+

CN107106493A - 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取 - Google Patents

球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取 Download PDF

Info

Publication number
CN107106493A
CN107106493A CN201580073536.9A CN201580073536A CN107106493A CN 107106493 A CN107106493 A CN 107106493A CN 201580073536 A CN201580073536 A CN 201580073536A CN 107106493 A CN107106493 A CN 107106493A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polynucleotide
nanoparticle
sna
domain
poly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580073536.9A
Other languages
English (en)
Inventor
C.A.米尔金
C.H.J.蔡
S.P.纳拉延
L.郝
E.欧阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern University
Original Assignee
Northwestern University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern University filed Critical Northwestern University
Publication of CN107106493A publication Critical patent/CN107106493A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供了由附着至纳米颗粒表面的密集填充的高度取向的多核苷酸链组成的球形核酸(SNA)，其能够克服核酸递送的典型挑战。本公开内容证明相对于富含其他核苷酸的SNA，富含G的SNA显示出进入细胞内的高几倍的摄取。本公开内容提供了使SNA的细胞内递送达到最大的有效策略，其适用于其他纳米颗粒系统，因此建立了对于基于纳米颗粒的治疗剂的细胞内递送的重要设计考虑。

Description

球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年11月21日提交的美国临时申请号62/083,092的优先权利益，所述美国临时申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。
政府利益声明
本发明在由空军科学研究办公室(Air Force Office of Scientific Research)授予的授权号FA9550-11-1-0275；以及由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号U54CA151880和U54 CA159341下由政府支持作出。政府在本发明中拥有一定的权利。
电子提交材料以引用的方式并入
本专利申请包含以计算机可读形式的序列表作为本公开内容的分开部分，所述序列表以引用的方式全文并入，并且标识如下：文件名：2014-183_Seqlisting.txt；10,070字节，于2015年11月20日创建。
技术领域
本公开内容涉及用影响球形核酸(SNA)纳米颗粒通过细胞摄取的多核苷酸和核苷酸序列表面功能化的SNA纳米颗粒。
背景技术
球形核酸纳米颗粒缀合物(SNA)是显示出与线型核酸相比根本不同性质的一类生物纳米材料。SNA由高度取向的寡核苷酸链组成，其密集地填充到纳米颗粒核的表面上[Cutler等人，J Am Chem Soc 134：1376-1391(2012)]。与单链DNA不同，SNA可自然地进入哺乳动物细胞内而无需阳离子或亲脂转染试剂的帮助，尽管它们具有高负电荷[Rosi等人，Science 312：1027-1030(2006)]。SNA的强大的细胞摄取性质提供了关于开发细胞内诊断[Seferos等人，J Am Chem Soc 129：15477-15479(2007)]和基因调节[Giljohann等人，JAmChem Soc 131：2072-2073(2009)]工具的潜力，而没有传统上与阳离子或亲脂试剂相关的毒性或免疫应答[Massich等人，Mol Pharm 6：1934-1940(2009)]。实际上，SNA在体外和体内调节目的基因的能力已得到证明[Zheng等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.109：11975-11980(2012)；Jensen等人，Sci Transl Med 5，209ra152(2013)]。
机制研究已经将A类清道夫受体(SR-A)鉴定为负责识别这种结构的主要细胞受体，并且SNA与SR-A的结合导致质膜微囊介导的胞吞作用[Choi等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.110：7625-7630(2013)]。富含鸟苷酸(G)的线型核酸天然被SR-A识别，这已被提出是由于它们折叠成称为G-四链体(G-quadruplex)的二级结构的能力[Pearson等人，J BiolChem 268：3546-3554(1993)]。相比之下，腺苷酸(A)、胸苷酸(T)和胞苷酸(C)的线型聚合物不折叠成被SR-A识别的二级结构，并且像这样，它们不是天然配体[Pearson等人，J BiolChem 268：3546-3554(1993)]。
发明内容
由于它们的多价体系结构，SNA的细胞相互作用不仅取决于纳米结构的尺寸，还取决于配体呈递[Giljohann等人，Nano Lett 7：3818-3821(2007)]。不受理论的束缚，考虑SNA能够进入细胞而无需辅助转染试剂，因为SNA体系结构模拟了该二级结构形成。另外，本公开内容提供了在SNA与SR-A的相互作用和随后的细胞摄取中起重要作用的寡核苷酸序列。
相应地，本文提供的是用多核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒，结构域(i)位于对于纳米颗粒远侧的多核苷酸的末端处，和(ii)包含为至少50％但小于100％鸟苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，结构域位于多核苷酸的5′末端处。在进一步的实施例中，结构域位于多核苷酸的3′末端处。在再进一步的实施例中，结构域位于多核苷酸内的内部区域处。在各种实施例中，结构域长度为约2至约50个核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是DNA。在进一步的实施例中，多核苷酸是RNA。在再进一步的实施例中，结构域包含至少三个(GGX)基序。在一些实施例中，X是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些实施例中，X是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。在某些实施例中，X是鸟苷酸。在一些实施例中，X不是鸟苷酸。在进一步的实施例中，X是经修饰的核苷酸。
在一些实施例中，纳米颗粒用另外的多核苷酸功能化。在进一步的实施例中，另外的多核苷酸包含结构域。在一些实施例中，另外的多核苷酸是DNA。在进一步的实施例中，另外的多核苷酸是RNA。
在各种实施例中，结构域包含聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列，其包含多于一个鸟苷酸。在进一步的实施例中，结构域包含聚鸟苷酸(聚G)序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个鸟苷酸核苷酸。
在一些方面，本公开内容还提供了增加多核苷酸功能化的纳米颗粒的细胞摄取的方法，其包括修饰纳米颗粒以进一步包含结构域的步骤，与缺乏结构域的多核苷酸功能化的纳米颗粒相比，所述结构域增加所述寡核苷酸功能化的纳米颗粒的细胞摄取。在一些实施例中，结构域包含聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列，其包含多于一个鸟苷酸。在进一步的实施例中，结构域包含聚G序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个鸟苷酸核苷酸。在一些实施例中，结构域位于多核苷酸的5′末端处。在一些实施例中，结构域位于多核苷酸的3′末端处。在再进一步的实施例中，结构域位于多核苷酸内的内部区域处。在一些实施例中，结构域与多核苷酸共线(colinear)。在各种实施例中，多核苷酸是DNA。在一些实施例中，多核苷酸是RNA。
考虑本公开内容的方法中的任一种均用如本文公开的多核苷酸功能化的纳米颗粒进行。
在本公开内容的进一步方面，提供了用多核苷酸功能化的纳米颗粒，其中多核苷酸的远端以包含至少三个(GGX)基序的序列终止。在一些实施例中，至少三个(GGX)基序位于多核苷酸的5′末端上。在进一步的实施例中，至少三个(GGX)基序位于多核苷酸的3′末端上。在一些实施例中，X是脱氧核糖核苷酸，并且在进一步的实施例中，X是核糖核苷酸。在再进一步的实施例中，X是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。本公开内容还考虑在一些实施例中，X是经修饰的核苷酸。
在各种实施例中，纳米颗粒用另外的多核苷酸功能化。在一些实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是DNA。在进一步的实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是RNA。在再进一步的实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是siRNA。
在本公开内容的方面或实施例的任一个中，SNA具有净负电荷。
在一些方面，本公开内容提供了增加多核苷酸功能化的纳米颗粒的细胞摄取的方法，其包括修饰多核苷酸使得多核苷酸的远端(即，与使纳米颗粒功能化的末端相反的末端)以包含至少三个(GGX)基序的序列终止的步骤，其中与缺乏修饰的多核苷酸功能化的纳米颗粒相比，包含修饰的多核苷酸功能化的纳米颗粒的摄取增加。在一些实施例中，至少三个(GGX)基序位于多核苷酸的5′末端上。在进一步的实施例中，至少三个(GGX)基序位于多核苷酸的3′末端上。在另外的实施例中，纳米颗粒用另外的多核苷酸功能化。在相关实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是DNA。在一些实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是RNA。在进一步的实施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是siRNA。在一些实施例中，细胞是原核细胞。在进一步的实施例中，细胞是真核细胞。在相关实施例中，真核细胞是人细胞。
在一些实施例中，本公开内容还提供了方法，其中所述多核苷酸包含与靶多核苷酸序列充分互补的序列，以在合适的条件下与靶多核苷酸序列杂交。在进一步的实施例中，另外的多核苷酸包含与靶多核苷酸序列充分互补的序列，以在合适的条件下与靶多核苷酸序列杂交。在相关实施例中，杂交导致靶多核苷酸的检测。在再进一步的实施例中，杂交导致靶基因表达的抑制。
附图说明
图1a-1b显示了SNA的表征。1a)该表列出了使用基于荧光的测定在10nm金纳米颗粒上负载寡核苷酸。聚T SNA在所有核碱基类型中含有最高负载，而聚A SNA具有最低负载。1b)通过乙酸双氧铀染色SNA清楚地描绘了通过TEM成像在金纳米颗粒核(黑色)周围的DNA寡核苷酸壳(白色)。壳的厚度与从基于荧光的测定获得的寡核苷酸负载数据相关联。比例尺＝50nm。
图2描绘了动态光散射分析。由不同核碱基类型组成的寡核苷酸链共价附着到10nm AuNP的表面上使流体动力学直径增加了10-15nm，指示寡核苷酸壳的厚度为5-8nm。
图3显示了SNA的UV-Vis吸收光谱。DNA寡核苷酸壳与AuNP核的共价附着导致表面等离子体峰中的红移，从对于未经修饰的柠檬酸盐封端的AuNP的519nm到524nm，与壳包含的核碱基类型无关。
图4a-4b描绘了寡核苷酸负载的测量。4a)Cy5标记的SNA用于定量聚A、聚T、聚C和聚G SNA的负载。通过添加1M二硫苏糖醇(DTT)还原Au-硫醇键从AuNP的表面释放Cy5标记的单链DNA(Cy5-ssDNA)，并且允许通过Cy5荧光的定量。4b)Cy5部分附着到组成成分寡核苷酸的5′末端。
图5a-5c描绘了SNA的细胞摄取。5a)聚G SNA显示与C166细胞的最高结合，是由其他核碱基类型组成的SNA的4-10倍。5b)通过TEM成像，聚G SNA显示出在C166细胞内的最高累积，如其作为大簇(＞100/簇)在细胞溶质各处广泛分布所证明的。相比之下，由其他核碱基类型组成的SNA或者在细胞溶质的较为局限的区域中累积，或者出现在包含较少颗粒的簇(＜20个颗粒/簇)中。底行显示顶行的加框区域的放大图像。5c)聚G SNA还证明除C166之外的其他三种细胞系的最高结合，以SR-A的表达水平的递减次序包括HaCaT(永生化人角质形成细胞)、3T3(小鼠成纤维细胞)和A549(人肺上皮腺癌)。对于所有细胞类型，与其他核碱基类型的SNA相比，聚G SNA显示出3-5倍高的与细胞结合。聚G SNA与细胞的结合对于相同细胞类型与SR-A表达水平正相关。误差条指示来自一式三份测量的标准差。
图6a-6b显示了摄取对聚G壳的依赖性。6a)通过共聚焦显微镜检查，与富含T的QD-SNA相比，聚G QD-SNA(红色)显示C166细胞中的更高累积。比例尺＝10μm。6b)用富含T的AuNP-SNA和聚G QD-SNA以及富含T的QD-SNA和聚G AuNP-SNA处理的C166细胞中的金和镉含量的ICP-MS分析显示，聚G AuNP-SNA与富含T的QD-SNA相比优先进入细胞，并且聚G QD-SNA与富含T的AuNP-SNA相比优先进入细胞。误差条指示来自三次独立实验的标准差。
图7a-7d描述了寡核苷酸链的长度影响SNA的细胞摄取。7a)在组成成分寡核苷酸的5′末端处增加的鸟苷酸(G)含量增加SNA与C166细胞的细胞结合。当与聚T(T30)SNA相比时，需要最少四个GGT重复单元来增强SNA的细胞结合。7b)在组成成分寡核苷酸的中间中的GGT重复单元的包埋取消了细胞结合的增强。由空心正方形所示的序列是SEQ ID NO：27。由空心三角形所示的序列是SEQ ID NO：28。所有其他序列在本文中描述。7c)在组成成分DNA寡核苷酸的5′末端处增加dSpacer单元(其不具有核碱基)使SNA的细胞结合降低高达75％。7d)在组成成分DNA寡核苷酸的5′末端处增加C3 Spacer单元(其既没有核碱基也没有核糖)使SNA的细胞结合降低高达75％。误差条指示来自一式三份测量的标准差。
