氨酸杆菌
技术领域
本发明涉及一株源自昆虫的降解联苯菊酯的谷氨酸杆菌，属于微生物菌种领域。
背景技术
我国茶树种植环境多样，茶园面积持续扩大，且呈现持续稳定增长的良好态势，而灰茶尺蠖作为一种食叶型害虫，会给茶农带来巨大的经济损失，所以茶农会使用化学农药如联苯菊酯来防治灰茶尺蠖。联苯菊酯是一种中等毒性的拟除虫菊酯类农药，但化学农药的长期使用，造成的农残后果已日益凸显，不仅加剧了环境污染，同时也使得灰茶尺蠖对联苯菊酯产生了抗性。
昆虫肠道内含有丰富的微生物资源。昆虫为肠道微生物提供一个相对特殊且较外界环境稳定的生境，与此同时，昆虫肠道微生物为昆虫提供营养物质、协助免疫系统，为昆虫的发育和代谢做出贡献。它们的代谢活动及产物可以帮助宿主适应外界各种环境压力。迄今的研究表明，昆虫肠道共生菌可以实现宿主对外源营养物质的利用，帮助宿主昆虫对食物进行协助降解,并为其提供食物中缺乏的营养物质；此外，部分共生菌还可以协助种间种内通信,甚至促进其宿主的生长发育、影响宿主寿命。近些年来，随着对肠道微生物的研究逐渐深入，已经明确共生菌与昆虫抗药性间存在着一定的联系，主要表现在昆虫共生菌可直接对有毒物质进行代谢或间接介导宿主的解毒酶或相关基因的表达，进而提高宿主昆虫的抗药性。
目前，关于灰茶尺蠖肠道共生菌与宿主抗药性之间的关系还未见报道。如果能从灰茶尺蠖肠道中筛选获得代谢联苯菊酯的微生物，将能为解决农残问题提供新的思路和菌种资源。
发明内容
为了解决上述至少一个问题，本发明从灰茶尺蠖幼虫肠道中筛选得到了一株新的谷氨酸杆菌，该菌具有降解联苯菊酯的能力；本发明还通过分子生物学、生理生化分析、化学组分分析和表型特征分析等多相分析，对该菌进行全方面的鉴定，以期从微生物角度为灰茶尺蠖的绿色虫害防治奠定一定的基础，为解决农残问题提供新的思路和菌种资源。
本发明的第一个目的是提供一株具有降解联苯菊酯能力的谷氨酸杆菌Eg-H，已于2022年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221445。
本发明的新的具有降解联苯菊酯能力的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M 20221445，具有如下特性：
(1)基因组特征：与谷氨酸杆菌属中已有效发表菌种的最大基因组ANI(averagenucleotide identity，平均核苷酸一致性)值为82.78％，是新的种；基因组长度为3,189,534bp，基因数为3362，平均基因长度为948.70bp，rRNA数为19，tRNA数为64，sRNA数为1，GC含量为55.78％；
(2)生长和表型特征：革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无运动性，不产芽孢，菌体呈杆状；在没有联苯菊酯存在时菌体形状较短，有联苯菊酯存在时菌体形状较细长；在LB固体培养基上37℃培养两天后，菌落呈黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐，通常菌落直径约为0.5～0.6mm，生长的温度范围为15-40℃(最适生长温度为30℃)，可以耐受的盐浓度为0-10％(w/v)(最适生长盐度为2％)，生长的pH范围为5-10(最适生长pH为8.0)；
(3)生理生化特征：
产缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶；
可以发酵L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、鼠李糖、肌醇、柠檬酸埃斯库林铁、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-蔗糖、菊粉、D-棉子糖、淀粉、糖原、D-核糖醇等产酸；
可以利用多种碳源，比如糊精、D-阿拉伯糖醇、D-果糖、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖、麦芽糖、D-棉子糖、D-核糖、蔗糖、L-乳酸、L-苹果酸、丙酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、谷氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、甘油、肌苷；
具有过氧化氢酶、胱氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶等酶活性；
(4)联苯菊酯的利用和降解特征：
能够在联苯菊酯为唯一碳源的基础盐培养基中生长；
将其接种至6mg/L含药盐液体培养基培养48h后，联苯菊酯降解效率可达84.75％；
在培养基中初始联苯菊酯的浓度小于等于60mg/L时，菌株Glutamicibactersp.Eg-H对联苯菊酯的降解率在75.78％-85％之间，初始联苯菊酯的浓度增加至100mg/L时降解率为49.89％，初始联苯菊酯浓度高达200mg/L时对联苯菊酯的降解率为16.49％；
菌株降解联苯菊酯后的降解初产物对灰茶尺蠖幼虫无毒性或毒性极低。
本发明的第二个目的是提供含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的菌剂。
在一种实施方式中，所述菌剂为液体菌剂或者固体菌剂。
在一种实施方式中，所述液体菌剂的制备，是将谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445活化后接种到LB液体培养基中进行培养。
在一种实施方式中，所述固体菌剂为含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的冻干粉。
