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CN101421303A - 改进的初原纤维选择性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经变性疾病(尤其是阿尔茨海默病)和其它类似疾病的预防、治疗和诊断。更特别地，涉及高亲和力抗体，所述抗体对初原纤维构象的淀粉样β蛋白(Aβ)具有选择性、为IgG类别以及IgG1或IgG4亚类或其组合或其突变、保持高Fc受体结合和低C1(CIq)结合、有效清除Aβ初原纤维并具有降低的炎症风险。

Description

改进的初原纤维选择性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及神经变性疾病(尤其是阿尔茨海默病)和其它类似疾病的预防、治疗和诊断。更确切地，涉及亲和力高达10-7M、优选10-8M、甚至小于10-9M或小于10-10M或10-11M的抗体，所述抗体对处于其初原纤维构象的淀粉样β蛋白(Aβ)具有选择性、为IgG类别和IgG1或IgG4亚类或者其组合或其突变、保持高Fc受体结合和低C1(C1q)结合、有效清除Aβ初原纤维并降低炎症风险。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是引起认知、记忆和行为损伤的一种进行性和不可逆的神经变性病症。它是老年群体中痴呆的最常见原因，影响约5％的65岁以上群体和20％的80岁以上群体。AD特征是多种认知功能的隐袭性发病(insidious onset)和进行性衰退。其神经病理学情况包括胞外和胞内均有嗜银的蛋白性沉积。胞外沉积(称为神经斑)主要由被贫营养神经突(dystrophic neurite)(肿胀、扭曲的神经元凸起)包围的淀粉样β(Aβ)蛋白组成。这些胞外沉积中的Aβ的特征为具有β-折叠片结构的原纤维。这些沉积中的Aβ可以用某些染料例如刚果红染色，并显示原纤维的超微结构。被神经斑中原纤维结构的Aβ采用的这些特征符合通用术语“淀粉样蛋白”的定义。经典的胞内AD病理性损伤是神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)，其由称为配对螺旋丝(paired helical filament，PHF)的丝状结构组成，所述丝状结构由扭曲的高度磷酸化微管相关蛋白τ链组成。如在死后所进行的，脑中多发的神经斑和神经原纤维缠结沉积是AD的诊断标准。AD脑还显示肉眼可见的脑萎缩、神经细胞损失、局部炎症(小胶质增生(microgliosis)和星形细胞增多)和经常出现的脑血管壁中的大脑淀粉样血管病(cerebralamyloid angiopathy，CAA)。
Aβ40和Aβ42这两种Aβ肽形式是AD神经斑中的优势种类，而Aβ40是与AD相关的大脑血管淀粉样蛋白中的优势种类。酶活性使得在健康及患有AD的受试者的所有体细胞中均可以从称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的较大蛋白连续地形成Aβ。两种主要的APP加工事件通过β-和γ-分泌酶活性允许Aβ的产生，而称为α-分泌酶的第三种酶通过在Aβ序列内切割而阻止Aβ生成(Selkoe，1994；Ester 2001；US5604102)。Aβ42是长度为42个氨基酸的肽，即与Aβ40相比在C末端长出两个氨基酸。Aβ42更加疏水，并且更容易聚集为更大的Aβ肽结构(Jarret 1993)如Aβ二聚体、Aβ三聚体、Aβ四聚体、Aβ寡聚体、Aβ初原纤维或Aβ原纤维。Aβ原纤维是疏水和不溶的，而其它结构的疏水程度都较低，并且是可溶的。Aβ肽的所有这些更高级的分子结构基于其生物物理学和结构表观(例如在电子显微术中)及其生物化学特征(例如通过用尺寸排阻层析/Western印迹分析)为基础各自进行定义。这些Aβ肽(尤其是Aβ42)在生命过程中会逐渐聚集成为多种更高级的Aβ分子结构。如果该聚集过程更快速地发生，则强烈依赖于年龄的疾病AD会在生命中更早地发生。这是AD的“淀粉样蛋白级联假说”的核心，该假说主张APP加工、Aβ42水平及其装配成为更高级分子结构是AD的核心原因。AD脑的所有其它神经病理学状况和AD的症状(如痴呆)均以某种方式由Aβ或其聚集形式引起。
Aβ可以以不同的长度(即1-39、1-40、1-42和1-43)和片段大小(即1-28和25-35)存在。可能在肽的N端发生截短。所有这些肽都可以聚集并形成可溶的中间体和不溶的原纤维，各分子形式均具有独特的结构构象和生物物理学特性。例如，单体Aβ1-42是长度为42个氨基酸的可溶且无毒的肽，人们提出它参与正常的突触功能。在某些条件下，Aβ1-42可聚集成为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体直到12聚体和更高的寡聚体形式，它们均具有其独特的物理化学特性，如分子大小、EM结构和AFM(原子力显微术)分子形状。更高分子量的可溶性寡聚体Aβ形式的一个实例是初原纤维(Walsh 1997)，其具有>100kDa的表观分子量和直径4-11nm且长度<200nm的曲线性结构。最近已经证明，可溶性寡聚体Aβ肽(如Aβ初原纤维)损害长时程增强效应(Long-termpotentiation，LTP)，所述长时程增强效应是突触可塑性的一个度量，人们认为它反映了海马体中的记忆形成(Walsh 2002)。另外，寡聚体ArcticAβ肽对脑中的LTP显示比wtAβ强烈得多的抑制作用，可能是由于它们形成Aβ初原纤维的强烈倾向(Klyubin 2003)。
参考文献中还描述了与初原纤维明显不同的其它可溶寡聚体形式。一种这样的寡聚体形式是ADDL(Amyloid Derived Diffusible Ligand，淀粉样蛋白衍生的可扩散配体)(Lambert 1998)。ADDL的AFM分析主要揭示了沿z轴为4.7-6.2nm的小球形种类，其具有17-42kDa的分子量(Stine 1996)。另一种形式称作ASPD(Amyloidspheroid，淀粉样蛋白球)(Hoshi 2003)。ASPD是Aβ 1-40的球状寡聚体。毒性研究显示，>10nm的球状ASPD比较低级的分子形式更具毒性(Hoshi 2003)。这一看法获得了最近发现的北极(E693)APP突变的支持，所述突变引起早发性AD(US 2002/0162129 Al；Nilsberth等，2001)。该突变位于Aβ肽序列内。因此突变携带者会产生Aβ肽的变体，例如北极Aβ40和北极Aβ42。北极Aβ40和北极Aβ42均更容易聚集成为更高级的分子结构，即初原纤维。因此，北极突变的致病机制提示，可溶性的更高级分子初原纤维引起AD并含有特异性独特表位，即“AD疾病表位”。
在阿尔茨海默病(AD)脑中，胞外淀粉样蛋白斑一般可见于实质和血管壁中。该斑块由淀粉样蛋白组成，所述淀粉样蛋白是长度为Aβ38-43个氨基酸的疏水且自聚集的肽，其在斑块沉积之前逐渐聚合。已经提出，可溶性Aβ寡聚体种类是比淀粉样蛋白斑本身更好的疾病相关物(McLean等，1999；
Figure A200780009817D0008094622QIETU
等，2000)。在这些前原纤维中间体Aβ种类中，已经显示寡聚体形式在体外和体内均引起不利的生物效应(Walsh等，2002)，并因此可在疾病发病中起重要作用。已知多种分子大小的若干种寡聚体Aβ种类。重要的是，Aβ的单体、寡聚体和原纤维形式的构象是不同的，并可以被构象选择性抗体所靶向。尽管一些证据提示高分子量Aβ寡聚体特别具有神经毒性，但是主要的Aβ病原体的身份仍不清楚(Hoshi等，2003)。
已经描述了引起早发性AD的淀粉样蛋白前体蛋白(amyloidprecursor protein，APP)基因中的致病突变。其中之一的瑞典APP突变(Mullan等，1992)导致Aβ水平提高。人们发现位于Aβ结构域中的另一种北极APP突变(E693G)增强初原纤维(大Aβ寡聚体)的形成，提示这些Aβ中间体尤其具有致病性(US 2002/0162129 A1；Nilsberth等，2001)。北极APP突变的鉴定和对Aβ初原纤维毒效应的阐明已经提高了人们对AD发病机制中Aβ寡聚体的关注。
