CN102764430A - 一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物制药技术领域的一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物由占疫苗组合物总重的以下组分组成：免疫细胞因子0.01-20%、壳聚糖季胺盐水凝胶45-80%、疫苗抗原0.01-20%、硫柳汞0.01-15%、聚乙二醇0.5-2%。本发明的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的各组分之间发挥有效的叠加协同作用，免疫细胞因子作为黏膜疫苗佐剂和免疫调节剂，壳聚糖季胺盐水凝胶作为生物粘附物质和抗原递送系统，聚乙二醇作为稳定剂，与疫苗抗原联合使用，增加了疫苗抗原在鼻腔中的停留时间和抗原的免疫应答，显著的提高了喷鼻黏膜疫苗的全面有效性，减少疫苗喷雾剂对鼻黏膜的刺激性和抗原用量。

Description

一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

近年来，SARS、高致病性H5N1禽流感、甲型H1N1流感等病原黏膜感染性疾病的危害日趋严峻。众所周知，全球近20年新发、突发重大传染病多为黏膜感染所致，且普遍易感，难以控制。此外，生态环境变化、传病虫媒孽生、抗生素滥用、病原体变异、超级细菌及超级病毒出现等原因，一些被控制的传染病又呈死灰复燃，极易造成重大传染病暴发流行。因此WHO权威人士预言，人类将面临传染病的严重威胁。

众所周知，95%以上的病原体感染发生在黏膜或由黏膜入侵而致病。黏膜系统广泛分布在呼吸道、消化道和泌尿生殖道，以及外分泌腺，而呼吸道占首位。该系统在体内的覆盖面积大，形成机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线，特别是黏膜免疫模拟自然感染诱导产生分泌性IgA和CTL效应及全面免疫应答在抗感染免疫中发挥重要作用，且各黏膜间具有相通性。然而，现注射免疫疫苗途径通常只能激发系统免疫应答,而无黏膜免疫应答及交叉免疫保护作用，使得疫苗品种、类型单一和依从性差，而使用受限。在过去的几十年，人们试图设计疫苗剂型既能产生系统免疫又能同时产生黏膜免疫及细胞免疫效应，但在黏膜疫苗佐剂及载体传递系统没有取得突破性进展，特别是在量效控制、缓释靶向性方面的存在技术瓶颈。因此，喷鼻黏膜疫苗佐剂及黏膜疫苗传递系统组合物吸引了人们的目光，并成为该领域发展的重点领域。

近些年的研究表明，以细菌霍乱肠毒素CT、大肠埃希菌不耐热肠毒素LT等毒素类成为具有潜力的黏膜免疫疫苗佐剂，它不仅能产生特异性抗体应答，还可诱导较强的黏膜免疫应答，并有效增强机体抵抗病原感染的能力，但其自身高免疫原性及毒素安全性使得在临床研究中止步不前，特别是其自身蛋白大分子免疫原性强，而把目的抗原所覆盖，由此难以成为候选人用黏膜疫苗佐剂成分。随后的研究，集中在免疫细胞因子具有增强免疫应答，并有一定佐剂效果，但免疫细胞因子庞大而种类复杂，至今还没有确切是哪个，也没有粘附性，且难以单一免疫细胞因子成为稳定有效的黏膜疫苗佐剂的问题。同时有报道，壳聚糖作为一种天然阳离子生物高聚物，因具有生物粘附性、相容性和降解性，而其降解产物无毒、无免疫原性和无致癌性，且壳聚糖具有一定的黏膜疫苗传递载体效应，成为很有前景的疫苗载体。但壳聚糖难溶于水，而易溶于稀酸溶液，这对大多数蛋白、肽类抗原效果欠佳，且使用受到限制。由此，试图发展一种安全、有效、稳定和质量可控制的黏膜疫苗佐剂及传递系统组合物是发展黏膜免疫疫苗的迫切重大需求。