图8a-8f描绘了使用CPT-SNA的喜树碱分子的递送。8a)通过文献先例，喜树碱分子(CPT)的-OH基团通过短双功能接头修饰，以形成喜树碱叠氮化物(CPT-N3)[Parrish等人，Bioconjugate Chem.18：263-267(2006)]。然后通过无铜点击化学(click chemistry)将CPT-N3偶联到二苯并环辛基-DNA-硫醇(DBCO-DNA-SH)，以形成喜树碱-DNA-硫醇(CPT-DNA-SH)。DCC＝N′N′-二环己基碳二亚胺，DMAP＝4-二甲基氨基吡啶，＝二氯甲烷，DMSO＝二甲基亚砜。8b)基于CPT在440nm的荧光发射的测量揭示，所有四种核碱基类型的CPT-SNA均含有55±15个CPT分子/颗粒。8c)通过用CPT-SNA处理的A549细胞的金含量的ICP-MS分析，CPT-聚G SNA可在所有测试的核碱基类型中以最高数量进入细胞。CPT-SNA(至少AuNP核)在处理后看起来不离开细胞。误差条指示来自一式三份测量的标准差。8d)通过共焦成像，CPT-聚G SNA可在所有测试的核碱基类型的CPT-SNA中以最高数量将CPT分子(绿色)递送到A549细胞内。蓝色＝细胞核。比例尺＝20μm。通过MTT测定(8e)和由碘化丙啶染色支持的流式细胞术分析(8f)，CPT-聚G SNA在所有测试的核碱基类型的CPT-SNA中也是最细胞毒性的。误差条指示来自四次测量的标准差。
图9a-9d描绘了CPT-DNA-SH的合成。9a)喜树碱-叠氮化物(CPT-N3)的1H NMR。9b)通过MALDI-ToF分析，在用二苯并环辛基四甘醇接头(DBCO-TEG；F.W.：570.6；GlenResearch)修饰后，DNA链的分子量增加预期的量。在通过无铜点击偶联与CPT-N3(F.W.：487.5)反应以形成CPT-DNA-SH后，DBCO-DNA-SH的分子量进一步增加预期的量。此处显示的是A30 DNA与DBCO和CPT的缀合的代表性光谱。9c)通过MALDI-ToF MS测量的分子量与预期分子量一致。9d)四种类型的CPT-DNA-SH链的序列信息(也显示于表4中)。
图10显示了通过MTT测定的细胞活力。在没有CPT分子的情况下，通过对用20nMSNA处理的A549细胞的MTT测定，4-7天后聚A SNA、聚T SNA、聚C SNA和聚G SNA未显示明显的细胞毒性。这种阴性对照显示通过CPT-SNA引起的任何可观察到的细胞毒性源于CPT分子，而不是SNA体系结构。报告的值表示来自三次独立实验的平均值的平均值±SE。
图11显示了用于检测活化的半胱天冬酶3的ELISA结果。在用各种类型的CPT-SNA处理A549细胞时，CPT-(GGT)10 SNA比CPT-A30 SNA、CPT-T30 SNA和CPT-(CCT)10 SNA诱导显著更高的半胱天冬酶3的活化，半胱天冬酶3是凋亡信号传导蛋白。报告的值表示来自三次独立实验的平均值的平均值±SE。
图12显示了与聚A、聚T和聚C SNA相比，聚G SNA显示更高的与C166细胞的细胞结合。
图13显示了SNA的细胞摄取。
具体实施方式
由附着至纳米颗粒表面的密集填充的高度取向的寡核苷酸链组成的球形核酸(SNA)能够克服核酸递送的典型挑战。SNA已显示有效地进入50种不同的细胞类型，而无需使用辅助转染试剂并显示出最低限度的细胞毒性。最近，这些结构的胞吞机制显示依赖于A类清道夫受体(SR-A)。本公开内容涉及通过构建其组成成分寡核苷酸链富含鸟苷酸(G)的SNA，利用SR-A与聚(鸟苷酸)寡核苷酸链的相互作用使SNA进入细胞内的摄取达到最大。
相应地，本公开内容证明了寡核苷酸功能化的纳米颗粒的效用，其中寡核苷酸还包含调节细胞摄取的结构域。如本文使用的，“结构域”被理解为核碱基序列。如本文定义的经修饰的核碱基也预期构成如本文提供的结构域。在一个方面，结构域与在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸共线。在另一个方面，结构域与纳米颗粒直接结合，而不与在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸结合。在另外一个方面，结构域通过间隔物与纳米颗粒结合，而不与在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸结合。换言之，在一些实施例中，结构域通过间隔物与纳米颗粒结合，与和寡核苷酸的任何结合相分离(因此在此类实施例中，间隔物不包含核碱基)。
如本文使用的，术语“核苷酸”采取其在本领域中的普通含义。因此，例如“A”＝腺苷酸，“T”＝胸苷酸，“C”＝胞苷酸，“G”＝鸟苷酸，并且“U”＝尿苷酸。
此处注意到，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
如本文使用的，术语“多核苷酸”(在SNA上功能化或作为靶分子)可与术语寡核苷酸互换使用，并且该术语具有本领域公认的含义。
还应注意术语“附着的”、“缀合的”和“功能化的”在本文中也可互换使用，并且指寡核苷酸或结构域与纳米颗粒的结合。
“杂交”意指按照沃森-克里克DNA互补性、Hoogstein结合或本领域已知的其他序列特异性结合的规则，通过氢键在两条或三条核酸链之间的相互作用。杂交可在本领域已知的不同严格条件下进行。
如本文使用的，“聚X”结构域(其中“X”是核苷酸，例如鸟苷酸)是在其长度上包含大于50％但小于100％的“X”的序列。例如，长度为30个核苷酸的聚鸟苷酸(聚G)结构域由至少15个(但小于30个)鸟苷酸核苷酸组成。因此，如本文使用的，“聚X”结构域不是均聚物序列。
纳米颗粒
本发明提供了纳米颗粒，其被功能化以具有与其附着的多核苷酸。一般而言，考虑的纳米颗粒包括对如本文所述的多核苷酸具有高负载能力的任何化合物或物质，包括例如且不限于金属、半导体、脂质体颗粒、绝缘体颗粒组合物和树枝状聚合物(有机相对于无机)。
因此，本发明考虑了纳米颗粒，其包含各种无机材料，包括但不限于金属、半导体材料或陶瓷，如美国专利申请号20030147966中所述。例如，基于金属的纳米颗粒包括本文所述的那些。陶瓷纳米颗粒材料包括但不限于：透钙磷石、磷酸三钙、氧化铝、二氧化硅和氧化锆。纳米颗粒由其生产的有机材料包括碳。纳米颗粒聚合物包括聚苯乙烯、硅酮橡胶、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。生物可降解的生物聚合物(例如多肽，如BSA、多糖等)、其他生物材料(例如碳水化合物)和/或聚合物化合物也考虑用于生产纳米颗粒。还考虑了例如如PCT/US2014/068429(其以引用的方式全文并入本文)中公开的脂质体颗粒。本文还考虑了例如如美国专利公开号2012/0282186(其以引用的方式全文并入本文)中描述的空心颗粒。
在一个实施例中，纳米颗粒是金属的，并且在各个方面，纳米颗粒是胶体金属。因此，在各种实施例中，可用于实践该方法的纳米颗粒包括金属(包括例如且不限于金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍或顺应纳米颗粒形成的任何其他金属)、半导体(包括例如且但不限于CdSe、CdS和由ZnS涂布的CdS或CdSe)和磁性(例如铁磁体)胶体材料。可用于本发明实践的其他纳米颗粒还包括但不限于ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Fe+4、Ag、Cu、Ni、Al、钢、钴铬合金、Cd、钛合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。制备ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs纳米颗粒的方法也是本领域已知的。参见例如Weller，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，41(1993)；Henglein，Top.Curr.Chem.，143，113(1988)；Henglein，Chem.Rev.，89，1861(1989)；Brus，Appl.Phys.A.，53，465(1991)；Bahncmann，在Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy(Pelizetti和Schiavello编辑1991)中，第251页；Wang和Herron，J.Phys.Chem.，95，525(1991)；Olshavsky，等人，J.Am.Chem.Soc.，112，9438(1990)；Ushida等人，J.Phys.Chem.，95，5382(1992)。
在实践中，提供了使用具有与其附着的寡核苷酸的任何合适的颗粒来增加细胞摄取且抑制基因表达的方法，所述寡核苷酸不干扰复合物形成，即与靶多核苷酸的杂交。颗粒的尺寸、形状和化学组成有助于所得到的寡核苷酸功能化的纳米颗粒的性质。这些性质包括例如光学性质、光电性能、电化学性质、电子性质、各种溶液中的稳定性、磁性、以及孔和通道尺寸变化。考虑具有不同尺寸、形状和/或化学组成的颗粒混合物的使用，以及具有均匀尺寸、形状和化学组成的纳米颗粒的使用。合适的颗粒的例子包括但不限于纳米粒子颗粒、聚集物颗粒、各向同性颗粒(例如球形颗粒)和各向异性颗粒(例如非球形杆、四面体、棱柱体)和核-壳颗粒，例如于2002年12月28日提交的美国专利申请序列号10/034,451和于2002年12月28日提交的国际申请号PCT/US01/50825中所述的颗粒，所述专利的公开内容以引用的方式全文并入。
制备金属、半导体和磁性纳米颗粒的方法是本领域众所周知的。参见例如，Schmid，G.(编辑)Clusters and Colloids(VCH，Weinheim，1994)；Hayat，M.A.(编辑)Colloidal Gold：Principles，Methods，and Applications(Academic Press，San Diego，1991)；Massart，R.，IEEE Transactions On Magnetics，17，1247(1981)；Ahmadi，T.S.等人，Science，272，1924(1996)；Henglein，A.等人，J.Phys.Chem.，99，14129(1995)；Curtis，A.C.，等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，27，1530(1988)。所制备的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒的制备在Fattal等人，J.Controlled Release(1998)53：137-143和美国专利号4,489,055中描述。用于制备包含聚(D-glucaramidoamine)的纳米颗粒的方法在Liu等人，J.Am.Chem.Soc.(2004)126：7422-7423中描述。包含聚合的甲基丙烯酸甲酯(MMA)的纳米颗粒的制备描述在Tondelli等人，Nucl.Acids Res.(1998)26：5425-5431中描述，并且树枝状聚合物纳米颗粒的制备在例如Kukowska-Latallo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：4897-4902(Starburst聚酰胺-胺树枝状聚合物)中描述。
合适的纳米颗粒也从例如Ted Pella，Inc.(金)、Amersham Corporation(金)和Nanoprobes，Inc.(金)商购可得。
还如美国专利申请号20030147966中所述的，包含本文所述材料的纳米颗粒是商购可得的，或它们可由溶液中的逐步成核(例如通过胶体反应)，或者通过各种物理和化学气相沉积工艺例如溅射沉积来产生。参见例如HaVashi，(1987)Vac.Sci.Technol.July/August 1987，A5(4)：1375-84；Hayashi，(1987)Physics Today，December 1987，第44-60页；MRS Bulletin，January 1990，第16-47页。
如在美国专利申请号20030147966中进一步描述的，使用本领域已知的方法，使用HAuCl4和柠檬酸还原剂产生考虑的纳米颗粒。参见例如Marinakos等人，(1999)Adv.Mater.11：34-37；Marinakos等人，(1998)Chem.Mater.10：1214-19；Enustun&Turkevich，(1963)J.Am.Chem.Soc.85：3317。具有约140nm的分散聚集物粒径的氧化锡纳米颗粒从日本Chiba的Vacuum Metallurgical Co.，Ltd.商购可得。各种组成和尺寸范围的其他商购可得的纳米颗粒可例如得自Burlingame，Calif的Vector Laboratories，Inc.。
纳米颗粒的尺寸范围可为平均直径约1nm至约250nm、平均直径约1nm至约240nm、平均直径约1nm至约230nm、平均直径约1nm至约220nm、平均直径约1nm至约210nm、平均直径约1nm至约200nm、平均直径约1nm至约190nm、平均直径约1nm至约180nm、平均直径约1nm至约170nm、平均直径约1nm至约160nm、平均直径约1nm至约150nm、平均直径约1nm至约140nm、平均直径约1nm至约130nm、平均直径约1nm至约120nm、平均直径约1nm至约110nm、平均直径约1nm至约100nm、平均直径约1nm至约90nm、平均直径约1nm至约80nm、平均直径约1nm至约70nm、平均直径约1nm至约60nm、平均直径约1nm至约50nm、平均直径约1nm至约40nm、平均直径约1nm至约30nm、或平均直径约1nm至约20nm、平均直径约1nm至约10nm。在其他方面，纳米颗粒的尺寸为约5nm至约150nm(平均直径)、约5至约50nm、约10至约30nm、约10至150nm、约10至约100nm、或约10至约50nm。纳米颗粒的尺寸为约5nm至约150nm(平均直径)、约30至约100nm、约40至约80nm。在方法中使用的纳米颗粒的尺寸如通过其特定用途或应用的要求而变。尺寸的变化有利地用于优化纳米颗粒的某些物理特征，例如光学性质或可如本文所述功能化的表面积的量。
寡核苷酸
