CN108728384A - 一种高效降解农药的节杆菌及其筛选和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效降解农药的节杆菌及其筛选和应用，该菌株已于2018年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2018328。本发明菌株能有效降解多菌灵，为解决多菌灵农药残留的问题奠定了基础，也为多菌灵高效降解酶的研发提供了材料。

Description

一种高效降解农药的节杆菌及其筛选和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的节杆菌(Agrobacterium)，具体涉及一种能够降解多菌灵(carbendazim，MBC)的节杆菌(Arthrobacter sp.)菌株及其筛选分离以及该菌对农药的降解应用。

背景技术

多菌灵(carbendazim)，又名棉萎灵、贝芬替、苯并咪唑44号，英文商品名MBC，相对分子质量为191.2，分子式为:C₉H₉N₃0₂，化学结构式如下:

多菌灵是广谱性杀菌剂，2011年以来，每年使用量约在4万吨，2012年其登记的产品数达857个，剂型包括原药、粉剂、悬浮剂、可湿性粉剂、悬乳剂、种衣剂等近十种。在我国，多菌灵广泛应用于小麦、果树、茶叶、蔬菜等病害的防治，还用于水果的采后保鲜。在农业上，主要用于防治麦类赤霉病、水稻纹枯病、稻瘟病、菌核病；果树和蔬菜的白粉病、炭疽病、黑星病、灰霉病等；种苗处理可防治禾谷类作物黑穗病和瓜类、番茄枯萎病等。工业上，多菌灵可用于纺织、造纸、皮革、橡胶等材料的防霉防腐。另外，苯菌灵、苯并咪唑类和托布津类杀菌剂在土壤中和作物体中也是通过转化为多菌灵而起作用。

多年来大量连续使用内吸性杀菌剂多菌灵，使得许多植物病菌对其产生了抗药性，如黄瓜灰霉病菌，油菜菌核病菌，番茄灰霉菌，稻瘟病菌，芒果炭疽病菌等。为了达到防治效果，农民加大了施用量，致使土壤中多菌灵含量经积累作用达到了很高的浓度，也导致了其在农产品中的残留量严重超标的问题。我国GB18406.1-2001标准规定，蔬菜水果中多菌灵残留量不得超过0.5mg/kg。2007年，欧盟委员会发布2007/12/EC指令，修订了苯菌灵(Benomyl)、多菌灵(Carbendazim)、戊菌唑(Penconazole)三种杀菌剂的残留限量，值得关注的是，多菌灵和苯菌灵在柑橘中的限量指标由原来的5mg/kg修订为0.05mg/kg，严格了100倍，食用菌类中的最大残留限量由1mg/kg调整为0.1mg/kg，严格了10倍。由于多菌灵在环境中的稳定性和长期性，因此，通过自然迁移和生物链传播，对土壤、植物、动物和地下水生产了很大影响。尤其是饮用水和农产品中多菌灵污染超标严重，已对直接或间接接触多菌灵的人和动物的健康构成了严重威胁。

