CN115671038A

CN115671038A - 一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法

Info

Publication number: CN115671038A
Application number: CN202211460591.1A
Authority: CN
Inventors: 崔朋飞; 李洁; 吴诗瑞; 沈耀艳; 代开俊; 王程; 蒋鹏举; 王建浩
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2022-11-17
Filing date: 2022-11-17
Publication date: 2023-02-03

Abstract

本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，包括如下步骤：将白垩(chalk)吸附DOX的悬浮液与果胶钙充分混合，得到具有结肠定位功能的口服递送阿霉素。本发明利用白垩的多孔结构，吸附阿霉素，果胶和Ca²⁺形成果胶凝胶，将吸附阿霉素的白垩加入果胶凝胶中，最终得到白垩‑果胶口服给药体系。果胶能被结肠中的酶特异性酶解，白垩能够减少在中性pH条件下药物的释放，从而达到结肠定位的效果。通过体内外药物释放实验，可以验证阿霉素在结肠部位靶向释放。

Description

一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，具体是一种白垩-果胶凝胶为载体通过口服给药达到结肠定位目的的方法。

背景技术

结肠癌是世界三大癌症之一，其发病率仅低于乳腺癌和肺癌。目前主要治疗手段有手术切除和化疗。手术切除会给机体带来直接损失，还会引发并发症；各种文献表明，在不同给药途径的评估中，口服给药的依从性最高。但只有少数化疗药物被证明并用于临床。这些药物需要克服以下限制。首先，药物在恶劣的胃部条件下稳定性差。其次，肝脏的首过效应导致药物的生物利用度低。最后，粘液屏障阻止药物的渗透和随后的吸收。克服这些局限性可以提高口服制剂对结直肠癌的治疗效果。

盐酸多柔比星(DOX)是一种水溶性抗癌药，属于第一代蒽环类药物。它用于治疗不同类型的癌症。DOX插入DNA并停止复制过程，导致细胞死亡。虽然阿霉素是有效的，但其给药可能会引起一些不良副作用，包括快速清除、肝脏蓄积、蓄积和不可逆的心肌病。为了消除或减少这些副作用，已经提出了不同的给药方法，包括使用不同的药物输送系统(DDS)。DDS的应用还可以促进DOX的延长释放，从而减少过量的可能性。

果胶作为一种植物来源的多糖，已被应用于结肠特异性给药。果胶不能被哺乳动物的胃和小肠消化，但结肠细菌可以分泌果胶酶，当药物包被的果胶经口转运到结肠时，可以被果胶酶降解，释放药物，使结肠靶向药物递送。

但是口服药物到达结肠前需要克服胃肠道两重屏障。因此，迫切需要一种新的药物制剂形式，用于抵抗胃肠道的药物损失，使其能够在口服递送的情况下达到结肠部位，并且释放大量药物，达到治疗效果。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，该方法可以口服递送DOX，克服胃肠道的屏障，达到结肠部位，并且能够在结肠部位释放药物，从而提高治疗效果。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案为：

一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，包括如下步骤：将白垩(chalk)吸附DOX的悬浮液与果胶钙充分混合，得到具有结肠定位功能的口服递送阿霉素。

进一步的，果胶钙的制备方法包括：将果胶按体积比加入Ca²⁺溶液，搅拌混匀成胶，将C-DOX加入果胶凝胶中，搅拌混匀，得到PC-DOX。

更进一步的，果胶浓度为0.1-8％(w:v)，Ca²⁺浓度为0.1-80％(w:v)。果胶与Ca²⁺体积比为2.5:1。

进一步的，白垩吸附DOX的悬浮液(简称C-DOX)通过如下方法获得：向Chalk悬浮液中加入DOX溶液，搅拌至DOX被Chalk充分吸附(优选连续搅拌8-48h，更优选连续搅拌12h)，得到C-DOX。

更进一步的，白垩与DOX质量比为0.1-20:1。

本发明利用白垩的多孔结构，吸附阿霉素，果胶和Ca²⁺形成果胶凝胶，将吸附阿霉素的白垩加入果胶凝胶中，最终得到白垩-果胶口服给药体系。果胶能被结肠中的酶特异性酶解，白垩能够减少在中性pH条件下药物的释放，从而达到结肠定位的效果。通过体内外药物释放实验，可以验证阿霉素在结肠部位靶向释放。与现有技术相比，本发明可以在口服给药后，有效地抵御胃肠道屏障，使药物靶向定位至结肠；同时在结肠中被酶特异性酶解，释放DOX，从而达到治疗结肠癌的目的。

