CN114878669B

CN114878669B - 一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白cd44的光电化学传感器的制备方法

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Publication number: CN114878669B
Application number: CN202210703445.0A
Authority: CN
Inventors: 贾越; 张诺; 冷东全; 魏琴
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2025-07-01
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN114878669A

Abstract

本发明涉及一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法。制备方法分为三步，先通过水热法在FTO导电玻璃表面负载TiO₂纳米阵列，再利用磁控溅射技术，在TiO₂纳米阵列表面均匀溅射Ag纳米层，最后将TiO₂‑Ag浸入硫化钠溶液中实现Ag的局部硫化得到光电转换体TiO₂‑Ag‑Ag₂S纳米复合阵列；然后利用透明质酸和跨膜糖蛋白CD44的主客体识别作用以及DNA链置换反应实现对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231表面跨膜糖蛋白CD44的提取；最后通过生物偶联与共价键合，实现光电材料与目标物在导电界面的组装，该传感器制备方法相较于其它已经报道的方法可控性强，特别是获得了具有良好信号输出稳定性的传感界面。该方法提到的方案与流程在材料合成、光电化学传感、细胞检测等领域有重要借鉴。

Description

一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及无机纳米材料合成与光电化学生物传感领域领域，具体涉及一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法。

背景技术

当前，被称作“粉红杀手”的乳腺癌已经取代肺癌，成为全球第一大癌症。已经证实跨膜糖蛋白CD44与肿瘤浸润转移有密切关系，临床上已经在乳腺肿瘤中发现跨膜糖蛋白CD44普遍存在。因此如果能够实现体液中跨膜糖蛋白CD44的快速灵敏检测，则对于乳腺癌的早期诊断和治疗有重要作用。光电化学传感器以良好的稳定性、低成本、高检测效率受到了研究者的广泛关注，但传感芯片的批间差异性始终是阻碍其广泛应用的一大缺陷。

二氧化钛（TiO₂）以其无毒、廉价、稳定的优势在光催化、光电化学传感受到了广泛的关注，但缺陷也是显而易见的，较宽的能带迫使其只能吸收能量较高的短波长紫外光有明显的响应，而对于可见光的吸收结果较差，并且单纯TiO₂电子空穴复合速率较快，限制了其在不同领域的应用。针对TiO₂的改性，目前量子点/染料敏化、贵金属负载、离子掺杂、构建异质结等手段被广泛应用。

N型半导体的异质结类型主要分为Type-I、Type-II、Z型三种构型，每种构型对两种半导体的能带结构要求不同，其中Type-I由能带呈平行结构的两种或多种组分构成，而Type-II、Z型都需要能带成交错排列的两种或多种组分构成。不同构型之间可以转化，通过一个欧姆接触面将能带呈现平行结构的半导体的电子和空穴进行重组，造成其中一个组分能带的提升从而实现Type-I型到Z型的转变。已经有研究报道基于Ag₂S-Ag-TiO₂ Z型异质结的构建，方案是在先合成Ag纳米立方体，通过Ag-O的强键能在Ag表面原位合成TiO₂，最后对Ag局部硫化得到一个由内向外的Ag₂S-Ag-TiO₂结构。这种方案的难度在于Ag层厚度的控制，它仅依靠Ag-O键来保护中间的痕量Ag不被氧化。对此我们提出了一种新的合成方案来制备Z型纳米复合阵列异质结TiO₂-Ag-Ag₂S，并以此作为信号源和传感基底实现了跨膜糖蛋白CD44的灵敏检测，该方案有效改善了传感器的信号输出稳定性，降低传感芯片的批间差异性，为实现乳腺癌的早发现、早治疗提供了一种新方法。

发明内容

一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，该方法具有以下工艺步骤：

（1）制备TiO₂-Ag-Ag₂S异质结：

将面积为1*1 cm²的FTO玻璃导电面朝上平铺在50 mL高压反应釜底，并倒入包含8~ 45 mL去离子水、8 ~ 45 mL浓盐酸和0.2 ~ 1.2 mL钛酸四丁酯的混合液，在120 ~ 160^oC下保温8 ~ 12 h，得到不同密度与厚度的TiO₂纳米阵列，对产物洗涤、室温干燥后在马弗炉中400 ~ 500 ^oC退火3 h提升结晶度；

对上步骤中获得的TiO₂纳米阵列进行金属银粒子负载，在磁控溅射镀膜机上使用银靶材，调整氩气压力为1 ~ 5 Pa，溅射功率为40 ~ 80 W，溅射时间为1 ~ 3 min，获得不同银粒子密度的TiO₂-Ag复合材料；

