CN116570595A - Am679在上调eftud2表达和抑制hbv药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出AM679在EFTUD2上调作用及在抑制HBV药物中的用途。其中所述AM679结构式如下：
Description
技术领域
本发明涉及药学领域，尤其涉及AM679在上调EFTUD2表达和抑制HBV药物中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是肝脏疾病进展甚至肝细胞癌变的重要影响因素。现有的抗病毒药物包括核苷(酸)类似物和聚乙二醇化干扰素，仅能抑制乙肝病毒的转录与复制而无法完全清除病毒基因组以实现慢性乙型肝炎的治愈。而HBV难以清除的关键，一方面在于病毒的复制与转录模板——共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA,cccDNA)的持续存在，另一方面在于宿主免疫反应的缺陷。乙型肝炎病毒宿主免疫应答的深入研究，一定程度上拓展了药物治疗的潜在靶点，其中选择性调控宿主因子的治疗策略受到的关注尤为广泛。
发明内容
为了解决上述技术问题，申请人前期研究发现延伸因子结合蛋白2(ElongationFactor Tu GTP-binding Domain-containing 2,EFTUD2)作为剪接体GTP酶，可以通过pre-mRNA剪接作用调节固有免疫信号通路抑制HBV复制，证实EFTUD2是一个有价值的抗HBV治疗的全新靶点。在此研究基础上，通过建立Epro-LUC-HepG2细胞系，筛选出能够靶向正调控EFTUD2启动子活性的诱导剂，最终挑选出能够显著促进EFTUD2在肝细胞核内高表达且细胞毒性较低的小分子化合物AM679，设想小分子化合物AM679有望为宿主免疫反应缺陷的HBV患者提供全新的免疫治疗选择。
尽管FLAP抑制剂的早期开发集中在哮喘治疗上，但是随着在炎症通路在多种病理生理过程中的作用不断发展，AM679的潜在应用范围也在不断扩展。研究发现，在较多类型的癌症中5-脂氧合酶及其代谢物的表达上调，并且已被证明其与肿瘤发生率上升有关，有观点认为在肿瘤的发展和进展过程中癌细胞可能利用5-脂氧合酶途径与肿瘤微环境相互作用。而通过抑制肝星状细胞中5-脂氧合酶可减轻肝脏纤维化，提示其可能在肝星状细胞激活过程中起关键作用。至今尚无AM679抗HBV活性相关研究的报道，本专利旨在探究AM679对HBV复制、转录及表达的调节作用。
申请人在多次实验的基础上，验证小分子化合物AM679可以在体外上调EFTUD2表达，并可抑制HBV DNA、总HBV RNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平。这项发现可能揭示了AM679上调EFTUD2并有效对抗HBV的全新药学用途。
为此，本发明提出AM679在上调EFTUD2表达和抑制HBV中的用途；
其中，所述AM679的结构式如下：
进一步的，提出AM679在上调EFTUD2表达和抑制HBV药物中的用途。
进一步的，AM679在制备通过上调EFTUD2表达以及通过pre-mRNA剪接作用调节固有免疫信号通路以抑制HBV复制的药物中的用途。
进一步的，所述的上调EFTUD2表达为，对EFTUD2启动子作用、基因、蛋白表达等的上调。
进一步的，所述抑制HBV为抑制HBV DNA、总HBV RNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平。
进一步的，AM679在体外上调EFTUD2表达，并可抑制HHBV DNA、总HBV RNAs、HBV3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平的用途。
进一步的，AM679在体外上调EFTUD2表达，并可抑制HBV DNA、总HBV RNAs、HBV3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平药物中的用途。
进一步的，所述抑制HBV为，单独或联合使用AM679抑制HBV DNA、和或HBsAg、和或HBeAg、和或总HBV RNAs、和或HBV 3.5-kb RNA等指标。
进一步的，AM679在体外或体外上调EFTUD2表达，并抑制HBV DNA、和或总HBVRNAs、和或HBV 3.5-kb RNA、和或HBsAg及HBeAg药物中的用途。
进一步的，AM679在HepAD38和或HepG2-NTCP细胞中上调EFTUD2药物中的用途。
进一步的，AM679在HepAD38细胞中抗HBV药物中的用途。
进一步的，AM679在HBV体外感染细胞模型中抑制HBV复制和转录,且与ETV联用后增强抗HBV效果药物中的用途。
进一步的，本发明还提出一种AM679与ETV药物组合物联合提高抗HBV获益的用途。
本发明涉及的小分子化合物AM679可以购买获得，也可通过合成制备。有益效果：本发明涉及的化合物AM679对EFTUD2具有很好的上调作用，对HBV多种指标，尤其是对HBVDNA、总HBV RNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg具有很好的抑制效果，同时联合ETV治疗也可见明显获益，从固有免疫应答的角度为HBV患者治疗提供更多选择，具有良好的药物应用前景。
附图说明：
图1.AM679对HepAD38细胞活性的抑制曲线；
图2.AM679对HepG2-NTCP细胞活性的抑制曲线；
图3.AM679对LO2细胞活性的抑制曲线；
图4.AM679在HepAD38细胞及HepG2-NTCP细胞中对EFTUD2的上调作用；
图5-1.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制上清HBV DNA；
图5-2.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制胞内HBV DNA；
图5-3.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制HBV总RNAs；
图5-4.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制HBV 3.5-kb RNA；
图5-5.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制上清HBsAg分泌；
图5-6.AM679在HBV复制细胞模型中可抑制上清HBeAg分泌；
