CN102262158A - 重组融合蛋白质在快速诊断检测中的直接应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，基于目前国内外抗体快速检测领域普遍存在的抗原水溶性差、检测信号弱、灵敏度低、特异性差等问题，本发明提出直接采用携带融合标签的整体融合蛋白质进行分析物的平面流动型快速检测。1.本发明的要点是：构建融合蛋白重组基因；表达并纯化重组融合蛋白质；用重组融合蛋白质制备检测试剂和捕获试剂。2.本发明显示，融合蛋白质具备水溶性好、易于纯化、具备天然构型、活性高、标记效率高等优点，由此制成的快速检测试剂灵敏度和特异性高。3.根据本发明组建的快速检测试剂能够检测一种或者同时检测两种分析物。4.本发明在疾病诊断、流行病普查、医学鉴定、新药研制、农牧兽医等应用和基础研究领域具备广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及直接采用携带融合标签的整体融合蛋白质进行快速诊断检测。
背景技术
检测人类等生物样本中特定蛋白质因子的含量，对于医学、生物学、农牧业等领域的基础研究和实际应用具有非常重要的意义。例如，检测人体血液中针对丙型肝炎等致病病毒特异性抗体的存在，是目前诊断这些传染病的主要手段。同样，测定癌症和心血管疾病的早期生物标记蛋白质因子含量的变化对于这些疾病的早发现早治疗和疗效观察极为重要。随着医学和生物学领域的不断进展，各种蛋白质检测方法应运而生，其中最方便、应用范围最广也是目前使用最多的是各种免疫检测技术，例如免疫沉淀、免疫组织化学、和酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA)和快速免疫检测技术等。虽然ELISA比较简便常用，可以定量，但是耗时较长，一般需要4-5小时或者过夜，而且花费较高，需要特定的读测仪器和受过专门训练的工作人员才能完成。而实际工作中往往不具备这些检测条件，或需要立即知道检测结果，因此ELISA的广泛应用受到很大限制。而近年来基于平面流动技术发展起来的快速免疫检测方法，因其操作简单、费用低、耗时短(仅需15-20分钟就可以看到结果)，无论在国内外，在农村还是城市都比ELISA方法具备优势和发展前景。基于此，世界卫生组织(WHO)于2005年提出采用快速检测技术检测禽流感等各类流行性感冒病毒。同时，美国疾病防治中心(CDC)也于2004年建议采用快速检测技术对怀孕妇女和医护工作人员普遍检查人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染情况。
快速免疫检测主要有两类方法。一类方法是检测样本中某一特异性抗原，例如检测人体血液中的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原或表面抗原，这类方法需要亲和力高、信号强、特异性好的相应抗体作为主要检测试剂。另一类方法是检测样本(通常是血液)中针对某一抗原的特异性抗体，例如检测人体血液中针对HIV或者丙型肝炎病毒(HCV)的抗体，这类方法需要纯度高、溶解性好、信号强、特异性专一的相应抗原分子或抗原片段作为主要检测试剂。图1展示针对抗体的快速检测试剂组件。以检测人体血样中HCV抗体为例，在加样处加入血液样品，通过扩散渗透作用经过玻璃纤维到达存放干燥的金标-抗原(本例为HCV核心蛋白)位置，使之溶解。如果血样中存在抗HCV抗体，则这些抗体将与金标抗原结合，形成抗体-金标抗原复合物，继续沿硝酸纤维膜向吸水纸方向移动。到达检测线区域时，与检测线上的固相抗原结合，其中的金标抗原在此处富集而显示阳性反应信号。未结合的金标抗原在质控线区域被此处的固相HCV抗体捕获而显示质量控制信号。如果血样中不含HCV抗体，则金标抗原不能在检测线上富集显色，但是能够在质控线富集显色而呈阴性反应(图1)。
