CN115819584A - 抗pd-l1抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗PD‑L1抗体、其制备方法和应用。所述抗体由重链和轻链构成；所述重链氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有85～100%的同一性；所述轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有85～100%的同一性。本发明提供了一种具有高特异性、强竞争活性的抗PD‑L1抗体，并且确保其具有良好的热稳定性。其能够有效地检测PD‑L1的存在情况及阻断PD‑L1/PD‑1通路，实现阻断/治疗相关疾病，且高的热稳定性使其能够与多数现有的联合治疗手段结合，具备更广泛的使用价值。

Description

抗PD-L1抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗PD-L1抗体、其制备方法和应用。

背景技术

免疫系统必须在有效应答以清除致病体与保持耐受以防止自身免疫疾病之间实现平衡。T细胞对于保持这种平衡是关键的，它们的适当的调节主要是通过B7-CD28家族的分子协调进行。B7家族成员(其行使配体的功能)和CD28家族成员(其行使受体的功能)之间的相互作用不仅提供了关键的正信号，可发起、提高和维持T细胞应答，而且在适当时还提供促进限制、终止和/或消弱T细胞应答的关键负信号。CD28家族的一个成员，称为PD-1(也称为程序化细胞死亡-1)在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上被增量调节；B7家族中的配体，PD-L1(也称为B7H1或程序化细胞死亡-1配体1)与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。

已有的结果显示，肿瘤细胞中高表达的PD-L1是通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。例如，在卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌和黑色素瘤的大量样品中，在不考虑后续治疗的情况下，PD-L1的表达与不良预后和总存活期短有关。考虑到PD-L1在癌症发展和免疫系统调节中的重要作用，持续需要检测PD-L1的存在情况以及阻断PD-L1/PD-1通路的有效抗体。因而抗PD-L1抗体应运而生。

抗PD-L1抗体在癌症诊疗方面具有巨大的用途。如其在晚期非小细胞肺癌的治疗中具有显著的疗效，并且在此基础上，其在小细胞肺癌、局部晚期非小细胞肺癌等多种肺癌疾病种均有着良好的运用。

其能够用于多种治疗手段，如联合化疗、靶向药物及放疗等。但是，目前抗PD-L1抗体仍有许多的缺陷亟待解决。其中尤为突出的便如目前抗PD-L1抗体的热稳定性差的问题。因而提高抗PD-L1抗体的热稳定性和竞争力，是进一步拓宽抗PD-L1抗体应用领域及提高其应用效果的关键。

发明内容

为解决现有的抗PD-L1抗体的热稳定性相对较差，且多数抗PD-L1抗体的竞争力较弱，用于治疗时效果有限等问题，本发明提供了一种抗PD-L1抗体、其制备方法和应用。

本发明的目的在于：

一、制备获得具有强竞争力的抗PD-L1抗体；

二、确保抗PD-L1抗体具有良好的热稳定性。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案。

抗PD-L1抗体，

所述抗体由重链和轻链构成；

所述重链包括以下至少一种：

第一重链（4D11_huVH4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有85～100 %的同一性；

第二重链（4D11_huVH5），其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有85～100 %的同一性；

第三重链（4D11_huVH6），其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有85～100 %的同一性；

所述轻链包括以下至少一种：

第一轻链（4D11_huVL3），其氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有85～100 %的同一性；

第二轻链（4D11_huVL4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有85～100 %的同一性。

作为优选，

所述4D11_huVH4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述4D11_huVH5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述4D11_huVH6的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述4D11_huVL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述4D11_huVL4的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示.

