CN109810923B

CN109810923B - 一株用于污水脱氮的好氧反硝化菌sly2-21及其应用

Info

Publication number: CN109810923B
Application number: CN201910191583.3A
Authority: CN
Inventors: 王晓慧; 杨静丹; 刘琳
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109810923A

Abstract

一株用于污水脱氮的好氧反硝化菌SLY2‑21及其应用，属于环境微生物及水处理生物脱氮领域，该菌株于2019年1月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.17221；本发明菌株是从垃圾渗滤液中筛选所得，本发明提供的菌株可以有效的去除污水中的氨态氮和硝态氮，该菌株经扩大培养后，可直接用于河道水体的脱氮，在实际工程中具有较大的应用潜力，从长远意义上讲，将会对环境保护工作起到一定的推动作用。

Description

一株用于污水脱氮的好氧反硝化菌SLY2-21及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物及水处理生物脱氮领域，具体涉及一株用于污水处理的好氧反硝化细菌菌株，同时提供这种菌株的脱氮效能及实际应用。

背景技术

当今氮素污染是普遍存在的，水体中氮化物形式有蛋白氮、氨氮、有机氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，故高效、快速去除水中氮素是当今水污染防治领域的一个重要课题。传统生物脱氮技术的理论基础是微生物的硝化作用和反硝化作用，但传统生物脱氮技术存在诸多缺陷，使得脱氮过程的不连续性和效率低下。

传统理论认为反硝化是严格的厌氧过程，但从20世纪80年代以来，好氧反硝化细菌不断被报道，好氧反硝化越来越受到人们的关注。好氧反硝化现象会有生物学解释是由于科学家们发现了环境中存在的好氧反硝化细菌及其含有的好氧反硝化酶系，研究好氧反硝化酶系的得知，有两种硝酸盐还原酶存在于Thiosphaera Pantotropha的细胞里，分别是膜内硝酸盐还原酶，与细胞膜相结合和周质硝酸盐还原酶，存在于细胞壁和细胞膜之间。在厌氧环境条件下，被表达的酶是膜内硝酸盐还原酶(在好氧时其不起作用)；在好氧的环境条件下，被表达的酶是周质硝酸盐还原酶(在很高DO浓度下仍然能够发生作用)。亚硝酸盐还原酶(Nir)是反硝化过程中起主要作用的酶，Nir基因也是在反硝化功能基因中研究最多的基因，Nir分布于细胞膜外周质中，有2种类型：一种是细胞色素cd1型(cd1Nir)，另一种是含铜离子型(CuNir)。一氧化氮还原酶结合于细胞膜上，催化NO还原成N₂O，反应过程中共有两个电子发生转移。到目前为止，已发现的三种一氧化氮还原酶有：结合在膜上的细胞色素bc，主要存在于细胞中；可溶性细胞色素P450，主要在真菌中发现；A-型黄素蛋白，发现于非脱氮菌中。一氧化二氮还原酶位于膜外周质空间内，为可溶解性含铜离子酶，将N₂O还原为N₂，是脱氮过程的最后一步。Robertson等认为协同呼吸是好氧反硝化的一个重要机理，即反硝化菌可以将电子从被还原的物质传递给氧气，同时也可以传递给硝酸盐。

目前为止，菌种发现种类较为单一，且研究多集中在降解基因和降解机理方面，实际应用研究有限。因此，从自然界筛选出对具有高效好氧反硝化效能的菌株，深入研究该菌的生长特性、反硝化特性及其污水脱氮中的应用。进一步发掘好氧反硝化细菌的菌种资源，为以后对好氧反硝化细菌的脱氮机理研究提供材料，具有重要的理论意义和良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株好氧反硝化菌(Achromobacter marplatensis)SLY2-21。该菌株能够在好氧条件下有效降解水体中的硝态氮及氨态氮，但不能降解亚硝态氮，为污水生物脱氮工艺的生物强化提供高效的菌制剂。