主动免疫法作为阿尔茨海默病的一种治疗策略首先由(Schenk等1999)报道。该免疫策略的靶标是阿尔茨海默斑中发现的原纤维形式的Aβ。最近使用原纤维化的Aβ作为疫苗(AN-1792)的主动Aβ疫苗接种临床I期/II期试验不得不停止，因为在少量患者中发生了脑膜脑炎(Bayer等，2005)。在该研究中观察到的副作用很可能是由与血管壁中原纤维淀粉样蛋白反应的抗Aβ抗体引起的。CAA中的原纤维淀粉样蛋白与血脑屏障(BBB)非常接近，因此抗原抗体反应可对BBB产生损伤，导致T-淋巴细胞渗入CNS(Pfeifer等，2002；Racke等，2005)。而且，只有小部分参与的患者展示对Aβ疫苗的免疫应答。尽管该研究过早地结束，但是其似乎暗示着主动Aβ免疫可能仅在AD患者的一些亚群中有益。
已经描述了对人Aβ初原纤维具有选择性的单克隆抗体(US2002/0162129 A1)。产生高度纯净和稳定的人Aβ初原纤维的方法包括使用具有北极突变(Glu22Gly)的合成Aβ42肽。突变有助于免疫和对Aβ初原纤维选择性抗体进行杂交瘤筛选。重要的是，这些抗体与野生型Aβ初原纤维和Aβ-Arc初原纤维均结合(PCT/SE 2005/000993)。
已经描述了对其它Aβ构象如Aβ原纤维(O′Nuallain 2002)、胶束Aβ(Kayed 2003)、ADDL(Lambert 2001)具有选择性的抗体。然而，它们对Aβ初原纤维均不具有选择性。
发明内容
本发明涉及改进的抗体，即IgG类和IgG1或IgG4亚类的高亲和力(小于10-7M)Aβ初原纤维选择性抗体或者其组合或其突变，其具有降低的炎症风险，可用于改善阿尔茨海默病、唐氏综合征或其它神经变性病症的预防、治疗和诊断。所述抗体已经通过经典的杂交瘤技术和抗体工程开发出来。
本发明公开了来自抗体VL和VH链上CDR1-3区的共有氨基酸序列，所述抗体选择性结合寡聚体Aβ形式，即组成“阿尔茨海默病表位”的Aβ初原纤维，该共有氨基酸序列与降低补体因子C1q结合的Fc区修饰组合，降低补体活化和炎症的风险。
抗体的恒定区具有许多重要的功能，值得一提的是结合Fc受体和补体因子C1q。后一功能已经被失活，以避免炎性反应。
总而言之，与已知的其他免疫疗法治疗程式相比，该类型的高亲和力初原纤维选择性抗体具有以下的独特优点：
1)以高亲和力靶向致病的Aβ初原纤维；
2)通过与补体因子C1q低结合或不结合而降低炎性副作用即脑膜脑炎的风险；
3)高亲和力抗体降低了有效治疗所需的临床剂量；
4)提供精确给药的程式；
5)与血管壁中的Aβ原纤维即CAA的结合较少，降低炎性副作用的风险；
6)在外周结合的抗体更少，这样更多的抗体会穿过血脑屏障并可用于结合和清除脑中的Aβ寡聚体形式。
本发明的一个方面是发现了结合人野生型Aβ初原纤维的CDR区的抗体共有氨基酸序列(实施例1)。该发现确定了赋予对野生型人Aβ初原纤维的高亲和力及选择性的结合位点(CDR区)可用作治疗剂或诊断剂。免疫球蛋白(IgG)分子的基本结构包含通过二硫桥连接在一起的两条相同的轻链和两条相同的重链(图1)。轻链(λ或κ)具有各约110个氨基酸残基的可变区(VL)和恒定区(CL)。重链具有约110个氨基酸残基的可变区(VH)，但具有大得多的300-400个氨基酸残基的恒定区(CH)，其包含CHγ1、CHγ2和CHγ3区或结构域。
恒定区(Fc)活化补体系统并与摄入并破坏感染性微生物或外源/非自身抗原的巨噬细胞、小胶质细胞和嗜中性粒细胞上的Fc受体结合。该功能是特别重要的，因为它是抗体治疗原理(即Fc受体介导的小胶质细胞吞噬作用和Aβ初原纤维的清除)的一部分。根据汇聚假说(sinkhypothesis)，其它抗体介导的清除机制也在进行，即Aβ抗体的抗聚集特性和外周的Aβ初原纤维清除。重链和轻链的可变区含有3个称为互补性决定区或CDR的高变区。CDR区是位于VL和VH区中的长度约13-23个氨基酸的小段。抗体一条“臂”上的六个CDR区形成了结合抗原的“袋”。图1显示了IgG免疫球蛋白的基本结构及其亚结构域。
本发明的另一方面涉及高亲和力的初原纤维选择性抗体。描述了在10-7M、优选10-8M、甚至小于10-9M、小于10-10M或小于10-11M范围内的对初原纤维的亲和力(实施例2)。这些抗体具有下述优点：与具有10-6M范围内亲和力的抗体相比，它们能够以更低的剂量施用。这具有显著的临床优点，即通过注射施用的这些高亲和力的抗体可以皮下给药，因为仅需要少量的抗体就可获得效力。给药程式不仅限于皮下注射。另外，效力所需的更低剂量会降低用于制造抗体的货物成本。本发明的另一方面是该抗体为IgG类，适用于治疗用途，因为它可穿过血脑屏障。可以通过Fc受体介导的小胶质细胞吞噬作用来实现脑实质中Aβ初原纤维的清除。其它抗Aβ清除机制也有可能起作用。这种可溶性Aβ初原纤维的清除是治疗的中心机制。Aβ初原纤维被认为是高度神经毒性的，起始并驱动疾病过程。脑中Aβ初原纤维的清除具有重大的临床价值。除了清除Aβ初原纤维以外，其它Aβ寡聚体形式(包括Aβ原纤维)会通过去除Aβ初原纤维而间接减少，因为不同的Aβ聚集形式(即二聚体、三聚体、四聚体和更高级的寡聚体形式，包括初原纤维和原纤维)处于平衡中。含有Aβ原纤维的斑块减少的例子在用高亲和力初原纤维选择性抗体(mAb 158)处理72小时后的阿尔茨海默转基因小鼠模型(APPswe)中展示(实施例3)。因此，通过所述抗体清除Aβ初原纤维还具有间接减少其它Aβ聚集形式或寡聚体形式的优点。
本发明的又一方面是IgG1亚类的高亲和力人Aβ初原纤维选择性抗体，其对存在于脑中小胶质细胞上的人FcγRI受体具有高亲和力。高亲和力抗体会导致Aβ初原纤维的有效清除，这具有重大的治疗价值。因此，与其它免疫治疗策略(如主动疫苗接种或者用靶向其它Aβ形式的其它IgG1亚类单克隆抗体进行单克隆抗体治疗)相比，所述抗体显示CNS和外周的Aβ初原纤维均被清除。重要的是，该治疗在毒性可溶Aβ种类(如Aβ初原纤维)以升高的水平存在的疾病早期进程中以及疾病晚期进程中均有效。已经在显示瑞典和北极突变的转基因小鼠模型APPswearc中描述了寡聚体Aβ形式水平的升高(Lord A.等2006)。本发明的又一方面是，高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体能够减少或抑制Aβ聚集，从而降低脑中可溶性寡聚体Aβ形式的水平。
本发明的又一方面是，高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体同样能够结合寡聚体形式的Aβ，即CNS外的Aβ初原纤维，从而使所述Aβ形式在血脑屏障两侧的平衡发生偏移，以降低所述Aβ形式的CNS水平(引流法)。
如上所述，使用对Aβ初原纤维具有选择性的Aβ疫苗(AN-1792)治疗阿尔茨海默患者的Elan临床研究在6％的病例中导致副作用，即脑膜脑炎。靶向Aβ原纤维的策略导致严重的副作用，Aβ原纤维是存在于脑实质中的淀粉样蛋白斑的核心，但重要的是它也存在于血管壁中。副作用很可能是由抗体与脑血管壁中的CAA(大脑淀粉样血管病)结合而引起的，这起始了炎性过程。通过补体活化活性降低的改进的高亲和力初原纤维选择性抗体而避免了这一重要的临床问题。这些抗体会保持Aβ初原纤维的高清除效力，而降低副作用(即脑膜脑炎)风险。
本发明的另一方面是，高亲和力初原纤维选择性抗体具有低Aβ原纤维结合(见实施例2)，这样由于与CAA中所存在的Aβ原纤维的结合更少而降低了副作用的风险。
本发明的又一方面是，对高亲和力Aβ初原纤维选择性IgG抗体进行改造，以减少补体因子C1q与IgG1中CH2结构域的结合，并降低补体活化和炎症风险。该修饰可以以若干种不同的方法进行。一种方法是制造嵌合抗体，其中IgG1恒定区的CHγ2结构域被缺失，并更换为来自IgG4的相应结构域或该结构域中赋予C1q结合的部分。已经很明确的是，IgG4不结合C1q，因此不激活补体级联。为此，以下述方式工程改造重链(CH)的恒定区，从而将IgG1上的高亲和力Fc受体结构域(CHγ3)与不结合补体因子C1q的IgG4结构域(CHγ2)组合。含有嵌合恒定重链(IgG1:CHγ1，CHγ2:IgG4，CHγ3:IgG1)的这种新抗体会同时具有下述两种重要的特性：通过Fc受体介导的吞噬作用有效清除Aβ初原纤维以及降低副作用(即炎症如脑膜脑炎)的风险。