近年的研究表明，以缩水甘油三甲基氯化胺或碘甲烷等化合物与壳聚糖反应可得到季胺化壳聚糖及其衍生物，它与壳聚糖相比具有更好的水溶性、亲水性和阳离子性，极大的适合蛋白、肽类、核酸等生物大分子类抗原，并且利用季铵化壳聚糖本身的阳离子性质，或对其高分子链上的羟基、氨基修饰，通过调节壳聚糖与水分子之间的相互作用，可制备具有不同pH敏感响应性水凝胶，使壳聚糖溶液在宿主体温下发生胶凝，以达到疫苗抗原的长效释放效应。并且季铵盐壳聚糖水凝胶能够与鼻上皮细胞及其粘液层发生强烈作用，以保证在被黏膜纤毛清除之前使疫苗抗原转运通过鼻黏膜，此外还可以通过上皮细胞之间紧密连接处的暂时开放而增加极性蛋白、肽类抗原细胞旁路搬运的能力，实现对疫苗抗原在黏膜传递载体效应和靶向性的作用，从而实现黏膜疫苗载体传递效应。

到目前为止，制备的壳聚糖或季铵盐壳聚糖水凝胶作为黏膜疫苗传递载体系统还存在致命缺点，限制了发展使用。主要表现在：其一是，尽管壳聚糖具有缓慢释放及免疫增强效应，但自身在酸性溶液才可发挥作用，这对于蛋白类、肽类抗原限制了使用；其二是，季铵化壳聚糖水凝胶尽管解决了酸性对蛋白、肽类抗原的影响，多是在体外成形植入或注射体内，限制了季铵盐壳聚糖水凝胶黏膜应用范围；其三是，季铵化壳聚糖水凝胶尽管有一定免疫增效，但远远不能达到疫苗佐剂发挥的作用，还需要其他佐剂的协助；其四是现制备的pH敏感季铵化壳聚糖水凝胶的pH响应性不够敏感，难以迅速响应体内pH微小变化而实现疫苗抗原的间断性释放；其五是疫苗抗原在储备过程中易染菌使其失效或对人体造成其它危害。由此，很有必要研制一种喷鼻黏膜疫苗传递载体与佐剂的组合物，以实现对黏膜感染疾病安全简便、全面有效的免疫预防，实现免疫防控感染性疾病的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物。

本发明的目的还在于提供一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物制备方法。

本发明的目的也在于提供一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的在制备免疫预防药物中的应用。

一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，所述疫苗组合物由占疫苗组合物总重的以下组分组成：免疫细胞因子0.01-20%、壳聚糖季胺盐水凝胶45-80%、疫苗抗原0.01-20%、硫柳汞0.01-15%、聚乙二醇0.5-2%。

所述免疫细胞因子为天然的或重组的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33中的一种或一种以上。

所述免疫疫苗抗原为灭活或减毒的病毒抗原、细菌抗原、天然或重组的蛋白抗原、多糖抗原、核酸抗原、蛋白结合多糖抗原中的一种或一种以上。

所述疫苗组合物通过喷鼻或滴鼻，也可舌下滴入免疫途径接种。

上述一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的制备方法，按照如下步骤进行：

（1）壳聚糖季铵盐的制备

将6.0克壳聚糖分散于90ml双蒸水中，形成壳聚糖分散液，将75.0克2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶解于双蒸水中并定容至30ml，将2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶液边搅拌边加入壳聚糖分散液中形成混合溶液，于80℃下搅拌反应6小时，将混合溶液倒入4℃预冷的丙酮中，放置在2-8℃过夜，其中混合溶液与丙酮的体积比为1:3～1:4。将过夜后的沉淀放置105℃条件下烘干，得到白色疏散固体物，为壳聚糖季铵盐；

（2）壳聚糖季铵盐水凝胶的制备

将壳聚糖季铵盐6.0克和聚乙二醇3克溶解于96ml 0.1mol/L的醋酸溶液中，冷却至4℃，搅拌下逐滴加入浓度为0.1-0.5g/ml的α-β-甘油磷酸钠溶液24ml，搅拌均匀，调节溶液pH值至7.0；将该溶液加热至37℃保温60分钟，形成壳聚糖季铵盐水凝胶；然后置于2-8℃保存；