图6-1.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制上清HBV DNA；
图6-2.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制胞内HBV DNA；
图6-3.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制HBV总RNA；
图6-4.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制HBV 3.5-kb RNA；
图6-5.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制上清HBsAg；
图6-6.AM679在HBV体外感染细胞模型中可抑制上清HBeAg。
具体实施方式：
下面结合附图，对本发明技术方案进行更进一步的描述。
以下实施例涉及的引物序列：
HBV DNA：
HBV DNA forward 5’-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3’
HBV DNA reverse 5’-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3’
总HBV RNA：
total HBV RNAs forward 5’-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3’
total HBV RNAs reverse 5’-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3’
HBV 3.5-kb RNA：
HBV 3.5-kb RNA forward 5’-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3’
HBV 3.5-kb RNA reverse 5’-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’
EFTUD2：
EFTUD2 forward 5’-CAATATCATGGACACTCCAGGAC-3’
EFTUD2 reverse 5’-CGGTCAATCTTGTTGATGCACA-3’
GAPDH：
GAPDH forward 5’-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3’
GAPDH reverse 5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’
药效实验
(一)主要实验材料
AM679购自MCE公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Opti-MEM养基购自美国Gibco公司；PBS购自苏州赛默飞世尔仪器有限公司；D-Hank'sSolution购自武汉普诺赛生命科技有限公司；双抗购自上海碧云天公司；Trypsin-EDTASolution购自上海碧云天公司；L-Glutamine solution购自美国Sigma-Aldrich公司。
(二)细胞培养
本研究应用了以下三种细胞株：人肝癌细胞株HepAD38和HepG2-NTCP；人正常肝细胞株LO2细胞。细胞在5％C02-95％空气、饱和湿度以及37℃的条件下，培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中。
(三)CCK-8细胞增殖实验
将生长状态良好的HepAD38、HepG2-NTCP、LO2细胞分别以2000/孔接种96孔板，加入不同浓度的AM679，设3个复孔、阴性对照孔和空白孔，置于培养箱中并持续药物处理72小时。取出培养板，弃细胞上清，每孔加入100μL新鲜培养基和10μL CCK-8溶液，轻轻敲击培养板以帮助混匀，避光孵育2-4小时。酶标仪双波长检测OD值(检测波长为450nm，参考波长630nm)。
以药物浓度为横坐标，细胞活性为纵坐标，用GraphPad Prism 8(GraphPadsoftware公司)软件拟合抑制曲线。AM679对HepAD38细胞的抑制曲线如图1所示，对HepG2-NTCP细胞的抑制曲线如图2所示，对LO2细胞的抑制曲线如图3所示。
(四)检测AM679对EFTUD2的上调作用
将生长状态良好的HepAD38和HepG2-NTCP细胞分别以5×105/孔接种于6孔板。实验组分别加入终浓度为2nM的AM679处理48小时，设置0.1％ DMSO为阴性对照组。
使用RNA-Quick Purification Kit(奕杉生物，上海)提取细胞内总RNA，并用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，USA)对产物的纯度和浓度进行检测，A260/A280均在1.90-2.00之间，浓度(c)调整至100-1000ng/μl之间。采用TARAKA公司的反转录试剂盒(RR036A)逆转录生成cDNA。以GAPDH为内参基因，采用TARAKA公司的实时荧光定量PCR试剂盒(RR820A)检测EFTUD2表达。
结果如图4所示，在HepAD38和HepG2-NTCP细胞中，2nM AM679可上调EFTUD2mRNA表达2倍以上，效果良好。
(五)检测AM679在HepAD38细胞中的抗HBV效果
将生长状态良好的HepAD38细胞以5×105/孔接种于6孔板。实验组分别加入终浓度为0.5nM、2nM的AM679，设置0.1％ DMSO为阴性对照组、25nM的恩替卡韦(ETV)为阳性对照组，并同时设置2nM AM679联合25nM ETV治疗组。分别在第3、6、9天检测细胞上清中的HBVDNA(乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(荧光探针PCR法)，广州达安基因)、HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)，上海科华)，操作方法均按照试剂盒说明进行；检测细胞内HBV DNA、HBV总RNAs、HBV 3.5-kb RNA。
提取细胞内DNA方法：
(1)准备无菌无酶1.5mL EP管若干，无水乙醇，PBS，Protease K，Rnase A(100mg/ml)，水浴锅预热至56℃；DNA提取试剂盒各组分放至室温；