附图说明

图1本发明实施例1中PC-DOX的制备及表征：(A)C-DOX(B)Chalk和C-DOX的SEM图；(C)不同浓度果胶-Ca²⁺凝胶图；(D)果胶和果胶-Ca²⁺凝胶的SEM图；(E)PC-DOX的实验组和对照组；(F)PC-DOX的SEM图。

图2本发明实施例2中模拟各组样品在胃和小肠中的药物释放：(A)模拟胃(pH1.2)中药物释放图；(B)模拟小肠(pH 6.8)中药物释放图。

图3本发明实施例3中果胶酶解后药物释放图。(A)PC-DOX实验组及对照组加入果胶酶后，药物释放图；(B)PC-DOX加入果胶酶酶解后的SEM图。

图4本发明实施例4中果胶酶解PC-DOX实验组及DOX对照组CT26细胞摄取图和流式细胞仪荧光定量图。

具体实施方式

本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明下面结合实施例作进一步详述：

本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下：

PC-DOX制备方案具体如下：取一定量的果胶，按体积比加入Ca²⁺，搅拌混匀成胶，将C-DOX加入果胶凝胶中，搅拌混匀，得到PC-DOX。

C-DOX通过如下方法获得：取一定质量的Chalk悬浮液，加入DOX溶液,连续搅拌12h，得到C-DOX。

PC-DOX实验组及对照组模拟在胃和小肠中药物释放。

果胶酶解PC-DOX实验组及对照组药物释放实验。

果胶酶解PC-DOX实验组及DOX对照组CT26细胞摄取实验。

实施例1

PC-DOX的制备及表征。

500μL 1mg/mL DOX溶液加入5mg/mL Chalk悬浮液中，DOX与Chalk的质量比分别调整为1:1,1:2,1:5,1:10,1:15和1:20(w:w)。再加入蒸馏水共5mL(C_DOX＝100μg/mL)，将混合物搅拌12h，混合后8000rpm离心3min。取离心后上清液测荧光强度，测定上清液中残留DOX的浓度，计算包封率。

由图1(A)可知，当DOX和Chalk质量比为1:10时，包封率为96％。

利用扫描电子显微镜(SEM)对白垩进行表征。图1(B)表明，Chalk吸附DOX后形态无明显变化。

制备不同浓度(1％、2％、3％、5％和6％)的果胶，在果胶中加入10％ CaCl₂溶液成胶(果胶:10％ CaCl₂＝2.5:1，v:v)，观察凝胶现象，筛选最适果胶凝胶浓度。

由图1(C)可知，1％和2％果胶凝胶效果较差，5％和6％果胶凝胶成色不均匀。因此，3％果胶凝胶较好。

利用扫描电子显微镜(SEM)对果胶进行表征。图1(D)表明，果胶未成胶前，是疏松的网状结构；当果胶与Ca²⁺结合后，形成致密的结构。

在已经制备好的3％果胶中加入10％ CaCl₂溶液成凝胶(果胶:10％CaCl₂＝2.5:1，v:v)，在凝胶中加入之前上述方法制备的10mg/mL的C-DOX悬浮液，搅拌混匀。最终，如图1(E)所示，制备完成PC-DOX实验组及对照组。

利用扫描电子显微镜(SEM)对PC-DOX进行表征。图1(F)表明，吸附了DOX的Chalk在果胶凝胶中均匀分布。

实施例2

体外药物释放实验。

pH＝1.2的人工胃液的配制：在9mL的浓盐酸，加约800mL蒸馏水及胃蛋白酶10g，pH值约为1.2。透皮扩散仪设置参数37℃，100rpm进行模拟释放。将2.2中制备好的样品装进透析袋(3.5kDa)中，将透析袋放入装有10mL人工胃液的西林瓶中，在第0、5、10、15、30、45、60、90和120分钟时分别取1mL释放液，再加入1mL预热的人工胃液补足取出的释放液体积，将各时间点取出的释放液稀释后测量荧光强度。计算药物累计释放率Q_n。

pH＝6.8的人工肠液的配制：称取6.8g磷酸二氢钾，加水至500mL使其溶解，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.8。另称取10g胰蛋白酶加水溶解，两液混合后，加水定容至1000mL。透皮扩散仪设置参数37℃，100rpm进行模拟释放。将2.2中制备好的样品装进透析袋(3.5kDa)中，将透析袋放入装有15mL人工肠液的西林瓶中，在第0、0.5、1、2、4、6h时分别取1mL释放液，再加入1mL预热的人工肠液补足取出的释放液体积，将各时间点取出的释放液稀释后测量荧光强度。计算药物累计释放率Q_n。