（3）在配制的上述壳聚糖季铵盐水凝胶中边搅拌边按比例加入免疫细胞因子2-8mg/ml，疫苗抗原10-20mg/ml，硫柳汞0.1-3mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，即为喷鼻黏膜免疫疫苗组合物溶液，置2-8℃保存。

上述一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物在制备免疫预防药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的组分之间发挥有效的叠加协同作用，免疫细胞因子作为黏膜疫苗佐剂和免疫调节剂，壳聚糖季胺盐水凝胶作为生物粘附物和抗原递送系统，与疫苗抗原联合使用，既增加了疫苗抗原在鼻腔中的停留时间，又增加了抗原的免疫应答效应，从而显著的增加了喷鼻黏膜疫苗的有效性，还减少了疫苗喷雾剂对鼻黏膜的刺激性和抗原用量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例中的实验动物来源于军事医学科学院实验动物中心。

实施例1  喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的制备

壳聚糖的来源：壳聚糖购买于美国sigma公司或国内药用级生产公司，分子量为150KD，脱乙酰化85%以上。

制备方法如下：

（1）壳聚糖季铵盐的制备

将6.0克壳聚糖分散于90ml双蒸水中，形成壳聚糖分散液，将75.0克2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶解于双蒸水中并定容至30ml，将2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶液边搅拌边加入壳聚糖分散液中形成混合溶液，于80℃下搅拌反应6小时，将混合溶液倒入4℃预冷的丙酮中，放置在2-8℃过夜，其中混合溶液与丙酮的体积比为1:3。将过夜后的沉淀放置105℃条件下烘干，得到白色疏散固体物，为壳聚糖季铵盐；

（2）壳聚糖季铵盐水凝胶的制备

将壳聚糖季铵盐6.0克和聚乙二醇3克溶解于96ml 0.1mol/L的醋酸溶液中，冷却至4℃，搅拌下逐滴加入浓度为0.1-0.5g/ml的α-β-甘油磷酸钠溶液24ml，搅拌均匀，调节溶液pH值至7.0；将该溶液加热至37℃保温60分钟，形成壳聚糖季铵盐水凝胶；然后置于2-8℃保存；

（3）在配制的上述壳聚糖季铵盐水凝胶中边搅拌边按比例加入免疫细胞因子4-8mg/ml，疫苗抗原10-20mg/ml，硫柳汞0.1-3mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，即为喷鼻黏膜免疫疫苗组合物溶液，置2-8℃保存。

实施例2 不同免疫细胞因子作为免疫疫苗组合物佐剂产生的中和抗体效价

1.免疫细胞因子的来源：天然或重组的人IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33共26种细胞因子，购于R&D Systems(Minneapolis，MN)公司。

2.不同免疫细胞因子作为免疫疫苗组合物佐剂的制备：

按实施例1中的步骤和比例分别制备含上述免疫细胞因子的疫苗组合物，其中的免疫抗原分别为流感三价裂解抗原、呼吸道合胞病毒VLP抗原、百白破多糖结合蛋白抗原、肺炎23价多糖结合蛋白抗原、乳头瘤6价VLP抗原、流感嗜血杆菌多糖结合蛋白抗原。用疫苗组合物分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠，间隔2周加强免疫1次，观察体液免疫中和抗体效果，如表1所示。

表1.不同免疫细胞因子作为免疫疫苗组合物佐剂产生的中和抗体效价

由表1可见，IL-1β、IL-1 α、IL-2、IL-18和IL-33免疫细胞因子不同程度提高抗原中和抗体效价，其中IL-1β效果最好。

实施例3 免疫细胞因子IL-1β作为免疫疫苗组合物佐剂产生黏膜免疫和细胞免疫应答的效果

按实施例1中的步骤和比例分别制备含免疫细胞因子IL-1β的疫苗组合物和不含免疫细胞因子IL-1β的疫苗组合物，其中的免疫抗原分别为流感三价裂解抗原、呼吸道合胞病毒VLP抗原、百白破多糖结合蛋白抗原、肺炎23价多糖结合蛋白抗原、乳头瘤6价VLP抗原、流感嗜血杆菌多糖结合蛋白抗原。用疫苗组合物分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠，间隔2周加强免疫1次，观察黏膜免疫、细胞免疫应答效果，如表2所示。

