CN101444644B - 一种组织工程化骨及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨及其应用。本发明的技术方案如下：一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨，它由下列方法制得：(1)Nell-1基因转染体外培养的骨髓基质细胞；(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料构建组织工程化骨，促进了裸鼠皮下异位成骨和大鼠颌骨临界骨缺损(CDS)修复的效果。本发明优点表现在：Nell-1基因修饰的组织工程化骨植入裸鼠体内后，材料网孔内新骨较对照组成骨多，Micro-CT显示Nell-1基因修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损时，可以在大鼠颌骨CSD内安全生长，并能更有效的修复骨缺损。

Description

一种组织工程化骨及其应用

技术领域

本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨及其应用。

背景技术

Nell-1(Nel样I型分子)是具有成骨能力的新基因，与颅缝早闭有关。Nell-1蛋白是一个分泌蛋白，结构上含有分泌信号肽序列，一个氨基端trombospondin-1-like分子，5个含半胱氨酸残基的VonWillebrand因子样重复，以及6个表皮生长因子(EGF)样功能团。Nell-1编码90kDa的多肽，在真核细胞中，N端与50kDa的碳水链连接，在胞浆内糖基化成140kDa。Nell-1最终形成400kDa磷酸化的三聚体分泌到胞外。种系间基因序列高度保守，比如人与大鼠Nell-1蛋白有93％的同源性。在研究颅缝早闭时，发现该基因在非家族性非系统性患者的早闭颅缝部位上调。人的Nell-1主要在颅缝成骨部位的间充质细胞和成骨细胞内表达。CMV驱动的Nell-1转基因小鼠，主要表现颅骨增生，发生颅缝早闭。最近的研究显示，Nell-1促进成骨的能力非常强。Nell-1过表达可加速颅骨成骨细胞系MC3T3和原代成骨细胞FRCC的分化，矿化结节较对照组增加约6倍，而Nell-1的反义表达可抑制该细胞的分化。Nell-1体外诱导FRCC细胞ALP表达的能力比BMP-4强。应用Nell-1蛋白修复小鼠颅骨缺损的在一定的条件下与BMP-2相当。有意思的是该基因可以促进成骨细胞的分化以及成骨分化终末阶段所伴随的凋亡，而对成纤维细胞系或原代的成纤维细胞却没有作用，其作用部位可能是在成骨信号通路的下游，或者通过与BMP成骨作用不同的机制促进成骨。由于BMPs对多种组织和细胞有广泛的生物学活性，而Nell-1促进细胞的矿化只针对具有成骨潜能的细胞，局限在成骨环境内成骨，所以应用该因子在安全性方面较BMP有着潜在的优越性。Nell-1转基因小鼠的出生死亡率和致畸率大大低于BMP转基因小鼠，也提示Nell-1具有较低的全身毒性。Nell-1作为新克隆的成骨基因，在颅颌面部骨组织特异性表达的特点、潜在的应用安全性以及明显的成骨能力，使得应用Nell-1修复口腔颌面部骨缺损具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨；