降低炎症风险的又一方法是改变抗体的寡糖结构，这会降低补体因子C1q结合和补体活化。已经描述了人IgG1中Asn-297处复杂的双天线寡糖的30种不同的结构。人们相信，与CH2结合的碳水化合物的缺失会引起抗体“铰链”区的构象改变，降低了与效应分子的相互作用效力，并丧失了补体活化功能和C1q结合。
通过将Asn-297定点诱变为任何其它氨基酸而对高亲和力人Aβ初原纤维选择性抗体进行修饰会产生保留Fc受体结合而C1q结合更少的抗体，因此使炎症风险(尤其是在血脑屏障处)降低。修饰抗体糖基化的替代方案是在N-乙酰葡糖胺基转移酶I已经失活的细胞类型中表达抗体。这会产生Asn-297的碳水化合物结构发生改变的抗体。形成了Man5GlcNAc2结构，但不仅限于该结构。这种碳水化合物修饰会降低补体因子C1q结合并抑制炎症(Wright等1998)。或者，可以通过在抑制糖基化的衣霉素存在下培养表达抗体的细胞来产生糖基化的初原纤维选择性抗体。这些抗体会具有改变的补体活化活性以及改变的Fc受体功能(Leatherbarrow el al.1985)。筛选表达具有低补体活性和高Fc受体结合的抗体的克隆会产生显示高Fc-介导的Aβ初原纤维清除和低C1q结合的初原纤维选择性抗体。
本发明的又一方面是用于治疗或预防AD的IgG1亚类高亲和力人Aβ初原纤维选择性抗体，其中补体因子C1q结合位点已进行了修饰，即Pro331>Ser331，以降低或抑制补体因子C1q的结合(Xu等1994)。人IgG1中的331位脯氨酸残基也可以更换为苏氨酸或甘氨酸或任何其它极性氨基酸。这种修饰可以通过标准分子生物学技术如定点诱变或DNA缺失来实现。
本发明的又一方面是高亲和力人Aβ初原纤维选择性IgG抗体作为阿尔茨海默病的诊断工具或生物标记物而用于特异性测定人组织中、尤其是脑脊液(cerebrospinal fliud，CSF)、血、尿或唾液中初原纤维水平的用途。CSF或血中的人Aβ初原纤维水平很可能与未患阿尔茨海默病的匹配老年对照组存在差异。发生阿尔茨海默病的人很可能在CSF或血中具有提高的Aβ初原纤维水平。因此，通过测定CSF或血中的Aβ初原纤维水平可以进行疾病的早期诊断。这有可能用新的高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体与夹心ELISA法组合来实现(实施例2A)，其中已经测定了低至10pM水平的Aβ初原纤维。该测定法中的其它Aβ形式如Aβ原纤维、Aβ单体和Aβ片段(1-16；17-40)的干扰为10％或更低。
本发明还涉及高亲和力初原纤维特异性抗体用于在人和动物组织例如脑脊液、血、血清、尿和脑组织(但不限于这些组织)中测定Aβ初原纤维的用途，这提供了可能的阿尔茨海默病诊断方法。在这些组织以及细胞培养物中使用抗-Aβ初原纤维抗体测定Aβ初原纤维的合适方法是免疫测定法，如ELISA、RIA、Western印迹或点印迹。所述方法将适于追踪临床试验中的治疗效力(初原纤维减少)，并适合用作阿尔茨海默病或唐氏综合征的诊断测试。
因为CSF和血中的Aβ初原纤维水平非常低，因此在基于ELISA方法的诊断测试中需要高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体才能够测量低水平的Aβ初原纤维。可使用其它超高灵敏度的方法如邻位连接(proximity ligation，实施例4)(Gullberg 2004)或类似的扩增体系或者Biacore或类似技术来提高灵敏度。邻位连接技术是以下述发现为基础的：针对分析物(在该情况下为蛋白质)上不同表位产生的不同抗体可在所述分析物上彼此邻近地结合。如果所述不同的抗体与寡核苷酸缀合，则所述寡核苷酸之间的距离对连接体寡核苷酸而言将短至足以在连接组分的帮助下在该寡核苷酸之间形成桥。还添加了扩增组分，可通过其进行RT-PCR。通过这一原理产生了反映靶蛋白的身份和量的可扩增DNA序列。该技术使得有可能获得增强的信号应答，从而检测更低浓度的分析物。
本发明人令人惊奇地发现，改进的邻位连接技术也可以与其Aβ初原纤维特异性抗体一起使用，以检测低浓度的更大的Aβ肽结构(即Aβ初原纤维)而非Aβ单体。他们发现初原纤维构象的Aβ肽显示下述结构(重复单元)，所述结构使得两个本发明抗体有可能在初原纤维上彼此足够接近地结合。如果所述抗体与寡核苷酸缀合，则可以使用连接体寡核苷酸将所述寡核苷酸桥接。使用扩增组分进行PCR。通过该原理产生了反映靶初原纤维的身份和量的可扩增DNA序列(见图4A)。
邻位连接或该技术称作“滚环(rolling circle)”的形式是高度灵敏的技术，尤其适用于检测具有重复序列的多聚体结构，例如要用于诊断阿尔茨海默病和其它神经变性病症的Aβ初原纤维。
本发明还涉及高亲和力初原纤维特异性抗体在人和动物组织中为对Aβ初原纤维检测、定位和定量而进行成像的用途。就检测目的而言，抗体可以用放射性配体如I131、C14、H3或镓68标记，但不仅限于这些放射性同位素。该方法将适合用作阿尔茨海默病或唐氏综合征的诊断工具。
本发明的又一方面是制造特别用于兽医学中的抗体种类。所述诊断方法也适用于兽医用途。
本发明的另一方面是对所述抗体进行人源化以避免副作用，即避免在人中用作治疗或诊断剂时针对所述抗体的免疫应答。
又一方面是适用于施用给人和动物的抗体在生理缓冲剂(如PBS，但不仅限于PBS)中的制剂。该抗体制品可以为了更好的稳定性而被冻干。冻干的制剂可含有赋形剂(如甘露醇但不仅限于甘露醇)，以在冻干后稳定产物。
抗体制品可含有抗菌剂。
本发明的抗体或片段可在所述CDR区和/或其构架中显示氨基酸缺失、替换和插入。插入或用于替换的氨基酸也可以是氨基酸衍生物，条件是抗体的亲和力和特异性仍然是完整的。
实施例
提供以下的实施例用于说明，而不是旨在将本发明限制在这些具体的实施例。
实施例1
克隆并测序人野生型Aβ初原纤维选择性单克隆抗体。可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)的氨基酸序列示于表1。CDR区1-3的位置标有下划线，并且还示于表2和表3。CDR区的氨基酸序列形成结合人野生型Aβ初原纤维的结构基础，构成了“阿尔茨海默病表位”。
高亲和力初原纤维特异性抗体BA9/158的VL及VH链的CDR区1-3的氨基酸序列示于表1、2和3。其它初原纤维选择性抗体(BA2、BA3、BA4和BA7)的测序数据提供了CDR区的替代氨基酸序列，但不仅限于此。VH和VL链CDR1-3区的组合氨基酸序列产生了以高亲和力及特异性与人Aβ野生型初原纤维结合的分子“袋”。该“袋”形成了“阿尔茨海默病表位”的结构基础。在两条VH链中均观察到CDR氨基酸序列长度的变异，且VL链与人Aβ初原纤维相容性结合(表2和3)。更短的CDR区提供了更受限制的抗体结合袋三维结构，而更长的则更灵活。
我们要求保护如表1、2和3中所示的CDR序列，以及如表4和5中所示的初原纤维特异抗体VH和VL链“小鼠构架”区(即CDR区外)中以及人VL和VH构架区的氨基酸序列，但不仅限于此。来自高亲和力初原纤维特异抗体BA9/158的VL和VH链的VL和VH区1-3的构架区氨基酸序列示于表4和5。
除表1、2和3中所示之外的其它CDR区中的氨基酸替换与对人野生型Aβ初原纤维的高亲和力和高特异性结合是相容的。当极性氨基酸存在于CDR区的特定位置时，该特定氨基酸可以被另一极性氨基酸替换，而保留或改进对Aβ初原纤维高亲和力和特异性的结合。类似地，如果在某个位置上存在非极性或带负电荷或正电荷的氨基酸，则该氨基酸可以被来自同一组的类似氨基酸替换。
另外，可以用赋予抗体相似功能和结构的功能等价物来交换CDR区任何位置中的特定氨基酸。
实施例2.通过ELISA表征高亲和力人Aβ野生型初原纤维选择性单克隆抗体
