CN107446022B - 一种可拮抗parp1蛋白rna结合活性的多肽pip-14及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽PIP-14及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。

背景技术

肿瘤严重影响着人类的健康，是世界范围内一个主要的致死因素。目前已有的抗肿瘤方法虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在疗效低、选择性差、毒副反应大、易产生耐药等问题。因此，寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。

肿瘤靶向治疗是指在分子水平上，通过药物靶向作用于肿瘤细胞，使其特异性死亡，而不影响正常组织细胞。与传统细胞毒化疗不一样，肿瘤分子靶向治疗具有特异性抗肿瘤作用，且毒性明显减少。肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收，还可以通过提高机体免疫功能，抑制肿瘤的生长和转移，增强抗肿瘤作用，因此，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。例如，抗肿瘤尿蛋白(ANUP)是人体尿液中一种具有抗肿瘤和抗血管生成作用的蛋白质。Kathleen等人工合成了与ANUP的N端同源的2个多肽，发现对人宫颈癌细胞HeLa的抑制率达到70％，鸡胚胎尿绒毛膜试验结果表明，这2个多肽都具有抑制血管生成的作用。

人多聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)广泛表达于肿瘤细胞中，其主要参与DNA损伤修复，影响放化疗药物的作用。研究表明：对PARP1活性的抑制可增加放化疗的敏感性。PARP1在肿瘤中的广泛表达使得它成为肿瘤治疗的潜在靶标。

人类PARP1蛋白由1014个氨基酸残基组成，相对分子量为116kDa，含有四个功能域(图1)，即N端的DNA结合区(包括三个锌指结构域ZnⅠ、ZnⅡ、ZnⅢ)、C端的催化域(CAT)、中间的自修饰域(BRCT)与RNA结合域(WGR)。经典的PARP1抑制剂如PJ-34通过抑制PARP1的酶活性，从而达到抗肿瘤的作用。其中，WGR结构域是一段由79个氨基酸组成的活性区域，存在于polyA聚合酶和调控大肠杆菌钼酸盐代谢的因子中,目前推测该区域具有结合核酸的能力。对WGR进行靶向阻遏，能够影响蛋白质-核酸复合物的形成，从而达到治疗肿瘤的作用。多肽代谢快、无毒副作用的特点对靶向治疗药物的研发具有指导意义，有望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。靶向PARP1蛋白WGR结构域的多肽尚未见报道。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

为解决以上问题，发明人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

基于该研究，本发明提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌蛋白PARP1与RNA的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。

本发明还提供了上述可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接PARP1的RNA结合活性肽段后，有明显的抑制肿瘤活性的作用。

附图说明

图1为PARP1蛋白的结构域示意图；

图2为对照肽和PIP-14处理肿瘤细胞48小时后的荧光显微镜照片；

图3为PC-3细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图；

图4为SH-SY5Y细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图；

图5为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理PC-3细胞不同时间的细胞活性统计图；

图6为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理SH-SY5Y细胞不同时间的细胞活性统计图；

图7为平板克隆形成实验照片；

图8为根据图7计算的细胞克隆数的统计图；

图9为软琼脂克隆形成实验照片；

图10为根据图9计算的细胞克隆数的统计图；

图11为Transwell细胞侵袭实验照片；

图12为根据图11计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；

图13为肿瘤细胞的血管形成活性抑制实验照片；

图14为根据图13计算的肿瘤细胞的相对血管形成活性统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.抗肿瘤多肽的合成

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQ ID NO:1所示，穿膜结构域序列如SEQ IDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-DIVKGTNSYYKLQK(SEQ ID NO:3)，命名为PIP-14。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin。

2.PIP-14的细胞定位检测

取对数期生长的肿瘤细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔10000个细胞种植于内置无菌爬片的24孔板内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后加入20μmol/L的多肽，维持48小时。弃去上清，1×PBS洗两次后采用4％多聚甲醛固定，室温固定30分钟后弃甲醛，用1×PBS洗两次，然后采用DAPI染核，3-5分钟后再次用1×PBS洗两次，然后纯甘油制片，整个操作过程均要求严格避光；制片结束后在激光共聚焦显微镜下观察带有FITC荧光基团的多肽在细胞内的定位。实验结果如图2所示，PIP-14能够有效被细胞摄取，并积聚于肿瘤细胞的细胞核，呈现强胞核染色。

