CN109097305A - 一种根瘤菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种根瘤菌Rhizobium sp.WP 1‑3，保藏编号为CGMCC No.14472。另外，本发明还公开了该根瘤菌在土壤解钾以及分解土壤中难溶性磷中的应用。本发明的根瘤菌是以钾长石为钾源筛选出来的优势菌株，该菌株在生长繁殖的过程中可将土壤中硅铝酸盐中的不溶性钾元素转化为可溶性组分，同时可通过促进难溶性磷的分解来增加土壤中磷元素的来源。此外本菌株还具有固氮的作用，为植物生长代谢提供所需的氮素。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种根瘤菌及其应用。
背景技术
钾和磷是植物体内重要的营养元素，为生物固氮所必须，也是促进植物生长代谢的关键成分。钾和磷在调节细胞渗透，物质运输，促进酶活化，促进光合作用，提高二氧化碳的同化率，促进作物体内物质的合成和转运以及增强植物抗性和忍耐能力等方面起到重要的促进作用。土壤中的钾和磷大多存在于硅铝酸盐和磷灰石等矿物中，以矿物钾和矿物磷形式存在的钾和磷不能被植物直接吸收，农业上普遍采用的以化学钾和化学磷形式对植物体进行补充的方式容易破坏土壤结构从而造成环境污染。随着人们对环境的重视程度的提高，生物肥料在提高土壤中营养元素来源、增加土壤多样性和改善农产品品质方面的特点引起了广泛的关注。
解磷解钾菌是一种能有效分解土壤中含钾矿物质和含磷矿物质的菌种，可以将土壤中难溶性的钾和磷转化为可溶性养分，增加土壤中钾元素和磷元素的来源。开发利用高效解磷解钾菌所制成的微生物肥料，对于农业生活生产发展以及环境保护具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种可用于土壤解钾和分解土壤中难溶性磷的根瘤菌。该菌株源于土壤，生态安全，该菌株是以钾长石为钾源筛选出来的优势菌株，在生长繁殖的过程中可将土壤中硅铝酸盐中的不溶性钾元素转化为可溶性组分，同时可通过促进难溶性磷的分解来增加土壤中磷元素的来源。此外本菌株还具有固氮的作用，为植物生长代谢提供所需的氮素。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种根瘤菌，其特征在于，所述根瘤菌为Rhizobium sp.WP 1-3，保藏编号为CGMCC No.14472，保藏日为2017年7月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1、该菌株具有如下的性质：
形态特征：WP 1-3菌株菌落呈圆形，杆状菌无色透明，边缘整齐，湿润粘稠，富有弹性。
生理生化特征：革兰氏阴性细菌。
2、该菌株的筛选方法包括：
步骤一、富集：从西安市雁塔区紫薇花园、白沙路路边、博文路广场和甘家寨旁地表以下10cm处采集土壤样品各20g左右，将采集的土壤样品放入烘箱中烘干，将烘干土壤过100目筛，以无菌方式准确称取1g过100目筛的土壤于9mL无菌水中，静置30min后在室温条件下摇床振荡30min，得到稀释度为10-1的土壤悬液；从上述土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-2的土壤悬液；从稀释度为10-2土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-3的土壤悬液；
步骤二、初筛和纯化：取步骤一中稀释度为10-3的土壤悬液0.1mL采用涂布平板法涂布于钾细菌培养基中，置于30℃恒温培养箱内倒置培养5天～7天，将菌落周围出现透明圈的菌株视为有解钾能力的菌株，挑取周围有透明圈的菌株在钾细菌培养基进行多次划线分离纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株(共10株)，将纯化菌株转接到营养琼脂培养基上，于4℃冰箱中保存待用；并将保存的菌株分别标记为WP1-1、WP1-2、WP1-3、WP2-1、WP2-2、WP2-3、WP3-2、WP3-3、WP4-1和WP4-2；所述钾细菌培养基的组成为：葡萄糖10g，碳酸钙5g，磷酸氢二钠(无水)0.2g，七水硫酸锰0.2g，二水硫酸钙0.2g，氯化钠0.2g，琼脂18g，钾长石10g，加入蒸馏水至1000mL，培养基pH为7.2；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，加入蒸馏水至1000mL，培养基pH为7.2～7.4；
步骤三、复筛：将步骤二中保存的菌株活化得到菌悬液，将菌悬液滴加到钾细菌培养基中，30℃培养5天，以1μL无菌水为对照，测量菌株产生的溶钾圈直径D和菌落直径d，并根据D/d值的大小初步确定菌株的解钾能力，结果见表1。
表1透明圈法测定10株菌株的解钾能力
| 溶钾圈直径D/mm | 菌落直径d/mm | 比值D/d | |
| WP 1-1菌株 | 67 | 57 | 1.17 |
| WP 1-2菌株 | 61 | 50 | 1.22 |
| WP 1-3菌株 | 69 | 52 | 1.33 |
| WP 2-1菌株 | 70 | 57 | 1.23 |
| WP 2-2菌株 | 63 | 55 | 1.15 |
| WP 2-3菌株 | 68 | 57 | 1.19 |
| WP 3-2菌株 | 65 | 54 | 1.30 |
| WP 3-3菌株 | 63 | 51 | 1.24 |
| WP 4-1菌株 | 66 | 55 | 1.20 |
| WP 4-2菌株 | 65 | 53 | 1.21 |