将上步骤中获得的TiO₂-Ag复合材料浸入浓度为1 ~ 5 mol/L硫化钠水溶液中，4~ 12 h后取出，洗涤、干燥，获得不同Ag层厚度的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米复合阵列；

（2）提取乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44：

取20 ~ 50 mg透明质酸HA，紫外灯照射灭菌后溶解于20 ~ 50 mL 1×PBS中，将1mL、1 ~ 5 mmol/L的单链DNA P2与5 ~ 10 mL HA溶液混合，形成生物共轭物HA-P2；将10mL、5 ~ 10 mmol/L的酪氨酸Y与1 mL、1 ~ 5 mmol/L DNA 单链P1混合并震荡，形成偶联物Y-P1；将P2-HA与Y-P1混合，60 ^oC下保温4 h实现局部碱基配对，得到双链DNA Y-P1-P2-HA；在24孔板的每个孔上滴加200 ~ 800 μL Y-P1-P2-HA，然后将不同浓度的乳腺癌细胞加入各孔中进行主客体识别0.5 h；离心后，将下层底物用等量1×PBS重新分散，再加入50 ~100 U 限制性核酸内切酶Nt.BbvCI,37 ^oC下保存2 h完成跨膜糖蛋白CD44的提取；

（3）构建光电化学传感器：

使用离子束溅射仪调节电流为10 ~ 30 µA，溅射时间为30 ~ 80 s，在步骤（1）中获得的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米阵列表面溅射一层金纳米粒子，得到TiO₂-Ag-Ag₂S/Au；将1 mL、5~ 10 mmol/L的发夹DNA H1滴涂在TiO₂-Ag-Ag₂S/Au表面孵化2 ~ 5 h，继续在电极表面滴加800 μL、5%的6-巯基-1-己醇溶液封闭非特异性活性位点，最后将步骤（2）获得的携带信号标记物的跨膜糖蛋白CD44溶液滴涂在电极表面完成传感器构建。

所述的一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，所使用的DNA序列为H1：SH-TAC TAT ATT GTG TAA GTA GTC TAG ACG TAG CTG ATTTTA TTA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACTT；P1：AAC CTC AGC TAC GTC TAG ACT ACT TACACAA-NH₂；P2：TCT AGA CGT AGC TGA GGTT-NH₂。

所述的一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的乳腺癌细胞类型为MDA-MB-231细胞。

本发明的有益成果

（1）本发明制备了用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器，首次结合水热合成法、磁控溅射法、原位硫化法三种新合成技术制备了光敏材料Z型Ag₂S-Ag-TiO₂纳米复合阵列作为传感基底，协同DNA链置换反应、透明质酸与跨膜糖蛋白CD44之间的主客体识别以及限制性核酸内切酶的特异剪切位点，实现了乳腺癌细胞MDA-MB-231中跨膜糖蛋白CD44的灵敏检测，该方法具有专一的选择性，制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点；

（2）本发明制备的用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器对跨膜糖蛋白CD44表现出很高选择性和灵敏性，有特异的专一性，响应电流与乳腺癌细胞MDA-MB-231浓度呈良好的线性关系，相关系数R²=0.998，检测限低至230细胞/毫升；

（3）本发明用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色，光敏材料合成方案适用于其它类似结构复合材料的制备。

具体实施例方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

（1）制备TiO₂-Ag-Ag₂S异质结：

将面积为1*1 cm²的FTO玻璃导电面朝上平铺在50 mL高压反应釜底，并倒入包含8mL去离子水、8 mL浓盐酸和0.2 mL钛酸四丁酯的混合液，在120 ^oC下保温8 h，得到不同密度与厚度的TiO₂纳米阵列，对产物洗涤、室温干燥后在马弗炉中400 ^oC退火3 h提升结晶度；

对上步骤中获得的TiO₂纳米阵列进行金属银粒子负载，在磁控溅射镀膜机上使用银靶材，调整氩气压力为1 Pa，溅射功率为40 W，溅射时间为1 min，获得不同银粒子密度的TiO₂-Ag复合材料；

将上步骤中获得的TiO₂-Ag复合材料浸入浓度为1 mol/L硫化钠水溶液中，4 h后取出，洗涤、干燥，获得不同Ag层厚度的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米复合阵列；

（2）提取乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44：

取20 mg透明质酸HA，紫外灯照射灭菌后溶解于20 mL 1×PBS中，将1 mL、1 mmol/L的单链DNA P2与5 mL HA溶液混合，形成生物共轭物HA-P2；将10 mL、5 mmol/L的酪氨酸Y与1 mL、1 mmol/L DNA 单链P1混合并震荡，形成偶联物Y-P1；将P2-HA与Y-P1混合，60 ^oC下保温4 h实现局部碱基配对，得到双链DNA双链Y-P1-P2-HA；在24孔板的每个孔上滴加200 μL Y-P1-P2-HA，然后将不同浓度的乳腺癌细胞加入各孔中进行主客体识别0.5 h；离心后，将下层底物用等量1×PBS重新分散，再加入50 U 限制性核酸内切酶Nt.BbvCI,37 ^oC下保存2 h完成跨膜糖蛋白CD44的提取；