(2)提供组织工程化骨用途。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：选择Nell-1基因腺病毒载体转染体外培养扩增的大鼠bMSCs，Nell-1基因是具有成骨能力的新基因，目前的研究认为在细胞水平上，Nell-1单独诱导一定程度的成骨分化，它可能操纵了一些成骨相关基因的下游途径，并影响了其他信号通路，促进成骨细胞的分化。作为一种新克隆的成骨相关基因，Nell-1具有潜在的安全性以及明显的成骨作用，它的产物蛋白可能成为骨组织工程中一种新的生长因子。根据目前研究结果的总结，在成骨方面它有如下的特点：(1)生物学特异性，Nell-1促进成骨主要作用于成骨细胞或具有成骨潜能的细胞，尚未见作用于其他细胞；(2)细胞周期特异性，Nell-1基因只在分化期作用于成骨细胞。它的机理可能是操纵成骨相关基因的下游途径，相对来说，具有成骨特异性；(3)潜在较低的生物学毒性，Nell-1转基因小鼠的出生死亡率和致畸率都大大低于BMP转基因小鼠；采用腺病毒作为载体，不仅仅是由于转染效率的考虑，更重要的是病毒基因组不会将外源基因整合到细胞染色体。腺病毒载体能够克服组织特异性的转染屏障，不会在不需要的组织中产生转染。腺病毒所介导的基因只能短暂表达，较为安全。而组织工程化组织构建是一个相对短暂的过程，只需要一段时间内的基因表达，如BMP-2基因用于骨构建需3周左右的时间。所以采用短暂表达的腺病毒更适合组织工程化骨的构建。腺病毒基因转染作为骨组织工程的方法在研究细胞系已经得到较多的应用，被证实有很肯定的转染效率和活跃的治疗性生长因子表达。骨髓基质细胞(bone marrow stromalcells，bMSCs)具有来源丰富，采集方便，容易在体外培养、诱导、扩增的特点，并具有明确的成骨潜能，是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在体外培养具有较强的传代增殖能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨缺损基因治疗较为理想的靶细胞。本发明利用腺病毒介导的Nell-1基因体外转染大鼠bMSCs，转染后72小时基因转染效率达到峰值，基因表达也达到峰值。利用LacZ基因作为测定转染效率和阴性对照的报告基因。LacZ为编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)的基因。使用LacZ的原理为基因转染之后合成的β-gal能水解X-gal，产生蓝色的沉淀能在显微镜下直观地观察到并计算。在MOI＝80pfu/cell时可获得54.8±4.6％的转染效率，在MOI≤160pfu/cell时，基因转染效率随着转染滴度增加而增高。反转录PCR显示，在转染目的基因的泳道中，400bp大小的条带明显。结果表明有Nell-1基因转录水平的表达，而LacZ组和空白对照组未见此条带出现，表明此两组中无Nell-1基因的表达。以β-actin蛋白为内参照，进行各组间内参照蛋白浓度一致的蛋白电泳，可见转染目的基因泳道有大小约90kDa的蛋白条带表达，条带的表达随转染滴度的增加而更加明显，显示转染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表达，而LacZ组和空白对照组未见此条带出现，显示对照组无Nell-1基因蛋白水平的表达。

实时荧光PCR使用了与DNA特异结合并发生荧光的染料或带有特异荧光基团的探针来标记PCR产物。本发明在实时荧光PCR前用反转录PCR进行初步验证时，设定未见明显二聚体的引物设计及退火温度为采用标准。在实时荧光PCR反应后对所有的PCR产物均进行熔链曲线分析，均未见非特异性PCR产物，说明实时荧光PCR的结果是可信的。基因检测结果显示利用腺病毒介导的Nell-1基因体外转染大鼠bMSCs后促进ALP、BSP、OCN、OPN等成骨分化表型标志基因的上调。

应用腺病毒介导的Nell-1基因体外转染鼠、兔、羊、猪、狗等bMSCs，然后将基因修饰的细胞与生物支架材料复合(如β-TCP、天然型无机骨NNB、珊瑚、藻酸钙、PGA、PLGA、胶原等)可以构建组织工程化骨促进颌骨缺损的修复。以贝奥路公司研制的微孔结构及降解率可控β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)为例，可以起到临时支架作用，引导骨生长，允许周围的骨向材料中浸润长入，然后材料被逐渐吸收，无炎症或排斥反应，不产生局部或全身性毒性反应。β-TCP是磷酸三钙不同相结晶物的一种。自二十世纪70年代以来，β-TCP一直是骨替代材料研究领域的热点之一，其分子式为Ca3(PO4)2，工业合成β-TCP粉料的钙/磷比为1.49～1.51，与正常骨组织的钙磷比接近。β-TCP的成分与骨基质的无机成分[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]相似，故被认为具有良好的生物相容性。β-TCP具有吸收缓慢，低免疫反应和低毒性等特点，并具有骨引导性，适合作为组织工程修复颌骨的材料。Nell-1基因修饰大鼠bMSCs复合β-TCP材料裸鼠皮下植入实验大体观察显示植入物表面皮肤完整光滑，无积液，伤口无感染，植入物无排出。周围软组织包裹材料，未见异物排斥反应，也未见明显炎症反应。HE染色标本病理学观察N组可见较多的软骨样和板层骨样组织自支架区向空隙区生长，血管结构和骨陷窝样结构较C组和L组明显。成骨面积N组高于其余两组。应用Nell-1基因修饰的bMSCs还可以与支架材料复合，构建组织工程化骨促进大鼠临界骨组织缺损(CSD)的修复。Micro-CT可以更加直观的显示N组修复区域密度大于L组，骨质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结合处也更加致密。