实施例2显示了高亲和力初原纤维选择性的抗体，如通过夹心ELISA所测量的，该抗体与Aβ单体的交叉反应低200-1000倍，与Aβ原纤维的交叉反应低40倍(图2A)。根据竞争性ELISA实验，该抗体对人Aβ42野生型初原纤维具有强亲和力，但是对Aβ肽的N端部分和Aβ单体仅具有非常弱的亲和力。未观察到与Aβ C端的结合(图2B)。另外，该抗体与其它类型的淀粉样蛋白(如medin或运甲状腺素蛋白)不交叉反应。另外，该抗体不识别最丰富的Aβ前体——人APP。
图2A展示了夹心ELISA。用抗体158包被孔，随后以递增的浓度向孔中添加不同的Aβ形式。通过添加生物素化的mAb 158和HRP标记的链霉亲和素来测量结合的Aβ形式。根据制造商推荐的方法测量显色。
图2B展示了竞争性ELISA。用人Aβ初原纤维包被ELISA平板。随后将抗体158与递增量的不同Aβ形式一起孵育(竞争)。向微量滴定板孔中添加孵育混合物并允许游离的抗体与孔中固定的初原纤维结合。使用标准步骤通过第二抗体测量结合的158抗体。
实施例3
在阿尔茨海默转基因小鼠模型(APPswe)中通过急性颅内注射来测定高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体的效力。用于效力评估的转基因小鼠表达带有瑞典突变的人APP(APPswe)。在该范例中，将抗体直接注射进脑实质中富含斑块的区域中，并在72小时后评价对神经病理学情况的影响(Wilcock等，2003)。其它研究显示，直接应用抗Aβ抗体在体内导致淀粉样沉积的快速清除(Bacskai等，2001；Brendza等，2005)。高亲和力Aβ初原纤维选择性抗体的注射在APPswe小鼠模型中引起斑块的显著减少(图3)。
在图3中，测试了高亲和力初原纤维选择性抗体在转基因小鼠模型(APPswe)中的治疗效力。14月龄的APPSwe转基因小鼠被颅内注射A：PBS和B：1μg/μl高亲和力初原纤维选择性抗体(158)，并在注射后72小时检查。与对照侧(A；箭头)相比，在注射部位(B；箭头)附近的下托中可注意到显著的Aβ负荷清除。
实施例4
将邻位连接与高亲和力初原纤维选择性抗体组合用于测量Aβ初原纤维。检测到低至10pM-范围的人野生型Aβ初原纤维，而完全检测不到Aβ单体制备物。高度灵敏的邻位连接方法与高亲和力抗体的组合是尤其有利的，因为其提供了仅测定分析物的寡聚体形式的系统，这尤其适用于诊断阿尔茨海默病和其它蛋白质“聚集”疾病如朊病毒病、克-雅病、淀粉样变和帕金森病。
在图4中，通过邻位连接技术测量pM水平的人Aβ初原纤维。邻位连接测定法：方法描述(来自Gullberg等，2004)：步骤1，将样品与邻位探针对一起孵育(～1h)；步骤2，添加连接所需的所有组分并通过定量PCR检测(≈5分钟连接时间)。在该测定法中使用高亲和力初原纤维选择性单克隆抗体；步骤3，定量PCR(≈2h)。稀释合成的Aβ单体和Aβ初原纤维制备物并在上述邻位连接测定法中测试它们的反应性。
实施例5
mAb 158不识别一般性淀粉样蛋白表位。
已经显示，先前报道的Aβ构象依赖型抗体结合其它淀粉样蛋白前体蛋白(amyloidogenic protein)的寡聚体和原纤维，提示了存在于所有淀粉样蛋白质聚集体上的共同表位。由于从除Aβ外的其它淀粉样蛋白前体蛋白产生初原纤维在技术上有困难，改为针对不同的淀粉样蛋白原纤维来测试mAb158。对这些实验使用斑点印迹测定法，因为在溶液中发生抗体-抗原反应的抑制性ELISA不适用于不溶性抗原如原纤维。然而，斑点印迹测定法不适用于评价针对多种Aβ形式的抗体特异性，即不适用于测量针对初原纤维和原纤维的选择性差异。将medin、胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP)和α-突触核蛋白的原纤维固定在硝酸纤维素膜上，以维持其天然构象。mAb158不对除Aβ原纤维之外的任何淀粉样蛋白显示反应性(图5A)。mAb158与Aβ原纤维的结合提示，Aβ初原纤维表位的一部分也存在于Aβ原纤维结构中。使用抗体6E10(Aβ)、pAb179(medin)、pAbA110(IAPP)和mAb211(α-突触核蛋白)作为阳性对照(图5B)。代表性的印迹来自重复实验(n＝3)。
mAb158不结合APP
APP和可溶性APP片段的水平通常超过生物样品(如CSF和脑匀浆)中的Aβ水平，因此Aβ抗体与APP的交叉反应性可通过与APP结合而抑制治疗，使用于结合和消除Aβ初原纤维和/或Aβ寡聚体的游离抗体更少。它还可破坏通过Aβ的夹心ELISA来测量生物样品中的Aβ初原纤维。为了阐明mAb158是否结合天然APP，进行了免疫沉淀实验。用mAb158或6E10免疫沉淀HEK细胞培养基(模拟实验、APPswe和APPArc-Swe)和小鼠脑匀浆(非转基因的、APPswe和APPArc-Swe)，然后用6E10作为检测抗体来进行变性Western印迹(图5C)。如在图5C中所见，mAb158不免疫沉淀来自细胞培养基的αAPP或来自小鼠脑匀浆的全长APP，而6E10如所预计的一样免疫沉淀αAPP或APP。两种抗体均同样免疫沉淀用作对照的合成Aβ初原纤维(图5C)。代表性的印迹来自重复实验(n＝3)。
实施例6
建立Aβ初原纤维特异性夹心ELISA。为了能够测量生物样品中的Aβ初原纤维，建立捕获和检测抗体均为mAb158的夹心ELISA。该测定法以1pM的检出限和高至250pM的线性范围测量Aβ初原纤维(图6A，线条表示标准曲线的线性回归)。由于标准曲线中所使用Aβ初原纤维大小的不确定性，浓度1pM以一个Aβ单体的分子量(4514g/mol)为基础。但是，由于估计初原纤维的分子量至少为100kDa，因此以摩尔Aβ初原纤维计算的检出限可低至50fM。AβArc初原纤维的标准曲线给出低于野生型Aβ初原纤维的信号，可能是由于Aβ初原纤维大小的差异(图6A、6B)。被滴定的合成LMW-Aβ(低分子量Aβ)。术语“低分子量Aβ”表示具有约4-12kDa分子量的Aβ单体、二聚体和三聚体。将Aβ初原纤维和Aβ1-16用于验证ELISA的构象特异性(图6B)，其中使用亲水性的Aβ1-16肽，因为预计其不会聚集。由两种相同抗体组成的ELISA需要蛋白质的至少二聚体来产生信号，如所预计的，用mAb158夹心ELISA甚至没有检测到μM浓度的Aβ1-16(图6B)。当用已知将聚集Aβ解离为单体的70％甲酸(FA)预处理LMW-Aβ和Aβ初原纤维时，夹心ELISA失去信号(数据未显示)。因此，在高nM浓度下对LMW-Aβ的检测(图6B)可能是由于肽制剂中含有少量聚集体。
生物样品中天然存在的远过量的单体Aβ、holoAPP和APP片段可通过占据捕获抗体覆层的结合位点从而抑制初原纤维结合而干扰Aβ初原纤维分析。通过以下步骤研究这一问题：向固定浓度的Aβ初原纤维(50pM，以单体单位表示)中添加递增的过量Aβ 1-16，并用mAb158ELISA和6E10-6E10夹心ELISA二者对其进行分析(图6C)。如所预计的，与Aβ初原纤维相比500000倍摩尔数过量的Aβ 1-16不破坏使用mAb158夹心ELISA进行的测量，因为Aβ 1-16与捕获抗体结合很差。相反，500倍过量的Aβ 1-16足以降低6E10-6E10 ELISA的信号，其中Aβ 1-16以高亲和力与捕获抗体结合(图6C)。另外，将合成的Aβ初原纤维添加至模拟的HEK细胞培养基中或非转基因小鼠的脑匀浆中时，90％的信号被恢复(数据未显示)。
实施例7
测量生物样品中的Aβ初原纤维。