目前国内外针对抗体的快速检测方法和相应试剂普遍存在着检测灵敏度较低的问题，无法有效地检测抗体含量较低的血样，这在我国国内产品中表现尤甚。以HCV抗体快速检测试剂为例，国内一家公司产品对HCV阳性血样的检出率仅为22.5％。造成这一问题的主要原因有：(1)用来作为抗原的蛋白质通常在微生物蛋白质表达系统例如大肠杆菌中产生。由于改变了蛋白质表达的外部环境，许多本来水溶性蛋白质由于形成内含体(inclusion body)等原因，在大肠杆菌中表达后水溶性很差，需要特殊的促溶性处理(比如用高浓度尿素溶解，或者用亚硝基胍使蛋白质变性后再复性)才能用作抗原；而这些促溶性处理除了增加成本、耗费时间、降低产量之外，还不可避免地导致抗原蛋白质产物的不均一性和分子构型及其识别相应抗体特性的改变。(2)实际工作中，用做抗原的蛋白质本身分子量可能很小，而且，为了规避非特异性结合，常常只表达抗原蛋白质的某一段序列(结构域)用作抗原。其分子量就更加小，进行胶体金标记时效果较差，使检测信号微弱，即便有阳性反应，也因为信号过弱而观察不到。
为了克服上述问题，人们提出了一些解决方法，比如通过选择表达抗原蛋白质序列、尝试各种途径促进蛋白质水溶性、改变用于金标的胶体金颗粒大小、提高金标标记效率、采用生物素-链亲和素(biotin-streptavidin)系统放大检测信号等等。这些方法虽然有一定效果，然而，到目前为止，快速免疫检测方法灵敏度低的问题仍然没有得到根本改善。
而另一方面，随着分子生物学、基因组学和蛋白质组学研究的深入进行，蛋白质表达和纯化技术也有了长足的发展。为了提高重组蛋白质的水溶性，方便蛋白质纯化，人们将特定功能多肽标签(结构域)的编码序列植入所研究基因序列内，形成融合基因，表达产生融合蛋白质。其中多聚组氨酸标签(His-tag)等序列较短，主要用于重组蛋白质的纯化；而谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)和麦芽糖结合蛋白(Maltose bindingprotein，MBP)等融合蛋白质序列较长，除了方便纯化之外，还能够提高重组蛋白质的水溶性。这一方面归功于GST和MBP本身的极佳亲水性提高了整个重组融合蛋白质的水溶性；另一方面，这些融合蛋白序列能够帮助重组融合蛋白质的在翻译后的正确折叠形成可溶的天然构型。如果需要，可以将这些标签或融合蛋白序列去除，只保留原来蛋白质的天然氨基酸序列。但是有趣的是，去除掉融合蛋白序列后，这些天然序列蛋白质的水溶性常常随之下降，使人们不得不采用上述高浓度尿素或者亚硝基胍等促溶性处理使之恢复可溶性。
虽然融合蛋白质技术已经在许多生物学基础研究和生物技术领域中广泛采用，然而在快速检测领域的应用目前仅限于将His-tag标记等短小标签融合在抗原蛋白质上以方便蛋白质的纯化。如果把GST和MBP等融合蛋白质技术应用于快速检测，将在创新检测原理、扩增检测信号、提高检测灵敏度等方面具有重要意义。
发明内容
一、发明介绍
本发明针对现有抗体快速检测技术的局限性，提出了一种直接采用携带融合标签的整体重组融合蛋白质作为捕获抗原和检测抗原的抗体快速检测新技术。本发明的内容和原理包括：
1、克隆编码携带双重标签抗原蛋白质的重组融合基因。采用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)等重组DNA技术，在抗原蛋白质编码基因序列的5‘-端或3‘-端加入一个短小多肽标签(例如His-tag)的编码序列和一个较大融合基因(例如MBP或GST)的编码序列，构建双重标签抗原重组融合基因。将构建物克隆进某一表达载体(例如大肠杆菌表达质粒pET28)。转化导入载体宿主细胞(例如大肠杆菌菌株BL21)。
2、诱导表达并纯化重组双重标签抗原融合蛋白质。培养含有上述重组质粒的菌株细胞，加入诱导物，诱导表达重组抗原融合蛋白质。然后分别根据短小多肽标签和较大融合基因的特性分离纯化重组抗原融合蛋白质。以His-tag和MBP融合蛋白为例，可以首先用固相金属亲和层析柱针对HIS-tag进行第一轮纯化，然后用直链淀粉亲和层析柱针对MBP融合蛋白部分进行第二轮纯化，从而使重组抗原蛋白质的纯度达到或超过99％。这样高纯度的抗原蛋白质将极大减少因非特异蛋白质的存在而引起的检测本底噪音。