| 无菌水 | 0 | 0 | 0 |
结果显示初筛得到的具有分解钾长石能力的10株菌株中WP 1-3菌株的溶钾圈最大，D/d值达到1.33，故WP 1-3菌株解钾能力最强。
3、该菌株的鉴定方法为：
(1)形态学鉴定：将筛选出来的WP 1-3菌株在钾细菌培养基上活化，观察细菌菌落生长特征；用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，记录结果。
结果：WP 1-3菌株菌落呈圆形，杆状菌无色透明，边缘整齐，湿润粘稠，富有弹性。
(2)生理生化鉴定：革兰氏阴性菌。
(3)16SrDNA的扩增与测序：
该菌种的鉴定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
菌种的鉴定过程包括菌株DNA的提取，PCR扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物转化，质粒提取与测序，经纯化后16SrDNA序列在核糖体数据库上比对；其中PCR扩增的引物序列为：
上游引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR扩增的反应体系中，各物质的加入量如下：模板0.5μL，其中基因组DNA浓度为20ng/nL～50ng/nL；10x buffer 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP 1μL，酶0.2μL，10μM的F各1μL，10μM的R1μL，加入双蒸水定容至25μL；扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环后在72℃延伸10min，在4℃下终止反应。
WP1-3菌株16SrDNA序列分析及比对：PCR扩增的产物的片段大小1351pb，测序得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO.3)与GenBank中已发表的根瘤菌相关片段序列有99％同源性。
综合生理生化鉴定结果和16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株WP 1-3为根瘤菌(Rhizobium sp.)。
本发明还提供了上述根瘤菌在土壤解钾中的应用。
进一步的，本发明还提供了上述根瘤菌在分解土壤中难溶性磷中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的根瘤菌WP 1-3菌株源于土壤，该菌株生态安全。
2、本发明的根瘤菌WP 1-3菌株可以用于土壤解钾和分解土壤中难溶性磷。本发明的菌株是以钾长石为钾源筛选出来的优势菌株，该菌株在生长繁殖的过程中可将土壤中硅铝酸盐中的不溶性钾元素转化为可溶性组分，通过测定，本发明的根瘤菌WP1-3的解钾能力可达22.591mg/L。本发明的根瘤菌还可通过促进难溶性有机磷和无机磷的分解来增加土壤中磷元素的来源，测定结果显示本发明的根瘤菌WP1-3分解无机磷能力为4.443mg/L，分解有机磷能力达到22.408mg/L，满足生物体生长代谢过程的需要，从而起到促进植物生长和提高产量的作用。
3、本发明的根瘤菌WP 1-3菌株在具有土壤解钾和分解土壤中难溶性磷的作用以外，还具有固氮作用。本发明的根瘤菌WP1-3在培养7天后的固氮能力达到38.521mg/L，可为植物生长提供丰富的氮素。
4、本发明的根瘤菌WP1-3菌株可以为后续研制生物肥料和生物农药等提供高效、稳定的菌种及基础资料。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
菌株的筛选：
步骤一、富集：从西安市雁塔区紫薇花园、白沙路路边、博文路广场和甘家寨旁地表以下10cm处采集土壤样品各20g左右，将采集的土壤样品放入烘箱中烘干，将烘干土壤过100目筛，以无菌方式准确称取1g过100目筛的土壤于9mL无菌水中，静置30min后在室温条件下摇床振荡30min，得到稀释度为10-1的土壤悬液；从上述土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-2的土壤悬液；从稀释度为10-2土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-3的土壤悬液；
步骤二、初筛和纯化：取步骤一中稀释度为10-3的土壤悬液0.1mL采用涂布平板法涂布于钾细菌培养基中，置于30℃恒温培养箱内倒置培养5天～7天，将菌落周围出现透明圈的菌株视为有解钾能力的菌株，挑取周围有透明圈的菌株在钾细菌培养基进行多次划线分离纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株(共10株)，将纯化菌株转接到营养琼脂培养基上，于4℃冰箱中保存待用；并将保存的菌株分别标记为WP1-1、WP1-2、WP1-3、WP2-1、WP2-2、WP2-3、WP3-2、WP3-3、WP4-1和WP4-2；所述钾细菌培养基的组成为：葡萄糖10g，碳酸钙5g，磷酸氢二钠(无水)0.2g，七水硫酸锰0.2g，二水硫酸钙0.2g，氯化钠0.2g，琼脂18g，钾长石10g，加入蒸馏水至1000mL，培养基pH为7.2；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，加入蒸馏水至1000mL，培养基pH为7.2～7.4；
步骤三、复筛：将步骤二中保存的菌株活化得到菌悬液，将菌悬液滴加到钾细菌培养基中，30℃培养5天，以1μL无菌水为对照，测量菌株产生的溶钾圈直径D和菌落直径d，并根据D/d值的大小初步确定菌株的解钾能力，结果见表1。