在一种实施方式中，所述菌剂中还含有其他辅料，比如麦芽糊精、淀粉等。
本发明的第三个目的是提供一种降解联苯菊酯的方法，包括在含有联苯菊酯的体系中加入本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445或者含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的菌剂。
在一种实施方式中，所述含有联苯菊酯的体系可以是茶树落叶、土壤等。
在一种实施方式中，所述联苯菊酯的浓度在0～200mg/L。
在一种实施方式中，所述联苯菊酯的浓度在5～100mg/L；可选地，为5～60mg/L。
在一种实施方式中，所述降解是将谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445接种到含有联苯菊酯的体系中培养。可选地，是培养12～72h；可选地，是培养36～48h。
在一种实施方式中，谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445是按照2％～7％的接种量接种到含有联苯菊酯的体系中。
本发明的第四个目的是提供一种微生物肥料，所述微生物肥料中含有本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445。可以应用于土壤中农药联苯菊酯残留的降解。
在一种实施方式中，所述微生物肥料为缓释型微生物肥料，包括草木灰、硅藻土、膨化蛭石、尿素、硫酸镁、硫酸钾、谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445菌剂、糯米淀粉、氯化铵、磷酸二氢铵、海藻酸钠。
在一种实施方式中，所述微生物肥料为改良土壤的微生物肥料，由以下重量百分比的原料制成：谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445菌剂40～45％；黄腐酸钾25～30％；胺鲜酯2～3％；酵母提取物5～6％；壳寡糖5～6％；腐殖酸钠4～6％；海藻提取物4～6％；复合蛋白酶2～3％。
本发明的第五个目的是提供一种提高灰茶尺蠖的联苯菊酯抗性的制剂，所述制剂中含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445。
可选地，所述制剂可以是饲料。
本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445能够降解联苯菊酯从而提高昆虫宿主灰茶尺蠖的抗性，可以用于分析灰茶尺蠖抗性与肠道共生菌的关系，可为灰茶尺蠖的生物防治提供理论基础和防治靶点，为解决农残问题提供新的菌株资源。
本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445是利用以联苯菊酯为唯一碳源的基础盐培养基，从抗性品系灰茶尺蠖幼虫肠道中分离得到，利用细菌通用引物27F、1492R对其16SrDNA基因进行PCR扩增后送样测序，测序结果表明其序列全长为1414bp(序列如SEQ IDNO:1所示)。根据16S rDNA以Maximum-Likelihood(ML)法构建的系统发育树表明Glutamicibacter sp.Eg-H与谷氨酸杆菌属的模式菌株聚集在一起且单独呈一支，与之相邻分支上亲缘性最近的2株模式菌Glutamicibacter mishrai S5-52T和Glutamicibacterhalophytocola KLBMP 5180T的16S rRNA基因序列相似度分别为98.93％、98.16％。经16srDNA测序初步鉴定该菌为谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)。
选择系统发育树中同源关系最近的5株模式菌Glutamicibacter mishrai S5-52T、Glutamicibacter halophytocola KLBMP 5180T、Glutamicibacter nicotianae NBRC14234T、Glutamicibacter arliaitensis Re117T、Glutamicibacter uratoxydans NBRC15515T作为参考菌株，按照《常见细菌系统鉴定手册》对谷氨酸杆菌Glutamicibactersp.Eg-H进行多相分类的研究，主要包括形态学特征、生长特性、生理生化特征、极性脂组成、呼吸醌醌型、脂肪酸成分、基因组学分析以及DNA(G+C)含量等分类指标，同时分别采用标准的方法来测试其酶活特性及碳氮源利用情况。结合表型、生理生化、化学分类及DNA-DNA杂交等数据分析可知Glutamicibacter sp.Eg-H为谷氨酸杆菌属的一个新种。
本发明的有益效果：
本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445，筛选自抗性品系灰茶尺蠖幼虫肠道中，具有独特的基因组特征、生长和表型特征、生理生化特征、联苯菊酯的利用和降解特征；特别地，能够降解联苯菊酯从而提高昆虫宿主灰茶尺蠖的抗性。基于表型特征、生理生化、化学组分、分子生物学的多相分类鉴定，确定谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445为新种；该菌具有降解农药联苯菊酯的能力，可为灰茶尺蠖的生物防治奠定基础，为解决农残问题提供新的菌株资源。
生物材料保藏
谷氨酸杆菌，分类学命名为谷氨酸杆菌Glutamicibacter sp.Eg-H，于2022年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20221445。
附图说明