作为优选，

所述抗体为人源化抗体。

抗PD-L1抗体的制备方法，

所述方法包括：

1）构建非人源性杂交瘤细胞，从中纯化得到RNA，以纯化后的RNA逆转录为cDNA作为模板后采用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增，将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选择阳性PCR产物克隆并测序，得到非人源性抗体原始序列；

2）人源性序列构建：基于步骤1）所得的非人源性抗体原始序列，建模并经过数据库对比，将非人源性抗体原始序列突变为人源化序列；

3）抗体构建：将步骤2）所得的人源化序列组合成人源化抗体；

4）抗体表达：于Expi293哺乳动物表达系统中进行步骤3）所得人源化抗体的表达；

5）抗体纯化：收取经步骤4）于Expi293细胞表达后的细胞上清液，纯化至抗体纯度≥90 %。

作为优选，

步骤1）所述非人源性杂交瘤细胞由以下方法培养得到：

1-1）利用PD-L1-his抗原对小鼠进行靶蛋白免疫注射，使小鼠体内产生能分泌特异性靶蛋白抗体的B细胞；

1-2）取产生免疫反应的小鼠脾脏细胞进行细胞融合，得到融合细胞；

1-3）所得融合细胞经ELISA法检测筛选并选取能够与PD1-hFc竞争结合PD-L1-his的融合细胞进行亚克隆，亚克隆后再次经过ELISA法检测筛选并选取能够与PD1-hFc竞争结合PD-L1-his的融合细胞进行建株，得到非人源性杂交瘤细胞。

作为优选，

步骤1）非人源性抗体原始序列包括：

重链核酸序列、轻链核酸序列、重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。

作为优选，

所述重链核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述轻链核酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

作为优选，

步骤2）所述人源化序列包括人源性重链序列和人源性轻链序列。

抗PD-L1抗体的应用，

所述抗PD-L1抗体用于促进细胞上清中IFN-γ的分泌。

作为优选，

所述抗PD-L1抗体用于制备药物和/或药物组合物；

所述药物和/或药物组合物用于肿瘤和/或癌症和/或免疫性疾病和/或感染性疾病的靶向治疗。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种具有高特异性、强竞争活性的抗PD-L1抗体，并且确保其具有良好的热稳定性。其能够有效地检测PD-L1的存在情况及阻断PD-L1/PD-1通路，实现阻断/治疗相关疾病，且高的热稳定性使其能够与多数现有的联合治疗手段结合，具备更广泛的使用价值，而在竞争力方面，其也普遍优于现有的如阿特珠单抗等市售抗PD-L1抗体。

附图说明

图1为实施例2所述鼠源性杂交瘤抗体纯化结果示意图；

图2 ELISA法测定鼠源PD-L1抗体与目标抗原结合活性的测试结果；

图3为ELISA法测定鼠源PD-L1抗体与9.0 µg/ml的PD-1-hFc配体竞争活性的测试结果；

图4为FACS法检测鼠源PD-L1抗体与CHO-PD-L1细胞的结合活性测试结果；

图5为FACS法检测鼠源PD-L1抗体与PD1-hFc的竞争活性的测试结果；

图6为鼠源PD-L1抗体阻断CD80-hFc活性检测结果；

图7为4D11人源化抗PD-L1抗体纯化结果示意图；

图8为ELISA法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-L1-his结合活性测试结果；

图9为FACS法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与CHO-PD-L1细胞的结合活性测试结果；

图10为ELISA法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-1-mFc的竞争活性测试结果；

图11为FACS法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-1-mFc的竞争活性测试结果；

图12为Luciferase Assay检测4D11人源化抗PD-L1抗体活性表征结果；

图13为4D11人源化抗PD-L1抗体热稳定性实验测试结果；

图14为4D11人源化抗PD-L1抗体MLR实验表征结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

小鼠的初次免疫：

用PD-L1-his抗原对3只Bal B/C 小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司，雌性8周龄）进行靶蛋白免疫注射，使小鼠体内产生能分泌特异性靶蛋白抗体的B细胞；

小鼠的加强免疫：

基于初次免疫结果，选择在初次免疫结果种表现最优的61号小鼠，对61号小鼠以皮下注射方式进行加强免疫，后续用于细胞融合。

实施例2

杂交瘤融合试验：

细胞融合：

取实施例1所记载的61号免疫小鼠，处死后取脾脏细胞，据SP2/0:脾细胞=1:5的原则按照细胞融合标准操作规程进行免疫小鼠细胞融合，融合号标记为H009融合细胞板，批号：20210806。