多菌灵的毒性作用包括以下4方面：(1)致癌、致突变毒性：小鼠试验证实多菌灵会诱发小鼠肝脏癌变，然而结合其他试验数据，植物科学委员会(Scientific Committee onPlants)认为由多菌灵引起小鼠肝脏肿瘤不足以得出多菌灵对人也有致癌作用的推论。但是，多菌灵确实对染色体具有致突变能力，有学者测验了多菌灵对人类淋巴细胞培养物的影响，结果发现多菌灵是一种作用很强的非整倍体剂，即使是在低剂量的情况下，也会影响染色体的数量。这是因为多菌灵能抑制微管蛋白的聚合，而微管蛋白对细胞分裂中染色体的分离具有重要作用。(2)生殖毒性：多菌灵是一种内分泌干扰素，能破坏哺乳动物子宫发育，干扰成年鼠的精子和睾丸发育。研究发现多菌灵作用剂量超过50mg/kg时，明显可见大鼠睾丸的重量减轻、生精小管萎缩和输精小管闭锁。倘若大鼠在交配前接触过多菌灵，雌性后代会表现出雄激素特性的发育毒性，如没有阴道、子宫角不完全发育等，表明多菌灵的毒性作用可能与雄激素和雄激素受体依赖机制有关。(3)胚胎毒性：让喂食多菌灵饲料60d的雄性小鼠与正常雌性小鼠交配，发现虽然雌性小鼠的受孕率和平均着床数没有受到明显影响，但死胎率有所增加。若使6～15d的孕鼠染上多菌灵，35mg/kg的剂量便可产生明显的胚胎毒性，表现为吸收胎增多、活胎数减少、胎儿体重减轻，甚至胎儿畸形，若剂量增加到160mg/kg，则无胎儿形成。(4)其他毒性作用：多菌灵对蜜蜂无毒，对鸟类低毒。对鱼类和其他水生生物有毒性，例如淡水鱼、蓝鳃太阳鱼、糠虾和水生无脊椎动物的LC₅₀分别为0.36mg/L、5.5mg/L、0.098mg/L和0.087mg/L。因为水中的沉积物会吸附多菌灵，所以毒性通常不会太高，但依赖沉积物生存的生物很可能会受到高剂量多菌灵的影响。土壤有机物对多菌灵有强烈的吸附作用，导致土壤中蚯蚓和线虫数目减少。

多菌灵化学性质稳定、低于50℃时至少可稳定两年；在碱性溶液中缓慢分解，随pH值升高，分解加快，而在酸性溶液中稳定。在水环境中可被紫外光解，而在土壤环境中，可与土壤颗粒不同程度的结合，主要靠微生物的降解，其半衰期在裸露的土壤中为6～12个月，在有植被的土壤中为3～6个月。微生物降解是目前有机农药残留最主要的去除途径。

我国是农业大国，同时也是农药生产和使用大国，每年农药的使用量达50万t，其中约有80％的农药直接进入环境，受农药污染的耕地面积至少有1300～1600万公顷。分离和筛选高效农药降解菌，将有助于解决土壤农药污染严重的问题，减少通过地表径流或农田渗漏形成的农药对水环境的污染，提高农产品质量安全，促进我国农业的可持续发展。

发明内容

鉴于现存多菌灵降解微生物的数量局限性，本发明的目的在于提供一种对多菌灵具有高效降解效率的新型降解菌株，它能有效地降解农药多菌灵，为多菌灵农药残留问题的解决奠定了基础，也为多菌灵高效降解酶的研发提供了材料。

为实现上述技术目的，本发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终创造性地从连续多年施用多菌灵的土壤中分离获得了一种对多菌灵具有高效降解效率的新型降解菌株，具体地，本发明的技术方案概括如下：

一种能够有效降解多菌灵的节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H菌株，该菌株已于2018年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2018328，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学校内，邮编430072。

本发明的节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H是按照如下方法筛选得到的：

(1)多菌灵降解菌的筛选、分离与纯化

取农田常年施用多菌灵的新鲜的土样样品，投于多菌灵为唯一碳源的富集培养基，周期性的提高多菌灵浓度至300mg/L，进行富集驯化培养，取10^-1～10^-11梯度稀释的驯化富集培养液进行菌的分离纯化培养，得土壤中的多菌灵降解菌纯化菌种djl-7H。

(2)多菌灵降解菌djl-7H的鉴定

通过5000倍扫描电镜对多菌灵降解菌djl-7H的微观形态学进行了鉴定。生理生化测定指标包括：标接触酶、淀粉水解、吲哚试验、革兰氏染色、甲基红、V-P和3-酮基乳糖的指标测定。djl-7H的16S rDNA分子学鉴定委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行，得到长为1372bp的16S rDNA序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。应用ClustalX 1.83 version和MEGA 4.0软件采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树(如图3所示)。根据形态学特征、系统发育分析，并结合文献报道，确定菌株种属类型。