如本文使用的，术语“核苷酸”或其复数与本文所讨论的和本领域另外已知的修饰形式是可互换的。在某些情况下，本领域使用术语“核碱基”，其包含天然存在的核苷酸和包括经修饰的核苷酸的非天然存在的核苷酸。因此，核苷酸或核碱基意指天然存在的核碱基A、G、C、T和U。非天然存在的核碱基包括例如且不限于黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4，N4-乙醇基胞嘧啶、N′，N′-乙醇基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟氨酸、肌苷以及在Benner等人，美国专利号5,432,272以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，1997，Nucleic Acids Research，第25卷：第4429-4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基”还不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括其杂环类似物和互变异构体。进一步的天然和非天然存在的核碱基包括下述中公开的那些核碱基：美国专利号3,687,808(Merigan等人)，Sanghvi在Antisense Research and Application的第15章中，S.T.Crooke和B.Lebleu编辑，CRCPress，1993，以及Englisch等人，1991，Angewandte Chemie，国际版本，30：613-722(尤其参见第622和623页，以及Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，J.I.Kroschwitz Ed.，John Wiley&Sons，1990，第858-859页，Cook，Anti-Cancer DrugDesign 1991，6，585-607中，所述参考文献各自以引用的方式全文并入本文)。在各个方面，多核苷酸还包括一种或多种“核苷碱基”或“碱基单元”，其是一类非天然存在的核苷酸，其包括化合物例如可如核碱基起作用的杂环化合物，包括在最经典意义上并非核苷碱基，但充当核苷碱基的某些“通用碱基”。通用碱基包括3-硝基吡咯，任选取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任选取代的次黄嘌呤。其他期望的通用碱基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本领域已知的那些通用碱基。
经修饰的核苷酸在EP 1 072 679和WO 97/12896中描述，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。经修饰的核碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素、特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的经修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3′，2′:4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱被其他杂环替代的那些碱基，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些核碱基，The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑John Wiley&Sons，1990中公开的那些核碱基，由Englisch等人，1991，Angewandte Chemie，国际版本，30：613公开的那些核碱基，以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，CRC Press，1993公开的那些核碱基。这些碱基中的某些碱基可用于增加结合亲和力，并且包括5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且在某些方面与2′-O-甲氧基乙基糖修饰相结合。参见美国专利号3,687,808，美国专利号4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
制备预定序列的多核苷酸的方法是众所周知的。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版1989)和F.Eckstein(编辑)Oligonucleotides and Analogues，第1版(Oxford University Press，New York，1991)。固相合成方法对于聚核糖核苷酸和聚脱氧核糖核苷酸两者均为优选的(合成DNA的众所周知的方法也可用于合成RNA)。聚核糖核苷酸也可酶促制备。非天然存在的核碱基也可掺入多核苷酸内。参见例如美国专利号7,223,833；Katz，J.Am.Chem.Soc.，74：2238(1951)；Yamane等人，J.Am.Chem.Soc.，83：2599(1961)；Kosturko等人，Biochemistry，13：3949(1974)；Thomas，J.Am.Chem.Soc.，76：6032(1954)；Zhang等人，J.Am.Chem.Soc.，127：74-75(2005)；和Zimmermann等人，J.Am.Chem.Soc.，124：13684-13685(2002)。
所提供的如本文定义的用多核苷酸或其修饰形式和结构域功能化的纳米颗粒一般包含长度约5个核苷酸至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体而言，纳米颗粒用多核苷酸功能化，所述多核苷酸长度约5至约90个核苷酸、长度约5至约80个核苷酸、长度约5至约70个核苷酸、长度约5至约60个核苷酸、长度约5至约50个核苷酸、长度约5至约45个核苷酸、长度约5至约40个核苷酸、长度约5至约35个核苷酸、长度约5至约30个核苷酸、长度约5至约25个核苷酸、长度约5至约20个核苷酸、长度约5至约15个核苷酸、长度约5至约10个核苷酸，以及具体公开至多核苷酸能够实现所需结果的尺寸长度的所有多核苷酸中间体。相应地，考虑了长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500个或更多个核苷酸的多核苷酸。
在一些实施例中，附着到纳米颗粒的多核苷酸是DNA。当DNA附着到纳米颗粒时，在一些实施例中，DNA由这样的序列组成，所述序列与多核苷酸的靶区域充分互补，使得附着到纳米颗粒的DNA寡核苷酸与靶多核苷酸发生杂交，由此将靶多核苷酸与纳米颗粒结合。在各个方面，DNA是单链或双链的，只要双链分子还包括与靶多核苷酸的单链区域杂交的单链区域。在一些方面，在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸的杂交可与双链靶多核苷酸形成三链体结构。在另一个方面，可通过将在纳米颗粒上功能化的双链寡核苷酸与单链靶多核苷酸杂交来形成三链体结构。
在一些实施例中，本公开内容考虑附着至纳米颗粒的多核苷酸是RNA。在一些方面，RNA是小干扰RNA(siRNA)。
如本文定义的，寡核苷酸还包括适体。一般而言，适体是能够与靶配体紧密结合并且谨慎区分靶配体的核酸或肽结合种类[Yan等人，RNA Biol.6(3)316-320(2009)，其以引用的方式全文并入本文]。在一些实施例中，适体可通过称为通过指数富集的配体系统进化(SELEX)方法的技术获得[Tuerk等人，Science 249：505-10(1990)，美国专利号5,270,163和美国专利号5,637,459，所述参考文献各自以引用的方式全文并入本文]。核酸适体的一般讨论在例如且不限于Nucleic Acid and Peptide Aptamers：Methods and Protocols(Mayer编辑，Humana Press，2009)和Crawford等人，Briefings in Functional Genomicsand Proteomics 2(1)：72-79(2003)中发现。适体的另外讨论，包括但不限于RNA适体的选择、DNA适体的选择、能够共价连接到靶蛋白的适体的选择、经修饰的适体文库的使用、以及适体作为诊断剂和治疗剂的用途在由Molekulyarnaya Biologiya，第34卷，No.6，2000，第1097-1113页翻译的Kopylov等人，Molecular Biology 34(6)：940-954(2000)中提供，所述参考文献以引用的方式全文并入本文。在各个方面，适体为长度约10至约100个核苷酸、或长度约100至约500个核苷酸。适体的生产和使用是本领域普通技术人员已知的。
在一些方面，多个寡核苷酸被功能化至纳米颗粒。在各个方面，多个寡核苷酸各自具有相同的序列，而在其他方面，一个或多个寡核苷酸具有不同的序列。在进一步的方面，多个寡核苷酸串联排列并且由间隔物分离。间隔物在本文下文中更详细地描述。
考虑用于附着至纳米颗粒的多核苷酸包括调节从靶多核苷酸表达的基因产物的表达的多核苷酸。这样的多核苷酸包括如本文下文定义的DNA、RNA及其修饰形式。相应地，在多个方面而非限制性地，考虑了与靶多核苷酸杂交并且引发靶多核苷酸的转录或翻译降低的多核苷酸，与双链多核苷酸杂交并抑制转录的三螺旋形成多核苷酸，以及与靶多核苷酸杂交且抑制翻译的核酶。
在各个方面，如果靶向特异性多核苷酸，则单一功能化寡核苷酸-纳米颗粒组合物具有结合相同转录物的多个拷贝的能力。在一个方面，提供了用相同的多核苷酸功能化的纳米颗粒，即每个多核苷酸具有相同的长度和相同的序列。在其他方面，纳米颗粒用两个或更多个不相同的多核苷酸进行功能化，即所附着的多核苷酸中的至少一个与至少一个其他附着的多核苷酸不同之处在于它具有不同的长度和/或不同的序列。在其中不同的多核苷酸附着到纳米颗粒的方面，这些不同的多核苷酸结合相同的单个靶多核苷酸但在不同的位置处，或结合编码不同基因产物的不同靶多核苷酸。
结构域
如本文所述，其为寡核苷酸功能化的纳米颗粒的部分的结构域显示影响纳米颗粒被细胞摄取的效率。相应地，结构域增加或(通过结构域的缺乏)降低效率。如本文使用的，“效率”指细胞中/通过细胞的纳米颗粒摄取的数目、量或速率。因为进入和离开细胞的纳米颗粒的过程是动态过程，所以可通过摄取更多的纳米颗粒或通过保留进入细胞的那些纳米颗粒更长的时间段来提高效率。类似地，可通过摄取更少的纳米颗粒或通过保留进入细胞的那些纳米颗粒更短的时间段来降低效率。
在一些方面，结构域位于寡核苷酸的末端处。在一些实施例中，结构域位于寡核苷酸的5′末端处，并且在进一步的实施例中，结构域位于寡核苷酸的3′末端处。
在一些实施例中，结构域位于未功能化至纳米颗粒的寡核苷酸的末端处。换言之，在这些实施例中，结构域位于对于纳米颗粒表面远侧的寡核苷酸的末端处。在进一步的实施例中，结构域位于对于纳米颗粒表面远侧的寡核苷酸的末端处，并且结构域也不与任何其他分子附着。
在一些方面，结构域与寡核苷酸连续/共线。在一些方面，结构域位于寡核苷酸内的内部区域处。在进一步的方面，结构域位于附着至纳米颗粒的第二寡核苷酸上。在一个方面，在功能化至纳米颗粒的寡核苷酸中存在多于一个结构域。相应地，在一些方面，多于一个结构域串联或个别地存在于寡核苷酸的5′末端处、和/或3′末端处、和/或内部区域处。
在另一个方面，在一些实施例中，考虑将结构域作为与寡核苷酸分开的实体附着至纳米颗粒，即在一些实施例中，结构域直接附着到纳米颗粒，与寡核苷酸分开。
进一步考虑，在一些实施例中，寡核苷酸包含位于本文所述位置中的一个或多个处的多于一个结构域。
在一些实施例中，结构域提高了寡核苷酸功能化的纳米颗粒通过细胞的摄取效率。在各种实施例中，结构域为长度约2至约1000、约2至约500、约2至约100、约2至约50、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约100、约5至约50、约5至约30、约5至约20、约5至约10、约10至约100、约10至约50、约10至约30、约10至约20、约10至约15、约20至约100、约20至约50、约20至约40、约20至约30个核苷酸。在进一步的实施例中，结构域为长度小于100、小于80、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或小于5个核苷酸。如本文公开的，该结构域包含鸟苷酸核苷酸(聚G)序列。在各个方面，结构域包含两个鸟苷酸。在进一步的方面，结构域包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多个鸟苷酸核苷酸。
在本公开内容的各个方面和实施例中，结构域包含为至少约50％但小于100％鸟苷酸核苷酸的序列。因此，在一些实施例中，结构域包含为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％鸟苷酸核苷酸的序列。在进一步的实施例中，结构域包含小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％、或小于95％鸟苷酸核苷酸的序列。在再进一步的实施例中，结构域包含约50％至99％、约60％至99％、约65％至99％、约70％至99％、约75％至95％、约80％至99％、约85％至99％、约90％至约99％或约95％至约99％鸟苷酸核苷酸的序列。在一些实施例中，结构域包含为99％鸟苷酸核苷酸的序列。均聚鸟苷酸序列，即为100％鸟苷酸的序列，未被考虑用作本文的结构域。
因此，鉴于结构域的潜在的核苷酸长度和结构域中存在的各种百分比的鸟苷酸核苷酸，各自如上所述，考虑到结构域的剩余核苷酸序列(即，并非鸟苷酸但是结构域的部分的核苷酸序列)是任何核苷酸或其修饰形式。例如且不限于，一些实施例中的结构域是(GGX)n序列，其中X是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸，胞苷酸(或其修饰形式)，并且n是约1至约500。在一些实施例中，X是鸟苷酸(条件是在这样的实施例中，结构域不是均聚的鸟苷酸序列)。在一些实施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些实施例中，考虑用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞摄取的效率高于用相同寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒。在一些方面，用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞摄取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒更有效1％。在各个方面，用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞摄取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒更有效2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。或是约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约l0倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、约500倍、约550倍、约600倍、约650倍、约700倍、约750倍、约800倍、约850倍、约900倍、约950倍、约1000倍、约1500倍、约2000倍、约2500倍、约3000倍、约3500倍、约4000倍、约4500倍、约5000倍、约5500倍、约6000倍、约6500倍、约7000倍、约7500倍、约8000倍、约8500倍、约9000倍、约9500倍、约10000倍高或更高。