表2.IL-1β作为喷鼻黏膜免疫疫苗组合物佐剂产生黏膜免疫和细胞免疫应答效果

由表2可见，IL-1β能显著提高疫苗抗原的黏膜抗体sIgA效价及IFN-γ细胞免疫应答效果，而没有加入IL-1的疫苗抗原组产生的sIgA和IFN-γ较低，从而表明IL-1β作为黏膜疫苗佐剂具有明显提高抗原全面应答效果。

实施例4 喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的抑菌效果

按照实施例1的方法分别制备两份喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，一份添加硫柳汞1mg/ml，一份不添加硫柳汞，置于2-8℃保存。

4个月后添加硫柳汞的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物没有任何污染和腐败，未添加硫柳汞的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物在保存40天后开始有杂菌污染，保存4个月后开始长菌。

实施例5 喷鼻黏膜免疫疫苗组合物中PEG的增稳效果

按照实施例1的方法分别制备两份喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，一份添加2%PEG，一份不添加PEG，置于2-8℃保存。结果显示，添加PEG的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物能显著提高疫苗稳定性，保存18个月以上稳定；未添加PEG的喷鼻黏膜免疫疫苗组合物稳定性，仅保存不足10个月。

实施例6 喷鼻流感三价裂解疫苗组合物的制备及免疫效果评价

H1N1、H3N2和B型流感病毒来源：美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

将H1N1、H3N2和B型流感病毒分别接种9-11日龄鸡胚尿囊，在37℃培养48h后，收集尿囊液病毒，用甲醛灭活，膜包超滤浓缩，蔗糖梯度离心纯化，Trion-100裂解病毒颗粒，再梯度离心除糖纯化，制备流感三价（H1N1、H3N2和B型）裂解病毒抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质、外源因子检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，按比例向壳聚糖季铵盐水凝胶中边搅拌边加入免疫细胞因子IL-1β 8mg/ml，流感三价（H1N1、H3N2和B型）裂解病毒抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备喷鼻流感三价裂解疫苗，置2-8℃保存。

制备壳聚糖没有季铵化的水凝胶喷鼻流感三价裂解疫苗组合物：按实施例1中步骤（2）制备水凝胶，其中将壳聚糖季铵盐替换为壳聚糖，制备壳聚糖没有季铵化的水凝胶，按比例向水凝胶中边搅拌边加入免疫细胞因子IL-1β 8mg/ml，流感三价（H1N1、H3N2和B型）裂解病毒抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备壳聚糖没有季铵化的水凝胶喷鼻流感三价裂解疫苗组合物，置2-8℃保存。

将本发明制备的喷鼻流感三价裂解疫苗组合物、注射流感三价裂解疫苗、壳聚糖没有季铵化的水凝胶喷鼻流感三价裂解疫苗分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、雪貂，间隔2周加强免疫1次。然后分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道分泌液，测定血清中和抗体、sIgA、INF-γ细胞免疫应答效果，随后分别用100LD₅₀相应的流感病毒强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

由表3的结果可见，本发明制备的壳聚糖季铵盐水凝胶与免疫细胞因子IL-1β的喷鼻流感三价裂解疫苗在两种动物体内均能产生高效价的中和抗体效价，并能产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，动物全部存活；而注射流感三价裂解疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和INF-γ细胞免疫应答，并且抗原用量是注射疫苗用量的1/3；而壳聚糖没有季铵化及水凝胶的喷鼻流感三价裂解疫苗免疫没能有效产生免疫应答与免疫保护效果。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻流感三价裂解疫苗具有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表3. 壳聚糖季铵盐水凝胶作为疫苗组合物传递载体、IL-1β作为疫苗组合物佐剂制备的喷鼻流感三价裂解疫苗的免疫效果