本发明的目的之二在于提供该菌株SLY2-21在河道污水脱氮中的应用效能。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株好氧反硝化细菌(Achromobacter marplatensis)SLY2-21，经16S rDNA鉴定为Achromobacter marplatensis，属于无色杆菌属，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号、邮编100101)，保藏日期为2019年1月21日，保藏编号为CGMCC No.17221。

本发明所提供的好氧反硝化细菌SLY2-21，其生物学特征在于经鉴定为革兰氏阴性菌，乳白色，圆形规则，表面光滑湿润，易挑起，菌体为杆状，长度为1～2um，宽度为0.3～0.5um。异养生长，最佳碳源柠檬酸钠，最佳C/N 15，最适宜pH值为7.0～8.0，最适温度30℃。

本发明提供一种筛选好氧反硝化菌的方法。

本发明的菌种筛选采用多种筛选方法相结合，首先通过LB培养基来富集好氧反硝化菌，然后再通过在培养基中添加pH指示剂来快速有效地筛选好氧反硝化菌。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案的步骤依次是取样，LB富集培养，初筛，复筛，最后得到在好氧条件下，能同时降解污水中的硝态氮及氨态氮，反硝化能力较高的菌株。

取垃圾渗滤液首先进行LB培养基的富集培养，采用格利斯试剂初步筛选出好氧反硝化菌；然后根据反硝化菌产碱的性能，通过在培养基中添加溴百里酚蓝指示剂的方法，来有效地筛选好氧反硝化菌；再经异养硝化富集后，用模拟的污水复筛高效反硝化能力的好养反硝化菌。

本发明提供了菌株鉴定的方法。

本发明的菌株鉴定方法主要是通过16S rDNA鉴定的方法，利用通用引物扩增出进化过程中保守的16S rDNA片段进行测序，然后与基因文库中的数据进行比对，根据菌株同源性比例确定菌株的属性，最后再根据系统进化树进行确认。

本发明的好氧反硝化菌应用于降解污染的水体中的硝态氮和氨态氮。具体为对菌体进行扩大培养后，接种于含硝态氮和氨态氮污染的水体。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明提供的菌株可以有效的去除污水中的硝态氮和氨态氮,将好氧反硝化菌扩大培养后按2％的比例投入含硝态氮的水体中，将好氧反硝化菌扩大培养后按2％的比例投入含氨态氮的水体中，硝态氮去除率为98.78％，氨态氮去除率为63.03％，这对开发脱氮微生物制剂或污水处理剂具有广阔的应用前景。

生物材料保藏信息

生物材料名称：SLY2-21(Achromobacter marplatensis)；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏日期：2019年1月21日；

保藏编号：CGMCC No.17221。

附图说明

图1为SLY2-21菌株的电镜扫描照片。

图2为本发明菌株16S rDNA的系统发育树。

图3为好氧反硝化菌的异养硝化生长和脱氮效率。

图4为好氧反硝化菌的好氧反硝化生长和脱氮效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图1至附图4与实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

好氧反硝化细菌的筛选具体步骤如下：

1、驯化与富集：取充分混合的新鲜垃圾渗滤液10mL接种于100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，放于摇床上30℃,150rpm，培养48h，每12h取样定性检测培养基中N0₃ ^--N和NO₂ ^--N的含量。取10mL富集培养液转接于新鲜的LB液体培养基中，转接5次，共富集10天。

每间隔12h用二苯胺试剂和格利斯试剂分别定性检测培养基中N0₃ ^--N和NO₂ ^--N的含量。用灭过菌的滴管吸取3滴培养液于灭过菌的试管，再于试管中滴加3滴格里斯试剂，如果培养液变为粉色或者棕色，则证明有亚硝酸盐的存在，为硝酸盐还原阳性，该菌种可能为好氧反硝化细菌。如果无色，再取出灭过菌的试管滴加3滴培养液和3滴二苯胺试剂，如果培养液变为蓝色，则证明有硝酸盐的存在，硝酸盐并未转化为亚硝酸盐，则为阴性反应，此菌种有很大可能不是好氧反硝化细菌，应舍去，试验结果均遇格利斯试剂变粉红色。