在一些实施例中，结构域的缺乏降低寡核苷酸功能化的纳米颗粒通过细胞的摄取效率。在一些实施例中，考虑用寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒被细胞摄取的效率低于具有比用包含结构域的相同寡核苷酸功能化的纳米颗粒。在一些方面，用寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒被细胞摄取的效率比用包含该结构域的相同寡核苷酸功能化的纳米颗粒低1％。在各个方面，用寡核苷酸功能化但缺乏结构域的纳米颗粒被细胞摄取的效率比用包含该结构域的相同寡核苷酸功能化的纳米颗粒低2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、约500倍、约550倍、约600倍、约650倍、约700倍、约750倍、约800倍、约850倍、约900倍、约950倍、约1000倍、约1500倍、约2000倍、约2500倍、约3000倍、约3500倍、约4000倍、约4500倍、约5000倍、约5500倍、约6000倍、约6500倍、约7000倍、约7500倍、约8000倍、约8500倍、约9000倍、约9500倍、约10000倍低或更低。
经修饰的寡核苷酸
如上文讨论的，经修饰的寡核苷酸被考虑用于功能化纳米颗粒。在各个方面，在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸被完全修饰或部分修饰。因此，在各个方面，多核苷酸中的核苷酸单元的一个或多个或所有糖和/或一个或多个或所有核苷酸间键合被“非天然存在的”基团替代。
在一个方面，该实施例考虑了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，多核苷酸的糖主链被含酰胺的主链替代。参见例如美国专利号5,539,082；5,714,331；和5，719，262，以及Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
对于所公开的多核苷酸考虑的核苷酸和非天然核苷酸之间的其他键合包括下述中所述的那些键合：美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；美国专利公开号20040219565；国际专利公开号WO 98/39352和WO 99/14226；Mesmaeker等人，Current Opinion in Structural Biology 5：343-355(1995)以及SusanM.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，25：4429-4443(1997)，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
寡核苷酸的具体例子包括含有经修饰的主链或非天然核苷间键合的那些寡核苷酸。具有经修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主链中不具有磷原子的那些寡核苷酸。在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸视为在“寡核苷酸”的含义内。
含有磷原子的经修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3′-5′键合的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、这些的2′-5′键合的类似物、以及具有反转极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键合为3′至3′、5′至5′或2′至2′键合。还考虑的是具有反转极性的多核苷酸，其包含在最3′核苷酸间键合处的单个3′至3′键合，即可为无碱基(核苷酸缺失或在其位置中具有羟基)的单个反转核苷残基。还考虑了盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键合的制备的代表性美国专利包括美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
不包括磷原子的经修饰的多核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键合、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的主链。这些包括具有下述的那些：吗啉键合；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。在另外其他实施例中，提供了具有硫代磷酸酯主链的多核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，并且该寡核苷酸包括美国专利号5,489,677和5,602,240中所述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-。参见例如美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述专利的公开内容以引用的方式全文并入本文。
在各种形式中，寡核苷酸中的两个连续单体之间的键合由选自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R″)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O，S)-、-P(S)2-、-PO(R″)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-的2至4个，优选3个基团/原子组成，其中RH选自氢和C1-4-烷基，并且R″选自C1-6-烷基和苯基。这些键合的举例说明性例子是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当用作与连续单体的键合时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2--、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(当用作与连续单体的键合时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(当用作与连续单体的键合时包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2--O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-；-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRH H-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R″)2-O-；在其中考虑了-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-O-P(-O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3)-O-和-O-PO(NHRN)-O-，其中RH选自氢和C1-4-烷基，并且R″选自C1-6-烷基和苯基。进一步的举例说明性实例在Mesmaeker等人，1995，Current Opinion in Structural Biology，5：343-355以及Susan M.Freier和Karl-HeinzAltmann，1997，Nucleic Acids Research，第25卷：第4429-4443页中给出。
多核苷酸的另外其他修饰形式在美国专利申请号20040219565中详细描述，所述专利的公开内容以引用的方式全文并入本文。
经修饰的多核苷酸还可含有一个或多个取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2′位置处包含下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其他实施例包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他多核苷酸在2′位置处包含下述之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善多核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善多核苷酸的药效学性质的基团、以及具有相似性质的其他取代基。在一个方面，修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，1995，Helv.Chim.Acta，78：486-504)即烷氧基烷氧基。其他修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域也称为2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
另外其他的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟(2′-F)。2′-修饰可在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置中。在一个方面，2′-阿拉伯糖修饰是2′-F。类似的修饰也可在多核苷酸上的其他位置处作出，例如在3′末端核苷酸上的糖的3′位置处或2′-5′连接的多核苷酸中和在5′末端核苷酸的5′位置处。多核苷酸还可具有糖模拟物，例如环丁基部分代替戊呋糖基糖。参见例如美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，所述专利的公开内容以引用的方式全文并入本文。
在一个方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2′-羟基连接到糖环的3′或4′碳原子，由此形成双环糖部分。该键合在某些方面是桥接2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n为1或2。LNA及其制备在WO 98/39352和WO 99/14226中描述，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
与纳米颗粒的寡核苷酸附着
考虑用于该方法的寡核苷酸包括通过任何方式与纳米颗粒结合的寡核苷酸。不管寡核苷酸通过其与纳米颗粒附着的方式，通过5′键合、3′键合、某种类型的内部键合或这些附着的任何组合来实现在各个方面的附着。
附着方法是本领域普通技术人员已知的，并且在美国公开号2009/0209629中描述，所述专利以引用的方式全文并入本文。将RNA附着到纳米颗粒的方法一般在PCT/US2009/65822中描述，所述专利以引用的方式全文并入本文。
因此提供了具有与其附着的寡核苷酸的纳米颗粒，其中进一步包含结构域的寡核苷酸与纳米颗粒结合。
间隔物
在某些方面，考虑了功能化纳米颗粒，其包括其中寡核苷酸和结构域通过间隔物附着到纳米颗粒的那些纳米颗粒。如本文使用的，“间隔物”意指这样的部分，其不参与调节基因表达本身，但作用于增加纳米颗粒和功能性寡核苷酸之间的距离，或者当以多个拷贝附着至纳米颗粒时增加各个寡核苷酸之间的距离。因此，考虑将间隔物串联定位在各个寡核苷酸之间，无论寡核苷酸具有相同的序列还是具有不同的序列。在其中结构域直接附着到纳米颗粒的本发明的方面，结构域任选地通过间隔物功能化至纳米颗粒。在另一个方面，结构域在与间隔物末端相对的寡核苷酸末端上。在其中串联的结构域功能化至纳米颗粒的方面，间隔物任选地在串联结构中的一些或全部结构域单元之间。在一个方面，当存在时，间隔物是有机部分。在另一个方面，间隔物是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂质、乙二醇或其组合。
在某些方面，多核苷酸具有它通过其与纳米颗粒共价结合的间隔物。这些多核苷酸是与上文描述相同的多核苷酸。由于间隔物与纳米颗粒的结合，多核苷酸与纳米颗粒的表面间隔开，并且对于与其靶的杂交更容易接近。在间隔物是多核苷酸的情况下，在各种实施例中，间隔物的长度至少约10个核苷酸、10-30个核苷酸或甚至大于30个核苷酸。间隔物可具有不干扰多核苷酸变得与纳米颗粒或靶多核苷酸结合的能力的任何序列。在某些方面，多核苷酸间隔物的碱基全部是腺苷酸、全部是胸苷酸、全部是胞苷酸、全部是鸟苷酸、全部是尿苷酸、或全部是一些其他经修饰的碱基。相应地，在其中间隔物由所有鸟苷酸组成的一些方面，考虑间隔物可如本文所述充当结构域。
表面密度
本文提供的纳米颗粒具有在纳米颗粒的表面上的多核苷酸的填充密度，其在各个方面都足以导致纳米颗粒之间和单个纳米颗粒上的多核苷酸链之间的协同行为。在另一个方面，在纳米颗粒之间的协同行为增加了多核苷酸对核酸酶降解的抗性。在另外一个方面，通过细胞的纳米颗粒摄取受与纳米颗粒结合的多核苷酸密度的影响。如以引用的方式全文并入本文的美国专利申请公开号2008/0306016中所述，在纳米颗粒的表面上较高密度的多核苷酸与通过细胞的纳米颗粒的增加摄取有关。本公开内容提供了其中由于纳米颗粒表面上更高密度的多核苷酸而增加的纳米颗粒摄取与本文所述的结构域的存在组合起作用的实施例。例如且不限于，在纳米颗粒表面上具有给定密度的多核苷酸的纳米颗粒(其中纳米颗粒还包含如本文公开的聚G结构域)，将证明相对于在纳米颗粒表面上具有相同密度的多核苷酸的纳米颗粒(其中纳米颗粒缺乏聚G结构域)通过细胞的功能化纳米颗粒的摄取增加。在各个方面，还包含聚G结构域的功能化纳米颗粒通过细胞的摄取增加相对于缺乏聚G结构域的功能化纳米颗粒为1％。在进一步的方面，还包含聚G结构域的功能化纳米颗粒通过细胞的摄取增加相对于缺乏聚G结构域的功能化纳米颗粒为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、约500倍、约550倍、约600倍、约650倍、约700倍、约750倍、约800倍、约850倍、约900倍、约950倍、约1000倍、约1500倍、约2000倍、约2500倍、约3000倍、约3500倍、约4000倍、约4500倍、约5000倍、约5500倍、约6000倍、约6500倍、约7000倍、约7500倍、约8000倍、约8500倍、约9000倍、约9500倍、约10000倍高或更高。