实施例7 喷鼻免疫流感三价亚单位疫苗的制备及免疫效果评价

将H1N1、H3N2和B型流感病毒分别接种9-11日龄鸡胚尿囊，在37℃培养48h后，收集尿囊液病毒，用甲醛灭活，膜包超滤浓缩，蔗糖梯度离心纯化，Trion-100裂解病毒颗粒，再梯度离心除糖纯化，制备流感三价（H1N1、H3N2和B型）血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质、外源因子检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，向配制的壳聚糖季铵盐水凝胶中按比例边搅拌边加入免疫细胞因子 IL-1β 8mg/ml，上述制备的流感三价血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备喷鼻免疫流感三价亚单位疫苗，置2-8℃保存。

将制备的喷鼻流感三价亚单位疫苗，分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、雪貂，间隔2周加强免疫1次，并用实施例6中的喷鼻流感三价裂解疫苗、注射流感三价裂解疫苗做对照，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道不同部位分泌液，测定血清中和抗体、呼吸道sIgA黏膜免疫、INF-γ细胞免疫应答效果，随后分别用100LD₅₀相应的流感病毒强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

由表4的结果可见，本发明制备的壳聚糖季铵盐水凝胶与IL-1β黏膜佐剂的喷鼻流感三价亚单位疫苗在两种动物体内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，动物全部存活，与喷鼻流感三价裂解疫苗效果相当，而注射流感三价裂解疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，并且抗原用量是注射疫苗用量的1/4；由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻流感三价亚单位疫苗有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表4.壳聚糖季铵盐水凝胶作为疫苗传递载体、IL-1β作为疫苗佐剂制备的喷鼻流感三价亚单位疫苗的免疫效果

实施例8 喷鼻免疫流感病毒样颗粒疫苗的制备及免疫效果评价

将H1N1、H3N2和B型流感病毒，采用基因重组技术、原核或真核表达系统分别克隆、重组、表达、纯化制备HA-NA-M1病毒样颗粒抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质、外源因子检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，向配制的壳聚糖季铵盐水凝胶中按比例边搅拌边加入免疫细胞因子 IL-1β 8mg/ml，HA-NA-M1病毒样颗粒抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备喷鼻流感三价VlP疫苗，置2-8℃保存。

将制备具有壳聚糖季铵盐水凝胶与IL-1β黏膜佐剂的喷鼻流感三价VlP 疫苗，分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、雪貂，间隔2周加强免疫1次，并用注射流感三价裂解疫苗、壳聚糖没有季铵化及水凝胶的喷鼻流感三价VLP疫苗做对照，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道不同部位分泌液，测定血清中和抗体、呼吸道分泌液IgA、INF-γ细胞免疫应答效果，随后分别用100LD₅₀相应的流感病毒强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

由表5的结果可见，制备的壳聚糖季铵盐水凝胶与IL-1β的喷鼻流感三价VLP疫苗在两种动物体内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生sIgA和INF-γ细胞免疫应答，动物全部存活，效果好于喷鼻流感三价亚单位疫苗效果，而注射流感三价裂解疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，并且抗原用量是注射疫苗用量的1/5；而壳聚糖没有季铵化及水凝胶的喷鼻流感三价VLP疫苗免疫没能有效产生免疫应答与免疫保护效果。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻流感三价VLP疫苗具有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表5.壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗传递载体、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻流感三价VLP疫苗的免疫效果

实施例9 喷鼻呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗的制备及免疫效果评价

A、B型呼吸道合胞病毒：来源于美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

将A、B型呼吸道合胞病毒，采用基因重组技术、原核、真核细胞表达系统分别克隆、重组、表达、纯化制备获得纯化呼吸道合胞病毒病毒样颗粒抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质、外源因子检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，向配制的壳聚糖季铵盐水凝胶中按比例边搅拌边加入免疫细胞因子 IL-1β 8mg/ml，呼吸道合胞病毒病毒样颗粒抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备喷鼻呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗，置2-8℃保存。

将制备的喷鼻呼吸道合胞病毒VLP疫苗、注射呼吸道合胞病毒灭活疫苗、壳聚糖没有季铵化的水凝胶的喷鼻呼吸道合胞病毒VlP疫苗分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、棉鼠，间隔2周加强免疫1次，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道不同部位分泌液，测定血清中和抗体、呼吸道分泌液IgA、细胞免疫应答效果，随后分别用50LD₅₀A、B型呼吸道合胞病毒强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