上述格里斯试剂A液：磺胺酸0.5g溶于150mL醋酸(30％)，存于棕色瓶中；B液：1-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水煮沸后缓慢加30％稀醋酸150mL，存于棕色瓶中；使用前等体积混合A，B溶液。

二苯胺试剂：1g二苯胺溶于20ml蒸馏水缓慢加入100ml浓H₂SO₄，存于棕色瓶中。

上述富集培养基LB(g/L)：胰蛋白胨1.0；酵母提取物0.5；KNO₃ 2.0；pH值7.2。

2、分离纯化

取l0mL富集好的驯化液，移入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡混匀，按倍比稀释，分别得到10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6，10^-7的稀释溶液，选用梯度为10^-4,10^-5,10^-6，10^-7；分别取1mL稀释菌液在BTB培养基上涂布，置于恒温培养箱中，30℃条件下培养2～3d。好氧反硝化菌可利用硝酸盐产生碱度，因而会使菌落周围培养基变为蓝色。观察BTB培养基上的单菌落，菌落变为蓝色或菌落周围出现晕圈的即初筛的好氧反硝化菌，挑取形态各异变蓝单菌落进行多次划线纯化，纯化5代后得到的菌落特征基本一致，获得初筛菌株16株。然后接种在斜面培养基中4℃，保存供后续试验用。

上述BTB初筛培养基：琼脂20g、KNO₃ 1g、FeSO₄·7H₂O 0.05g、CaCl₂·2H₂O 0.2g、MgSO₄·7H₂O 1g、琥珀酸钠8.5g、KH₂PO₄ 1g、溴百里酚蓝(取0.1g溴百里酚蓝溶于10mL酒精)1mL、溶解后以蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0～7.3。

3、复筛

将纯化获得的菌株接种于LB培养基中进行扩大培养，4000rpm离心5min后，弃上清，用无菌水制备菌悬液(OD值约为1.5)，按2％接种量接种于装有异养硝化液体培养基的锥形瓶中，30℃，150rpm摇床培养36h进行异养硝化作用的富集。

将异养硝化富集后的菌悬液再次分别以5％的接种量接种至分别装有100mL异养硝化培养基和好氧反硝化培养基的250mL锥形瓶中，于30℃，150rpm摇床培养5天，检测接种前后NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的浓度变化。选择氨氮去除率60.21％，硝氮去除率98.86％的菌株作为进一步研究的目的菌株。

上述异养硝化培养基(NI)(g/L)：C₄H₄Na₂O₄·6H₂O 11；MgSO₄·7H₂O 0.1；Na₂HPO₄·12H₂O 6.7；KH₂PO₄ 1；NH₄Cl 1.5；微量元素溶液2mL；pH值7.0～7.3。

上述反硝化培养基(DM)(g/L)：C₄H₄Na₂O₄·6H₂O 13；MgSO₄·7H₂O 0.1；Na₂HPO₄·12H₂O 7.9；KH₂PO₄ 1.5；KNO₃ 3；微量元素溶液2mL；pH值7.0～7.3。

上述微量元素溶液(g/L)：EDTA 50；ZnSO₄ 2.2；CaCl₂ 5.5；MnCl₂·4H₂O 2.06；FeSO₄·7H₂O 5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1；CuSO₄·5H₂O 1.57；CoCl₂·6H₂O 1.61；pH值6.0。

实施例2

好氧反硝化菌SLY2-21的分子生物学鉴定：

经过上述筛选分离后得到一株脱氮效果较好的好氧反硝化菌株SLY2-21，该菌株经生理生化测试为革兰氏阴性，乳白色，圆形规则，表面光滑湿润，易挑起，SEM扫描发现，SLY2-21菌体为杆状，大小为1～2um×0.3～0.5um(见图1)。