(2)将待测细胞转移到准备好的EP管中，低速离心后弃上清，200μL PBS重悬细胞；
(3)先后加入Protease K 20μL、Rnase A 4μL，涡旋15s，瞬时离心15s，加入200μLBuffer AL后重复涡旋及瞬离15s；
(4)放置56℃水浴锅加热30min；加热结束后瞬离10s，加入200μL无水乙醇，涡旋瞬离15s；
(5)管中液体转移至试剂盒配套离心柱中，6000g离心1min(可视情况调整转速)，更换套管，弃废液；
(6)离心柱中加500μL Buffer AW1，6000g离心1min，弃废液。再加入500μL BufferAW2，20000g离心3min，弃废液(必要时更换离心柱套管)。再次20000g离心1min，更换新套管。
(7)加入50μL Buffer AE，静置5min，6000g离心1min(可重复操作，提高产量)。
(8)在NanoDrop 2000分光光度计上检测上述提取的DNA浓度和纯度，并放置-80℃保存。
其余方法同前方法。PCR结果显示，AM679在HBV复制模型即HepAD38细胞中，以时间、剂量依赖的方式降低上清HBV DNA、胞内HBV DNA、HBV总RNAs、HBV 3.5-kb RNA的表达；此外，通过ELISA法检测上清HBsAg、HBeAg，发现HBsAg及HBeAg随AM679的作用时间、剂量下降。以上结果均验证了AM679在HBV复制模型中对HBV有抑制活性，结果如图5-1至5-6所示。
(六)检测AM679在HBV体外感染细胞模型中的抗HBV效果
利用HepG2-NTCP细胞构建HBV体外感染细胞模型的方法：
HBV浓缩液的制备。HepAD38细胞在含有2μg/ml强力霉素和400μg/ml G418的培养基中生长至80％融合，换用不含强力霉素和G418的培养基继续培养10-14天，每隔2天收集上清液、保存于4℃。将收集的所有上清液在4℃下250×g离心20分钟，取上清，0.45μm无菌过滤后，加入PEG 8000，终浓度为8％。反复颠倒混匀，4℃过夜。次日在4℃、10000×g离心1小时，弃掉上清液，即得到纯化的HBV病毒。以适量DEME重悬，PCR确定病毒浓缩液拷贝数，储存-80℃备用。
HepG2-NTCP细胞在培养基中用2μg/ml强力霉素预处理2-3天以诱导NTCP受体表达。随后，在4％ PEG 8000存在下，将制备的HBV病毒与经强力霉素处理的细胞1000GEq/cells的感染复数(MOI)孵育24小时。用PBS洗涤细胞3次，并进一步用含有强力霉素的培养基维持培养。
在构建完成的感染模型中，实验组为：2nM AM679处理组和2nM AM679+25nM ETV联合治疗组，设置0.1％ DMSO为阴性对照组、25nM ETV为阳性对照组。在第10天检测细胞上清及细胞内HBV DNA、总HBV RNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平。方法同前。
与在HBV复制模型中相似，PCR和ELISA结果显示，在HBV体外感染细胞模型中单独使用AM679同样有效抑制了上清HBV DNA及胞内HBV DNA、总HBV RNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg的表达；相对地，单用ETV仅能降低HBV DNA，并不能减少HBsAg的分泌和HBVRNA的表达。此外，AM679+ETV的组合提高了AM679的抗病毒活性，结果如图6-1至6-6所示。
Claims (10)
1.AM679在上调EFTUD2表达和抑制HBV药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述AM679的结构式如下：
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：AM679在制备通过上调EFTUD2表达以及通过pre-mRNA剪接作用调节固有免疫信号通路以抑制HBV复制的药物中的用途。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述上调EFTUD2表达为对EFTUD2启动子作用、基因、蛋白表达的上调。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抑制HBV为，抑制HBV DNA、总HBVRNAs、HBV 3.5-kb RNA、HBsAg及HBeAg水平；
所述抑制HBV为，单独或联合使用AM679可抑制HBV DNA、和或HBsAg、和或HBeAg、和或HBV DNA、和或总HBV RNA、和或HBV 3.5-kb RNA。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：AM679在体外上调EFTUD2表达，并抑制HBsAg、和或HbeAg、和或总HBV RNA、和或3.5-kb RNA、和或HBV DNA药物中的用途。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：AM679在HepAD38和或HepG2-NTCP细胞中上调EFTUD2药物中的用途。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：AM679在HepAD38细胞中抗HBV药物中的用途。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：AM679在HBV体外感染细胞模型中抑制HBV复制和转录,且与ETV联用后增强抗HBV效果药物中的用途。
10.AM679与ETV在制备提高抗HBV疗效的药物组合物中的应用。
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| US20110256130A1 (en) * | 2008-12-01 | 2011-10-20 | Joshua Robert Schultz | Methods of treating inflammatory disorders |
| CN112111595A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-22 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种筛选上调eftud2表达的化合物的方法 |
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