图1为菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的菌落形态特征图；
图2为菌株Glutamicibacter sp.Eg-H革兰氏染色图；
图3为菌株Glutamicibacter sp.Eg-H扫描电镜图；A、B分别为在不含和含有20mg/L联苯菊酯的液体LB培养基中生长的Glutamicibacter sp.Eg-H；
图4为菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的全细胞极性脂图和呼吸醌液相图；
图5为基于16S rRNA基因序列构建的菌株Glutamicibacter sp.Eg-H和谷氨酸杆菌属其他模式株系统发育树图；分支节点上的数字表示为1000次的重复比，大于50％的数字显示在节点；
图6为针对菌株Glutamicibacter sp.Eg-H组装的基因组序列，结合编码基因的预测结果所绘制的基因组圈图；最外圈是基因组序列位置坐标，由外圈到里圈分别为：正链基因、负链基因、ncRNA标记(黑色表示tRNA，红色表示rRNA)、GC含量(橘色表示大于均值，蓝色表示小于均值)、GC偏移(用来衡量G和C的相对含量，用于环状染色体中标记起点和终点；GC偏移＝(G-C)/(G+C)；紫色表示大于0，橘色表示小于0)；
图7为不同培养时间对菌株Glutamicibacter sp.Eg-H生物量及降解效率的影响；
图8为不同联苯菊酯浓度对菌株Glutamicibacter sp.Eg-H降解效率的影响；
图9为菌株Glutamicibacter sp.Eg-H对联苯菊酯代谢产物的GC-MS谱分析；
图10为联苯菊酯代谢产物2,4-二叔丁基酚对灰茶尺蠖的毒性检测。
具体实施方式
以下实施例中所述培养基及试剂配方如下：
1、皂化试剂
45g氢氧化钠(分析纯)溶于150mL甲醇(Methanol,HPLC级)及150mL去离子蒸馏水，将水与甲醇混合，搅拌过程中加入氢氧化钠，直至氢氧化钠颗粒完全溶解。
2、甲基化试剂
325mL 6N盐酸，275mL甲醇(Methanol,HPLC级)，在搅拌过程中将酸加入甲醇中；
3、提取试剂
200mL正己烷(Hexane,HPLC级)与200mL乙醚(Ethyl ether,HPLC级)混合均匀。
4、联苯菊酯储备液
称取0.121g联苯菊酯纯度标准样品(纯度99.1％，北京北方伟业计量技术研究院)粉末溶于30mL丙酮，按联苯菊酯粉末比吐温20为1：1.5的质量比加入吐温20，并用丙酮定容至100mL，获得浓度为12g/L的联苯菊酯浓乳液，即为联苯菊酯储备液，以备稀释取用。
5、PBS缓冲液(10mmol/L，PH7.4)
KCl 0.02，NaCl 0.8g，KH2PO4 0.024g，Na2HPO4·12H2O 0.29g，ddH2O 50mL，调pH至7.4后，双蒸水定容至100mL，高压灭菌，冷却后备用。
6、LB液体培养基
称取胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，加水溶解并定容至1L。
7、LB固体培养基
称取胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，琼脂16g，加水溶解并定容至1L。
8、基础盐培养基
称取(NH4)2SO4 20g，MgSO4·7H2O 2g，CaCl2 0.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4·12H2O15g，KH2PO4 15g于广口瓶中，加纯水溶解并定容至1L制成基础盐母液放入冰箱储存，使用的时候按十倍稀释，制备成液体基础盐培养基(Minimal Salt Medium，MSM)，固体培养基中加1.6％琼脂。
9、含药盐培养基/含药MSM培养基
取1中联苯菊酯储备液125μL，与250mL灭菌MSM培养基混匀，制成联苯菊酯浓度为6mg/L的MSM联苯菊酯培养基，固体培养基中再添加琼脂16g。不同联苯菊酯浓度的含药盐培养基配置方法以此类推。
10、无菌人工饲料
在250mL烧杯中放入麦胚粉12g、大豆粉4.5g、蔗糖2g、琼脂粉2g、韦氏盐0.5g、尼泊金甲酯0.25g、山梨酸0.15g、胆固醇0.1g、肌醇0.05g、70mL纯水，用玻璃棒搅拌均匀，115℃，灭菌30min，灭菌完成后冷却至60℃左右，另配置维生素C0.2 g、氯化胆碱0.05g、酵母粉0.2g，加入8mL纯水稀释，0.22μm滤膜过滤除菌，倒入上述烧杯，并用已灭菌的玻璃棒来将两者搅拌混匀。将制备好的无菌人工饲料置于-20℃冰箱中保存备用。
实施例1：谷氨酸杆菌新种形态观察
1.1菌株来源
抗性品系灰茶尺蠖幼虫肠道标本。取抗性品系灰茶尺蠖幼虫标本，利用无菌操作取出整个肠道放入研磨器中，加1mL无菌PBS缓冲液进行充分研磨，将研磨后的液体稀释105倍，吸取50μL稀释液涂布于含药盐固体培养基上，每组三个重复，于37℃生化培养箱中进行培养，将单菌落依次接到新的含药盐培养基和LB固体培养基各纯化3次，纯化后的菌株保存在20％甘油置于-80℃冰箱备用，其中的菌株Glutamicibacter sp.Eg-H即为本发明所涉及的菌株。
1.2菌株的表型特征和生长特征
将1.1得到的菌株接种至LB固体培养基在37℃培养一天后，其菌落形态和菌体形态如图1、图2所示。结果显示，在LB固体培养基上37℃培养一天后，菌落呈黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐，通常菌落直径约为0.5～0.6mm。
图3为扫描电镜图，图3A和图3B分别为在不含和含有20mg/L联苯菊酯的液体LB培养基中生长的Glutamicibacter sp.Eg-H细胞形态。由图3可知，在没有联苯菊酯存在时，菌体形状较短，反之，菌体形状则较细长。