1、细菌基因组DNA抽提

将目的菌株接入LB培养基，隔夜培养后，取1mL离心得菌体，然后用基因组试剂盒提取细菌基因组，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳(1％)验证，紫外分析仪检查电泳结果。

2、PCR扩增16SrDNA片段

利用通用引物(27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳(1％)验证，紫外分析仪检查电泳结果。

PCR反应体系(总体积50μl)：10×Ex Taq buffer 5.0μl；2.5mM dNTP Mix 4.0μl；10p Primer 1 1.0μl；10p Primer 2 1.0μl；Template 2.0μl；5u Ex Taq 0.5μl；ddH₂O36.5μl。

PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃30s；退火54℃30s；延伸72℃1min30s；重复第二步，30个循环；终延伸72℃10min 1次；4℃∞。

3、电泳检测，切胶纯化测序，由美吉生物进行序列测定。

菌株SLY2-21的序列长度为1420，其基因序列表见SEQ ID NO：1。

将测序所得片段在EzBioCloud数据库进行比对，结果表明该菌与Achromobactermarplatensis的16S rDNA序列相似性较高，为99.31％。采用Mega7.0软件的邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法构建系统发育树分析该菌遗传学特征，确定菌株的种属情况以及其在遗传学上的进化地位，结果如图2所示。

实施例3

SLY2-21菌株的生长和脱氮特性：

1、将保存于4℃冰箱的SLY2-21菌株接种于LB培养基中30℃，150rpm扩大培养后，用无菌水制得OD约为1.5的菌悬液，然后按2％的接种量接种于含100mL异养硝化培养基的250mL锥形瓶中，充分混匀，于30℃，150rpm，摇床培养96h。分别定期取样测定上清液中NH₄ ⁺-N，OD₆₀₀值。为了减少误差，设置三个平行试验，结果见图3。

根据曲线可以看出，SLY2-21菌在硝化培养基中经过12h的生长后进入对数期，约27h进入稳定期，经一小段稳定期后进入衰亡期。在菌株生长同时NH₄ ⁺-N浓度降低，对数期时NH₄ ⁺-N浓度下降最快，稳定期以后NH₄ ⁺-N浓度下降缓慢，NH₄ ⁺-N去除率为63.03％，由于该菌为异养菌，推测有可能是跟碳源不断减少有关系。

2、将保存于4℃冰箱的SLY2-21菌株接种于LB培养基中30℃，150rpm扩大培养后，用无菌水制得OD约为1.5的菌悬液，然后按2％的接种量接种于含100mL好氧反硝化培养基的250mL锥形瓶中，充分混匀，于30℃，150rpm，摇床培养96h。分别定期取样测定上清液中NO₃ ^--N、NO₂ ^--N、OD₆₀₀值。为了减少误差，设置三个平行试验，结果见图4。

根据曲线可以看出，SLY2-21菌在好氧反硝化培养基中经过15h生长就进入对数期，这可能是由于LB培养基硝氮浓度与反硝化培养基的硝氮浓度相近，菌株有更好的适应性。由OD₆₀₀和NO₃ ^--N去除的关系可知，由于对数期菌株生长最快且细胞合成和代谢主要在这一阶段，所以好氧反硝化主要发生在对数期，到30h时NO₃ ^--N浓度趋于稳定，去除率达98.78％。但整个反硝化过程中，期间亚硝态有一定的积累，可能与所选碳源及碳氮比有关。

实施例4

好氧反硝化菌SLY2-21在实际污水处理中的应用：

将好氧反硝化菌种SLY2-21按1％的投菌量添加到天津某河道污水中进行曝气脱氮处理。进水水质为：氨氮7.41mg·L^-1，亚氮0.009mg·L^-1，硝氮0，总氮10.08mg·L^-1，在河道废水中补充KNO₃使得硝氮为10mg·L^-1。空白组A不做任何处理，B组添加柠檬酸钠(按C/N15)，C组添加柠檬酸钠与1％菌悬液。均于最适温度30℃下曝气培养，每12h取样测定氨氮，亚氮，硝氮和总氮含量。结果见表1。