本发明的技术方案如下：一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨，它由下列方法制得：

(1)Nell-1基因转染体外培养的骨髓基质细胞；

(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料构建组织工程化骨，所述的Nell-1基因以MOI＝50～80pfu/cell工作浓度转染体外培养的骨髓基质细胞，骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，生物支架材料是磷酸三钙、多孔羟基磷灰石、珊瑚、藻酸钙、胶原，生物支架材料是β-磷酸三钙，细胞密度为5×10⁷/ml的细胞悬液与生物支架材料复合。

Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨在颌骨缺损修复领域中应用。

本发明所公开一种组织工程化骨及其应用，其优点表现在：本发明利用腺病毒介导的Nell-1基因有效的稳定的转染大鼠bMSCs，并成功获得了Nell-1转录和蛋白水平的表达，为骨组织工程中Nell-1基因治疗打下了基础。本发明把Nell-1基因治疗与组织工程方法结合起来，以bMSCs作为基因治疗的靶细胞，同时应用其作为组织工程化骨的种子细胞，通过基因修饰bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。Nell-1基因修饰的组织工程化骨植入裸鼠体内后，材料网孔内新骨成骨多，Micro-CT显示Nell-1基因修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损时，可以在大鼠颌骨CSD内安全生长，并能更有效的修复骨缺损。

附图说明

图1：转染效率测定，在工作浓度时可获得较高的转染效率(荧光显微镜下观察，放大倍数100)。

图2：转染bMSCs后Nell-1基因转录水平的表达，反转录PCR转染后3天各组内参照条带均较为明显。N组泳道中出现400bp左右大小的条带而对照组和LacZ组无相应条带出现。C：空白对照组；N：Nell-1组；L：LacZ组。

图3：转染bMSCs后Nell-1基因在蛋白水平的表达，Western blot显示各组的内参照条带灰度较为相近，N组出现90kDa左右大小的条带，MOI为20、40、80pfu/cell的3组条带灰度依次增加，未对照组和LacZ组无相应的条带出现。C：空白对照组；L：LacZ组；N20/N40/N80：Nell-1组，MOI依次为20/40/80pfu/cell。

图4：Von Kossa硝酸银染色，第15日至第28日，各组中的钙结节数目逐渐增多，Von Kossa硝酸银染色后，C组和L组钙结节数目少于N组。

图5：N组裸鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数100)可见较多的软骨样和板层骨样组织自支架区向空隙区生长，成骨面积较C组和L组明显。

图6：C组裸鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数100)。

图7：L组裸鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数100)。

图8：Micro-CT显示N组(右侧颌骨)修复区域密度大于L组(左侧颌骨)，骨质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结合处更加致密。