细胞筛选：

取上述H009融合细胞板中的融合细胞，经ELISA法检测，挑选与PD-L1-his结合较强，与PD1-hFc配体竞争较强的34个孔进行亚克隆。

亚克隆：

为了最后拿到稳定的克隆株，通过检测亚克隆细胞，对阳性细胞克隆化达，进一步纯化细胞。经过2个周期的亚克隆，ELISA法检测与PD-L1-his结合较强（OD450=2.200）及与PD1-hFc竞争较强（OD450=0.690）的4D11克隆进行建株及检测，得到鼠源性杂交瘤细胞。

纯化：

取上述鼠源性杂交瘤细胞进行扩培，鼠源性杂交瘤细胞经扩培后收取细胞上清液，按照蛋白纯化标准操作规程进行抗体纯化。纯化结果如图1所示，从图1中可以看出，本次纯化所得的鼠源性杂交瘤细胞中抗PD-L1抗体纯度＞90 %。

实施例3

鼠源性杂交瘤细胞PD-L1抗体活性检测：

（1）ELISA法检测鼠源PD-L1抗体与PD-L1-his结合活性：

通过ELISA法，将测板包被1.0 µg/ml的PD-L1-his，设置一个鼠源PD-L1抗体样品浓度梯度，测定结合活性OD值来检测鼠源PD-L1抗体与目标抗原结合亲和力强弱。结果如图2所示，从图2显示的数据可以看出，该鼠源PD-L1抗体与抗原结合较强（EC50=0.00301），曲线上下平台清晰，窗口大，活性较好。

（2）ELISA法检测鼠源PD-L1抗体与PD1-hFc竞争活性：

将待测板包被4.0 µg/ml的PD-L1-his，设置一个鼠源PD-L1抗体样品浓度梯度，测定OD值来检测鼠源PD-L1抗体与9.0 µg/ml的PD-1-hFc配体的竞争活性。结果如图3所示，从图3显示的数据可以看出，该鼠源PD-L1抗体OD值明显趋势，曲线上下平台清晰，具有较强竞争活性（IC50=0.02759）。

（3）FACS法检测鼠源PD-L1抗体与CHO-PD-L1细胞的结合活性：

将鼠源PD-L1抗体设置一系列浓度，与CHO-PD-L1细胞孵育，用FACS法测定结合信号强度，检测鼠源PD-L1抗体与目的蛋白的结合活性。结果如图4所示，从图4显示的数据可以看出，该鼠源PD-L1抗体与CHO-PD-L1结合较强，活性较好（IC50=0.1281）。

（4）FACS法检测鼠源PD-L1抗体与PD1-hFc的竞争活性：

通过FACS法，将CHO-PD-L1细胞均匀地铺设到96孔细胞板中，设置PD1-hFc恒定浓度，以及待测样品鼠源PD-L1抗体浓度梯度，一起与细胞进行结合，再加入每孔3µg/ml的二抗，结合后测定竞争活性OD值来检测鼠源PD-L1抗体与PD1-hFc竞争力强弱。结果如图5所示，从图5显示的数据可以看出，该鼠源PD-L1抗体竞争力较强（IC50=0.2174）。

（5）鼠源PD-L1抗体阻断CD80-hFc活性检测：

将待测板包被2.0 µg/ml的PD-L1-mFc，设置样品浓度梯度，测定OD值来检测鼠源PD-L1抗体与2.0 µg/ml的CD80-hFc的阻断活性。结果如图6所示，从图6显示的数据可以看出，该鼠源PD-L1抗体OD值明显趋势，曲线上下平台清晰，具有较强竞争活性（IC50=0.1942），其对CD80的阻断活性优于阳性对照。

从上述（1）~（5）的检测结果可以看出，本发明所得的鼠源PD-L1抗体具有较强的竞争力，其在治疗相关疾病方面具有巨大的应用潜力。

实施例4

鼠源性杂交瘤细胞PD-L1抗体测序：

培养杂交瘤细胞，从中得到小量纯化的高纯度RNA，逆转录为cDNA作为模板后使用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增。将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选取阳性克隆培养并送测序，对测序结果进行分析并将正确的序列订出，完成抗体的测序。

