CN109825454A - 一株硝酸盐还原菌、培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一株硝酸盐还原菌、培养方法及应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16609；保藏时间为：2018年10月24日。该菌株具有优异的嗜盐特性，在盐浓度为8％以下时，生长量随着盐浓度的升高而增加，不会出现菌株活力减弱或耐受能力降低的问题，可应用于高盐污水的治理，废水生物脱氮、养殖水体无机氮的净化等，还可应用于生物固氮方面，将土壤中硝酸盐的还原为氨态氮，减少土壤氮的流失，具有节省肥料、提高作物质量等多重功效，应用前景非常广阔。

Description

一株硝酸盐还原菌、培养方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一株硝酸盐还原菌、培养方法及应用。

背景技术

现如今，我国土地碳氮比严重失调，半个世纪以化肥为主，很少用有机肥，秸杆过腹还田是少数。由于碳氮比失调，土壤固氮能力下降，70％的氮肥进入环境，最后进入地下水，空气，固化在土壤中，造成巨大浪费和危害。土壤本身有机质含量太低，平均仅在1％以下；因为土壤缺乏有机质，土壤失去保水、保肥能力，造成水土流失严重。

此外，由于环境污染严重产生了大量的含盐废水，目前，许多常规的物理、化学和生化的方法也可应用于含盐废水处理，但由于海水成分的复杂性以及不同性质的含盐废水中污染物结构的特点，而使含盐废水处理与陆源污水处理产生较大的差异，尤其是高盐度的影响，增加了污水处理的难度。

经研究发现，高浓度无机盐对废水生物处理的毒害作用主要是通过升高的环境渗透压而破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，从而破坏微生物的生理活动。另外，废水中的盐度使废水的密度增加，造成废水与微生物的比重差减小，菌胶团絮体难以沉降，使得活性污泥容易上浮流失，出水水质变坏。

随着环境的日益恶化，加速治理已经成为首要的任务，但是一般微生物不具有耐盐、嗜盐特点，也不具有净化含盐污水能力，生物治理的方法不易形成产业进行推广应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明通过提供新的硝酸盐还原菌株及应用、该硝酸盐还原菌株的培养方法，以及可用于耐盐、抗盐来解决前述需求，尤其是对于生物固氮、高盐废水处理方面具有很好的治理作用，该方法绿色环保，成本低，耗时时间短，操作方便，通过这种采用生物治理的方法，该菌株具有优异的嗜盐特性，生长量随着盐浓度的升高而增加，在盐浓度为8％以下时，不会出现菌株活力减弱或耐受能力降低的问题，应用前景非常广阔。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种嗜盐菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16609；保藏时间为：2018年 10月24日。

该菌株的菌落形态描述特征为：革兰氏阴性杆菌，菌体呈直的短杆状。菌落圆形，淡褐色至米白色，表面光滑有光泽，不透明，菌落小而凸起。菌落具体形态可见附图3。

本申请提供的菌株为硝酸还原菌(Nitratireductor sp)，菌株名为Bn-104，从海滨盐碱地水样中分离得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:16609；保藏时间为：2018年10月 24日，检测为存活菌株并保藏。

分离纯化菌种的水样更优的来源方式是来源于浙江舟山海滨盐碱地的水样。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1的硝酸盐还原菌株在不同盐浓度培养液中的生长曲线的测定结果；

图2为本发明实施例2的硝酸盐还原菌株在不同盐浓度培养液中培养 2d后的生长量的测定结果；

图3为本发明实施例3的菌株的菌落形态；

图4为本发明实施例3的菌株在营养肉汤中与8％NaCl浓度的培养液中的菌体形态；

图5为对照菌株1在营养肉汤中与8％NaCl浓度的培养液中的菌体形态；

图6为对照菌株2在营养肉汤中与8％NaCl浓度的培养液中的菌体形态。

图7为本发明实施例中菌株Bn-104对水中氨氮的降解作用的柱状图。

本申请提供的菌株为硝酸还原菌(Nitratireductor sp)，菌株名为Bn-104，从海滨盐碱地水样中分离得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:16609；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间为：2018年10月24日，检测为存活菌株并保藏。

具体实施方式

本发明涉及一种分离的硝酸盐还原菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16609；保藏时间为：2018年10月24日。

该菌株具有很强的嗜盐能力，能实现硝酸盐的生物转化，可广泛应用于废水生物脱氮、养殖水体无机氮的净化等；可应用于生物固氮，将土壤中硝酸盐还原为氨态氮，减少土壤氮流失，具有节省肥料、提高作物质量等多重功效。菌株具有较好的高盐耐受能力，可用于高盐污水的治理，对高盐废水有较强的抗冲击能力。

上述菌株在不高于8％盐浓度培养液中，表现出嗜盐特性，生长量随着盐浓度的升高而增加。只要在不高于8％NaCl浓度的培养液中均可正常生长，可保持稳定的活力及耐受能力。