3、将重组抗原融合蛋白质用作检测抗原。根据快速检测所采用的技术路线，重组抗原融合蛋白质用作检测抗原的途径有两种：一种是直接用胶体金标记重组抗原融合蛋白质，这里金标的抗原融合蛋白质直接用作检测信号分子；另一种是经过生物素-亲和素放大步骤，用磺酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯-生物素(Sulfo-NHS-Biotin)将生物素标记在MBP融合重组抗原蛋白质上赖氨酸的伯胺基团，而用胶体金标记链亲和素或中性亲和素(Neutravidin)作为检测信号分子。
4、将重组抗原融合蛋白质用作捕获抗原，制作检测线。把和检测抗原相同的或不同但至少共享同一个抗原决定簇的重组抗原融合蛋白质作为捕获抗原，点印于快速检测装置中硝酸纤维膜测试条上，形成检测线。
5、制作质量控制线。如果检测信号分子是金标的重组抗原融合蛋白质，采用针对该抗原的抗体(采用本专业人员熟知的技术方法制备的单克隆抗体或多克隆抗体)点印于硝酸纤维膜测试条上，形成质控线。如果检测信号分子是金标的链亲和素(或中性亲和素)，则采用生物素标记的BSA在硝酸纤维膜测试条上点印形成质控线。
6、组装快速检测试剂产品。将上述硝酸纤维膜测试条、金标的检测抗原(或者生物素标记的作为检测抗原加上金标的链亲和素)、塑料垫片、吸水纸等，按照图1所示组装在快速检测塑料装置中。
7、检测方法及原理。用上述方法制备的快速检测试剂检测人血清中针对抗原蛋白质X的特异性抗X抗体：
(1)如果检测信号分子是金标的重组抗原融合蛋白质，加入血样后，样品通过扩散渗透作用到达存放干燥的金标检测抗原位置并使之迅速溶解。如果血样中存在抗X抗体，则该抗体识别并结合金标检测抗原，形成抗体-金标检测抗原二重复合物。该复合物继续沿硝酸纤维膜向吸水纸方向移动。到达检测线区域时，由于复合物中抗X抗体的两个抗原结合位点通常只有一个结合了X抗原蛋白，另一个抗原结合位点处于自由状态，能够与检测线上的固相捕获抗原结合，使整个复合物被捕获在检测线区域，因为金标检测抗原在此处富集而显示信号，使检测呈阳性反应。而游离的金标检测抗原则继续向吸水纸方向移动，在质控线区域被此处固相结合的抗X抗体捕获而显示质量控制信号(图2A)。如果血样中不含抗X抗体，则没有抗体-金标检测抗原二重复合物形成，金标检测抗原以游离状态向吸水纸方向移动，无法被检测线上的固相捕获抗原捕获，但是能够被质控线上的抗X抗体捕获富集而显色，从而检测呈阴性反应(图2B)。
(2)如果检测信号分子是金标的链亲和素，加入血样后，样品通过扩散渗透作用到达存放干燥的生物素标记的检测抗原和金标-中性亲和素位置，并使之迅速溶解。如果血样中存在抗X抗体，则该抗体识别并结合生物素标记的检测抗原，而后者通过生物素和金标的链亲和素紧密结合，形成抗体-抗原-金标链亲和素三重复合物。该复合物继续沿硝酸纤维膜向吸水纸方向移动。到达检测线区域时，复合物中抗X抗体分子的自由抗原结合位点与检测线上固相捕获抗原结合，使整个复合物被捕获在检测线区域，因为金标链亲和素在此处富集而显示信号，使检测呈阳性反应。而游离的金标链亲和素则继续向吸水纸方向移动，在质控线区域被此处固相结合的生物素-BSA捕获而显示质量控制信号(图3A)。如果血样中不含抗X抗体，则没有抗体-抗原-金标链亲和素三重复合物形成，金标链亲和素以游离状态或与生物素-检测抗原结合状态向吸水纸方向移动，无法被检测线上的固相捕获抗原捕获，但是能够被质控线上的生物素-BSA捕获富集而显色，从而检测呈阴性反应(图3B)。