由表6结果可见，制备的喷鼻呼吸道合胞病毒VLP疫苗在两种动物体内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生sIgA和细胞免疫应答，动物全部存活，而注射呼吸道合胞病毒灭活疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和血清INF-γ细胞免疫应答，且能诱发免疫损伤；而壳聚糖没有季铵化的水凝胶的喷鼻呼吸道合胞病毒VlP疫苗免疫没能有效产生免疫应答与免疫保护效果。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻呼吸道合胞病毒VLP疫苗具有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表6.壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗传递载体、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻RSV VLP疫苗的免疫效果

实施例10 喷鼻23价肺炎多糖结合蛋白疫苗的制备及免疫效果评价

23价肺炎球菌株：来源于美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

将23价肺炎球菌株，采用细菌发酵、多糖提取、蛋白交联技术，或生物合成多糖结合蛋白技术，制备纯化23价肺炎球菌多糖结合蛋白抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质和外源因子检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，向配制的壳聚糖季铵盐水凝胶中按比例边搅拌边加入免疫细胞因子IL-1β   8mg/ml，23价肺炎球菌多糖结合蛋白抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，分装于喷鼻免疫装置，制备23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗，置2-8℃保存。

将制备的喷鼻23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗，分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、恒河猴，间隔2周加强免疫1次，并用注射23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗、壳聚糖没有季铵化的水凝胶的喷鼻23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗做对照，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道不同部位分泌液，测定血清中和抗体、呼吸道sIgA和血清INF-γ细胞免疫应答效果，随后分别用200LD₅₀不同区域不同血清型肺炎强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

由表7结果可见，制备的壳聚糖季铵盐水凝胶与IL-1β的喷鼻23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗在两种动物体内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生sIgA黏膜免疫和血清INF-γ细胞免疫应答，动物全部存活，而注射23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，保护效果明显提高；而壳聚糖没有季铵化及水凝胶的喷鼻23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗免疫没能有效产生免疫应答与免疫保护效果。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻23价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗具有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表7.壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗传递载体、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻肺炎多糖结合蛋白疫苗的免疫效果

实施例11 喷鼻乳头瘤病毒VLP疫苗的制备及免疫效果评价

将6、8、11、18、56、58血清型乳头瘤病毒株（源于ATCC），采用基因重组技术、原核、真核细胞表达系统分别克隆、重组、表达、纯化制备六价乳头瘤病毒VLP抗原，并进行型别检定、抗原含量、热源质、外源因子等全面检定。

按实施例1制备方法，制备壳聚糖季铵盐水凝胶，向配制的壳聚糖季铵盐水凝胶中按比例边搅拌边加入免疫细胞因子IL-1β  8mg/ml，六价乳头瘤病毒VLP抗原15mg/ml，硫柳汞1mg/ml，调节溶液的pH值为6.8-7.0，置于2-8℃保存。

将制备的喷鼻六价乳头瘤病毒VLP疫苗，分别滴鼻免疫接种Balb/c小鼠、恒河猴，间隔2周加强免疫1次，并用注射六价乳头瘤病毒VLP疫苗、壳聚糖没有季铵化的水凝胶的喷鼻六价乳头瘤病毒VLP疫苗做对照，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集呼吸道分泌液，测定血清中和抗体、呼吸道分泌液IgA、细胞免疫应答效果，随后分别用200LD₅₀不同区域不同血清型乳头瘤病毒强毒株气溶胶攻毒，观察免疫保护效果。

结果如表8所示，制备的喷鼻六价乳头瘤病毒VLP疫苗在两种动物体内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生sIgA和细胞免疫应答，动物全部存活，而注射六价乳头瘤病毒VLP疫苗没有产生sIgA黏膜免疫和细胞免疫应答，保护效果明显低；壳聚糖没有季铵化的水凝胶喷鼻六价乳头瘤病毒VLP疫苗免疫没能有效产生免疫应答与免疫保护效果。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻六价乳头瘤病毒VLP疫苗具有很好的免疫应答和免疫保护效果，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表8.壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗传递载体、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻乳头瘤VLP疫苗的免疫效果