(3)多菌灵降解菌对多菌灵的降解测定

接种纯化的多菌灵降解菌djl-7H于降解培养基中，定时取样后进行HPLC-MS测定，通过多菌灵的含量测定确定多菌灵降解菌djl-7H对多菌灵的降解效率，并进一步通过质谱分析确定多菌灵降解菌djl-7H对多菌灵的降解产物。

本发明的节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H具有如下培养特征：牛肉膏蛋白胨培养基50℃培养24h，菌落呈圆形，乳白色，半透明状，凸起，边缘完整，表面光滑，湿润，粘稠不易挑，菌落大小为(0.3-0.5)cm×(0.3-0.5)cm(如图1所示)。于1000倍显微镜观察得到的形态特征为：杆状有少量鞭毛，菌体大小为0.2-0.5μm，1.0-3.0μm，在培养基上生长较迅速(如图2所示)。

另外，试验结果表明，节杆菌djl-7H菌株可高效降解多菌灵，因此本发明提供了上述节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H菌株在降解农药多菌灵方面的应用。

相比现有技术，本发明具有如下优点和显著进步性：本发明首次分离筛选出具有高效降解多菌灵的节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H，可用于高效降解农药多菌灵，有助于解决土壤中多菌灵污染严重的问题，减少通过地表径流或农田渗漏形成的多菌灵对水环境的污染，提高农产品质量安全，从而促进我国农业的可持续发展。

附图说明

图1多菌灵降解菌djl-7H菌株的单个菌落形态照片；

图2多菌灵降解菌djl-7H 5000倍扫描电镜照片；

图3利用MEGA软件构建多菌灵降解菌djl-7H系统进化树结构图；

图4降解菌djl-7H对多菌灵的降解曲线；

图5降解菌djl-7H对多菌灵的降解产物HPLC-MS分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明和解释本发明，而不应视为限定本发明的保护范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的一般文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1菌株djl-7H的筛选、分离与纯化

(1)样品采集：供试土壤采于西北农林科技大学园艺学院连续施用多菌灵的温室大棚土壤，目标菌株从所采集供试土壤中分离纯化所得。

(2)培养基：

a)LB液体培养基：NaCl 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，加入蒸馏水1000mL，调节pH值为7.0。

b)基础盐培养基：NaCl 1.0g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0。

c)LB固体培养基：同LB液体培养基，加入1％～2％的琼脂。

d)富集(降解)试验用培养基：同基础盐培养基，按需添加多菌灵。

e)分离纯化培养基：同富集(降解)试验用培养基，加入1％～2％的琼脂。

以上培养基使用前均需121℃高压灭菌30min。

(3)多菌灵降解菌株的富集分离与纯化：

a)在250mL的三角瓶中加入100mL富集培养基，同时加入5mg的多菌灵作唯一碳源，其浓度为50mg/L。调节pH为6.5后，121℃高压灭菌30min，放凉后，取新鲜土样样品10g加入(设6个平行，以不加新鲜土样样品为对照)，并加入适量灭菌玻璃珠，在30℃，150r/min摇床上培养5d。静置30min；

b)将步骤a中驯化富集培养5天后的样品从摇床取下，静置30min后用灭菌的移液管吸取上层菌悬液，以5％的接种量吸取上层菌悬液，接种到100mL富集培养基中，提高多菌灵浓度到100mg/L，同样培养条件下摇床培养5d。

c)方法同步骤b)，按每次50mg/L的增加量提高多菌灵浓度，循环驯化培养约一个月，加大多菌灵浓度直至300mg/L。

d)取最后一次驯化的富集培养液进行梯度稀释(10^-1～10^-11)，每个梯度设3个重复，涂布于含有多菌灵200mg/L的分离纯化培养基上，30℃培养，依次循环重复步骤c与步骤d的分离过程，直至在分离纯化培养基上明显观察到纯种菌株的单菌落出现。

e)用接种环挑取步骤d中在分离纯化培养基中生长快，菌落规则的单菌落，在含有多菌灵200mg/L的分离纯化培养基平板上划线分离，30℃培养。重复划线实验2-3次，待平板上出现长势良好且传代稳定的单菌落后，于4℃斜面保存。