本发明构建的重组抗原融合蛋白质中MBP(或GST等)融合蛋白的作用主要有以下几个方面：第一，这些融合蛋白本身皆有成熟配套的亲和层析方法可供使用，大大方便重组蛋白质的纯化，在双重纯化体系中可以使蛋白质纯度达到99％以上。第二，能够有效提高抗原蛋白质的水溶性，这对于原本水溶性较差的一些病毒蛋白质例如HCV核心蛋白的可溶性非常重要。这使得生产抗原蛋白质不必经过复杂低效的蛋白质促溶步骤，从而大大降低成本、提高产量。第三，不经过促溶处理获得的可溶性蛋白质分子具有更好的稳定性、均一性和分子折叠的正确性，能够呈现天然的抗原决定簇构型，保持原有的抗原特异性，从而提高检测灵敏度和特异性。第四，能够增加抗原蛋白质的大小，用作检测抗原时可以为将来标记报道分子(例如生物素)提供更多位点，而且在MBP多肽序列上的标记不影响抗原蛋白质对抗体的结合；用作捕获抗原时可以直接固相结合在硝酸纤维膜上，不必进行耗时、费工、降低抗原效率的小牛血清蛋白(BSA)标记(BSA标记常常是将分子量小的抗原蛋白质固相结合在硝酸纤维膜上时所需要)。
本发明方法中所说的检测抗原和捕获抗原是指用于快速检测样品中某种特异性抗体的蛋白质。其中检测抗原是指用于首先和样品中特异性抗体结合形成复合物的抗原蛋白质，检测抗原处在快速检测体系的移动相，或者标记有直接显示检测信号的物质(如胶体金、酶等等)，或者标记有能和信号物质特异性结合的分子基团(如生物素等)；其中捕获抗原是指用于点印而固相结合在“检测线“区域、能够和检测抗原-所测抗体复合物结合而将其捕获使之在检测线富集的抗原蛋白质。检测抗原和捕获抗原携带至少一种相同的抗原决定簇，因此能够分别与同一个抗体分子上两个结合位点之一结合。
本发明方法中所说的短小多肽标签是指携带一定特异性结合功能的长度为4-30个氨基酸残基的多肽序列，例如His-tag，FLAG-tag，等等。针对这些标签已经有成熟方便的亲和层析技术和试剂，可以方便地纯化相应的重组蛋白质。
本发明方法中所说的较大融合基因是指在与抗原基因融合并表达产生重组融合蛋白质后，能够提高原有抗原蛋白质水溶性、提高抗原蛋白质表达量的编码30个氨基酸残基以上的多肽序列。较大融合基因所编码的蛋白质本身具备一定的特异性结合功能，针对这些蛋白质已经有成熟方便的亲和层析技术和试剂，可以方便地纯化相应的重组蛋白质。常用的较大融合基因包括MBP和GST的编码基因。
本发明方法中所说的表达载体是指能够承载并方便表达重组融合基因的质粒或其他分子克隆工具，包括各类细菌质粒、酵母菌质粒、用于转染昆虫细胞、哺乳类细胞、植物细胞的表达质粒和病毒表达载体。本发明方法所说的宿主细胞是指能够接受表达载体并表达产生重组蛋白质的细菌细胞例如大肠杆菌、真菌细胞例如啤酒酵母、及其他类型真核生物细胞(包括昆虫细胞、哺乳类细胞、植物细胞等)。
本发明所公开的快速检测方法各步骤中涉及到的具体操作技术，如PCR和基因克隆等重组DNA技术、将重组质粒转化导入表达宿主细胞技术、重组蛋白质诱导表达技术、重组蛋白质层析纯化技术、胶体金蛋白质标记技术、用NHS-生物素等标记分子标记蛋白质技术、将蛋白质点印于硝酸纤维膜测试条形成检测线或质控线的技术、不同快速检测试剂的组装技术等等，是本领域专业技术人员所熟知的。
显而易见，本发明所公开的“重组融合蛋白质在快速诊断检测中的直接应用”，适用于任何旨在检测样本中特异性抗体的快速检测，包括人体血样中各种病毒和其他各类病原微生物的抗体、各种自身免疫抗体，动物血样中各种抗体。本发明所公开的方法稍加改动后同样适用于快速检测非免疫关系的蛋白质-蛋白质结合或者蛋白质与其他类型分子的结合。这一方法能够应用在临床诊断、流行病普查、疾病生物标记(biomarkers)鉴定分析、分子生物学和细胞生物学研究分析、蛋白质组学研究分析、新药靶位鉴定分析、临床药物动力学和药效学分析、畜牧兽医和农业诊断分析等领域的快速检测。根据这一方法的原理，能够开发、生产和组装各种快速检测试剂产品，包括完整试剂盒和试剂盒的组成部分，例如检测抗体和捕获抗议、点印有检测线和质控线的硝酸纤维膜测试条，等等。
附图说明
图1：抗体快速检测装置示意图
图2：检测信号分子是金标重组融合抗原蛋白质的快速检测原理示意图
图3：检测信号分子是金标链亲和素的快速检测原理示意图
图4：实施例1中HIV重组蛋白质结构示意图
图5：采用His-MBP-HIV融合蛋白质快速检测HIV血样
图6：实施例2中HCV重组蛋白质结构示意图