足以使纳米颗粒稳定的表面密度和对于纳米颗粒和多核苷酸的所需组合获得它必要的条件可凭经验来确定。一般地，至少约2pmole/cm2的表面密度将足以提供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。在一些方面，表面密度为至少15pmole/cm2。还提供了其中多核苷酸以下述表面密度与纳米颗粒结合的方法：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约19pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更多。
寡核苷酸靶序列和杂交
在一些方面，本公开内容提供了靶向特异性核酸的方法。可靶向任何类型的核酸，并且所述方法可用于例如基因表达的治疗性调节(参见例如美国专利申请公开号2009/0209629，其公开内容以引用的方式并入本文)。可通过本发明的方法靶向的核酸的例子包括但不限于基因(例如，与特定疾病相关的基因)、细菌RNA或DNA、病毒RNA、或mRNA、RNA或单链核酸。
术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指包含从翻译起始密码子开始的在任一方向(即5′或3′)上的连续核苷酸的mRNA或基因的一部分。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指包含从翻译终止密码子开始的在任一方向(即，5′或3′)上的连续核苷酸的这种mRNA或基因的一部分。因此，“起始密码子区域”(或“翻译起始密码子区域”)和“终止密码子区域”(或“翻译终止密码子区域”)都是可用功能化纳米颗粒上的寡核苷酸有效靶向的区域。
其他靶区域包括5′非翻译区(5′UTR)，从翻译起始密码子开始的在5′方向上的mRNA的一部分，包括5′帽位点和mRNA的翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)，以及3′非翻译区(3′UTR)，从翻译终止密码子开始的在3′方向上的mRNA的一部分，包括翻译终止密码子和mRNA的3′末端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5′帽位点包含经由5′-5′三磷酸键合连接到mRNA的最5′残基的N7-甲基化鸟苷残基。mRNA的5′帽区域被认为包括5′帽结构本身以及与帽位点相邻的前50个核苷酸。
对于原核靶核酸，在各个方面，核酸是由基因组DNA转录的RNA。对于真核靶核酸，核酸是动物核酸、植物核酸、真菌核酸包括酵母核酸。如上文，靶核酸是由基因组DNA序列转录的RNA。在某些方面，靶核酸是线粒体核酸。对于病毒靶核酸，核酸是病毒基因组RNA或由病毒基因组DNA转录的RNA。
所提供的用于抑制基因产物表达的方法包括这样的方法，其中与不存在寡核苷酸功能化的纳米颗粒的基因产物表达相比，靶基因产物的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。换言之，所提供的方法包括导致靶基因产物表达的基本上任何程度的抑制的那些方法。
抑制程度从体液样品或活组织检查样品或通过本领域众所周知的成像技术在体内进行测定。可替代地，在细胞培养测定中测定抑制程度，一般作为来源于使用特定类型的纳米颗粒和特定寡核苷酸在体内可预期的抑制程度的可预测量度。
实例
调查了球形核酸纳米颗粒缀合物(SNA)的序列依赖性细胞摄取。该过程通过与A类清道夫受体(SR-A)相互作用和质膜微囊介导的胞吞作用而发生。已知线型聚(鸟苷酸)(聚G)是SR-A的天然配体。下文描述的实例测试了具有较高G含量的SNA是否能够以比由其他核苷酸组成的SNA更大的量进入细胞，并且像这样根据组成成分寡核苷酸序列测量SNA的细胞内化。如下所示，具有富集G含量的SNA显示最高的细胞摄取。接下来，将小分子(喜树碱)与SNA化学缀合，以产生药物-SNA缀合物，并且观察到聚G SNA将大多数喜树碱递送至细胞，并且在癌细胞中具有最高的细胞毒性。本文提供的数据阐明了用于增强球形核酸的细胞内转运的重要设计考虑。
在四种细胞类型A549(人肺腺癌上皮)、NIH-3T3(小鼠成纤维细胞)、C166(小鼠内皮)和HaCaT(人角质形成细胞)中调查富含G的SNA的增强的细胞摄取。另外，通过设计负载有DNA-化学治疗缀合物的SNA，研究了序列依赖性细胞摄取的后果，并且与富含A、T、S的SNA相比，用富含G的SNA增加了喜树碱化学治疗分子递送至A549细胞和后续细胞毒性。
实例1
SNA上的核碱基类型决定了金纳米颗粒的表面上的DNA寡核苷酸壳的负载和厚度。
首先，通过将相同量的不同核碱基类型的烷基硫醇修饰的30-碱基对长的单链DNA寡核苷酸(ssDNA)(图1a；关于序列信息参见下表1)加入柠檬酸盐封端的10纳米(nm)直径金纳米颗粒(AuNP)的水性悬浮液内，来制备由不同核碱基类型(A、T、C或G)组成的SNA。为了制备富含C(聚C SNA)和G(聚G SNA)的SNA，沿着C和G的线型聚合物以规律间隔有意地插入T，分别获得(CCT)10和(GGT)10的序列。对于聚C SNA和聚G SNA，这些设计特征减弱了由于i-基序[Gehring等人，Nature 363：561-565(1993)]和G-四链体[Sen等人，Nature 334：364-366(1988)]形成而难以合成的合成聚C和聚G序列的挑战。相反，A和T的线型聚合物不会自然地折叠成稳定的二级结构，当制备富含A(聚A SNA)和T(聚T SNA)的SNA时，不需要用另一种核碱基稀释A和T的线型聚合物。通过动态光散射测量，所有SNA均具有22±4nm的流体动力学直径，提示关于寡核苷酸壳5-8nm的厚度(图2)。厚度的变化可能是由于负载的变化(参见下文)。通过UV-Vis光谱法，所有的SNA一般在大小上是单分散的，并且与未经修饰的AuNP相比(524nm相对于520nm)，显示出在表面等离子体峰中大约4nm的红移，这是由于在寡核苷酸壳的共价附着后的局部折射率的变化[Kumar等人，Nat Protoc 3：314-320(2008)](图3)。然后通过制备其寡核苷酸在其5′末端处含有Cy5荧光团的SNA，根据核碱基类型测量寡核苷酸负载(图4)。鉴于30个碱基的恒定寡核苷酸长度，富含嘧啶碱基(即C和T)的SNA具有显著更高的寡核苷酸负载，由此聚T SNA和聚C SNA分别具有大约180个ssDNA和大约140个ssDNA/AuNP。相比之下，富含嘌呤碱基的SNA具有较低的寡核苷酸负载：聚G SNA和聚A SNA分别只有大约75个ssDNA和大约45个ssDNA/AuNP(图1a)。
表1.SNA纳米颗粒缀合物及其DNA寡核苷酸序列的列表。制备由表1中列出的DNA寡核苷酸组成的SNA，以分别使用ICP-MS和TEM检查核碱基类型对其细胞摄取动力学和细胞内分布的作用(图5)。图2和图3呈现了这些SNA的流体动力学尺寸和吸收光谱的DLS和UV-Vis光谱数据。图1中的TEM成像数据揭示了SNA的形态。
为了通过透射电子显微镜检查(TEM)直接显现寡核苷酸壳，利用了用于SNA的乙酸双氧铀染色方案[Huxley等人，J Biophys Biochem Cytol 11：273-296(1961)]。与负载数据一致，聚T SNA的寡核苷酸覆盖率在所有测试的核碱基类型中最密集，如在AuNP的整个圆周上通过其干燥厚度为4-6nm的均匀寡核苷酸壳证明的(图1b)。Chen等人使用单分子FRET(smFRET)和小角度X射线散射(SAXS)，以证明在生理水平的盐(150mM NaCl)的存在下，40个碱基长的单链聚T DNA(T40)的端对端距离为大约6.6nm[Chen等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.109：799-804(2012)]。因此，如通过TEM图像揭示的聚T SNA的干燥壳厚度提示，当它们径向延伸远离AuNP的中心时，聚T DNA链接近由AuNP的弯曲表面提供的最大负载。聚ASNA具有厚度仅1-2nm的最薄的寡核苷酸壳，但它们的壳仍是均匀的。鉴于其中等寡核苷酸负载，聚C SNA和聚G SNA具有2-4nm厚的寡核苷酸壳，但是它们的壳不像聚T SNA和聚A SNA那样均匀。尽管这种技术受到干燥影响，但数据与来自寡核苷酸负载研究的结果一致(图1a)。简言之，寡核苷酸负载和TEM成像数据与文献先例一致，即嘧啶碱基(C和T)比其嘌呤配对物(A和G)更不强烈地吸附至金表面Demers等人，J Am Chem Soc 124：11248-11249(2002)；Hurst等人，78，8313-8318(2006)；Storhoff等人，Langmuir 18：6666-6670(2002)；Kimura-Suda等人，Journal of the American Chemical Society 125：9014-9015(2003)；Opdahl等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.104：9-14(2007)]，支持了前者延伸远离金表面而后者与表面相互作用的观点。
实例2
聚G SNA在所有测试的核碱基类型中以最高量进入多种哺乳动物细胞类型。
接下来，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)监测不同核碱基类型的SNA的细胞摄取动力学。选择C166细胞是因为其表达SR-A[Choi等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.110：7625-7630(2013)]，SR-A是介导SNA的细胞摄取的关键受体(图5a)。在两小时温育后，聚G SNA显示出在所有测试的核碱基类型中最高水平的细胞结合，累积5×105个颗粒/细胞。与聚G SNA形成对比，聚T SNA显示超过5倍低的细胞结合，是所有核碱基类型中细胞结合的最低水平。与聚T SNA和聚G SNA相比，聚A和聚C SNA显示出中等水平的细胞结合。类似的数据呈现于图13中。还参见图12，其证明了聚G SNA显示比聚A、聚T和聚C SNA更高的与C166细胞的细胞结合。经修饰的ELISA测定显示聚G SNA证明与重组A类清道夫受体(SR-A)的最高结合，SR-A负责聚G SNA增加的细胞结合。
然而，ICP-MS，允许敏感定量与细胞结合的金的大量含量的技术，不提供关于SNA的细胞内分布的任何信息。因此，TEM用于确定SNA是进入细胞还是仅与细胞膜结合(图5b)。与细胞一起温育2小时后，由所有核碱基类型组成的SNA可进入C166细胞，如通过其在细胞溶质或初级内体内的累积所证明的。与ICP-MS数据一致，代表性TEM图像显示聚G SNA在所有核碱基类型中是细胞中最丰富的，在颗粒簇数目/细胞的横截面积和颗粒数目/簇(通常＞100个SNA/簇)两个方面。相比之下，尽管TEM图像不允许精确定量细胞中的颗粒，但聚ASNA、聚C SNA和聚T SNA以比聚G SNA显著更小的量(＜20个SNA/簇)进入细胞。
总之，当组成成分寡核苷酸链保持恒定在30个碱基长时，比其他核碱基类型(即A、C、T)更高部分的G的掺入使SNA对C166细胞的递送达到最大。为了确定这种G依赖性摄取是否仅适用于C166细胞，对于三种其他哺乳动物细胞类型，即HaCaT、3T3和A549，进一步跟踪SNA的细胞摄取动力学(图5c)。这些细胞系连同C166，具有一系列的SR-A的表达水平；以表达水平的递减次序，它们是HaCaT、C166、3T3和A549[Choi等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.110：7625-7630(2013)]。与C166细胞的摄取数据一致，聚G SNA证明对于这些细胞类型的最大的结合程度，显示出比由其他核碱基类型组成的SNA的4-10倍高的细胞结合。值得注意的是，聚G SNA的细胞结合也与SR-A的表达水平正相关；当与相同浓度的聚G SNA一起温育时，HaCaT、3T3和A549细胞分别显示出最高、中等和最低的细胞结合。因此，G的掺入以与SR-A的表达水平相关的方式使SNA对多种哺乳动物细胞类型的递送达到最大。另外，这些数据显示当核碱基类型不保持恒定时，寡核苷酸负载不决定细胞摄取动力学；尽管它们的寡核苷酸负载较低，但聚G SNA以比聚T SNA更高的量进入细胞。
实例3
不管核组成如何，聚G壳使细胞内递送达到最大。
为了证明与聚A、聚T和聚C SNA相比，聚G SNA的聚G壳促进了增加的细胞摄取，合成了具有不同核组成的富含T的SNA和聚G SNA，5nm AuNP或硒化镉(CdSe)量子点(QD)(关于序列信息参见表2)。制备由表2中列出的寡核苷酸组成的5纳米AuNP-SNA和QD-SNA，以研究聚G壳对不同核组成的SNA的细胞摄取的作用(图6)。所有序列均为28个碱基长，并且以二苯并环辛基(DBCO)基团封端。使用先前描述的策略合成AuNP-SNA和QD-SNA[Zhang等人，NatMater 12：741-746(2013)，其以引用的方式全文并入本文]。在一组实验中，用等浓度的富含T的QD-SNA和聚G AuNP-SNA处理C166细胞。在另一组实验中，用等浓度的富含T的AuNP-SNA和聚G QD-SNA处理细胞。然后使用共聚焦显微镜检查来跟踪进入细胞的QD的荧光信号。用富含T的QD-SNA和聚G AuNP-SNA处理的C166细胞显示非常少的细胞内荧光。然而，用富含T的AuNP-SNA和聚G QD-SNA处理的C166细胞显示显著更高的细胞内荧光(图6a)，指示具有聚G壳的SNA进入C166细胞内的更高摄取。为了进一步证实，ICP-MS用于分析用单独的富含T的AuNP-SNA或QD-SNA、单独的聚G AuNP-SNA或QD-SNA、富含T的AuNP-SNA和聚G QD-SNA的组合、以及富含T的QD-SNA和聚G AuNP-SNA的组合处理的C166细胞中的Au含量和Cd含量。用聚G AuNP-SNA处理的C166细胞具有的Au含量是用富含T的AuNP-SNA处理的细胞的3倍。相比之下，用聚G QD-SNA处理的细胞显示的Cd含量是用富含T的QD-SNA处理的细胞的三倍(图6b)。用聚G AuNP-SNA和富含T的QD-SNA处理的细胞具有与Cd含量相比更高的Au含量，并且对于用富含T的AuNP-SNA和聚G QD-SNA处理的细胞，这种趋势是相反的(图6b)。这种竞争性细胞摄取测定显示，具有聚G壳的SNA优先进入细胞，而不管核组成如何，指示聚G壳对细胞表面受体具有更大的亲和力。
表2.SNA纳米颗粒缀合物及其DNA寡核苷酸序列的列表。
实例4
寡核苷酸的最外周大约10个碱基决定了SNA的细胞摄取。
为了从几何角度来表征细胞摄取性质，调查了显著促成SNA的细胞摄取的DNA寡核苷酸的部分。再次，比较了当所有组成成分寡核苷酸保持恒定在30个碱基时SNA的细胞结合(关于序列信息参见表3)。制备由表3中列出的寡核苷酸组成的SNA，以探测核苷酸位置对SNA的细胞摄取的作用(图7)。所有序列均为30个碱基长，并且在3′末端处含有最少6个胸苷酸(T)残基。在3′末端处的聚(T)基序允许寡核苷酸在AuNP的表面上几乎恒定的负载，而不依赖于序列。寡核苷酸的部分不含任何核碱基；通过使用dSpacer CE亚磷酰胺(d；具有核糖单元和磷酸盐主链两者)或Spacer亚磷酰胺C3(c；仅具有磷酸盐主链)来制备这些无碱基区域。