测序结果如下表所示：

	生物学信息测序结果	序列编号
			鼠源抗体重链核酸测序结果(Nucleicacidsequence)	CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGCCCCAGCCTGGTGAAGCCCTCCCAGACACTGAGCCTGACATGTTCCGTGACAGGCGATTCCATCACCAGCGGCTACTGGAGCTGGATCAGAAAGTTCCCTGGCAGCAAGTTCGAGTACATGGGCTACATCTCCTACACCGGCAGCACATACCAGAACCCCTCCCTGAAGAGCAGAATCTCCATCACAAGAGACACCAGCAAGAATCAGTACTACCTGCAGCTGAACAGCGTGACCAGCGAGGATACAGCCACCTACTTCTGTGCCAGGTCCAGCGATTGGCTGTACCCCTTCGCCGATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCGCCGCC	SEQ IDNO：6
鼠源抗体轻链核酸测序结果(Nucleicacidsequence)	CAGATCGTGCTGACACAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGAGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCCTCCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCTCCACATCCCCTAAGCTGTGGATCTACGACACATCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGGCAGATTCTCCGGAAGCGGCTCCGGCAATTCCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGTGGCCACATACTACTGTTTCCAGGGCAGCGGCTACCCCCTGACATTTGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG	SEQ IDNO：7
			鼠源抗体重链氨基酸测序结果(Proteinsequence)	QVQLKESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWSWIRKFPGSKFEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTSEDTATYFCARSSDWLYPFAD	SEQ IDNO：8
鼠源抗体轻链氨基酸测序结果(Proteinsequence)	QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLTFGAGTKLELK	SEQ IDNO：9

实施例5

人源序列突变：

用3D建模的方法，经数据库比对，将原始鼠源序列突变成人源序列。将鼠源性杂交瘤细胞PD-L1抗体原始序列设计为多个人源化氨基酸（huVH4、huVH5、huVH6、huVL3、huVL4，具体序列见下方），并将设计的序列组合成人源化抗体，于Expi 293哺乳动物表达系统中进行抗体的表达。

上述人源化氨基酸序列的测序结果如下表所示。

	生物学信息测序结果	序列编号
			4D11_huVH4	QVQLKESGPGLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWSWIRQHPGKKFEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRISITRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCARSSDWLYPFADWGQGTTVTVSS	SEQ IDNO：1
4D11_huVH5	QVQLKESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGDSITSGYWSWIRQHPGKGFEYMGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSDWLYPFADWGQGTTVTVSS	SEQ IDNO：2
			4D11_huVH6	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYWSWIRQHPGKGLEYMGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSDWLYPFADWGQGTTVTVSS	SEQ IDNO：3
4D11_huVL3	EIVLTQSPATLSLSPGERATMTCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGNDYTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSGYPLTFGQGTKLEIK	SEQ IDNO：4
			4D11_huVL4	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLWIYDTSKLATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSGYPLTFGQGTKLEIK	SEQ IDNO：5

对上述4D11人源化抗PD-L1抗体进行纯化：于Expi 293细胞表达的4D11人源化抗PD-L1抗体，收取细胞上清液，按照蛋白纯化标准操作规程进行抗体纯化。对实验结果进行表征，表征结果如图7所示。试验结果表明，经过纯化后的4D11人源化抗PD-L1抗体纯度＞90%。

实施例6

4D11人源化抗PD-L1抗体活性检测：

（1）ELISA法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-L1-his结合活性：

通过ELISA法，将测板包被1.0 µg/ml的PD-L1-his，设置一个4D11人源化抗PD-L1抗体样品浓度梯度，测定结合活性OD值来检测4D11人源化抗PD-L1抗体与目标抗原结合亲和力强弱。对实验结果进行表征，表征结果如图8所示，该4D11人源化抗PD-L1抗体与抗原结合较强，曲线上下平台清晰，窗口大，活性较好。该系列抗体中，4D11-huVH4/3、4D11-huV5/L3、4D11-huV6/L3和4D11-huV4/L4活性均优于阳性抗体Atezolizumab。