本发明请求保护上述保藏编号的嗜盐菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的嗜盐能力的突变菌株。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将嗜盐菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。

本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一嗜盐菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的嗜盐菌株。

所述组合物用于工业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是工业方面常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。

本发明还提供了上述硝酸盐还原菌株的培养方法，包括如下步骤：所述嗜盐菌株在营养肉汤培养基或含有NaCl的培养液中培养；

优选地，培养的温度为25-35℃之间，培养的时间为24h以上；

更优地，培养的温度为30℃，培养的时间为48h以上。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨8-12g/L，牛肉粉1-4g/L，氯化钠3-6g/L，葡萄糖0.5-3g/L。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖1g/L。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述含有NaCl的培养液中，NaCl 的浓度为8wt％以下，更优地NaCl的浓度为4-8wt％之间，更优选地为 6-8wt％之间，最优选地为8wt％。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述嗜盐菌株在含有NaCl的培养液中培养，所述嗜盐菌株的接种量体积百分比为3-7％，更优地接种量为 5％；

优选地，所述含有NaCl的培养液为营养肉汤培养基额外添加NaCl。

现有技术中的菌株的筛选和培养方法为：在复杂的微生物群落结构中筛选出具有特定功能的微生物，需要针对微生物的代谢特征选择性培养，从而筛选出目标微生物。现有技术中，对耐盐微生物的筛选时，在对水样或土样进行梯度稀释后，多涂布于含不同NaCl浓度的培养基平板中培养，分离纯化后，提高培养基中盐浓度以对其进行驯化，使菌株具高盐耐受能力。在培养发酵时持续提供高浓度盐环境，保持并加强菌株耐盐功能。

然而现有耐盐菌株筛选方法筛选出的菌株，经多次传代后，可能会有活力降低，功能减弱等问题。本发明正是利用正常的营养肉汤培养基(无额外添加NaCl)从盐碱地水体中分离耐盐微生物。筛选出的菌株无需经过高浓度NaCl培养驯化即可耐受高浓度NaCl，该菌株在营养肉汤培养基及 8％NaCl浓度(额外添加NaCl)培养基中皆能迅速生长繁殖。在生产应用中不会产生菌株活力降低等问题。

上述方法通过富集、分离纯化的方法从盐碱地水样中最终得到目标菌种，后续对该菌种进行了生长曲线的测定以及对其嗜盐效果进行了评定，具体可见下述实施例以及实验例的具体过程。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

硝酸盐还原菌的分离纯化以及培养方法具体包括如下步骤：

1)配制营养肉汤培养基：蛋白胨8g/L，牛肉粉4g/L，氯化钠3g/L，葡萄糖3g/L；

2)菌种的筛选：利用上述营养肉汤培养基从水样中分离耐受高浓度 NaCl的菌种。分离菌种的水样来源于浙江舟山海滨盐碱地水样。分离菌株无需经过驯化即可耐受高浓度NaCl；

3)在营养肉汤中培养制备菌株种子液，30℃，150r/min，培养24h后，以5％接种量接种至等量的含有不同NaCl浓度(0％、4％、8％、10％、15％) 的营养肉汤培养基中，30℃，150r/min振荡培养，在培养时间为2h、5h、 10h、15h、20h、25h、36h、48h时分别取样，测定不同培养时间的培养液的吸光度，以培养时间为横坐标，以OD600吸光度，绘制菌株在不同盐浓度培养液中的生长曲线，采用比浊法测定菌体浓度，绘制生长曲线，具体测定结果见图1。

由图1可知，菌株在不同盐浓度中的生长浓度虽不相同，但在分别培养时表现出的生长趋势相同。菌株的生长繁殖分为4个时期：迟缓期、对数期、稳定区、衰亡期。在NaCl浓度为0.5％-8％中，该菌在接种5h后迅速增长进入对数期，在24h接近稳定期；在NaCl浓度为10％-15％的较高盐浓度时菌株的生长速度明显减慢，生长量极少，NaCl浓度为15％时几乎没有生长。

4)配制含氨氮的模拟废水：葡萄糖5.0g，(NH₄)2SO₄ 0.4g，NaCl 1.0g， K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，pH值7.2～7.4，用去离子水定容至 1000mL。

以营养肉汤培养基，30℃，150r/min培养24h，获得菌株菌悬液，吸取 10mL菌悬液，2000r/min离心10min，弃去上清液，再用10mL生理盐水洗涤沉淀，混匀，再次离心，如此重复3次，以除去菌种培养中产生的氨氮。用10mL生理盐水支撑氨氮降解菌种液。

按10％接种量接种至100mL上述配制好的模拟废水中，150r/min，30℃振荡培养3d，7d后，经2000r/min离心10min，取上清液测定氨氮浓度；与未接种的空白培养基作对比，计算出氨氮降解率，具体结果见图7，当 7d后氨氮降解率可以达到70％以上。(氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法进行)。