Glutamicibacter sp.Eg-H为革兰氏阳性菌，生长温度范围为15～40℃(最适生长温度为30℃)，NaCl的耐受范围为0～10％(w/v)(最适生长盐度为2％)，pH生长范围为5.0～10.0(最适生长PH为8)。
1.3菌株的极性脂、脂肪酸、呼吸醌情况
按5％的接种量，将OD600值为0.8的Glutamicibacter sp.Eg-H种子液接种于LB液体培养基中，于37℃的180rpm的摇床下震荡培养12h(测定脂肪酸需要使用TSB培养基)。将菌悬液于4000rpm下离心，15min，收集湿菌体后送至北京宝杰罗生物科技有限公司，测定极性脂、脂肪酸、呼吸醌，具体实验步骤如下：
(1)极性酯测定
称取100mg冻干菌体放入1mL的0.3％ NaCl研磨10min，用10mL甲醇将磨碎的菌体洗入到50mL的耐有机溶剂螺口离心管中，沸水浴加热5min，再加入3mL 0.3％ NaCl溶液和5mL氯仿，上下颠倒5min，4000rpm离心5min弃去细胞残渣和上层水相，收集氯仿层；加入5mL0.3％ NaCl溶液和5mL氯仿，再次上下颠倒5min，4000rpm离心5min收集氯仿层。45℃减压蒸馏，干燥物即为磷酸类脂。将干燥的极性脂重新溶于约0.1mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)中，备用。用毛细管点样于10cm×10cm硅胶板的一角(型号为Art 5554，DC-Alufolien Kieselgel60F 254，Merck)，距离硅胶板下缘及左边边缘均1cm，第一向展层剂(氯仿:甲醇:水＝65:25:4(v/v))层析约25min；取出硅胶板，晾干后将硅胶板旋转90度，使用第二向展层剂(氯仿:甲醇:冰醋酸:水＝80:12:15:4(v/v))层析约30min，晾干后显色。配制下列显色液：
A:Dragendorff试剂(D试剂)
溶液A：次硝酸铋1.7g溶于100mL 20％冰醋酸中。溶液B：碘化钾40g溶于100mL蒸馏水中。将3.5mL溶液A依次加5mL溶液B，20mL冰醋酸，和50mL蒸馏水即为D试剂。
B:Ninhydrin试剂(N试剂)
0.4g茚三酮溶于100mL水饱和正丁醇。
C:Anisaldehyde试剂(A试剂)
270mL 95％乙醇，15mL浓硫酸，15mL p-茴香醛，3mL冰醋酸。
D:Dittmer and lester试剂(P试剂，又称钼蓝试剂或磷酸试剂)
溶液A：称取1.6g钼酸铵溶于12mL水中。溶液B：在4mL浓盐酸中加入1mL液体汞和8mL溶液A，混匀，摇动30min，过滤。液体汞在移取过程中如果泄露，应立即用单质硫(硫磺)覆盖。在剩余的溶液A中加入20mL浓硫酸和全部的溶液B，冷却、4度保存(储存液为亮绿色，稳定性不明)。用前，将储存液：水以1:3(v/v)的比例稀释，配成的显色剂为琥珀色。如需剧烈染色，可在100mL喷显剂中加入2.5mL浓硫酸。
E:磷钼酸试剂
磷钼酸10g溶解于95％的乙醇中。
D试剂显色，不需加热，对PC、PE、PME特异性显色，在黄色的背景上呈现桔黄色的斑点；N试剂显色，需60～70℃加热4-5min，PE、PME与某些含葡萄糖胺未知结构的磷酸类脂显红色；A试剂显色，65～70℃加热10-15min，此条件下显黄绿色斑点的为含糖的磷酸类脂或PIMS；P试剂显色不需加热，所有的磷酸类脂和P试剂均显蓝色；L磷钼酸试剂显色：70℃加热5～15min，所有极性脂在黄绿色背景上呈现灰褐色斑点。
(2)脂肪酸测定
用接种环从培养基表面刮取适量培养物(约40mg)，置于螺口玻璃管中，加入1mL皂化试剂，振荡5～10s，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；待样品管冷却后，加入2mL甲基化试剂，盖严振荡5～10s，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却，此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；在冷却的样品管中加入1.25mL提取试剂，慢慢振荡10min左右，加2-3滴饱和氯化钠溶液，弃下层水相；在剩余有机相中加入3mL 1.18％氢氧化钠溶液，慢慢振荡5min左右，加几滴饱和氯化钠溶液(目的是使分层更明显)，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。
使用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION ver A5.01)；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，5℃/min升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2μL；检测器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min。校准标样(Calibration standard)为MIDI CalibrationMix 1(MIDI,Inc.)。
(3)呼吸醌测定
湿菌体于-80℃冷冻3d后使用冷冻干燥机抽干菌体，取冻干菌体约100mg，加入氯仿:甲醇＝2:1的溶液40mL，在黑暗处磁力搅拌10h。在黑暗处用滤纸过滤收集滤液，用减压旋转薄膜蒸发仪40℃减压蒸馏至干燥。用少量(1-2mL)丙酮重新溶解干燥物，长条状点样于GF254硅胶板上(青岛海洋化工厂分厂，100×200mm)，以甲苯作展层剂展层约20min。取出风干后在254nm紫外灯下观察。在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为泛醌的位置Rf＝0.4～0.5。刮下目的条带，用1mL丙酮溶解，然后用含脱脂棉的1mL枪头去硅胶，收集滤液(可适当浓缩至200μL～300μL)，即得醌组分的丙酮溶液。置于4℃、黑暗处保存。