图7：采用His-MBP-HCV融合蛋白质快速检测HCV血样
图8：采用His-MBP-HIV和His-MBP-HCV融合蛋白质双重快速检测HIV/HCV血样
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐述本发明的原理和方法。
实施例1：直接将纯化的His-MBP-HIV融合蛋白质用于HIV平面流动型快速检测
(1)构建His-HIV和His-MBP-HIV融合基因
采用PCR扩增不同的HIV病毒cDNA片段(HIV-1的gp41和HIV-2的gp36)，克隆至大肠杆菌表达载体pET-28和pET-32。如图4所示，HIV重组基因A和B含有相同的HIV病毒基因序列，重组基因C和D含有相同的HIV病毒基因序列，但A和C的N端只携带His-tag，而B和D的N端携带His-tag和MBP融合基因。
(2)His-MBP-HIV重组融合蛋白质比His-HIV重组蛋白质在水溶性和纯度上的改善
将含有上述A、B、C和D的重组表达质粒转化进大肠杆菌菌株BL-21，经IPTG诱导表达产生重组蛋白质。离心收菌，超声波破碎，离心分出上清和沉淀，分别跑SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时进行Western blotting，分别用小鼠抗MBP抗体和人体抗HIV血清检测重组蛋白质的表达量、水溶性、蛋白质大小和对HIV抗体的免疫结合能力。结果显示，重组蛋白质A和C水溶性较差，90％以上蛋白质位于离心后的沉淀组分，必须经过蛋白质变性后方能镍离子亲和层析柱纯化。而重组蛋白质B和D呈现出高度水溶性，90％以上处于离心后的上清液，可以在天然状态下分别采用镍离子亲和层析柱针对His-tag和采用直链淀粉亲和层析柱针对MBP进行纯化，双重纯化后得到的重组融合蛋白质纯度超过99％。
(3)制备生物素标记的His-MBP-HIV重组融合蛋白质和BSA
用Sulfo-LC-NHS-生物素在室温下处理HIV重组融合蛋白质B(His-MBP-gp36-gp41)(分子比例30∶1)30分钟，将生物素标记在融合蛋白质赖氨酸残基的伯胺基团，用作检测抗原。采用同样原理用Sulfo-LC-NHS-生物素标记BSA，用来制作质量控制线。标记后，加入25mMTris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)粹灭未反应的Sulfo-LC-NHS-生物素分子并透析去除之。
(4)制备金标链亲和素：以氯金酸为材料，采用柠檬酸三钠法制备获得颗粒直径大约为30-40纳米的胶体金悬浮液。用胶体金标记链亲和素。
(5)用His-MBP-HIV重组融合蛋白质制备检测测试条
用HIV重组融合蛋白质D(His-MBP-gp36S-gp41S)作为捕获试剂在硝酸纤维膜上点印成检测线。用生物素标记的BSA在同一硝酸纤维膜上检测线的远端(靠近吸水纸端)平行点印成质控线。
(6)平面流动型HIV抗体快速检测
以生物素标记的HIV重组融合蛋白质B和金标链亲和素冰冻干燥混合后作为检测试剂，以HIV重组融合蛋白质D为捕获试剂的平面流动型快速检测组装后，成功地检测出HIV阳性人体血样，而HIV阴性血样则呈现阴性(图5)。
实施例2：直接将纯化的His-MBP-HCV融合蛋白质用于HCV平面流动型快速检测
(1)构建His-HCV和His-MBP-HCV融合基因
通过PCR扩增不同的HCV病毒cDNA片段(HCV基因型I和II；编码核心抗原、NS3、NS4和NS5非结构蛋白质的基因片段)，克隆至大肠杆菌表达载体pET-28和pET-32。如图6所示，HCV重组基因A和B含有相同的HCV病毒基因序列，重组基因C和D含有相同的HCV病毒基因序列，但A和C的N端只携带His-tag，而B和D的N端携带His-tag和MBP融合基因。
(2)His-MBP-HCV重组融合蛋白质比His-HCV重组蛋白质在水溶性和纯度上的改善