结果显示初筛得到的具有分解钾长石能力的10株菌株中WP 1-3菌株的溶钾圈最大，D/d值达到1.33，故WP 1-3菌株解钾能力最强。
菌株的鉴定：
(1)形态学鉴定：将筛选出来的WP 1-3菌株在钾细菌培养基上活化，观察细菌菌落生长特征；用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，记录结果。
结果：WP 1-3菌株菌落呈圆形，杆状菌无色透明，边缘整齐，湿润粘稠，富有弹性。
(2)生理生化鉴定：革兰氏阴性菌。
(3)16SrDNA的扩增与测序：
该菌种的鉴定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
菌种的鉴定过程包括菌株DNA的提取，PCR扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物转化，质粒提取与测序，经纯化后16SrDNA序列在核糖体数据库上比对；其中PCR扩增的引物序列为：
上游引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR扩增的反应体系中，各物质的加入量如下：模板0.5μL，其中基因组DNA浓度为20ng/nL～50ng/nL；10x buffer 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP 1μL，酶0.2μL，10μM的F各1μL，10μM的R1μL，加入双蒸水定容至25μL；扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环后在72℃延伸10min，在4℃下终止反应。
WP1-3菌株16SrDNA序列分析及比对：PCR扩增的产物的片段大小1351pb，测序得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO.3)与GenBank中已发表的根瘤菌相关片段序列有99％同源性。
综合生理生化鉴定结果和16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株WP 1-3为根瘤菌(Rhizobium sp.)。
在土壤解钾、分解土壤中难溶性磷中的应用：
(1)WP1-3菌株分解含钾矿物的能力测定
本实验采用四苯硼钠比色法测定钾元素总量。
在250mL三角瓶中加入150mL钾细菌液体培养基，经高温高压灭菌，然后将WP 1-3菌株按照3％～6％的比例接种到钾细菌液体培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5天～7天后置于离心机中离心，其中离心机转速为2000r/min，离心时间为20min，取离心后的上清液加入甲醛-EDTA掩蔽剂1mL，摇匀，向摇匀后的溶液中加入1mL的四苯硼钠溶液继续摇匀，静置15min后再次摇匀，然后置于1mL比色皿中，于420nm波长处测定吸光度并确定钾元素含量，以加入等体积无菌水的对照组为调零组，结果见表2，可知根瘤菌WP1-3菌株可将含钾矿物分解，WP1-3菌株的解钾能力为22.591mg/L。
所述钾细菌液体培养基的组成为：蔗糖0.75g，钾长石10g，硫酸铵0.15g，磷酸氢二钠(无水)0.3g，加蒸馏水至1000mL。
表2WP1-3菌株分解含钾矿物的测定结果
(2)WP1-3菌株分解无机磷的能力测定
本实验采用钼锑抗比色法测定磷元素含量。
在250mL三角瓶中加入150mL无机磷培养基，经高温高压灭菌，然后将WP 1-3菌株按照3％～6％的比例接种到无机磷培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5天～7天后置于离心机中离心，其中离心机转速为2000r/min，离心时间为20min，取离心后的上清液加入二硝基苯酚指示剂2滴～3滴，并用100g/L氢氧化钠溶液调节至溶液刚呈微黄色，准确加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容后置于室温15℃以上放置30min，然后置于1mL比色皿中，于700nm波长处测定吸光度并确定磷元素含量，以加入等体积无菌水的对照组为调零组，结果见表3，可知根瘤菌WP1-3菌株分解无机磷能力为4.443mg/L。
所述无机磷培养基的组成为：葡萄糖10g，琼脂20g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，四水硫酸锰0.03g，磷酸三钙12g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸铵0.5g，加蒸馏水至1000mL，该无机磷培养基的pH为7.2。
表3WP1-3菌株分解无机磷的测定结果
(3)WP1-3菌株分解有机磷的能力测定
本实验采用钼锑抗比色法测定磷元素含量。
在250mL三角瓶中加入150mL有机磷培养基，经高温高压灭菌，然后将WP 1-3菌株按照3％～6％的比例接种到有机磷培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5天～7天后置于离心机中离心，其中离心机转速为2000r/min，离心时间为20min，取离心后的上清液加入二硝基苯酚指示剂2滴～3滴，并用100g/L氢氧化钠溶液调节至溶液刚呈微黄色，准确加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容后置于室温15℃以上放置30min，然后置于1mL比色皿中，于700nm波长处测定吸光度并确定磷元素含量，以加入等体积无菌水的对照组为调零组，该根瘤菌WP1-3菌株分解有机磷能力达到22.408mg/L。