首先，通过ICP-MS比较了聚T SNA以及含有不同量的在5′末端处的G(以重复GGT单元的形式)和在3′末端处的T的SNA之间的细胞结合。在DNA寡核苷酸的3′末端处的聚T区段允许在AuNP的表面上几乎恒定的寡核苷酸负载。一般而言，SNA的细胞结合随着在组成成分寡核苷酸的5′末端处的G含量增加而增加(图7a)。看起来需要在组成成分寡核苷酸的5′末端处的最少四个GGT重复，以显著增强细胞结合；与聚T SNA相比，两个GGT重复的添加并不显著增加细胞结合。
d＝具有核糖单元和磷酸盐主链两者的无碱基位点
c＝仅具有磷酸盐主链的无碱基位点
表3.SNA纳米颗粒缀合物及其DNA寡核苷酸序列的列表
还比较了由GGT重复在5′末端处暴露或埋在链中间的寡核苷酸组成的SNA的细胞结合(参见表3中的序列信息)。当与其中GGT重复在5′末端处暴露的情况相比时，在5′末端上放置T12基序以将GGT重复埋在DNA寡核苷酸链的中间使细胞结合降低大约70％，有效地遏制了GGT重复对SNA的细胞摄取的优异作用(图7b)。这些观察显示在30个碱基长的组成成分DNA寡核苷酸的5′末端处的大约10个碱基主要决定了SNA的细胞摄取性质。除了经由引入更多的G增加聚T SNA的细胞摄取之外，还探测了与聚T SNA的细胞摄取最相关的SNA纳米结构的一部分。为此，构建了在组成成分DNA寡核苷酸的5′末端处含有不同长度的无碱基间隔物的SNA(参见表3中的序列信息)。这些无碱基间隔物包括不包含核碱基的dSpacer(GlenResearch)和既不具有核碱基也不具有环结构的C3间隔物(Glen Research)。具有较高无碱基间隔物含量的SNA显示与聚T SNA相比低大约75％的细胞结合(图7c和7d)，当将多于10个无碱基间隔物单元添加到5′末端时其被拉平。再次，这些数据证明在SNA纳米颗粒的最外围部分处暴露的组成成分寡核苷酸链的大约三分之一(在5′末端处的总共30个碱基中的10个)在确定其细胞结合中是几何学上最必需的。它们还再次肯定核碱基而不是磷酸盐主链或核糖单元是决定SNA的细胞结合的生化活性组分。
实例5
聚G SNA可使小分子化学治疗剂(例如喜树碱)对癌细胞的细胞内递送达到最大。
除通过ICP-MS测量和TEM成像提供的经验数据之外，还通过证明含有药物的SNA的细胞摄取的增加对应于其针对癌细胞的细胞毒性的增加，来提供聚G SNA在所有核碱基类型中最有效地进入哺乳动物细胞的功能证据。作为概念证明，通过将喜树碱(CPT)(小分子化学治疗剂)共价附着到其组成成分寡核苷酸的最外围位置，并且随后根据核碱基类型检查其杀死癌细胞的能力，制备了含有喜树碱的SNA(CPT-SNA)。选择A549人肺腺癌上皮细胞(如图5c中讨论的)作为模型细胞系，因为它们的SR-A和窖蛋白-1的低表达，这两者都是SNA的细胞摄取的必需蛋白质[Choi等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.110：7625-7630(2013)]。鉴于通过A549细胞的SNA细胞摄取的适度程度，任何可观察到的细胞毒性都突出了根据核碱基类型的CPT-SNA效力。为了将CPT分子附着到DNA链上，遵循文献先例以使CPT的-OH基团与含有叠氮化物的接头反应，以合成喜树碱-叠氮化物(CPT-N3)[Parrish等人，Bioconjug Chem 18：263-267(2007)]。无铜点击化学用于将CPT-N3直接偶联到双功能单链DNA(ssDNA)上，所述双功能单链DNA具有在一个末端上的二苯并环辛基(DBCO)基团以及在另一个末端上的硫醇基团。然后所得的缀合物喜树碱-DNA-硫醇(CPT-DNA-SH)可如先前所述共价附着到AuNP的表面，获得CPT-SNA(图8a和9)。
表4.序列如图9d所示。
使用该方法制备了CPT-聚A SNA、CPT-聚T SNA、CPT-聚C SNA和CPT-聚G SNA。鉴于聚T SNA和聚C SNA的寡核苷酸负载显著高于聚A SNA和聚G SNA的寡核苷酸负载量，用未经修饰的T30-SH链有意地稀释CPT-T30-SH链，并且用未经修饰的(CCT)10-SH链稀释CPT-(CCT)10-SH链，因为链被功能化到AuNP上，以便获得在由所有核碱基类型组成的SNA上的CPT分子的类似负载，这允许直接比较聚G SNA的增强的细胞摄取对CPT递送的作用。实际上，喜树碱分子/颗粒的负载被确定为大致相等(大约55±15个CPT分子/AuNP)(图8b)。接下来通过使用ICP-MS测量与细胞结合的金含量来研究核碱基类型对通过A549细胞的CPT-SNA摄取的作用。在温育9小时和18小时后，与由其他核碱基类型组成的CPT-SNA相比，CPT-聚G SNA显示与A549细胞6-9倍高的结合。这一观察加强了下述结论：在AuNP的表面上共价功能化的DNA寡核苷酸的10个最外围碱基在决定SNA的细胞摄取性质方面是最显著的。即，放置在SNA外周处的小分子药物并不显著干扰DNA寡核苷酸与细胞表面SR-A之间的相互作用。使CPT-SNA与A549细胞进一步温育18小时，用新鲜的无纳米颗粒培养基补充，并且允许生长另外54小时。在72小时后，与细胞结合的金含量类似于在18小时后与细胞结合的金含量，暗示CPT-SNA几乎没有明显的胞吐作用(图8c)。除了通过ICP-MS跟踪CPT-SNA的AuNP核之外，通过共聚焦成像显现A549细胞中的CPT分布，利用了在440nm处CPT分子的荧光发射[Zamai等人，Mol Cancer Ther 2：29-40(2003)]。在使CPT-SNA与A549细胞一起温育18小时后，去除颗粒，用新鲜培养基补充，并且在处理后3和5天成像。在3天后，CPT-聚G SNA显示在所有测试的核碱基类型中最高的CPT细胞内累积。在5天后，用CPT-聚G SNA处理的细胞仍然显示最高的荧光，但荧光更为扩散(图8d)。基于ICP-MS和共聚焦成像数据，并且不受理论的束缚，考虑CPT-SNA在细胞中持续足够的时间段，以通过细胞内酯酶的作用逐渐释放CPT分子并且发挥细胞毒性效应[Cheng等人，Bioconjug Chem 14：1007-1017(2003)]。为了测试这点，将20nM CPT-SNA(或等价地，大约1.1μM CPT分子)与不同的序列和A549细胞一起温育18小时，用新鲜培养基补充细胞，并且在几天后通过使用经修饰的MTT测定来测量其活力。在CPT-SNA处理后4至7天之间，CPT-聚G SNA比由其他核碱基类型组成的CPT-SNA明显更细胞毒性。在7天后，与用由其他核碱基类型组成的CPT-SNA处理的细胞的80-100％存活率相比，用CPT-聚G SNA处理的细胞仅显示大约20％的细胞存活率(图8e)。作为阴性对照，A549细胞也与由所有核碱基类型组成的20nM无CPT的SNA一起温育18小时，并且在处理后7天未观察到明显的细胞毒性(图10)，证实了所观察到的通过CPT-SNA处理诱导的细胞毒性源于所附着的CPT分子，而不是SNA体系结构本身。
另外，在用CPT-SNA处理后6天，用碘化丙啶染色细胞以检测CPT诱导的细胞凋亡。染色细胞的流式细胞术揭示CPT-(GGT)10 SNA是最细胞毒性的(图8f)。为了进一步确保CPT在细胞中是活性的，活化的半胱天冬酶3(已知由CPT活化的细胞凋亡信号传导蛋白)[Stefanis等人，J Neurosci 19：6235-6247(1999)]的量在5天后通过ELISA在细胞中进行测量。用CPT-聚G SNA处理的细胞显示比用CPT-A30、CPT-T30和CPT-(CCT)10 SNA处理的细胞更高量的活化的半胱天冬酶3(图11)。总之，CPT-聚G SNA比由其他核碱基类型组成的CPT-SNA明显更有效，如通过聚G SNA增加的CPT对癌细胞的递送和增加的细胞毒性所证明的。这个实例强调了G依赖性递送的功能优点，并且证明了以更高效率递送其他治疗实体的潜力。
结论
由上述非限制性实例证明的是用于增加SNA纳米颗粒缀合物进入细胞的摄取的方法。具有含有高G含量的三维寡核苷酸壳的SNA以比主要由A、T和C组成的SNA更高的量通过细胞内化。此外，富含G的SNA可用于增强核酸和小分子药物两者的细胞内递送。这指示序列组成是除浓度之外的另一种可调谐性质，其可用于定制SNA的细胞内递送。这种定制序列组成的策略是用于基于纳米颗粒的诊断和治疗应用的强大工具，因为它使得能够合理设计具有所需细胞摄取性质的纳米颗粒构建体。
实例6
材料和方法
下述材料和方法用于生成前述实例中所述的数据。
DNA寡核苷酸的合成。使用标准固相合成和试剂(Glen Research)在MM48寡核苷酸合成仪(BioAutomation)上合成DNA。除非另有说明，否则所有DNA均使用具有MicrosorbC18柱(Varian)的ProStar HPLC(Varian)进行纯化。表1含有DNA的详细序列信息。
球形核酸(SNA)纳米缀合物的制备。将硫醇化DNA以1OD DNA/mL补充有0.1％Tween20的10nM AuNP的浓度加入10nm柠檬酸盐加帽的AuNP中。在室温下搅拌1小时后，伴随NaCl的逐渐加入经过6小时使溶液老化，以使最终的NaCl浓度达到0.5M。使用50-kDa AmiconMWCO膜(Millipore)，经由针对Nanopure水的透析，使功能化的AuNP与游离DNA链分离。通过在Cary 5000UV-Vis分光光度计(Agilent)上分别测量其在524nm和260nm处的消光来测定AuNP和DNA浓度。为了制备含有喜树碱的SNA(CPT-SNA)，溶液用NaCl经过5小时老化，以使最终的NaCl浓度达到0.3M。
寡核苷酸负载的测量。将10微升(μL)10nM Cy5标记的不同核碱基类型的SNA加入100μL的1M DTT内。将混合物在40℃下伴随振荡温育15分钟，随后为以14000×g的离心，以去除任何金沉淀物。将100μL上清液置于96孔板中，并且使用Synergy H4 MultimodeMicroplate Reader(Biotek)测量荧光信号(激发：633nm；发射滤光片：660-710nm)。通过与校准标准曲线比较来确定寡核苷酸的浓度。将寡核苷酸浓度除以AuNP浓度(通过UV-Vis光谱法在520nm处测量的)获得寡核苷酸负载。
寡核苷酸壳的显现。将20μL 100nM SNA滴铸到涂布有碳和formvar(ElectronMicroscopy Sciences)的每个辉光放电的200目铜网格上。干燥后，将20μL的2％乙酸双氧铀添加到网格上，以染色寡核苷酸壳1分钟。使用一张滤纸将过量的乙酸双氧铀吸掉。使用HD-2300(Hitachi)显微镜在TEM模式下在80kV的束电压下使干燥的网格成像。Orius SC1000CCD相机(Gatan)用于记录图像。
细胞摄取动力学。提前12小时以5×104个细胞/孔的群接种在24孔板中，将C166(小鼠内皮)、3T3(小鼠成纤维细胞)、HaCaT(人角质形成细胞)或A549(人肺腺癌上皮)细胞在37℃和5％CO2下与0.3mL SNA(在OptiMEM中10nM)/孔一起温育。在不同的时间点取出SNA，随后为OptiMEM冲洗，受胰蛋白酶作用用于使用血细胞计数器计数，并且以8000rpm离心5分钟以形成团块。细胞团块在室温(RT)下用0.3mL浓HNO3中的3％HCl消化过夜，用于后续ICP-MS分析。
ICP-MS。在加入5μL 5ppm铟(内部标准)和5mL基质溶液(2％HCl和2％HNO3)后，在扣除未经处理的细胞的本底金含量后，通过X Series II ICP-MS(ThermoFisher)测量所得溶液的Au-197含量。报告的值表示来自三次独立实验的平均值的平均值±SE。
TEM。将细胞团块在0.2mL在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝8)中的熔融2％琼脂糖中在40℃下混合5分钟。细胞-琼脂糖混合物在RT下使用玻璃移液管轻轻地清除到水中，以形成包覆的面条形果冻。在该琼脂糖果冻中埋入，将细胞固定在100mM二甲胂酸钠缓冲液(pH＝7.4)中的2.5％戊二醛中，用1％OsO4以及0.9％OsO4和0.3％K4Fe(CN)6染色，其中所有步骤均在4℃下进行2小时。在用乙醇和环氧丙烷逐渐脱水后，将细胞团块包埋在Epon 812树脂(Electron Microscopy Sciences)中。将80纳米厚的切片沉积到200目铜网格(EMS)上，并且用2％乙酸双氧铀(SPI Supplies)和Reynolds柠檬酸铅染色，用于使用80kV的束电压在JEM 1230显微镜(JEOL)下显现。Orius SC 1000CCD相机(Gatan)用于记录图像。
量子点和金纳米颗粒SNA的合成。代替将DNA链直接共价附着到纳米颗粒表面，首先用具有叠氮化物的两亲性聚合物涂布CdSe量子点和5nm金纳米颗粒，然后使用应变促进的叠氮化物-炔环加成将DNA偶联到聚合物涂布的颗粒。简言之，商购可得的疏水-配体加帽的纳米颗粒首先用含有疏水性烷基链和亲水性羧酸盐和叠氮化物修饰的乙二醇基团两者的两亲聚合物功能化，以将颗粒溶解在水性溶剂中。然后通过叠氮化物-炔点击化学用二苯并环辛基(DBCO)-封端的DNA链功能化颗粒，以在纳米颗粒周围产生致密的DNA壳。
喜树碱-叠氮化物的制备。喜树碱-叠氮化物(CPT-N3)的制备由先前公开的程序修改和修饰[Parrish等人，Bioconjugate Chem.18：263-267(2006)]。向具有搅拌器的经烘干的50mL圆底烧瓶中加入喜树碱(200mg，0.54mmol)、6-叠氮基己酸(170mg，1.08mmol)、4-二甲基氨基吡啶(8mg)和干燥二氯甲烷(10mL)。将悬浮液冷却至0℃，并且加入1，3-二环己基碳二亚胺(220mg，1.08mmol)。将反应混合物在惰性大气下搅拌12小时，加热至RT，然后倾入100mL乙醚内。将醚悬浮液冷却至0℃以沉淀二环己基脲(DCU)，并且通过真空过滤去除固体。将滤液冷却至-40℃，并且收集所得到的黄色沉淀物，并且由甲醇重结晶，以得到20-O-(6-叠氮基己酰)喜树碱(108mg)。回收的DCU用甲醇反复洗涤，获得另外一批产物(120mg；总得率228mg，87％)。
喜树碱-DNA-硫醇(CPT-DNA-SH)缀合物的制备。通过使用DBCO-TEG亚磷酰胺(GlenResearch，10-1941)的固态合成，制备在其5′末端处全部具有二苯并环辛基(DBCO)基团的各种序列的单链DNA(图9d)。通过收集在310nm处具有DBCO吸收峰的级分，使用1200SeriesHPLC(Agilent)进行DNA-DBCO缀合物的纯化。为了通过无铜点击化学将CPT部分附着到DNA，将80nmol的DNA-DBCO和3mg的CPT-叠氮化物(大约100倍过量)溶解于1.5mL的无水二甲基亚砜中。将反应在40℃下连续振荡18小时。这之后，向混合物中加入3.5mL去离子水以沉淀出过量的CPT，随后加入5mL乙酸乙酯以去除CPT。液-液萃取过程再重复四次。将水相(DMSO/水中的DNA-CPT)冷冻干燥，以回收产物，其化学种类通过MALDI-ToF证实。
共焦显微镜检查。接种在35mm FluoroDish(World Precision Instruments)中，将A549细胞与20nM在OptiMEM中的CPT-SNA一起温育18小时。从细胞中取出CPT-SNA，并且替换为完全DMEM(补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM)共3或5天。经处理的细胞用PBS冲洗，在PBS中的3.7％多聚甲醛中固定15分钟，并且用Hoechst核染剂染色，用于在Zeiss LSM 510倒置共焦扫描显微镜下成像。CPT的激发波长和发射波长分别为370nm和440nm。