实施例2菌株djl-7H的鉴定试验

(1)形态学特征

djl-7H菌株的菌落呈圆形，乳白色，半透明状，凸起，边缘完整，表面光滑，湿润，粘稠不易挑，菌落大小为(0.3-0.5)cm×(0.3-0.5)cm(如图1)。

形态学观察：采用光学显微镜和扫描电镜对供试菌株的形态进行观察，其形态特征为：杆状有少量鞭毛，菌体大小为0.2-0.5μm，1.0-3.0μm，在培养基上生长较迅速。(如图2)。

生理生化指标：参照《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》、《常见细菌系统鉴定手册》。具体测定指标包括：标接触酶、淀粉水解、吲哚试验、革兰氏染色、甲基红、V-P和3-酮基乳糖的指标测定。具体测定结果如表1所示。

表1菌株djl-7H的生理生化指标测定结果

(2)分子学鉴定：

(a)DNA的提取取活化后菌株分别接种于50mL牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃、150r/min振荡培养48h，12000r/min离心5min，收集菌体，4℃保藏备用。提取步骤参照《AxyPrep基因组DNA小量试剂盒》(见附录5)。

(b)16S rDNA的PCR扩增用上步所提菌体DNA作为PCR扩增模板；

所用引物序列如下：

P1：27f5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’20bp

P2：1492r 5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’19bp

扩增反应体系如下：

反应条件：98℃5min，95℃35s，55℃35s，72℃90s，进行35cycles；72℃8min。PCR结束后，吸取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确的扩增产物委托北京奥科生物科技有限公司进行测序。

鉴定菌株的16S rDNA序列在Genbank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中用BLAST进行同源性比较。应用Clustal X 1.83 version和MEGA 5.1软件采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树(如图3)。djl-7H菌株的遗传进化距离与Arthrobacter sp.属最近，说明该菌在分子系统发育分类学上节杆菌djl-7H。

最终根据形态学特征、生理生化检验及系统发育分析，并结合文献报道，确定该菌为Arthrobacter sp.属菌，命名为djl-7H。

实施例3节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H对多菌灵的降解试验

(1)种子液的制备

挑取一环菌体，接种至装有LB液体培养基的三角瓶中，30℃下振荡培养24h左右；用灭菌的LB液体培养基调整其OD₆₀₀均为1.0，移取5mL菌液至10mL的离心管中，在4℃、4000r/min下离心5min，收集菌体；用灭菌的基础盐培养基洗涤2次后，用等体积的灭菌基础盐培养基悬浮，备用。

(2)多菌灵的降解试验

在降解试验用培养基中加入100mg/L的多菌灵，以5％接种量分别接入多菌灵降解菌djl-7H种子液，于25℃、150r/min振荡培养。培养每隔6h分别定时取样，直至培养至72h时，用HPLC-MS检测培养液中的多菌灵及代谢产物。

多菌灵及代谢产物测定：将培养液于12000×g离心15min，上清液装入具塞有刻度的试管中，加入等体积丙酮，振荡2min后，加入固体NaCl至溶液饱和后，放入热水浴中加热，使水相和NaCl沉淀中的丙酮分层。取出丙酮相于试管中，在室温下用氮气吹干，然后用色谱纯甲醇溶解定容，用HPLC-MS分析。

分析采用液质联用质谱仪：LCQ DECA XP Plus质谱仪；C18反相柱：(5C₁₈-MS-Ⅱ，2.0nm×150mm)；流动相为甲醇：水＝1：1(体积比)，流速为0.8mL·min-1，检测波长286nm。采用电喷雾离子化源，正离子检测方式对代谢产物进行液质联用分析。