实施例12 喷鼻黏膜免疫疫苗在人体内免疫免疫效果评价

受试者：来源于解放军三0二医院体检人员，儿童、成年人、老年人接种及对照六组，每组各30人。

制备免疫细胞因子为IL-1β的喷鼻流感三价裂解病毒疫苗、喷鼻百白破多糖结合蛋白疫苗、喷鼻肺炎23价多糖结合蛋白疫苗、喷鼻流感嗜血杆菌（Hib）多糖结合蛋白疫苗，分别喷鼻免疫接种儿童、成年人、老年人，间隔2周加强免疫1次，并分别用注射疫苗做对照，分别采集静脉血并分离血清及淋巴细胞，同时采集上呼吸道分泌液，测定血清中和抗体、上呼吸道sIgA和血清INF-γ细胞免疫应答效果。

如表9所示，喷鼻流感三价裂解病毒疫苗、喷鼻百白破多糖结合蛋白疫苗、喷鼻肺炎23价多糖结合蛋白疫苗、喷鼻Hib多糖结合蛋白疫苗在儿童、成年人及老年人不同年龄段人群内均能产生高水平的中和抗体效价，并能产生黏膜免疫和细胞免疫应答效果，而注射流感三价裂解病毒疫苗、百白破多糖结合蛋白疫苗、肺炎24价多糖结合蛋白疫苗、Hib多糖结合蛋白疫苗没有产生有效的黏膜免疫和细胞免疫应答。由此可见，壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗载体传递系统、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻黏膜免疫疫苗在人体内能够产生全面免疫应答，并具有良好的交叉免疫保护效果。

表9.壳聚糖季铵盐水凝胶作为黏膜疫苗传递载体、IL-1β作为黏膜疫苗佐剂制备的喷鼻黏膜疫苗在人群种的免疫效果

Claims (5)

1.一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物由占疫苗组合物总重的以下组分组成：免疫细胞因子0.01-20%、壳聚糖季胺盐水凝胶45-80%、疫苗抗原0.01-20%、硫柳汞0.01-15%、聚乙二醇0.5-2%。

2.根据权利要求1所述一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，其特征在于，所述免疫细胞因子为天然的或重组的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33中的一种或一种以上。

3.根据权利要求1所述一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物，其特征在于，所述免疫疫苗抗原为灭活或减毒的病毒抗原、细菌抗原、天然或重组的蛋白抗原、多糖抗原、核酸抗原、蛋白结合多糖抗原中的一种或一种以上。

4.权利要求1所述的一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）壳聚糖季铵盐的制备

将6.0克壳聚糖分散于90ml双蒸水中，形成壳聚糖分散液，将75.0克2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶解于双蒸水中并定容至30ml，将2,3环氧丙基三甲基氯化铵溶液边搅拌边加入壳聚糖分散液中形成混合溶液，于80℃下搅拌反应6小时，将混合溶液倒入4℃预冷的丙酮中，放置在2-8℃过夜，其中混合溶液与丙酮的体积比为1:3～1:4。将过夜后的沉淀放置105℃条件下烘干，得到白色疏散固体物，为壳聚糖季铵盐；

（2）壳聚糖季铵盐水凝胶的制备

将壳聚糖季铵盐6.0克和聚乙二醇3克溶解于96ml 0.1mol/L的醋酸溶液中，冷却至4℃，搅拌下逐滴加入浓度为0.1-0.5g/ml的α-β-甘油磷酸钠溶液24ml，搅拌均匀，调节溶液pH值至7.0；将该溶液加热至37℃保温60分钟，形成壳聚糖季铵盐水凝胶；然后置于2-8℃保存；

（3）在配制的上述壳聚糖季铵盐水凝胶中边搅拌边按比例加入免疫细胞因子2-8mg/ml，疫苗抗原10-20mg/ml，硫柳汞0.1-3mg/ml，调节溶液的pH值为6.8～7.0，即为喷鼻黏膜免疫疫苗组合物溶液，置2-8℃保存。

5.根据权利要求1所述一种喷鼻黏膜免疫疫苗组合物在制备免疫预防药物中的应用。