用反相高压液相色谱分析法测定呼吸醌。高压液相色谱仪为HP-1050(HewlettPackard)，反相高压液相柱为十八烷基硅烷(ODS 5mm,2504.6mm,I,d)，流动相为甲醇(分析纯)：异丙醇(分析纯)＝2:1溶液，流速为1.00mL/min，柱温为40℃，240nm和270nm紫外检测，使用Agilent Chemstation软件完成测定并记录数据。根据标准条件下不同醌组分与洗脱时间的关系，结合参照对照菌株，分析实验菌株的醌类型。
综上，细胞成分的研究结果如图4所示，全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、糖脂(GL)组成，其主要脂肪酸为Anteiso-C15:0(51.7％)，C16:0(16.4％)，Anteiso-C17:0(10.0％)，Iso-C16:0(9.6％)，主要呼吸醌为MK-8和MK-9。
实施例2：谷氨酸杆菌新种16S rRNA分类鉴定
对实施例1的Glutamicibacter sp.Eg-H进行分子生物学鉴定，PCR扩增其16SrRNA基因，经电泳检测合格后送至上海生物工程有限公司测序。其中，PCR所使用的引物、反应体系和条件详细如下：27F引物序列(5’-3’)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(序列如SEQ ID NO:2所示)和1492R(引物序列(5’-3’)：GGTTACCTTGTTACGACTT(序列如SEQ ID NO:3所示)；20μL反应体系：1μL DNA模板，1μL引物27F，1μL引物1492R，10μL 2×Taq PCR StarMix，7μLddH2O；反应条件设定为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸2min，循环30次，最后在72℃保温10min。
结果显示该序列全长为1414bp(序列如SEQ ID NO:1所示)。将序列上传至EzBioCloud进行在线比对分析，并下载较高相似度模式菌株的16S rDNA序列，利用软件MEGA6.1以最大似然法(Maximum-Likelihood)建造系统发育树。如图5所示，Glutamicibacter sp.Eg-H与谷氨酸杆菌属的模式菌株聚集在一起且单独呈一支，其与之相邻分支上亲缘性最近的2株模式菌Glutamicibacter mishrai S5-52T和Glutamicibacter halophytocola KLBMP 5180T的16SrRNA基因序列相似度分别为98.93％、98.16％。
实施例3：谷氨酸杆菌新种基因组学分析
在获得Glutamicibacter sp.Eg-H的纯培养后，采用三代PacBio和二代Illumina两种高通量测序技术相结合的方法对菌株进行了全基因组测序，并对其基因组基本特征进行了预测分析，与谷氨酸杆菌属其他已知菌种进行了全基因组比对分析。
收集Glutamicibacter sp.Eg-H在LB液体培养基中菌液OD600值为0.8时菌体，提取菌体总DNA。将DNA样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行基因组测序。对基因组编码基因进行预测和组分分析发现，基因组总长度为3,189,534bp，基因数为3362个，平均基因长度为948.70bp，rRNA数量为19个，tRNA数量为64个，sRNA数量为1个，GC含量为55.78％，图6为基因组预测图。
对菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的基因组数据进行GO注释功能分类结果显示，菌株所有基因可分为三大类：参与的生物学过程、涉及的细胞成分、分子功能。其中，参与生物过程的基因中，占比较多的是细胞过程(2295个)、代谢过程(2085个)、单有机体过程(2069个)、固定位(723个)、对刺激的反应(654个)、生物调节(647个)、细胞成分组织或生物发生(597个)和生物调节(587个)；注释到分子功能的基因数较多的是催化活性(1952个)、结合功能(1532个)、转运活性(550个)、核酸结合转录因子活性(264个)、结构分子活性(106个)；注释到的细胞成分的基因中，占比较多的是细胞(1403个)、细胞组(1401个)、膜(1011个)、膜部分(632个)、大分子复合体(个个)、细胞器(213个)和细胞器部分(164个)。
对菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的基因组数据进行COG蛋白功能分类结果显示，编码参与氨基酸运输与代谢(E)蛋白的基因数目为369个，参与转录(K)但基因数目为234，参与碳水化合物运输和代谢(G)的有215个。
菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的碳水化合物活性酶(CAZyme)注释结果表明，含量最多的糖活性酶类别主要是糖苷转移酶和糖基水解酶，分别注释到210和126个相关基因。
菌株Glutamicibacter sp.Eg-H与现有报道的五株谷氨酸杆菌模式菌株进行比较基因组分析表明(表1)，DDH(DNA-DNAhybridization)值和ANI值均小于区分不同种的规定阈值(dDDH<70％、ANI<96％)。
表1Glutamicibacter sp.Eg-H与参比菌株的基因组序列相似性