MTT测定。以104个细胞/孔的群接种在24孔板中，将A549细胞与0.3mL SNA(在OptiMEM中20nM)一起温育18小时。这之后，从细胞中取出SNA，然后将其与1mL完全DMEM一起温育。在不同持续时间后，将20μL MTT原液(PBS中的5mg/mL MTT；Molecular Probes)加入与300μL完全DMEM预温育的细胞的每个孔内。在2小时后，向每孔中还加入300μL SDS溶液(在50％二甲基甲酰胺中200mg/mL)，随后为充分抽吸以使细胞重悬浮。在温育过夜后，将细胞裂解产物以14000×g离心10分钟，以去除任何金聚集物。使用Synergy H4 MultimodeMicroplate Reader(Biotek)，测定从细胞裂解产物收集的上清液级分在620nm处的吸光度。报告的值表示来自三次独立实验的平均值的平均值±SE。
流式细胞术。接种在6孔板中，A549细胞与1mL SNA(在OptiMEM中20nM)一起温育18小时。在处理后，去除CPT-SNA，并且使细胞在完全DMEM上生长126小时。然后使细胞受胰蛋白酶作用，洗涤并且悬浮于0.5mL PBS中。将0.5mL 3.7％多聚甲醛加入来自每个孔的细胞悬浮液中15分钟。在两次PBS冲洗后，使用1mL在PBS工作溶液(50mg/mL)中的碘化丙啶(Santa Cruz Biotechnology，sc-3541)染色溶液来染色细胞。染色样品在4℃下贮存，并且在流式细胞术分析前保护免受光照。使用BD LSR II流式细胞仪测量10,000个细胞的荧光强度。
化学品。6-叠氮基己酸购自EMD Millipore(Billerica，MA)。CdSe量子点购自Ocean NanoTech。十二烷基硫醇功能化的金纳米颗粒购自Nanoprobes。DBCO-NHS酯购自Clickchemistrytools。所有其他试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，并且按原样使用。
动态光散射。使用Nano Zetasizer(Malvern Instruments)进行测量，使用0.47作为AuNP的折射率。流体动力学直径(HD)测量从数量平均值得出。每个直方图表示六次重复测量后AuNP的尺寸分布。
MALDI-ToF MS。在采用2，5-二羟基苯乙酮(DHAP)作为基质材料的BrukerAutoFlex III MALDI-ToF质谱仪上，收集基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-ToF)数据。
1H NMR。在Bruker Avance 400MHz NMR光谱仪上记录1H NMR光谱。1H NMR光谱内部参考氘代溶剂中的残留质子信号。
活化的半胱天冬酶3的检测。将A549细胞以100,000个细胞/孔的密度在6孔板中铺平板，并且用在OptiMEM中的20nM CPT-SNA处理。在18小时后，用PBS洗涤细胞，并且还与完全DMEM(补充有10％胎牛血清和1％链霉素/青霉素)一起温育。在6天后，将细胞裂解并提取蛋白质。根据制造商的说明书(Cell Signaling 7190S)，通过ELISA检测活化的半胱天冬酶3的相对水平。

Claims (27)

1.一种用多核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒，所述结构域(i)位于对于所述纳米颗粒远侧的所述多核苷酸的末端处，和(ii)包含为至少50％但小于100％鸟苷酸的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述结构域位于所述多核苷酸的5′末端处。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述结构域位于所述多核苷酸的3′末端处。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述结构域位于所述多核苷酸内的内部区域处。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构域为长度约2至约50个核苷酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构域包含至少三个(GGX)基序。
7.根据权利要求6的纳米颗粒，其中X是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的纳米颗粒，其中X是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的纳米颗粒，其中X是经修饰的核苷酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒用另外的多核苷酸功能化。
11.根据权利要求10的纳米颗粒，其中所述另外的多核苷酸包含结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构域包含聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列，所述聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列包含多于一个鸟苷酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构域包含聚鸟苷酸(聚G)序列，所述聚鸟苷酸(聚G)序列包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个鸟苷酸核苷酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多核苷酸是DNA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多核苷酸是RNA。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述另外的多核苷酸是DNA。
17.根据权利要求10-15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述另外的多核苷酸是RNA。
18.一种增加多核苷酸功能化的纳米颗粒的细胞摄取的方法，所述方法包括以下步骤：
修饰所述纳米颗粒，以进一步包含结构域，与缺乏所述结构域的多核苷酸功能化的纳米颗粒相比，所述结构域增加所述寡核苷酸功能化的纳米颗粒的细胞摄取。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述结构域包含聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列，所述聚鸟苷酸(聚G)核苷酸序列包含多于一个鸟苷酸。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述结构域包含聚G序列，所述聚G序列包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个鸟苷酸核苷酸。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述结构域位于所述多核苷酸的5′末端处。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述结构域位于所述多核苷酸的3′末端处。
23.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述结构域位于所述多核苷酸内的内部区域处。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结构域与所述多核苷酸共线。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA。
26.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸功能化的纳米颗粒是根据权利要求1至17中任一项所述的纳米颗粒。
CN201580073536.9A 2014-11-21 2015-11-20 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取 Pending CN107106493A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462083092P 2014-11-21 2014-11-21
US62/083092 2014-11-21
PCT/US2015/062005 WO2016081911A2 (en) 2014-11-21 2015-11-20 The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107106493A true CN107106493A (zh) 2017-08-29

Family

ID=56014693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580073536.9A Pending CN107106493A (zh) 2014-11-21 2015-11-20 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11213593B2 (zh)
EP (1) EP3220895B1 (zh)
JP (1) JP2017537619A (zh)
KR (1) KR20170078843A (zh)
CN (1) CN107106493A (zh)
AU (1) AU2015349680A1 (zh)
CA (1) CA2968531A1 (zh)
WO (1) WO2016081911A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363822A (zh) * 2019-11-20 2020-07-03 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
EP3183007B1 (en) 2014-08-19 2020-06-17 Northwestern University Protein/oligonucleotide core-shell nanoparticle therapeutics
AU2017261360A1 (en) 2016-05-06 2018-11-29 Exicure Operating Company Liposomal Spherical Nucleic Acid (SNA) constructs presenting Antisense Oligonucleotides (ASO) for specific knockdown of interleukin 17 receptor MRNA
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
US10973927B2 (en) 2017-08-28 2021-04-13 The Chinese University Of Hong Kong Materials and methods for effective in vivo delivery of DNA nanostructures to atherosclerotic plaques
CN109975540B (zh) * 2019-04-04 2022-02-11 扬州大学 一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用
US12319711B2 (en) 2019-09-20 2025-06-03 Northwestern University Spherical nucleic acids with tailored and active protein coronae
US11951211B2 (en) * 2020-01-31 2024-04-09 Yale University DNA brick-assisted liposome sorting

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080292545A1 (en) * 2007-04-04 2008-11-27 Yuehe Lin Functionalized Encoded Apoferritin Nanoparticles and Processes for Making and Using Same
CN102215820A (zh) * 2008-11-17 2011-10-12 安龙制药公司 用于核酸输送系统的可释放融合脂质
US20130095039A1 (en) * 2010-09-30 2013-04-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid-mediated shape control of nanoparticles
US20140005258A1 (en) * 2009-09-01 2014-01-02 Northwestern University Delivery of Therapeutic Agents Using Oligonucleotide-Modified Nanoparticles as Carriers

Family Cites Families (492)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3445102A (en) 1965-09-24 1969-05-20 Messer Griesheim Gmbh Cutting torch carriage mount
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
WO1989002439A1 (en) 1987-09-21 1989-03-23 Ml Technology Ventures, L.P. Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5955589A (en) 1991-12-24 1999-09-21 Isis Pharmaceuticals Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ATE167523T1 (de) 1990-05-11 1998-07-15 Microprobe Corp Teststreifen zum eintauchen für nukleinsäure- hybridisierungsassays und verfahren zur kovalenten immobilisierung von oligonucleotiden