将含有上述编码HCV重组蛋白质A、B、C和D的表达质粒转化进大肠杆菌菌株BL-21，经IPTG诱导表达产生重组蛋白质。离心收菌，超声波破碎，离心分出上清和沉淀，分别跑SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时进行Western blotting，分别用小鼠抗MBP抗体和人体抗HCV血清检测重组蛋白质的表达量、水溶性、蛋白质大小和对HCV抗体的免疫结合能力。结果显示，重组蛋白质A和C水溶性极差，99％以上蛋白质处于离心后的沉淀组分，必须经过蛋白质变性后方能镍离子亲和层析柱纯化。而重组蛋白质B和D呈现出高度水溶性，80％以上处于离心后的上清液，可以在天然状态下分别采用镍离子亲和层析柱针对His-tag和采用直链淀粉亲和层析柱针对MBP进行纯化，双重纯化后得到的重组融合蛋白质纯度超过98％。
(3)制备生物素标记的His-MBP-HCV重组融合蛋白质和BSA
按实施例1(3)中描述的方法用Sulfo-LC-NHS-生物素标记HCV重组融合蛋白质D(His-MBP-NS5-NS4-NS3-C8asp)和BSA，分别用作检测抗原和制作质量控制线。。
(4)制备金标链亲和素：按实施例1(4)中描述的方法制备胶体金悬浮液，用胶体金标记链亲和素。
(5)用His-MBP-HCV重组融合蛋白质制备检测测试条
用HCV重组融合蛋白质B(His-MBP-核心-NS3-C8 asp)作为捕获试剂在硝酸纤维膜上点印成检测线。用生物素标记的BSA在同一硝酸纤维膜上检测线的远端(靠近吸水纸端)平行点印成质控线。
(6)平面流动型HCV抗体快速检测
以生物素标记的HCV重组融合蛋白质D和金标链亲和素冰冻干燥混合后作为检测试剂，以HCV重组融合蛋白质B为捕获试剂的平面流动型快速检测组装后，成功地检测出HCV阳性人体血样，而HCV阴性血样则呈现阴性(图7)。
实施例3：将纯化的His-MBP-HIV和His-MBP-HCV重组融合蛋白质用于平面流动型HIV/HCV双重快速检测
(1)制备生物素标记的His-MBP-HIV和His-MBP-HCV重组融合蛋白质和BSA
用实施例1(3)和实施例2(3)中描述的方法分别用Sulfo-LC-NHS-生物素标记实施例1中的HIV重组融合蛋白质B(His-MBP-gp36-gp41)和实施例2中的HCV重组融合蛋白质D(His-MBP-NS5-NS4-NS3-C8 asp)，用作检测抗原。同样的原理，用Sulfo-LC-NHS-生物素标记BSA，用来制作质量控制线。
(2)制备金标链亲和素：按实施例1(4)中描述的方法制备胶体金悬浮液，用胶体金标记链亲和素。
(3)用His-MBP-HIV和His-MBP-HCV重组融合蛋白质制备检测测试条
用实施例1中的HIV重组融合蛋白质D(His-MBP-gp36S-gp41S)作为捕获试剂在硝酸纤维膜上点印成HIV检测线；用实施例2中的HCV重组融合蛋白质B(His-MBP-核心-NS3-C8 asp)作为捕获试剂在同一硝酸纤维膜上平行点印成HCV检测线。用生物素标记的BSA在同一硝酸纤维膜上在两条检测线的远端(靠近吸水纸端)平行点印成质控线。
(4)平面流动型HIV/HCV抗体双重快速检测
以生物素标记的HIV重组融合蛋白质B、生物素标记的HCV重组融合蛋白质D和金标链亲和素冰冻干燥混合后作为检测试剂，以HIV重组融合蛋白质D和HCV重组融合蛋白质B为捕获试剂，组装平面流动型双重快速检测装置。该装置成功地检测出HIV阳性但HCV阴性人体血样、HIV阴性但HCV阳性血样、HIV阳性HCV也是阳性血样、以及HIV和HCV双阴性血样(图8)。
Claims (9)
1.一种直接应用重组融合蛋白质进行分析物快速检测的方法，其特征在于：
(1)构建融合蛋白质编码基因：将编码用于捕获和检测分析物的蛋白质编码序列、短小多肽标签和较大融合蛋白质DNA序列用重组DNA技术构建到一起，形成携带双重标签(短小多肽标签和较大融合蛋白质标签)的融合基因，克隆到表达载体。