已经提出，带有北极(Arctic)突变的细胞和小鼠模型中存在Aβ初原纤维，尽管直到现在仍没有直接测定生物样品中Aβ初原纤维的方法。因此，mAb158夹心ELISA第一次提供了在这类细胞和小鼠模型中测量Aβ初原纤维水平并将其与不含该内部Aβ突变的模型进行比较的可能性。将来自仅带有瑞典突变的细胞和小鼠中的样品与野生型Aβ初原纤维标准曲线比较，而来自表达具有北极突变的Aβ的细胞和小鼠中的样品与AβArc初原纤维标准曲线比较(图6A)。为了确保在该测定法中测量的所有Aβ均处于可溶状态，并且排除任何来自Aβ原纤维的可能的干扰，在分析之前将所有的样品以17900×g离心5分钟。分析来自瞬时转染APPswe和APPArc-swe的HEK-细胞的细胞培养基组，并与模拟实验的HEK细胞培养基比较。根据标准曲线(图6A)将Aβ初原纤维水平计算为一式三份的均值，然后对APP水平标准化，以补偿转染水平的差异(根据Stenh等)。APPArc-swe HEK-细胞培养基中的Aβ初原纤维浓度为28pM(±2)，显著地高于(p<0.0001)APPswe中观察到的8.2pM(±0.3)(图7A)。在模拟实验的培养基中未检测到Aβ初原纤维。还在来自10月龄APPArc-swe和APPswe的转基因小鼠的脑中测量Aβ初原纤维水平，所述小鼠具有斑块并且还具有神经元内Aβ病理情况(根据Lord等)。在分析前在TBS中将脑匀浆并离心，以回收可溶性Aβ级分。与使用细胞培养基进行的分析相似，Aβ初原纤维水平在组之间存在显著(p＝0.005)差异：APPArcSwe中为397pM(±59)，APPswe转基因小鼠脑中为108pM(±14)(图7B)。
在上述图(图6和7)中，样品数为：模拟细胞(n＝3)，用APPswe和APPArc-swe瞬时转染的分别为(n＝8)和(n＝11)。APPArc-Swe培养基中的Aβ初原纤维水平约为APPswe培养基中的9倍，而模拟培养基无信号(A)。将非转基因小鼠脑匀浆(n＝6)中TBS可溶性级分中Aβ初原纤维水平的测量与转基因小鼠(APPswe，n＝3，和APPArc-swe，n＝6)进行比较(B)。与细胞培养基相似，APPArc-Swe小鼠的Aβ初原纤维水平约为APPswe小鼠的7倍。误差条显示±SEM。
实施例8
腹膜内给药后mAb158显著降低APPswearc转基因小鼠中的Aβ初原纤维和总Aβ
在18周中每周一次对9-10月龄APPswearc小鼠腹膜内注射mAb158(12mg/kg)。研究后，分离脑并在TBS中匀浆，随后离心以沉淀不溶材料。将不溶材料在甲酸中增溶。这样，从小鼠脑得到两种级分，即TBS级分和甲酸级分。通过ELISA测定TBS级分中的Aβ初原纤维水平。与安慰剂组相比，在mAb158处理组中可见Aβ初原纤维显著减少(图8)。图8显示用mAb158或安慰剂处理4个月后APPswearc转基因小鼠脑TBS提取物中的Aβ初原纤维水平。
通过ELISA测定甲酸级分中的总Aβ(甲酸被用于增溶所有的Aβ形式，从而使得所有的Aβ形式均可检测)。与安慰剂组相比，在处理组中观察到总Aβ的显著减少(图9)。图9显示用mAb158或安慰剂处理4个月后APPswearc转基因小鼠脑甲酸提取物中的总Aβ水平。
实施例9-11
缩写
A                腺嘌呤
Ab方案           AERES生物医学方案
BHK              幼仓鼠肾
bp               碱基对
C                摄氏度
C                胞嘧啶
CHO              中国仓鼠卵巢
CMF              不含钙和镁
COS 7            非洲绿猴肾成纤维细胞系
dhfr             二氢叶酸还原酶
DMEM             Dulbecco改进的Eagles培养基
DMSO             二甲亚砜
DNA              脱氧核糖核酸
ELISA            酶联免疫吸附测定
FCS              胎牛血清
g                克
G                鸟嘌呤
hr               小时
HRP              辣根过氧化物酶
IgG              免疫球蛋白
K                G或T(IUPAC规则)
LSAP            大可溶性淀粉样蛋白产物(Large Soluble Amyloid
                Product)
mAb             单克隆抗体
sec             秒
min             分钟
M               A或C(IUPAC规则)
MTX             氨甲喋呤
NIMR            国家医学研究所(UK)
nm              纳米
OD              吸光度
PBS             磷酸盐缓冲盐水
PCR             聚合酶链式反应
R               A或G(IUPAC规则)
RT              室温
S               C或G(IUPAC规则)
T               胸腺嘧啶
UV              紫外线
V               可变的
V               A或C或G(IUPAC规则)
VH              免疫球蛋白重链可变区
VK              免疫球蛋白κ轻链可变区
W               A或T(IUPAC规则)
Y               C或T(IUPAC规则)
材料
设备
Figure A200780009817D00231
塑料耗材
Figure A200780009817D00232
免疫学和分子生物学试剂
Figure A200780009817D00241
来自国家医学研究所的溶液
 
溶液名称： 组分 量
PBS‘A’Dulbeccos(无钙&镁) NaClKClNa2HPO4KH2PO4水     8g0.2g1.15g0.2g1L
LB 细菌用胰蛋白胨酵母提取物NaCl水             10g5g10g1L 
LB琼脂 LB琼脂(Difco) 1L15g
培养试剂
 
物品 UK供应商 目录号 批号 有效期
含有GlutaMAXTM I、4500mg/L D-葡萄糖、丙酮酸钠的DMEM(1X)Dulbecco改进的Eagle培养基(高葡萄糖)    Invitrogen 41966-047 9206 07/07
DMSO(二甲亚砜) Sigma D2650 125K2409 12/07
青霉素&链霉素 Invitrogen 15070-063 1298401
血清：Fetal Clone I PerbioScience SH30080 AMM17779     12/07
SOC Invitrogen 15544-034 1306051
台盼蓝 Sigma T8154 19H2388
胰蛋白酶-EDTA溶液，经细胞培养测试，0.25％  Sigma T4049 48K2342 04/08
实施例9-158抗体的DNA序列
9.1-RNA制备
在2006年10月3日通过TAG收到了小鼠杂交瘤158的速冻细胞沉淀(有标签的管060824#158 5×106个细胞)。将这些细胞冷冻保存，直到根据制造商方案使用Qiagen RNeasy Midi试剂盒进行处理以分离RNA。
9.2-第1链合成
使用Amersham Biosciences第1链合成试剂盒，根据制造商方案对约5微克158 RNA进行逆转录，以产生158 cDNA-重复该过程以产生3种独立的cDNA产物(第1、2和3轮)，从而避免因RT反应引起的DNA突变。
9.3-克隆158免疫球蛋白的cDNA
在23个独立的反应中通过PCR扩增杂交瘤158 cDNA。使用11种VK引物(MKV1-11)与κ恒定区引物MKC(表6)组合，来扩增免疫球蛋白κ链可变区(VK)cDNA。类似地，使用12种不同VH引物(MHV1-12)与四种IgG恒定区引物(MHCG 1/2a/2b/3：表7)的混合物组合，通过PCR扩增IgG重链可变区(VH)cDNA。
第一组IgH PCR反应的结果是使用MHV5引物的单一扩增产物。其它11种引物对均未产生PCR产物。使用TOPO-TA 
Figure A200780009817D00261
试剂盒将由寡核苷酸引物MHV5+(MHCG 1/2a/2b/3混合物)所引发PCR反应的产物连接进
Figure A200780009817D00262