3.MTT比色法分析检测PIP-14对肿瘤细胞生长的抑制作用

取对数生长期的SH-SY5Y、PC-3细胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至5×10⁴个/ml，然后加入96孔板中，每孔100μl。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。培养24小时后，细胞完全贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μl的含有不同浓度多肽的DMEM基础培养基，并以另一合成多肽为对照组，将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。48小时后吸出培养液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl；于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

48小时后吸出培养液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl；于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。4小时后，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15min。在OD_490nm用酶标仪处测量各孔的吸光值，计算IC50。

结果如图3-6所示，该多肽能显著抑制SH-SY5Y和PC-3细胞的增殖活性，且呈剂量依赖性，经计算IC50约为50μmol/L，而对照肽无此抑制作用(图3和4)。用50μmol/L剂量的多肽，处理不同时间，显示出时间依赖性(图5和6)

4.克隆形成实验检测PIP-14对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用

取经对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞，用0.25％的胰酶消化并吹打成单个细胞。细胞计数，并用培养基调整细胞浓度。将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别以每孔100、200、500个细胞的梯度密度接种于含2ml培养基的六孔板中，并轻轻摇动，使细胞分散均匀。将多肽按照50μmol/L浓度加入培养基中。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养2周左右。当培养孔中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，用PBS洗3次。加入4％多聚甲醛室温固定细胞15分钟，然后弃去多聚甲醛，用PBS洗3次，每次5分钟。加入适量考马斯亮蓝，染色30分钟后吸去染液，然后用清水洗去染色液，空气干燥，将平皿倒置在显微镜下计数。

实验结果如图7和8所示，与对照组多肽相比，PIP-14多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。

5.软琼脂克隆形成实验

取多肽处理的对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，每孔加入300个细胞。用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持40℃ 温度，以防凝固。按1:1比例使1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液加入六孔板中，冷却凝固，作底层琼脂。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱备用。按1:1比例使0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基混合后，再加入适量的细胞悬液，充分混匀，注入铺有底层琼脂的培养板中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养3-4周。向六孔板中加入5mg/ml MTT溶液，4℃染色4小时后，取出观察照相。计数细胞克隆形成数目(每个克隆至少50个细胞)。

结果如图9和10所示，与对照组多肽相比，PIP-14多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。

6.Transwell实验检测PIP-14对肿瘤细胞迁移活性的影响

在24孔培养板中加入完全培养基，将Transwell小室放入孔中。取经多肽处理的对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数。每孔加入2.5×10⁵个细胞。将24孔板置于恒温37℃、5％CO₂细胞培养箱内，培养24小时。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍。甲醇固定20分钟，将小室风干。0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻擦掉上层未穿过小孔的细胞。显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

结果如图11和12所示，与对照组多肽相比，PIP-14处理的肿瘤细胞的迁移个数明显降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的迁移能力。

7.PIP-14抑制肿瘤细胞血管生成活性检测

在6孔板中PC-3细胞以80％密度铺板，每孔加入2ml培养基，再加入多肽，同时设对照孔。在37℃、5％CO₂环境培养48小时，收集培养孔内的上清液。实验前一天，从-80℃取出基质胶，放置冰上过夜溶解。取48孔细 胞培养板，每孔加入150μl基质胶至孔底，水平放置于37℃培养箱30分钟，待基质胶凝固。制备HUVEC单细胞悬液，计数后，向48孔板每孔加入约6000个细胞，再加入收集的上清100μl。在37℃、5％CO₂环境培养4-6小时，在倒置显微镜下动态观察HUVEC小管形成状态，适时拍照。

结果如图13和14所示，与对照肽相比，PIP-14能显著抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽PIP-14及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Val Lys Gly Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Gly

1 5 10 15

Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Lys

20 25

Claims (6)

1.一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗人神经母细胞瘤药物和抗人前列腺癌药物中的应用。

3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗人神经母细胞瘤药物和抗人前列腺癌药物中的应用。

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