降解试验结果如图4所示，djl-7H菌株可以多菌灵为唯一碳源生长并同时对多菌灵产生降解，在降解初期，djl-7H菌株对多菌灵的降解较慢，随着时间的推移降解速率呈上升趋势，到36h菌的生长达到对数生长期时，菌株对多菌灵的降解率速率也达最快，降解60h后，菌株对多菌灵的降解基本结束，降解速率缓慢并保持平稳。

采用HPLC-MS技术分析了djl-7H降解菌对多菌灵的降解产物，结果如图5所示。djl-7H株降解菌能有效降解多菌灵，对多菌灵的降解产物中检测到了质荷比m/z 134[M+H]⁺的2-氨基苯并咪唑(2-AB)和质荷比m/z 135[M+H]⁺的2-羟基苯并咪唑(2-HB)。进一步说明节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H可对多菌灵产生有效的降解作用。

序列表

<110> 宝鸡文理学院

<120> 一种高效降解农药的节杆菌及其筛选和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1372

<212> DNA

<213> 节杆菌(Arthrobacter sp. djl-7H)

<400> 1

caaggtggtt aggccatcgg cttcgggtgt taccaacttt cgtgacttga cgggcggtgt 60

gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag cgttgctgat ctgcgattac tagcgactcc 120

gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt tagggattag 180

ctccacctca cagtatcgca acccattgta ccggccattg tagcatgcgt gaagcccaag 240

acataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt 300

ctcccatgag tccccaccac tacgtgctgg caacatggaa cgagggttgc gctcgttgcg 360

ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtgaacca 420

gccccgaagg gaaaccccat ctctggagcg gtctggcaca tgtcaagcct tggtaaggtt 480

cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540

ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg cacttaatgc gttagctacg 600

gcgcggaaaa cgtggaatgt cccccacacc tagtgcccaa cgtttacggc atggactacc 660

agggtatcta atcctgttcg ctccccatgc tttcgctcct cagcgtcagt aaatgcccag 720

agacctgcct tcgccatcgg tgttcctcct gatatctgcg catttcaccg ctacaccagg 780

aattccagtc tcccctacat cactctagtc tgcccgtacc caccgcagat ccgaggttga 840

gcctcggact ttcacggcag acgcgacaaa ccgcctacga gctctttacg cccaataaat 900

ccggataacg cttgcgccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccggcgct 960

tcttctgcag gtaccgtcac tttcgcttct tccctactga aagaggttta caacccgaag 1020

gccgtcatcc ctcacgcggc gtcgctgcat caggcttccg cccattgtgc aatattcccc 1080

actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc ggtcaccctc 1140

tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacaa gctgataggc 1200

cgcgagtcca tcccccaccg ataaatcttt caacaaccca ccatgcggtg aaaagtcata 1260

tccggtatta gacccagttt cccgggctta tcccaaagtc gggggcaggt tactcacgtg 1320

ttactcaccc gttcgccact aatccaccca gcaagctggg cttcatcgtt cg 1372

Claims (6)

1.一种节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H菌株，其保藏号为CCTCC NO.M 2018328。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，它的培养特征为：牛肉膏蛋白胨培养基50℃培养24h，菌落呈圆形，乳白色，半透明状，凸起，边缘完整，表面光滑，湿润，粘稠不易挑，菌落大小为(0.3-0.5)cm×(0.3-0.5)cm。

4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，于1000倍显微镜观察得到的形态特征为：杆状有少量鞭毛，菌体大小为0.2-0.5μm，1.0-3.0μm，在培养基上生长较迅速。

5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，接触酶、淀粉水解和吲哚试验结果呈阳性，甲基红、V-P和3-酮基乳糖测定结果呈阴性。

6.权利要求1所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)djl-7H菌株在降解农药多菌灵中的应用。