Figure A200780009817D00263
载体。第一组IgK PCR反应的结果是使用引物MKV1和MKV2与MKC的两种单一扩增产物。其它9种引物对均不产生产物。使用TOPO-TA 
Figure A200780009817D00264
试剂盒将由寡核苷酸引物：MKV1或MKV2+MKC所引发PCR反应的产物连接进
Figure A200780009817D00265
Figure A200780009817D00266
载体中。通过挑取在琼脂网格上和PCR筛选混合物中，在LB/氨苄西林/X-gal琼脂平板上克隆以连接载体转化的大肠杆菌TOP10。通过PCR扩增来筛选克隆的质粒插入片段。对PCR产物进行凝胶电泳并鉴定产生正确大小PCR扩增产物(约500bp)的克隆。使用QIAprep Spin小量制备试剂盒方案处理各克隆的过夜培养物(5ml)，得到DNA质粒的小量制备物。
9.4-cDNA序列测定
重复进行RT-PCR、克隆和DNA序列分析的完整循环，以对每个免疫球蛋白链得到三个完全独立的序列信息集。使用1212和1233引物(表10)在两个方向上对来自各个RT-PCR反应组的质粒克隆进行测序。质粒使用
Figure A200780009817D00271
 Terminator v3.0循环测序即用型反应试剂盒(ABI)进行测序，在GeneAmp9600 PCR机器上循环并在ABI 310毛细管测序仪上分析。
9.5-158 VK DNA序列
使用PCR引物MKV2和MKC在第一链cDNA第1和第2轮中产生的VK克隆的序列与来源于骨髓瘤融合配偶体(如MOPC-21、SP2和Ag8)的不表达κ转录物相同。这是一种不表达转录物。使用PCR引物MKV1和MKC在第1链cDNA第1-3轮中产生的VK克隆的共有序列(158VK)示于表11。这是一种功能重排。表11了显示与表1、4和5中所示序列的一些差异。这些差异位于PCR引物所定位的FW1区中。不被我们的引物编码的与158VK中前导片段最为相同的小鼠VK前导序列为K5.1#(表12)。对信号肽正确切割#K5.1信号序列的预测通过预测程序来实现。最可能的预测切割位点正确地位于氨基酸残基19和20之间(表13)。嵌合158VK蛋白及DNA序列示于表14。
9.6-158 VH DNA序列
使用PCR引物MHV5和MHCG1/2a/2b/3混合物在第1链cDNA第1-3轮中产生的VH克隆的共有序列(158VH)示于表15。与158 VK一样，表1、4和5中所示FW1序列存在一些差异。不由我们的引物编码的与前导片段最相同的小鼠VH前导序列为NL-1(表16)。
实施例10-构建嵌合表达载体
嵌合表达载体的构建需要向VH和VK中添加合适的前导序列，之前是Hind III限制性位点和Kozak序列。Kozak序列(表8)确保可变区序列的有效翻译。其定义了核糖体能够起始翻译的正确的AUG密码子，最关键的碱基是AUG起点上游-3位的腺嘌呤。前导序列选择为Kabat数据库中最相似的小鼠前导序列。在正向引物(表9)中编码这些添加物。另外，嵌合表达载体的构建需要引入与158 J区的3’端相连的人γ1恒定区的5’片段(上至天然的Apa I限制性位点)。CH在表达载体中被编码在所插入VH序列的下游，但是缺少V-C内含子。对于轻链而言，天然的剪接供体位点(表8)和Bam HI位点被添加在V区下游。剪接供体序列有助于剪接除去κ V：C内含子，该内含子对VK至恒定区的框内结合是必需的。分析小鼠VH和VK基因以鉴定任何不需要的剪接供体位点、剪接受体位点、Kozak序列以及任何额外的亚克隆限制性位点的存在，它们随后会干扰功能性完整抗体的亚克隆和/或表达。在本实验中没有发现。
10.1-表达载体
根据制造商的方案，使用Qiagen Maxi试剂盒纯化表达载体pKN100和pG1D200的质粒DNA制备物。使用QIAGEN Plasmid Midi和Maxi试剂盒，从以其中任一载体转染的TOP10细菌的500ml培养物中进行质粒DNA纯化。载体图如图10和11中所示。
10.2-轻链嵌合引物
将小鼠前导序列K5.1#整合进嵌合158 VK的设计中。引物被设计为产生这样的PCR产物，其含有该完整前导序列和158 VK，以及用于克隆进pKN100表达载体中的末端限制性位点Hind III和Bam HI(表9)。正向引物158vl引入Hind III限制性位点、Kozak位点和K5.1#前导序列。反向引物158vlrev引入剪接供体位点和Bam HI限制性位点。
10.3-重链嵌合引物
将前导序列NL-1整合进嵌合158VH的设计中。引物被设计为产生这样的PCR产物，其含有该前导序列和158 VH区，以及用于克隆进pG1D200表达载体中的末端限制性位点Hind III和Apa I。这些在表9中展示。正向引物158vh引入Hind III限制性位点、Kozak翻译起始位点和NL-1前导序列。反向引物158vhrev引入γ1 C区的5’端和天然的Apa I限制性位点。对VK的K5.1前导序列的信号肽切割位点的预测示于表17。
10.4-产生嵌合158VH构建体：pG1D200158VH
用引物158vh和158vhrev(表9)扩增158VH DNA片段。将450bp(约)PCR产物T-A连接进载体pCR2.1中，并用于转化化学感受态TOP10细菌。通过正确的插入片段大小来选择克隆，并使用1212引物(表10)测序。将正确的表达插入片段亚克隆进pG1D200表达载体中，并通过使用引物BDSH61R(表10)的DNA测序来选择正确的亚克隆。将该克隆在200ml培养基中培养，以使用Qiagen Maxi Kit根据制造商方案产生质粒DNA。嵌合158VH的蛋白质和DNA序列示于表18。
10.5-产生嵌合158VK构建体：pKN100158VK
用引物158vl和158vlrev(表9)扩增158VK DNA片段。将450bp(约)的PCR产物T-A连接进载体pCR2.1中，并用于转化化学感受态TOP10细菌。通过正确的插入片段大小来选择克隆，并使用1212引物(表10)测序。将正确的克隆亚克隆进pKN100表达载体中。通过筛选插入片段大小和使用引物Hu-K2(表10)进行DNA测序来选择正确的亚克隆。将该克隆在200ml培养基中培养，以使用Qiagen Maxi Kit根据制造商方案生产质粒DNA。
实施例11-嵌合158抗体的生产和结合特性
11.1-COS 7细胞的转化和细胞培养
将一管COS 7细胞解冻并在补充有10％ Fetal Clone I血清和抗生素的DMEM中培养。一周后，用pG1D200158VH加上pKN100158VK(各10μgDNA)电穿孔细胞(0.8ml，107/ml)。将细胞在培养皿中的8ml生长培养基中培养3天。
11.2-嵌合抗体的生产
使用夹心ELISA测量COS7上清液中的抗体浓度。嵌合158VH×158VK抗体在以瞬时共转染的COS细胞条件化的培养基中以0.3μg/ml表达并随后以3.7μg/ml表达(表19)。
11.3-嵌合抗体的活性
使用两种ELISA分析嵌合158的抗原结合。使用以3.7μg/ml嵌合抗体条件化的培养基，通过直接ELISA方案(图12)测量与Aβ单体的结合，并与小鼠158IgG比较。其次，使用在流体相中与抗体混合的单体或初原纤维进行竞争性ELISA，所述抗体随后与固体相中的Aβ单体结合(图13)。这些实验显示，与原始的158小鼠抗体相似，嵌合158抗体与淀粉样蛋白Aβ单体和初原纤维结合。
评述
后来的测序显示，表1和4中所示的小鼠抗体序列数据在VH和VK链5’端均有错误。我们提出，这是由于使用了位于V区中的引物。在后来的测序中使用不能在V区中引入突变的位于前导序列中的引物。后来的测序显示了序列差异(见表15和11)。然而所述差异不位于CDR区中。
如直接结合ELISA和竞争性ELISA分别显示的，该嵌合抗体结合淀粉样蛋白Aβ单体和初原纤维。该证据证实，158 VH和158 VK链的组合编码抗LSAP抗体158，并指示这些序列适用于人源化步骤，以产生人源化的158抗体。
实施例12-人源化抗体的设计和讨论