所述有机磷培养基的组成为：葡萄糖3.506g，蛋白胨0.83g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾0.35g，碳酸钙0.25g，琼脂16g～20g，加蒸馏水定容至1000mL。
(4)WP1-3菌株固氮能力试验
本实验采用微量凯氏定氮法测定菌株固氮能力。
WP 1-3菌种活化后取菌体置于50mL无氮液体培养基中摇床培养，同时取等量灭活菌体和等量无菌水分别加入50mL无氮液体培养基中摇床培养作为对照，所述摇床培养的条件为30℃，160r/min，分别于3天和7天培养结束时利用微量凯氏定氮法测量培养基中的含氮量，结果显示，培养3天后，WP 1-3菌株的固氮能力达到10.825mg/L；培养7天后，WP 1-3菌株的固氮能力达到38.521mg/L。
所述无氮液体培养基的组成为：蔗糖50g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾2g，七水合硫酸镁0.5g，三氯化铁0.005g，碳酸钙0.1g，去离子水定容至1000mL，培养基的pH为7.0～7.5。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西安文理学院
<120> 一种根瘤菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcaagtcga acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaacatac 60
cctttcctgc ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc ctacggggga 120
aagatttatc ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg gtaaaggcct 180
accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca 240
cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 300
tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccggagaa 360
gataatgacg gtatccggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420
acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt 480
aagtcagggg tgaaatccca gagctcaact ctggaactgc ctttgatact gggtatcttg 540
agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg 600
aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 660
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc 720
gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg 780
tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 840
ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggtt tgggcagtgg 900
agacattgtc cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag 1020
catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga 1080
cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag 1140
tgggcagcga gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac 1200
tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt 1260
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttttacccg 1320
aaggtagtgc gctaaccgca aggaggtcag a 1351
Claims (3)
1.一种根瘤菌(Rhizobium sp.)，其特征在于，所述根瘤菌为Rhizobium sp.WP 1-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14472。
2.一种如权利要求1所述的根瘤菌在土壤解钾中的应用。
3.一种如权利要求1所述的根瘤菌在分解土壤中难溶性磷中的应用。
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