（2）FACS法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与CHO-PD-L1细胞的结合活性：

将4D11人源化抗体设置一系列4D11人源化抗PD-L1抗体浓度，与CHO-PD-L1细胞孵育，用FACS法测定结合信号强度，检测4D11人源化抗PD-L1抗体与目的蛋白的结合活性。对实验结果进行表征，表征结果如图9所示，该系列4D11人源化抗PD-L1抗体与CHO-PD-L1结合较强，活性较好。该系列4D11人源化抗PD-L1抗体中，4D11-huVH4/3、4D11-huV5/L3、4D11-huV6/L3、4D11-huV4/L4和4D11-huV5/L4结合活性均优于阳性抗体Atezolizumab。

（3）ELISA法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-1-mFc的竞争活性：

将待测板包被4.0 µg/ml的PD-L1-his，设置一个样品浓度梯度，测定OD值来检测4D11系列4D11人源化抗PD-L1抗体与9.0 µg/ml的PD-1-mFc配体的竞争活性。数据显示，该抗体OD值明显趋势，曲线上下平台清晰，具有较强竞争活性。对实验结果进行表征，表征结果如图10所示，4D11-huVH4/3、4D11-huV6/L3和4D11-huV4/L4竞争活性均优于阳性抗体Atezolizumab。

（4）FACS法检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-1-mFc的竞争活性：

通过FACS法，将CHO-PD-L1细胞均匀地铺设到96孔细胞板中，设置3.0 µg/ml PD-1-mFc恒定浓度，以及待测样品4D11人源化抗PD-L1抗体浓度梯度，一起与细胞进行结合，再加入Alex488标记羊抗鼠二抗，结合后测定竞争活性OD值来检测4D11人源化抗PD-L1抗体与PD-1-mFc竞争力强弱。对实验结果进行表征，表征结果如图11所示，该系列4D11人源化抗PD-L1抗体竞争力均比较强，其中4D11-huVH4/3、4D11-huV5/L3、4D11-huV6/L3、4D11-huV4/L4和4D11-huV5/L4竞争活性均优于阳性抗体Atezolizumab。

（5）Luciferase Assay检测4D11人源化抗PD-L1抗体活性：

将细胞huPD-1-NF-AT-Juakat、huPD-L1 artificial APC混匀共50 μl/孔加入96孔板中，其中细胞huPD-1-NF-AT-Juakat的终密度为1E5（cell/well），细胞huPD-L1artificial APC的终密度为2E4（cell/well）。待测4D11人源化抗PD-L1抗体稀释至一定浓度后，加入96孔细胞板与细胞一起孵育，孵育结束加入荧光反应液处理后，将96孔细胞培养板放入荧光化学发光分析仪读取化学发光值，对数据采用Graphpad Prism软件进行四参数曲线拟合，得出EC50值。对实验结果进行表征，表征结果如图12所示，该4D11人源化抗PD-L1抗体曲线上下平台清晰，窗口大，活性优于阳性对照Atezolizumab。

实施例7

人源化抗体热稳定性实验：

利用Protein Thermal Shift™ 染料试剂盒，通过实时荧光定量 PCR方法检测荧光信号强度，监测蛋白质的热稳定性。对实验结果进行表征，表征结果如图13和下表所示，4D11人源化抗PD-L1抗体除4D11-huVH5/L4和4D11-huVH6/L4之外，其他四个抗体Tm值均高于母本，其中4D11-huVH4/L4的热稳定性最高，其次是4D11-huVH4/L3；

蛋白名称	Tm值1	Tm值2	平均
				4D11-H/L	70.55	70.41	70.48
4D11-huVH4/L3	71.59	71.55	71.57
				4D11-huVH5/L3	70.74	70.65	70.70
4D11-huVH6/L3	70.70	70.68	70.69
				4D11-huVH4/L4	71.69	71.63	71.66
4D11-huVH5/L4	70.51	70.45	70.48
				4D11-huVH6/L4	70.50	70.44	70.47