表1菌株对河道污水中氮的去除能力

反应24h后，未投加反硝化菌的对照组A氨氮去除率仅为55.2％，硝氮的去除率为10.27％,总氮的去除率为9.32％；只投加碳源的B组，氨氮去除率为89.57％，硝氮的去除率为27.15％,总氮的去除率为31.89％；C组投加碳源与反硝化菌后氨氮去除率为96.76％，硝氮的去除率为43.71％,总氮的去除率为36.41％；三组中亚氮均有少量的积累，与对照组相比，加入反硝化菌可明显提高污水脱氮效率。以上结果说明该菌株用于废水处理中，能获得较好的污水处理效果，具有较好的应用前景。

菌株SLY2-21的序列表，SEQ ID NO：1：

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一株用于污水脱氮的好氧反硝化菌SLY2-21及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 好氧反硝化菌(Achromobacter marplatensisSLY2-21)

<400> 1

cctaccgtgg gtatcgcccc ccttgcggtt aggctaacta cttctggtaa aacccactcc 60

catggtgtga cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgcga catgctgatc 120

cgcgattact agcgattccg acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccggactacg 180

atcgggtttc tgggattggc tccccctcgc gggttggcga ccctctgtcc cgaccattgt 240

atgacgtgtg aagccctacc cataagggcc atgaggactt gacgtcatcc ccaccttcct 300

ccggtttgtc accggcagtc tcattagagt gccctttcgt agcaactaat gacaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc 420

acctgtgttc cggttctctt gcgagcactg ccaaatctct tcggcattcc agacatgtca 480

agggtaggta aggtttttcg cgttgcatcg aattaatcca catcatccac cgcttgtgcg 540

ggtccccgtc aattcctttg agttttaatc ttgcgaccgt actccccagg cggtcaactt 600

cacgcgttag ctgcgctacc aaggcccgaa ggccccaaca gctagttgac atcgtttagg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgtgc atgagcgtca 720

gtgttatccc aggaggctgc cttcgccatc ggtgttcctc cgcatatcta cgcatttcac 780

tgctacacgc ggaattccac ctccctctga cacactctag cccggtagtt aaaaatgcag 840

ttccaaagtt aagctctggg atttcacatc tttctttccg aaccgcctgc gcacgcttta 900

cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccggtg cttattctgc aggtaccgtc agtttcacgg ggtattagcc catgacgttt 1020

ctttcctgcc aaaagtgctt tacaacccga aggccttcat cgcacacgcg ggatggctgg 1080

atcagggttt cccccattgt ccaaaattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140

gtgtctcagt cccagtgtgg ctggtcgtcc tctcaaacca gctacggatc gtcgccttgg 1200

tgagccgtta ccccaccaac tagctaatcc gatatcggcc gctccaatag tgcaaggtct 1260

tgcgatcccc tgctttcccc cgtagggcgt atgcggtatt agctacgctt tcgcgtagtt 1320

atcccccgct actgggcacg ttccgataca ttactcaccc gttcgccact cgccaccaga 1380

ccgaagtccg tgctgccgtt cgactgcatg tgtaagcatc 1420

Claims

1.一株好氧反硝化细菌SLY2-21，该菌株经16S rDNA分子鉴定为Achromobactermarplatensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年1月21日，保藏编号为CGMCC No.17221。

2.权利要求1所述的一株好氧反硝化细菌SLY2-21的应用，用于降解去除污水中的硝态氮及氨态氮。

3.按照权利要求2所述的一株好氧反硝化细菌SLY2-21的应用，将好氧反硝化菌扩大培养后按2％的比例分别投入含硝态氮及氨态氮的水体中。

4.按照权利要求2所述的一株好氧反硝化细菌SLY2-21的应用，将好氧反硝化菌扩大培养后按1％的比例投入实际河道污水中。