（3）构建光电化学传感器：

使用离子束溅射仪调节电流为10 µA，溅射时间为30 s，在步骤（1）中获得的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米阵列表面溅射一层金纳米粒子，得到TiO₂-Ag-Ag₂S/Au；将1 mL、5 mmol/L的发夹DNA H1滴涂在TiO₂-Ag-Ag₂S/Au表面孵化2 h，继续在电极表面滴加800 μL、5%的6-巯基-1-己醇溶液封闭非特异性活性位点，最后将步骤（2）获得的携带信号标记物的跨膜糖蛋白CD44溶液滴涂在电极表面完成传感器构建。

实施例2

（1）制备TiO₂-Ag-Ag₂S异质结：

将面积为1*1 cm²的FTO玻璃导电面朝上平铺在50 mL高压反应釜底，并倒入包含25 mL去离子水、25 mL浓盐酸和1 mL钛酸四丁酯的混合液，在150 ^oC下保温10 h，得到不同密度与厚度的TiO₂纳米阵列，对产物洗涤、室温干燥后在马弗炉中450 ^oC退火3 h提升结晶度；

对上步骤中获得的TiO₂纳米阵列进行金属银粒子负载，在磁控溅射镀膜机上使用银靶材，调整氩气压力为2 Pa，溅射功率为60 W，溅射时间为2 min，获得不同银粒子密度的TiO₂-Ag复合材料；

将上步骤中获得的TiO₂-Ag复合材料浸入浓度为2 mol/L硫化钠水溶液中，8 h后取出，洗涤、干燥，获得不同Ag层厚度的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米复合阵列；

（2）提取乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44：

取30 mg透明质酸HA，紫外灯照射灭菌后溶解于30 mL 1×PBS中，将1 mL、3 mmol/L的单链DNA P2与8 mL HA溶液混合，形成生物共轭物HA-P2；将10 mL、8 mmol/L的酪氨酸Y与1 mL、3 mmol/L DNA 单链P1混合并震荡，形成偶联物Y-P1；将P2-HA与Y-P1混合，60 ^oC下保温4 h实现局部碱基配对，形成双链DNA Y-P1-P2-HA；在24孔板的每个孔上滴加400 μLY-P1-P2-HA，然后将不同浓度的乳腺癌细胞加入各孔中进行主客体识别0.5 h；离心后，将下层底物用等量1×PBS重新分散，再加入80 U 限制性核酸内切酶Nt.BbvCI,37 ^oC下保存2h完成跨膜糖蛋白CD44的提取；

（3）构建光电化学传感器：

使用离子束溅射仪调节电流为20 µA，溅射时间为40 s，在步骤（1）中获得的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米阵列表面溅射一层金纳米粒子，得到TiO₂-Ag-Ag₂S/Au；将1 mL、7 mmol/L的发夹DNA H1滴涂在TiO₂-Ag-Ag₂S/Au表面孵化3 h，继续在电极表面滴加800 μL、5%的6-巯基-1-己醇溶液封闭非特异性活性位点，最后将步骤（2）获得的携带信号标记物的跨膜糖蛋白CD44溶液滴涂在电极表面完成传感器构建。

实施例3

（1）制备TiO₂-Ag-Ag₂S异质结：

将面积为1*1 cm²的FTO玻璃导电面朝上平铺在50 mL高压反应釜底，并倒入包含45 mL去离子水、45 mL浓盐酸和1.2 mL钛酸四丁酯的混合液，在160 ^oC下保温12 h，得到不同密度与厚度的TiO₂纳米阵列，对产物洗涤、室温干燥后在马弗炉中500 ^oC退火3 h提升结晶度；

对上步骤中获得的TiO₂纳米阵列进行金属银粒子负载，在磁控溅射镀膜机上使用银靶材，调整氩气压力为5 Pa，溅射功率为80 W，溅射时间为3 min，获得不同银粒子密度的TiO₂-Ag复合材料；

将上步骤中获得的TiO₂-Ag复合材料浸入浓度为5 mol/L硫化钠水溶液中，12 h后取出，洗涤、干燥，获得不同Ag层厚度的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米复合阵列；