图9：颌骨缺损组织切片术后8周N组(HE染色，放大倍数200)的成骨较C组更加明显。

图10：颌骨缺损组织切片术后8周C组(HE染色，放大倍数200)的成骨。

图11：术后4周Nell-1基因转染的bMSCs所形成的新骨(E，G)较BMP-2组骨组织更致密(F，H·)。

具体实施方式

下面结合具体实验及其结果分析和相应的说明书附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1

一、Nell-1基因转染大鼠bMSCs及表达测定

步骤一、原代bMSCs的获取及培养  无菌状态下，取SPF级6周龄雄性Fischer 344大鼠胫骨和股骨骨髓，所得细胞悬液离心，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪，加DMEM培养液，均匀吹散，置于培养条件为37℃恒温混合气体(含95％空气，5％CO₂)，100％饱和湿度的培养箱中培养。每周换液3次，待90％左右的细胞融合时予以传代，培养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液，用于研究。

步骤二、Nell-1基因转染bMSCs  细胞生长至70-80％融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入一半量包含一定滴度腺病毒载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，Nell-1腺病毒载体浓度为3.5×10¹⁰pfu/ml，加入稀释的携基因的腺病毒载体后，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞，提高转染效率。一小时后加入另外半量的含20％血清的培养液。此时培养液中FBS含量为10％。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。每3天换液。Nell-1基因从美国Origen公司获得。

步骤三、基因转染效率检测  细胞接种于6孔板。转染LacZ基因72小时后，吸去培养液，以PBS轻轻漂洗细胞两次，室温下以4％多聚甲醛固定10分钟，再次以PBS轻漂洗两次。每孔加入X-gal染色液1ml，37℃水浴箱中染色1-3小时，观察发现细胞绿色染色即以PBS漂洗中止实验，在100×放大倍数下随机选择6个视野，统计LacZ表达阳性的细胞占细胞总数的百分比。

步骤四、反转录PCR测定Nell-1基因的转录  转染后72小时，提取总RNA，反应的条件为：42℃水浴2小时后，立即放入95℃水浴5分钟进行反转录，合成好的cDNA模板立即进行PCR反应。Nell-1的引物序列如下：正向引物：5’-CTGTGTGGCTCCTAACAAGTGTG-3’；反向引物：5’-GGATTCTGGCAATCACAAGCTGCT-3’，退火温度60℃，预计产物400bp。内参照β-actin的引物序列：正向引物：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；反向引物：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，退火温度60℃。循环参数为：95℃预变性5分钟，95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物采用2％凝胶电泳紫外灯下观察，与DNALadder Marker对比碱基大小，以出现与预计产物碱基大小相同的片断为阳性。

步骤五、Western blot检测Nell-1基因的蛋白表达  转染后72小时，吸去培养液，漂洗细胞，裂解，移入EP管；振荡后置冰盒中，离心，移上清入另一EP管；加入等体积2％SDS和1M DTT的混合物(SDS∶DTT体积比为4∶1)，充分振荡。变性后立即冷却。配浓度为5％的SDS丙烯酰胺积层胶，6％的SDS丙烯酰胺分离胶，以80V电压在积层胶中电泳，随后以100V电压在分离胶中电泳。聚偏氟乙烯(PVDF)膜预湿，放入电转缓冲液浸泡15分钟，随后将蛋白电泳分离后的凝胶与PVDF膜置入电转系统电转。封闭后孵育一抗。一抗滴度：anti-Nell-1为1∶850的兔抗；内参照anti-β-actin为1∶10000的小鼠抗。二抗：山羊抗兔抗体，滴度1∶3000；山羊抗鼠抗体，滴度1∶1000。以ECL plus化学发光试剂盒显影。

二、Nell-1基因影响大鼠bMSCs成骨分化的体外研究

步骤一、Von Kossa硝酸银法染色  bMSCs接种在6孔板内，每孔接种2×105个。基因转染方法同前。转染21，28天后，细胞以0.1％戊二醛溶液固定，蒸馏水漂洗，加入5％硝酸银溶液，紫外灯下反应，蒸馏水漂洗后加入5％硫代硫酸钠溶液反应，酒精漂洗。观察直径大于0.5mm的钙结节数目。