缩写和定义
 
158 小鼠单克隆抗LSAPTM抗体158
158VH 小鼠158抗体的VH
158VK 小鼠158抗体的VK
158RKAss 保留隐蔽剪接位点的158VK人源化形式
158RKA 去除了隐蔽剪接位点的158VK人源化形式
158RHAss 保留隐蔽剪接位点的158VH人源化形式
158RHA 去除了隐蔽剪接位点的158VH人源化形式
A 腺嘌呤
bp 碱基对
C 胞嘧啶
 
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补性决定区，使用Kabat编号系统来定义                                         
D-基因 多样性基因
DNA 脱氧核糖核酸
FW 构架区：除CDR区以外的免疫球蛋白可变区
G 鸟嘌呤
IgG 免疫球蛋白G
J-基因 连接基因
Kabat Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对和编号系统
mAb 单克隆抗体
MRCT 医学研究委员会技术(Medical Research CouncilTechnology)                             
T 胸腺嘧啶
VCI 被分类为游标(vernier)或标准(canonical)或VH-VL界面的构架残基                              
V基因 与J(对于VH为D)基因一起重排以产生完整VH或VK的基因区段                              
V区 在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的113。                    
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
设备
 
硬件&软件 来源
SGW02计算机 Silicon Graphics
PC计算机 Hewlett Packard
SR 7.6 Steve Searle，Wellcome Trust Sanger Institute，Cambridge.                              
Lasergene 6.0 DNAstar Inc
Modeler 9.0 Accelrys Ltd.
SignalP www.cbs.dtu.dk
BlastP www.ncbi.nlm.nih.gov
12.1-人V基因数据库
使用来自国际免疫遗传学数据库2006和免疫学相关蛋白质序列Kabat数据库Release 5(上次更新1999年11月17日)的人及小鼠免疫球蛋白的蛋白质序列来编译Kabat比对中的免疫球蛋白序列数据库。我们的数据库含有9322个人VH和2689个人VK序列。使用序列分析程序SR 7.6，用158 VH和158 VK蛋白质序列查询人VH和VK数据库(表20)。
12.2-选择用于158RHA的人构架
12.2.1-将158 VH与人VH序列进行比较
表21中展示了在游标(Vernier)(Foote，J.和G.Winter.1992.Antibody framework residues affecting the conformation of thehypervariable loops.JMol.Biol.224：487-499.)、标准(Canonical)(Morea，V.，A.M.Lesk和A.Tramontano.2000.Antibody modeling：implications for engineering and design.Methods 20：267-279.)和VH-VL界面(Interface)(Chothia，C，J.Novotny，R.Bruccoleri和M.Karplus.1985.Domain association in immunoglobulin molecules.The packing of variable domains.JMol.Biol.186：651-663.)(VCI)残基处与158 VH具有最高同一性的人VH序列，所述VCI残基位于V区构架(FW)内。还显示了与158相同的VCI残基数(VCI分值)和FW残基数(FW分值)。如表22中所示，所有这些VH序列均共有相同的VCI残基和CDR长度。AJ556669具有在该数据组的其它人序列中未观察到的不常见的Pro74，导致我们在最初的分析中将其扣除。然而，Pro74存在于158VH序列中，所以如果基于AF062243的VH构建体不结合抗原的话，AJ556669可认为是人源化的备选FW。对这些序列的比对(表23)突出了它们的差异。在该数据组中AF062243独特地具有保守性改变T(82a)S和F79的保留。AF062243的其它特征是保守性改变D1E、K19R、A23S、T77S、S118T。所有其它FW改变对于表23中的所有构架都是常见的。选择AF062243作为构架，158RHA以该构架为基础。
12.3-产生158RHA
158RHA的设计是简单地将来自158VH的CDR 1、2和3移植进AF062243的受体FW。与AF062243最相同的人种系V基因是VHM99649(VH3-07)(表24)，从其中提取前导肽(表25)。SignalP算法(Nielsen，H.，J.Engelbrecht，S.Brunak和G.von Heijne.1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites.Protein Eng 10：1-6.)预测到，它可被信号肽酶正确切割(表26)。表27展示了将158 VH CDR1、2和3移植进AF062243 FW中以产生158RHA蛋白质序列的方案。表28展示了从158VH和AF062243的天然DNA序列产生DNA序列158RHAss。对158RHAss DNA序列的分析预测了剪接供体位点的存在，其预测分值在表29中展示。如表30中所示，引入非编码突变以使这些预测的剪接位点失活，产生最终的158RHA DNA序列(表31)。
12.4-选择用于158RKA的人构架
12.4.1-将158 VK与人VK序列进行比较
表32中展示了在VCI残基处与158 VK具有最高同一性的人VK序列，以及与158VK相同的VCI残基数(VCI分值)和FW残基数(FW分值)。11个序列具有与158 VK相同的所有VCI残基。表33显示，所有这些序列均具有与158 VK相同的CDR长度。表34突出了它们的差异，显示K45仅在AB064054中保留，所述AB064054还保留了I85。G100P改变是不显著的，因为P100是常见的，在我们的人VK数据库中的发生率为15％。T7S和K74R这两种替换是保守的，所有其它替换对表34中的所有序列而言都是常见的。由于这些原因，选择AB064054来产生158RKA。
12.5-产生158RKA
158RKA的设计是简单地将来自158VK的CDR1、2和3移植进人AB064054的受体FW中。与AB064054最接近的种系V基因是A19(表35)，从其中提取前导肽(表36)。SignalP算法预测到了该前导肽的正确切割(表37)。表38显示通过将158VK CDR嵌入AB064054的FW中来产生158RKA蛋白质序列。表39显示从158VK和AB064054的天然DNA序列产生158RKAss的DNA序列。对158RKAss的分析预测到了剪接供体位点的存在，其分值在表40中展示。引入非编码突变(表41)以使这些位点失活，产生最终的158RKA DNA构建体(表42)。
12.6人源化抗体(BAN2401)的结合活性
将158RKA和158RHA基因插入含有IgG1恒定区的表达载体中。在COS细胞中表达该构建体，以产生人源化的158抗体。在竞争性ELISA中测试人源化158抗体的结合活性和特异性。该人源化抗体显示与mAb158和158嵌合抗体相同的结合特性(见图14)。
12.7158RHA和158RKA链中的其它突变。