从上表数据以及图13数据可以明显看出，相较于母本，以及常规的抗PD-L1抗体而言，如相较于常规的阿特珠单抗，热稳定性可以提高30 %以上，大大拓宽了抗PD-L1抗体的应用领域和应用范围，使其能够更加有效地适用于联合治疗手段。

实施例8

4D11人源化抗PD-L1抗体MLR实验：

设置所有4D11人源化抗PD-L1抗体样品浓度梯度，与诱导分化完全的细胞进行孵育，用ELISA试剂盒测定OD值，检测细胞上清液中IFN-γ的分泌情况。对实验结果进行表征，表征结果如图14所示，两组4D11人源化抗PD-L1抗体可促进细胞上清中IFN-γ的分泌，且其分泌情况与抗体剂量存在量效关系。

Claims (10)

1.抗PD-L1抗体，其特征在于，

所述抗体由重链和轻链构成；

所述重链包括以下至少一种：

第一重链（4D11_huVH4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有85～100 %的同一性；

第二重链（4D11_huVH5），其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有85～100 %的同一性；

第三重链（4D11_huVH6），其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有85～100 %的同一性；

所述轻链包括以下至少一种：

第一轻链（4D11_huVL3），其氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有85～100 %的同一性；

第二轻链（4D11_huVL4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有85～100 %的同一性。

2.根据权利要求1所述的抗PD-L1抗体，其特征在于，

所述4D11_huVH4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述4D11_huVH5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述4D11_huVH6的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述4D11_huVL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述4D11_huVL4的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1或2所述的PD-L1抗体，其特征在于，

所述抗体为人源化抗体。

4.抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，

所述方法包括：

1）构建非人源性杂交瘤细胞，从中纯化得到RNA，以纯化后的RNA逆转录为cDNA作为模板后采用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增，将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选择阳性PCR产物克隆并测序，得到非人源性抗体原始序列；

2）人源性序列构建：基于步骤1）所得的非人源性抗体原始序列，建模并经过数据库对比，将非人源性抗体原始序列突变为人源化序列；

3）抗体构建：将步骤2）所得的人源化序列组合成人源化抗体；

4）抗体表达：于Expi293哺乳动物表达系统中进行步骤3）所得人源化抗体的表达；

5）抗体纯化：收取经步骤4）于Expi293细胞表达后的细胞上清液，纯化至抗体纯度≥90%。

5.根据权利要求4所述的抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，

步骤1）所述非人源性杂交瘤细胞由以下方法培养得到：

1-1）利用PD-L1-his抗原对小鼠进行靶蛋白免疫注射，使小鼠体内产生能分泌特异性靶蛋白抗体的B细胞；

1-2）取产生免疫反应的小鼠脾脏细胞进行细胞融合，得到融合细胞；

1-3）所得融合细胞经ELISA法检测筛选并选取能够与PD1-hFc竞争结合PD-L1-his的融合细胞进行亚克隆，亚克隆后再次经过ELISA法检测筛选并选取能够与PD1-hFc竞争结合PD-L1-his的融合细胞进行建株，得到非人源性杂交瘤细胞。

6.根据权利要求4所述的抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，

步骤1）非人源性抗体原始序列包括：

重链核酸序列、轻链核酸序列、重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，

所述重链核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述轻链核酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

8.根据权利要求4所述的抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2）所述人源化序列包括人源性重链序列和人源性轻链序列。

9.抗PD-L1抗体的应用，其特征在于，

所述抗PD-L1抗体用于促进细胞上清中IFN-γ的分泌。

10.根据权利要求9所述的抗PD-L1抗体的应用，其特征在于，

所述抗PD-L1抗体用于制备药物和/或药物组合物；

所述药物和/或药物组合物用于肿瘤和/或癌症和/或免疫性疾病和/或感染性疾病的靶向治疗。

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