实施例4：生理生化实验鉴定
将菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的新鲜纯培养物(平板)寄送至北京宝杰罗生物科技有限公司，使用API 20NE、API ZYM、API50 CH(bioMe′rieux)、Biolog GENⅢ试剂盒(方法参照公司说明书)及细菌生化微量鉴定管(杭州天和微生物试剂公司)，获得测定该菌的唯一碳源利用及酶学特性指标。实验结果与系统发育树中最邻近的五株菌进行对比，结果见表2。基于系统发育、表型和生理生化数据，可以进一步确定该菌株可被分类为谷氨酸杆菌属的一个新种，暂定名为Glutamicibacter sp.Eg-H。
Glutamicibacter sp.Eg-H，于2022年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20221445。
表2菌株Glutamicibacter sp.Eg-H与亲缘菌的鉴别特征
注：+:阳性；-：阴性；w:弱阳性；菌株2-6的数据来源于文献[Das Lipika,DebSushanta,Das Subrata K.Glutamicibacter mishraisp.nov.,isolated from the coralFavia veroni from Andaman Sea.[J].Archives of microbiology,2020,202(04):733-745]。菌株1:Glutamicibacter sp.Eg-H；菌株2：Glutamicibacter mishrai S5-52T；菌株3：Glutamicibacter halophytocola KLBMP 5180T；菌株4：Glutamicibacter nicotianaeNBRC 14234T；菌株5：Glutamicibacter arilaitensis Re117T；菌株6：Glutamicibacteruratoxydans NBRC 15515T。
实施例5：菌株Glutamicibacter sp.Eg-H在降解联苯菊酯中应用
(1)菌株Glutamicibacter sp.Eg-H在不同培养时间时对联苯菊酯的降解效率
将纯培养Glutamicibacter sp.Eg-H菌株接种至含药MSM培养基(6mg/L联苯菊酯，(NH4)2SO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCl2 0.001％，FeSO4·7H2O 0.0001％，Na2HPO4·12H2O0.15％，KH2PO4 0.15％)中，于37℃、200r/min恒温摇床培养，分别在培养12h、24h、36h、48h和60h时收集样品，测定其OD600值，绘制以联苯菊酯为唯一碳源的条件下该菌的生长曲线，利用安捷伦气相色谱法检测联苯菊酯的剩余含量。
检测样品预处理：取10mL培养液加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，涡旋振荡5min，静置分层，加入1.5g无水硫酸钠至饱和，4000r/min离心10min后，转移上层有机相至新离心管，原离心管剩余的下层液体再加入10mL乙酸乙酯，重复上述步骤。合并两次的上层有机相，涡旋振荡5min后吸取1mL于10mL新离心管，经氮吹仪处理15min至风干，用正己烷定容至10mL，经0.22μm有机相滤膜过滤后装于色谱瓶，用于气相色谱仪检测。气相检测分析条件：色谱柱HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)、ECD检测器、起始柱温40℃保持1min，15℃/min升温至280℃、检测温度300℃、进样口温度275℃、进样量1μL。根据公式：降解率＝(1-实测残量/对照样残量)×100％计算降解率。
如图7所示，在培养至36h时其OD600值达到最大1.13，之后进入生长平台期，至48h时，其OD600值略微下降至1.012，随后小幅度波动。同时，在36h时菌株Glutamicibactersp.Eg-H对6mg/L联苯菊酯的降解效率达到80.30％，48h时降解效率达到最大84.75％。
(2)菌株Glutamicibacter sp.Eg-H在不同联苯菊酯浓度下对联苯菊酯的降解效率
将纯培养Glutamicibacter sp.Eg-H菌株按5％接种量分别接种至联苯菊酯浓度为6mg/L、20mg/L、60mg/L、100mg/L和200mg/L的含药MSM培养基中，于37℃、200r/min恒温摇床培养48h，每组设三个重复，同(1)采用气相色谱法对菌株的降解能力进行定量分析。
结果如图8所示，当培养基内联苯菊酯的浓度小于等于60mg/L时，菌株Glutamicibactersp.Eg-H对联苯菊酯的降解效率较高，在75.78％～85％之间，但随着联苯菊酯浓度增加至100mg/L时，该菌对联苯菊酯的降解率有显著性差异的下降(P<0.05)为49.89％；此外，当培养基内联苯菊酯浓度高达200mg/L时，菌株Glutamicibacter sp.Eg-H对联苯菊酯的降解率大幅下降至16.49％。
(3)菌株Glutamicibacter sp.Eg-H降解联苯菊酯产物的检测
将菌株Glutamicibacter sp.Eg-H以5％的接种量接种至联苯菊酯20mg/L的含药MSM培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养48h。萃取过程同(1)。