(2)制备融合蛋白质：根据表达载体特点，诱导表达产生重组融合蛋白质。用针对短小多肽标签和较大融合蛋白质的亲和层析材料纯化重组融合蛋白质。
(3)制备检测信号试剂：用生物素标记融合蛋白质，用胶体金标记能够特异识别生物素的蛋白质，共同组成检测信号试剂；或者采用胶体金标记融合蛋白质，作为检测信号试剂。
(4)制备快速检测测试条：直接用未标记的融合蛋白质在反应平面介质上点印形成检测线；用能够与检测信号试剂特异结合的试剂在同一反应平面介质上点印形成质量控制线。根据检测信号试剂的不同，点印质控线的试剂可以是用生物素标记的常用蛋白质例如BSA，也可以是针对检测试剂的抗体。
(5)组装快速检测装置：将上述检测信号试剂、快速检测测试条、吸水纸、支持平板和塑料外壳等组装产生快速检测装置。
(6)检测：加入待测样本，根据检测线和质控线的反应，确定检测结果。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的分析物是能够与所说的融合蛋白质特异结合的测试目的分子，主要包括但不限于人体及其他动物的抗体、抗体片段、其他蛋白质、肽、寡聚核苷酸适体、其他类型生物大分子及其复合物、以及亚细胞结构等。如果所说的分析物是抗体，则所说的融合蛋白质是能够与该抗体结合的抗原蛋白质或其片段(结构域)。
3.根据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的较大融合蛋白质是指任何与抗原基因融合并表达产生重组融合蛋白质后，能够提高原有抗原蛋白质水溶性、或提高抗原蛋白质表达量、或提高信号分子(生物素、胶体金、酶等等)标记效率的30个氨基酸残基以上的多肽序列。较大融合蛋白质包括但不限于任何来源的MBP和GST或其片段。一个重组融合蛋白质可以含有一个或若干个相同或不同的较大融合蛋白质。
4.根据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的短小多肽标签是指携带一定特异性结合功能的长度为4-30个氨基酸残基的多肽序列，包括但不限于His-tag、FLAG-tag、Strep-tag，等等。
5.根据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的融合蛋白质至少应用于所说的检测试剂或者在反应平面介质上点印形成检测线，或者同时应用于检测试剂和点印检测线。同时应用于检测试剂和点印检测线时，所用的融合蛋白质可以相同，也可以有所不同。
6.根据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的能够特异识别生物素的蛋白质包括任何能够特异性识别并结合生物素的任何来源的蛋白质，包括但不限于亲和素、链亲和素、中性亲和素、抗生物素抗体、这些蛋白质的突变体或修饰变异体以及其功能片段等。
7.据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的用于制备快速检测测试条的反应平面介质是能够固相结合蛋白质而形成检测线和质量控制线，并且允许液相样本扩散流动的薄层平面物质，包括但不限于硝酸纤维膜、尼龙膜、经过特殊处理的塑料表面或玻璃表面，等等。
8.权利要求1和2所述的快速检测方法，在临床检测诊断、流行病调查、生物标记鉴定分析、分子生物学和细胞生物学研究、蛋白质组学研究分析、新药靶位鉴定分析、临床药物动力学和药效学分析、畜牧兽医、农业病害诊断分析等领域的应用。
9.基于权利要求1和2所述直接应用重组融合蛋白质快速检测方法研制组装的快速检测装置及试剂，用于权利要求8所述的应用领域。其中所说的快速检测装置及试剂包括组装完整的快速检测装置及其组成部分，包括检测试剂、点印有检测线和质量控制线的快速检测测试条、吸水纸、塑料支持垫板、塑料外壳装置、用法说明等。等等。如果信号分子是酶，快速检测装置中还包括但不限于酶底物溶液和反应终止液。
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