Q_n：第n次药物累计释放率；C_n：第n次取出的释放液浓度，μg/mL；V：总体积，mL；C_i：第i次取出的释放液浓度，μg/mL；V_i：第i次取出的释放液体积，mL；W：药物总质量，μg。

图2(A)和(B)分别表示药物在胃和小肠中的释放。由图可知，PC-DOX组在胃和小肠中仅有10％-20％的药物释放，其他对照组药物释放都较高。

通过胃和小肠中的药物累计释放，可以计算出药物结肠靶向效率。

结肠靶向效率％＝(100-Q_G)×(100-Q_I)×100

Q_G:在胃中药物释放率；Q_I:小肠中药物释放率。

表1结肠靶向效率表

实施例3

果胶酶解药物释放实验。

样品制备：取280μL 3％果胶，加入112μL 10％ CaCl₂溶液成胶(果胶:10％CaCl₂＝2.5:1，v:v)，在凝胶中加入10mg/mL的C-DOX悬浮液，搅拌混匀。加入56μL 2％果胶酶(果胶:果胶酶＝5:1，v:v)，放入摇床中孵育8h，低速离心后取上清，稀释后测量其荧光值。

图3(A)表明，PC-DOX在果胶酶的作用下，酶解释放40％。

利用扫描电子显微镜(SEM)对酶解后的PC-DOX进行表征。由图3(B)可知，PC-DOX在酶解后，形成了2-3μm的白色小球。

实施例4

细胞摄取实验

CT26细胞(小鼠结肠癌细胞)用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基培养，在37℃，5％ CO₂培养箱中孵育。

当CT26细胞处于对数生长期时用DMEM冲洗，用胰酶消化，然后离心1500rpm，3min使细胞成球。用细胞计数板计数，然后以15w细胞/mL的密度接种到24孔板中。最后，细胞在37℃，5％ CO₂培养箱中培养16-18h。

取280μL 3％果胶，加入112μL 10％ CaCl₂溶液成胶(果胶:10％ CaCl₂＝2.5:1，v:v)，在凝胶中加入10mg/mL的C-DOX悬浮液，搅拌混匀。加入56μL 2％果胶酶(果胶:果胶酶＝5:1，v:v)，放入摇床中孵育8h，取酶解后样品进行用DMEM--稀释(DOX含量2.5μg/mL)，取1mL稀释后的样品和CT26细胞共孵育4h，使用荧光倒置显微镜拍照。

最后，细胞被胰酶消化，然后1500rpm离心3min成球，用DMEM培养基重悬细胞，使用流式细胞仪对细胞中荧光进行定量。

图4中DOX组和PC-DOX酶解后样品组的CT26细胞摄取暗场亮度几乎一致。通过流式细胞仪可以确定，PC-DOX组中77％的细胞具有荧光强度。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于，包括如下步骤：将白垩吸附DOX的悬浮液与果胶钙充分混合，得到具有结肠定位功能的口服递送阿霉素。

2.根据权利要求1所述的口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于：果胶钙的制备方法包括：果胶钙的制备方法包括：将果胶按体积比加入Ca²⁺溶液，搅拌混匀成胶，将白垩吸附DOX的悬浮液加入果胶凝胶中，搅拌混匀，得到PC-DOX。

3.根据权利要求2所述的口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于：果胶质量浓度为0.1-8％，Ca²⁺溶液质量浓度为0.1-80％，果胶与Ca²⁺溶液体积比为2.5:1。

4.根据权利要求1所述的口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于：白垩吸附DOX的悬浮液通过如下方法获得：向Chalk悬浮液中加入DOX溶液，搅拌至DOX被白垩充分吸附。

5.根据权利要求4所述的口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于：白垩与DOX质量比为0.1-20:1；和/或，所述搅拌为连续搅拌8-48h。

6.据权利要求4所述的口服递送阿霉素用于结肠定位的方法，其特征在于：所述搅拌为连续搅拌12h。