步骤二、Real-time PCR测定成骨相关基因表达  在基因转染后3天，7天，14天，21天进行总RNA提取纯化及cDNA合成。采用PP5软件设计候选大鼠ALP、BSP、OC、OP和Sox9基因引物，并合成引物序列。采用梯度PCR扩增样品，反转录合成cDNA。在50℃-68℃的范围内选定最佳退火温度，进行PCR扩增。PCR产物采用2％琼脂凝胶电泳紫外灯下观察，与DNA Ladder Marker对比碱基大小，以出现与候选基因碱基大小相同的片段为阳性。实时荧光定量PCR的体系加入96孔反应板后在ABI 7300型荧光定量PCR仪进行扩增。65℃-95℃绘制熔解曲线。所有标本均重复3次检测。检测的临界点设定为PCR反应过程中，荧光信号达到所设定的荧光信号阈值对应的循环数(cycle number at threshold，CT值)处。为了校正标本RNA的质量和反转录效率的差异，将标本检测所得的基因CT值与相对应的GAPDH基因CT值相减来进行标准化。

三、Nell-1基因修饰大鼠bMSCs复合β-TCP材料裸鼠皮下成骨

步骤一、支架材料的处理与细胞复合  β-TCP材料高温消毒备用。与细胞复合前24小时与成骨诱导培养液中浸泡以充分排出孔隙中的气泡。用消毒滤纸吸出孔隙中的培养液后，立即复合。将基因转染3天的bMSCs消化，制成细胞密度为5×10⁷/ml的细胞悬液，缓慢滴加到β-TCP材料至饱和状态，复合后的细胞-支架复合物即刻植入。

步骤二、细胞-支架复合物裸鼠皮下植入  经吸入少量乙醚后，裸鼠腹部注射氯胺酮3mg/0.3ml麻醉，在背部皮下剪开3个约1cm长的切口，以止血钳钝性分离皮下组织，复合物植入，缝合。

步骤三、取材及组织病理学观察  术后4周注射过量戊巴比妥致死，分离材料周围皮下组织，取出移植物，置10％EDTA液脱钙2周，脱水，包埋于石蜡，取圆柱形横断面切片，观察新骨成骨面积。

四、构建组织工程化骨促进颌骨缺损修复

步骤一、大鼠bMSCs培养及基因转染  取Fischer 344大鼠胫骨和股骨骨髓，置于培养条件为37℃恒温混合气体，100％饱和湿度的培养箱中培养。培养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液。细胞生长至70-80％融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，进行基因转染。

步骤二、组织工程化骨的构建  将基因转染3天的bMSCs消化，制成细胞密度为5×10⁷/ml的细胞悬液，缓慢滴加到直径为5mm的圆柱形β-TCP材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。

步骤三、大鼠下颌骨缺损模型创建及缺损修复实验  无菌状态下将成年Fisher 344大鼠麻醉、颌下区备皮、消毒，在大鼠颌下做平行于下颌下缘的切口，切开皮肤，皮下组织和肌肉-骨膜层并翻瓣，暴露下颌骨的颊侧和舌侧骨板。用Kavo高速钻机带5mm外径的钻头在下颌升支制造5mm直径的圆形缺损，过程中始终缓慢注射生理盐水冷却。在钻孔过程中注意对颌骨舌侧软组织的保护，防止伤及翼静脉丛。将bMSCs-β-TCP复合物填充于缺损中。随后以4-0缝线缝合肌肉-骨膜层和皮肤-皮下组织层。

步骤四、取材、组织病理学观察和Micro-CT扫描  将大鼠注射过量戊巴比妥致死，锐性分离软硬组织，以骨剪取出移植物，脱钙、脱水，石蜡包埋、切片、HE染色观察。将样本置于Micro-CT系统的检测试管内，沿颌骨的长轴方向扫描，获取连续的Micro-CT图像。图像高斯滤波后，选取水平面图像信息，并选取能够显示左右两侧缺损区域的3D图像。