实施例2

硝酸盐还原菌的培养方法具体包括如下步骤：

1)配制营养肉汤培养基：蛋白胨12g/L，牛肉粉1g/L，氯化钠6g/L，葡萄糖0.5g/L；

2)菌种的筛选：实施例1的分离纯化方法得到的菌株；

3)在步骤1)的营养肉汤中培养制备菌株种子液，25℃，150r/min，培养48h；

4)以体积百分比7％的接种量接种至等量含有不同NaCl浓度(0％、 4％、8％、10％、15％)的培养基中，35℃，150r/min振荡培养2d至稳定期时同时取样，测定各培养液的OD600吸光度，以比浊法测定菌体的生长量。以盐浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制菌株的耐盐能力曲线。并显微观察不同盐浓度培养液中菌体形态变化，具体结果见图2所示。

由图2可知，菌株可以在NaCl浓度为0.5％-15％的培养基中生长，在 0.5％-8％盐浓度范围内可大量生长繁殖。稳定期时，在0.5％-8％盐浓度时菌体生长量远远高于10％-15％时的生长量。且菌株在0.5％-8％盐浓度范围内，随着盐浓度的增加，稳定期的菌体浓度随之增加，在盐浓度8％时菌体浓度最大。即菌株在不高于8％盐浓度培养液中，表现出嗜盐特性，生长量随着盐浓度的升高而增加。

实施例3

硝酸盐还原菌的分离纯化以及培养方法具体包括如下步骤：

1)配制营养肉汤培养基：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖1g/L；

2)菌种的筛选：实施例1的分离纯化方法得到的菌株；

3)在步骤1)的营养肉汤中培养制备菌株种子液，25℃，150r/min，培养48h；

4)以5％的接种量分别接种至等量上述营养肉汤培养基和含有8％NaCl 浓度的培养基中，取样，进行菌体显微观察，观察菌体在高盐浓度培养时菌体形态变化，具体结果见图3-4。

比较例1

以假单胞菌(CK1)、微小杆菌(CK2)作为对照菌株，在实施例3的营养肉汤中培养制备菌株种子液，25℃，150r/min，培养48h；

以5％的接种量分别接种至等量上述营养肉汤培养基和含有8％NaCl浓度的培养基中，取样，进行菌体显微观察，观察菌体在高盐浓度培养时菌体形态变化，具体结果见图5和图6。

从图3-6的结果看出，对菌体进行染色观察，随着对照菌株CK1和CK2 在正常营养肉汤培养基中培养，菌体呈直杆状，菌体形态正常；而在8％盐浓度中或菌体膨大，或弯曲至扭曲变形。本发明实施例3的菌株在正常营养肉汤培养基中菌体呈杆状，菌体形态正常，在8％盐浓度中菌体形态与前者无明显变化，菌体无变形异常。

实施例4

嗜盐菌的分离纯化以及培养方法具体包括如下步骤：

1)配制营养肉汤培养基：蛋白胨11g/L，牛肉粉2g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖1.5g/L；

2)菌种的筛选：实施例1的分离纯化方法得到的菌株；

3)在步骤1)的营养肉汤中培养制备菌株种子液，33℃，150r/min，培养36h；

4)以3％的接种量分别接种至等量上述营养肉汤培养基和含有8％NaCl 浓度的培养基中，取样，进行菌体显微观察，观察菌体在高盐浓度培养时菌体形态变化，具体结果与图3无异。

本发明的方案具有以下优点：采用实验室可操作性强的分离手段，在实验室模拟现场的处理方式，并在实验室做了不同的盐浓度，设置的浓度高于实际的浓度，有利于今后的实际应用，另外该菌株采用的高效手段的驯化方法，增强了菌株在恶劣环境中的耐受程度，在今后的实际应用中，比没有经过驯化的菌种适应性更强。对今后的现实应用减少了使用风险。该菌株的降解效率比市场上现有的菌剂降解效率更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一株硝酸盐还原菌，其特征在于，所述硝酸盐还原菌株为Nitratireductor sp，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16609；保藏时间为：2018年10月24日。

2.权利要求1所述的硝酸盐还原菌株在污水治理方面的应用。

3.权利要求1所述的硝酸盐还原菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：所述硝酸盐还原菌株在营养肉汤培养基或含有NaCl的培养液中培养。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，培养的温度为25-35℃之间，培养的时间为24h以上。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，培养的温度为30℃，培养的时间为48h以上。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨8-12g/L，牛肉粉1-4g/L，氯化钠3-6g/L，葡萄糖0.5-3g/L。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖1g/L。

8.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述含有NaCl的培养液中，NaCl的浓度为8wt％以下。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述含有NaCl的培养液中，NaCl的浓度为4-8wt％之间，更优选地为6-8wt％之间，最优选地为8wt％。

10.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述硝酸盐还原菌株在含有NaCl的培养液中培养，所述硝酸盐还原菌株的接种量体积百分比为3-7％，更优地接种量为5％；

优选地，所述含有NaCl的培养液为营养肉汤培养基额外添加NaCl。