（2）提取乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44：

取50 mg透明质酸HA，紫外灯照射灭菌后溶解于50 mL 1×PBS中，将1 mL、5 mmol/L的单链DNA P2与10 mL HA溶液混合，形成生物共轭物HA-P2；将10 mL、10 mmol/L的酪氨酸Y与1 mL、5 mmol/L DNA 单链P1混合并震荡，形成偶联物Y-P1；将P2-HA与Y-P1混合，60 ^oC下保温4 h实现局部碱基配对，DNA双链Y-P1-P2-HA；在24孔板的每个孔上滴加800 μL Y-P1-P2-HA，然后将不同浓度的乳腺癌细胞加入各孔中进行主客体识别0.5 h；离心后，将下层底物用等量1×PBS重新分散，再加入100 U限制性核酸内切酶Nt.BbvCI, 37 ^oC下保存2h完成跨膜糖蛋白CD44的提取；

（3）构建光电化学传感器：

使用离子束溅射仪调节电流为30 µA，溅射时间为80 s，在步骤（1）中获得的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米阵列表面溅射一层金纳米粒子，得到TiO₂-Ag-Ag₂S/Au；将1 mL、10 mmol/L的发夹DNA H1滴涂在TiO₂-Ag-Ag₂S/Au表面孵化5 h，继续在电极表面滴加800 μL、5%的6-巯基-1-己醇溶液封闭非特异性活性位点，最后将步骤（2）获得的携带信号标记物的跨膜糖蛋白CD44溶液滴涂在电极表面完成传感器构建。

本发明制备的检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器成功用于乳腺癌细胞MDA-MB-231的检测，回收率在检测限低至230细胞/毫升。

Claims

1.一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备TiO₂-Ag-Ag₂S异质结：

将面积为1*1 cm²的FTO玻璃导电面朝上平铺在50 mL高压反应釜底，并倒入包含8 ~ 45mL去离子水、8 ~ 45 mL浓盐酸和0.2 ~ 1.2 mL钛酸四丁酯的混合液，在120 ~ 160 ^oC下保温8 ~ 12 h，得到不同密度与厚度的TiO₂纳米阵列，对产物洗涤、室温干燥后在马弗炉中400 ~ 500 ^oC退火3 h提升结晶度；

将上步骤中获得的TiO₂-Ag复合材料浸入浓度为1 ~ 5 mol/L硫化钠水溶液中，4 ~ 12h后取出，洗涤、干燥，获得不同Ag层厚度的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米复合阵列；

（2）提取乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44：

取20 ~ 50 mg透明质酸HA，紫外灯照射灭菌后溶解于20 ~ 50 mL 1×PBS中，将1 mL、1~ 5 mmol/L的单链DNA P2与5 ~ 10 mL HA溶液混合，形成生物共轭物HA-P2；将10 mL、5 ~10 mmol/L的酪氨酸Y与1 mL、1 ~ 5 mmol/L DNA 单链P1混合并震荡，形成偶联物Y-P1；将P2-HA与Y-P1混合，60 ^oC下保温4 h实现局部碱基配对，得到双链DNA Y-P1-P2-HA；在24孔板的每个孔上滴加200 ~ 800 μL Y-P1-P2-HA，然后将不同浓度的乳腺癌细胞加入各孔中进行主客体识别0.5 h；离心后，将下层底物用等量1×PBS重新分散，再加入50 ~ 100 U 限制性核酸内切酶Nt.BbvCI,37 ^oC下保存2 h完成跨膜糖蛋白CD44的提取；

（3）构建光电化学传感器：

使用离子束溅射仪调节电流为10 ~ 30 µA，溅射时间为30 ~ 80 s，在步骤（1）中获得的TiO₂-Ag-Ag₂S纳米阵列表面溅射一层金纳米粒子，得到TiO₂-Ag-Ag₂S/Au；将1 mL、5 ~ 10mmol/L的发夹DNA H1滴涂在TiO₂-Ag-Ag₂S/Au表面孵化2 ~ 5 h，继续在电极表面滴加800 μL、5%的6-巯基-1-己醇溶液封闭非特异性活性位点，最后将步骤（2）获得的携带信号标记物的跨膜糖蛋白CD44溶液滴涂在电极表面完成传感器构建。

2.如权利要求1所述的一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的传感器在制备时用到的DNA序列为H1： SH-TAC TAT ATTGTG TAA GTA GTC TAG ACG TAG CTG ATT TTA TTA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACTT；P1：AAC CTC AGC TAC GTC TAG ACT ACT TAC ACAA-NH₂；P2： TCT AGA CGT AGC TGA GGTT-NH₂。

3.如权利要求1所述的一种用于检测乳腺癌细胞表面跨膜糖蛋白CD44的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的乳腺癌细胞类型为MDA-MB-231细胞。