实验结果

一、Nell-1基因有效的转染大鼠bMSCs并获得表达

转染后72小时，基因转染效率达到峰值。选取此时间点来测定基因转染的效率。直视下即可以直观地观察到不同转染滴度下转染效率的差异。没有转染LacZ基因的细胞几乎无β-半乳糖苷酶活性，即不被X-Gal染色。在MOI＝80pfu/cell时可获得54.8±4.6％的转染效率(见图1)，在MOI≤160pfu/cell时，基因转染效率随着转染滴度增加而增高。反转录PCR显示，在转染目的基因的泳道中，400bp大小的条带明显。结果表明有Nell-1基因转录水平的表达，而LacZ组和空白对照组未见此条带出现，表明此两组中无Nell-1基因的表达(见图2)。以β-actin蛋白为内参照，进行各组间内参照蛋白浓度一致的蛋白电泳，可见转染目的基因泳道有大小约90kDa的蛋白条带表达，条带的表达随转染滴度的增加而更加明显，显示转染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表达，而LacZ组和空白对照组未见此条带出现，显示对照组无Nell-1基因蛋白水平的表达(见图3)。

二、Nell-1基因转染促进bMSCs的成骨分化

转染后第15日，N组中首先出现钙化结节；第15日至第28日，各组中的钙结节数目逐渐增多，Von Kossa硝酸银染色后，C组和L组钙结节数目少于N组(见图4)。根据Real-time PCR数据分析，N组相对于对照组各成骨相关基因的相对表达存在一定的差异。OC基因第3天时下调，第7天和第14天时上调，但都不明显，21天时表达明显上调，达55.6倍。OP基因表达上调，7天和14天时较显著。BSP基因N组BSP较L组表达明显上调，至14天时为26.2倍，21天时为16.0倍。

三、裸鼠皮下异位成骨

4周后获取标本时，植入处轮廓清晰可见，植入物表面皮肤完整光滑，无积液，伤口无感染，植入物无排出。周围软组织包裹材料，未见异物排斥反应，也未见明显炎症反应。HE染色组织切片见N组可见较多的软骨样和板层骨样组织自支架区向空隙区生长，成骨面积较C组和L组明显，C组和L组支架材料空隙中存在较多的梭形细胞，显示纤维组织结构。(见图5、图6、图7)。

四、构建组织工程化骨促进颌骨缺损的修复

术后8周的Micro-CT可以更加直观的显示N组修复区域密度大于L组，骨质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结合处也更加致密(见图8)。HE染色，成骨面积N组最高。(见图9，图10)。

实施例2

Nell-1与BMP-2基因修饰bMSCs体内成骨的比较

步骤一、细胞的培养和转染及体内实验  基因转染3天的bMSCs用于体内实验，制备细胞密度5×10⁷/ml的细胞悬液，在5-6周大小BALB/c裸鼠大腿肌肉内注射细胞悬液100μl。

步骤二、取材、组织病理学观察、X线观察和Micro-CT扫描  术后4周处死实验动物，并将标本置10％福尔马林固定，高分辨率Micro-CT扫描，μCT Ray T3.3和μCT Evaluation Program V5.0三维重建，最后将标本脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色。

实验结果

术后4周Nell-1基因转染的bMSCs所形成的新骨(E，G)较BMP-2组骨组织更致密(F，H)，(见图11)。

Claims (1)

1.一种组织工程化骨在颌骨缺损修复领域中的应用，其特征在于，所述组织工程化骨由下列方法制得：

(1)Ne11-1基因转染体外培养的bMSCs；

(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料复合构建组织工程化骨，所述的Nell-1基因以MOI＝50～80pfu/cell的工作浓度转染体外培养的骨髓基质细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述生物支架材料是磷酸三钙、多孔羟基磷灰石、珊瑚、藻酸钙、胶原，所述步骤(1)得到的产物是指细胞密度为5×10⁷/ml的细胞悬液。

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