通过将小鼠种系V基因VH AAK71612与158 VH进行比较，鉴定了CDR2中的单个体细胞突变A60G。另外，抗体158的分子模型在CDR残基的
Figure A200780009817D0034095945QIETU
中含有三个在158RHA中不保守的VH FW残基。这些替换为D1E、P74A和T82S(表43)。类似地，在CDR残基的
Figure A200780009817D0034095945QIETU
中存在两个在158RKA中不保守的VK FW残基。该替换为L3V和G100P(表44)。表43和44展示了在人源化形式158RHB、158RHC、158RHD、158RKB和158RKC中，在VH-1、VH-74、VH-82、VK-3和VK-100位向158RHA和158RKA中引入回复突变。
参考文献
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Claims (35)

1.对野生型人Aβ初原纤维具有选择性并具有高亲和力的抗体或其片段，其中所述抗体或片段在其六个CDR区域中具有以下的共有序列：
VH-CDR1             SFGMH
VH-CDR2             YISSGSSTIYYGDTVKG
VH-CDR3             EGGYYYGRSYYTMDY
VL-CDR1             RSSQSIVHSNGNTYLE
VL-CDR2             KVSNRFS
VL-CDR3             FQGSHVPPT
其中所述抗体或片段可在所述CDR区中显示氨基酸缺失、替换和插入。
2.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体在所述CDR区中显示1-10个氨基酸缺失、替换和插入。
3.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体在所述CDR区中显示1-5个氨基酸缺失、替换和插入。
4.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体在所述CDR区中显示1-3个氨基酸缺失。
5.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体具有降低的补体活化活性。
7.根据权利要求6的抗体，其中所述降低的补体活化活性是通过将331位脯氨酸改变为丝氨酸或其它极性氨基酸来实现的。
8.根据权利要求6的抗体，其中所述降低的补体活化活性是通过抑制或降低或改变糖基化来实现的。
9.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是IgG类。
10.根据权利要求9的抗体，其中所述抗体是IgG1或IgG4亚类。
11.根据权利要求10的抗体，其中所述抗体是IgG1或IgG4亚类的嵌合体，其中为了降低补体活化，重链恒定区CH2或部分CH2来自IgG4，且CH1和CH3区来自IgG1。
12.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体包含表31的完整重链序列和表42的完整轻链序列。
13.根据权利要求1-11中任一项的抗体，其中所述抗体包含表43的重链(VH)中突变，所述突变选自A60G、D1E、P74A和T82S，和/或包含表44的轻链(VK)中突变，所述突变选自L3V和G100P，或包含这些VH和VK突变的组合。
14.根据权利要求1-11中任一项的抗体，其中所述抗体包含表31的完整重链序列和表42的完整轻链序列，只是CDR1的重链序列左侧第八个氨基酸是S。
15.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体或突变抗体，以降低在人中的抗原性。
16.根据权利要求1-11中任一项的抗体，其中所述抗体是小鼠抗体。
17.根据前述权利要求中任一项的抗体，其中Aβ单体与初原纤维之间的特异性比例为至少1:200。
18.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体在其六个CDR区中具有以下的共有序列：
VH-CDR1             AASGFTFSSFGMHWVR
VH-CDR2             WVAYISSGSSTIYYGDTVKGRFT
VH-CDR3             CAREGGYYYGRSYYTMDYWGQ
VL-CDR1             ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYL
VL-CDR2             LIYKVSNRFSGVP
VL-CDR3             YYCFQGSHVPPTFGG
其中所述抗体或片段可在所述CDR区中显示氨基酸缺失、替换和插入。
19.根据权利要求18的抗体，其中所述抗体是小鼠抗体。
20.根据权利要求18或19的抗体，其中所述抗体包含表11的完整轻链序列158VK和表15的完整重链序列158VH。
21.用于人和兽医用途的组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所定义的抗体和可药用缓冲剂。
22.根据权利要求21的组合物，其还包含抗菌剂。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述组合物是冻干的。
24.根据权利要求22的组合物，其中所述组合物与赋形剂一起被冻干，以提高抗体在冻干期间和之后的稳定性。
25.根据权利要求23的组合物，其中所述赋形剂是甘露醇或海藻糖。
26.用于预防或治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括以下步骤：对患有或怀疑患有阿尔茨海默病的患者施用权利要求1-20中任一项所定义的抗体或权利要求21-25中任一项所定义的组合物。
27.用于预防或治疗唐氏综合征、卢伊体痴呆、血管性痴呆和其它神经变性病症的方法，所述方法包括以下步骤：对患有或怀疑患有唐氏综合征、卢伊体痴呆、血管性痴呆和其它神经变性病症的患者施用权利要求1-20中任一项所定义的抗体或权利要求21-25中任一项所定义的组合物。
28.用于在体外检测Aβ初原纤维的方法，包括以下步骤：
-向含有或怀疑含有Aβ初原纤维的生物样品中添加权利要求1-20中任一项所定义的抗体；
-测量所述Aβ初原纤维与所述抗体之间所形成的复合体的浓度。
29.根据权利要求28的方法，其中所述检测方法是免疫测定法。
30.根据权利要求28的方法，其中所述检测方法是邻位连接测定法。
31.用于在体内检测Aβ初原纤维的方法，包括以下步骤：
-向含有或怀疑含有Aβ初原纤维的哺乳动物中添加权利要求1-20中任一项所定义的抗体；
-测量所述Aβ初原纤维与所述抗体之间所形成的复合体的浓度。
32.用于诊断阿尔茨海默病的方法，包括以下步骤：
-从受试者中取得生物样品，
-向所述样品中添加权利要求1-20中任一项所定义的抗体，
-测量所述抗体与所述样品中任何Aβ初原纤维之间所形成的复合体的浓度。
33.用于诊断唐氏综合征、卢伊体痴呆、血管性痴呆和其它神经变性病症的方法，包括以下步骤：
-从受试者中取得生物样品，
-向所述样品中添加权利要求1-20中任一项所定义的抗体，
-测量所述抗体与所述样品中任何Aβ初原纤维之间所形成的复合体的浓度。
34.权利要求1-20中任一项所定义的抗体或权利要求21-25中任一项所定义的组合物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物的用途。
35.权利要求1-20中任一项所定义的抗体或权利要求21-25中任一项所定义的组合物用于制备治疗唐氏综合征、卢伊体痴呆、血管性痴呆和其它神经变性病症的药物的用途。
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