利用安捷伦气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行目标物测定与分析。色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度250℃；升温程序：160℃保持5min，以10℃/min升至200℃，保持1min，最后再以10℃/min升至280℃，保持8min。载气为氦气，流速1.5mL/min。质谱条件：电子电离方式；离子源温度230℃；电子能量70eV。结果显示，联苯菊酯保留时间为25.153min。经在NIST数据库的检索和比对，除去含硅等杂质峰，主要的差异峰为2,4-二叔丁基酚(2,4-Di-tert-butylphenol)。由联苯菊酯和其代谢产物的GC-MS质谱图(图9)可见，该峰保留时间在15.614min附近，NIST数据库比对匹配相似度为95.08％，保留指数为1510。
(4)降解初产物的毒性测试
2,4-二叔丁基酚(购自北京索莱宝科技有限公司，HPLC≧99％)储备液的配制按参照联苯菊酯储备液的制备方法进行制备。将此储备液按100mg/L浓度添加进人工饲料，用于饲喂30头形态大小相似、健康的4-5龄灰茶尺蠖幼虫，对照组饲喂正常的无菌人工饲料。如图10所示，48h后，取食无菌人工饲料的灰茶尺蠖幼虫存活率为93.33％，而取食含2,4-二叔丁基酚人工饲料的敏感品系幼虫的存活率也达94.45％，两者生存曲线无统计学差异。因此，该降解初产物对灰茶尺蠖幼虫无毒性或毒性极低。
实施例6：含有菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的菌剂
一种含有微生物菌剂，含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445；所述菌剂为液体菌剂或者固体菌剂。
可选地，所述液体菌剂的制备，是将谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445活化后接种到LB液体培养基中进行培养。
可选地，所述固体菌剂为含有谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的冻干粉。
进一步可选地，所述冻干粉的制备：先将谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445进行多级活化培养得到种子液，然后离心、洗涤多次得到菌泥；然后使用冻干保护剂溶解菌泥，预冻，再采用冻干机中进行冻干。可选地，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干后取出。可选地，所述保护剂使用量为种子液的10％。
可选地，所述菌剂中还含有其他辅料，比如麦芽糊精、淀粉等。
实施例7：含有菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的微生物肥料
一种微生物肥料，所述微生物肥料中含有本发明的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445。可以应用于土壤中农药联苯菊酯残留的降解。
可选地，所述微生物肥料为缓释型微生物肥料，包括草木灰、硅藻土、膨化蛭石、尿素、硫酸镁、硫酸钾、谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445菌剂、糯米淀粉、氯化铵、磷酸二氢铵、海藻酸钠。可以将部分硫酸镁、硫酸钾与菌剂采用糯米淀粉复合后装载于膨化蛭石中进行半封闭，后混合其余肥料原料造粒，达到良好的缓释作用。
可选地，所述微生物肥料为改良土壤的微生物肥料，由以下重量百分比的原料制成：谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445菌剂40～45％；黄腐酸钾25～30％；胺鲜酯2～3％；酵母提取物5～6％；壳寡糖5～6％；腐殖酸钠4～6％；海藻提取物4～6％；复合蛋白酶2～3％。该改良土壤的微生物肥料具有如下(1)-(4)至少一项用途：(1)改良土壤板结，平衡土壤结构；(2)改良土壤盐化酸化；(3)降解土壤重金属，降解土壤农残；(4)生根壮苗，保花护果，提高农作物抗病能力。
实施例8：含有菌株Glutamicibacter sp.Eg-H的灰茶尺蠖饲料
一种提高灰茶尺蠖的联苯菊酯抗性的饲料，所述饲料中含有谷氨酸杆菌CCTCCNO:M20221445。
可选地，由所述饲料中还含有：鸭蛋蛋清液2～5份、接骨草茎叶粉1.5～2.3份、乌桕叶粉1～1.6份、蔗糖0.7～1.5份、金银花叶粉1～1.8份、维生素C 0.01～0.04份、山梨酸钾0.001～0.005份、D-异抗坏血酸钠0.008～0.04份、琼脂粉1～5份、食用明胶0.1～0.6份、水150～270份。
可选地，由所述饲料中谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445含有1～10份。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO:1
ACGTCACCATTCGACGACTCCCCCCACACAAGGTGGTTAGGCCATCGGCTTCGGGT
GTTACCAACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCG
CAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACC
CCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTAGGGATTAGCTCCACCTCACAGTATCGCAACCCAT
TGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACG
TCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCACCACTACGT
GCTGGCAACATGGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGAC
ACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCAGCCCCGAAGGGAAAGACCATCT
CTGATCCGGTCTGGCACATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAT
CCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGC
CGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTACGGCGCGGAAAACGTGGAATGTC
CCCCACACCTAGTGCCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGC
TCCCCATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAAATGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGT
GTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACATCA
CTCTAGTCTGCCCGTACCCACCGCAGATCCGAGGTTGAGCCTCGGACTTTCACGGCAGA
CGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCGCCCT
ACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCAC
TCTCGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGG
CGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGA
GTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTC
GTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCCCCA
CCGATAAATCTTTCAACAACCCACCATGCGGTAAGAAGTCATATCCGGTATTAGACCCAG
TTTCCCGGGCTTATCCCAAAGTCGGGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCC
ACTAATCCACCCTGCAAGCAGGGCTTCATCGTTCGACTGCATGGTAGCG
SEQ ID NO:2
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
SEQ ID NO:3
GGTTACCTTGTTACGACTT
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (11)

1.一株具有降解联苯菊酯能力的谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)Eg-H，已于2022年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221445。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂或者固体菌剂。
4.一种降解联苯菊酯的方法，其特征在于，包括利用权利要求1的谷氨酸杆菌CCTCCNO:M20221445或者含有权利要求1的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445的菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述联苯菊酯的浓度在6～200mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述联苯菊酯的浓度在5～100mg/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述联苯菊酯的浓度在5～60mg/L。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445是按照2％～7％的接种量接种到含有联苯菊酯的体系中。
9.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中含有权利要求1的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445。
10.根据权利要求9所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料为缓释型微生物肥料，包括草木灰、硅藻土、膨化蛭石、尿素、硫酸镁、硫酸钾、谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445菌剂、糯米淀粉、氯化铵、磷酸二氢铵、海藻酸钠。
11.一种提高灰茶尺蠖的联苯菊酯抗性的制剂，所述制剂中含有权利要求1的谷氨酸杆菌CCTCC NO:M20221445。
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