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
CA2088258C (en) 1990-07-27 2004-09-14 Phillip Dan Cook Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
IL99066A (en) 1990-08-03 1996-01-31 Sterling Winthrop Inc Nuclease resistant compounds comprising an oligonucleotide sequence having a diol at either or both termini and compositions containing them
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon, Inc. Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
EP0724447B1 (en) 1991-10-24 2003-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
DE69232816T2 (de) 1991-11-26 2003-06-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE69312700T2 (de) 1992-04-14 1998-02-19 Cornell Res Foundation Inc Makromoleküle auf basis von dendritischen polymeren und verfahren zur herstellung
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
ATE143730T1 (de) 1992-04-22 1996-10-15 Ecole Polytech Lipidmembranen fur biosensoranwendungen
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
NL9301919A (nl) 1993-05-27 1994-12-16 Pelt & Hooykaas Werkwijze voor het afvangen van milieuschadelijke stoffen uit met dergelijke stoffen verontreinigd materiaal.
AU7401394A (en) 1993-07-20 1995-02-20 University Of Massachusetts Medical Center In vivo nucleic acid hybridization method
PT748382E (pt) 1993-09-02 2003-03-31 Ribozyme Pharm Inc Acidos nucleicos enzimaticos contendo nao-nucleotidos
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JPH09504297A (ja) 1993-10-27 1997-04-28 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ２′−アミドおよび２′−ペプチド修飾オリゴヌクレオチド
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5565350A (en) 1993-12-09 1996-10-15 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site directed mutations in eukaryotic cells
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5932536A (en) 1994-06-14 1999-08-03 The Rockefeller University Compositions for neutralization of lipopolysaccharides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
PT772619E (pt) 1994-07-15 2006-10-31 Univ Iowa Res Found Oligonucleotidos imunomoduladores
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
EP2168973A1 (en) 1995-05-04 2010-03-31 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US20050059016A1 (en) 2002-11-05 2005-03-17 Ecker David J. Structural motifs and oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO1997048715A1 (en) 1996-06-19 1997-12-24 Hybridon, Inc. Modulation of tetraplex formation by chemical modifications of a g4-containing oligonucleotide
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
JP4245664B2 (ja) 1996-07-29 2009-03-25 ナノスフェアー インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを備えた金ナノ粒子を使用して標的該酸を検出する方法
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU8755798A (en) 1997-04-04 1998-11-13 Biosite Diagnostics Incorporated Polyvalent and polyclonal libraries
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6844161B2 (en) 1997-09-04 2005-01-18 Gryphon Therapeutics, Inc. Modular protein libraries and methods of preparation
WO1999014226A2 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6287765B1 (en) 1998-05-20 2001-09-11 Molecular Machines, Inc. Methods for detecting and identifying single molecules
ES2628744T3 (es) 1998-05-22 2017-08-03 Ottawa Hospital Research Institute Métodos y productos para inducir inmunidad en mucosas
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
FR2783170B1 (fr) 1998-09-11 2004-07-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Emulsion immunostimulante
US6228642B1 (en) 1998-10-05 2001-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-(α) (TNF-α) expression
US6080580A (en) 1998-10-05 2000-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
US6827979B2 (en) 1999-01-07 2004-12-07 Northwestern University Methods utilizing scanning probe microscope tips and products therefor or produced thereby
AR022404A1 (es) 1999-01-25 2002-09-04 Photogen Inc Metodo y agentes para la terapia de radiacion mejorada
EP1177281B1 (en) 1999-04-30 2009-01-21 Cyclops Genome Sciences Limited Isolation of nucleic acid
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
CA2376623C (en) 1999-06-25 2011-04-19 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
DE19935756A1 (de) 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation
EP1204425B1 (en) 1999-08-19 2009-01-07 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
CA2388055A1 (en) 1999-09-25 2001-04-05 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acids
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US6585947B1 (en) 1999-10-22 2003-07-01 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Method for producing silicon nanoparticles
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
EP1238071B1 (en) 1999-11-29 2008-04-23 Avi Biopharma, Inc. Uncharged antisense oligonucleotides targeted to bacterial 16s and 23s rrnas and their uses
US20030181412A1 (en) 1999-12-21 2003-09-25 Ingeneus Corporation Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses
CA2395742A1 (fr) 1999-12-30 2001-07-12 Aventis Pharma S.A. Compositions comprenant des acides nucleiques incorpores dans des particules minerales bilamellaires
AU774593C (en) 2000-01-13 2005-06-23 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
CA2402955C (en) 2000-03-28 2010-03-09 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
AU2001249609A1 (en) 2000-03-28 2001-10-08 Department Of Veterans Affairs Methods for increasing a cytotoxic T lymphocyte response in vivo
US7291284B2 (en) 2000-05-26 2007-11-06 Northwestern University Fabrication of sub-50 nm solid-state nanostructures based on nanolithography
WO2002000916A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 California Institute Of Technology Methods for identifying an essential gene in a prokaryotic microorganism
ATE324465T1 (de) 2000-07-11 2006-05-15 Univ Northwestern Nachweismethode mittels verstärkter silberfärbung
US6806289B1 (en) 2000-07-14 2004-10-19 Stephen J. Lippard Coordination complexes, and methods for preparing by combinatorial methods, assaying and using the same
ATE384072T1 (de) 2000-09-26 2008-02-15 Idera Pharmaceuticals Inc Modulation der immunostimulatorischen aktivität von immunostimulierenden oligonukleotidanaloga durch positionelle chemische veränderungen
US6678548B1 (en) 2000-10-20 2004-01-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Unified probabilistic framework for predicting and detecting seizure onsets in the brain and multitherapeutic device
US7083958B2 (en) 2000-11-20 2006-08-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Membrane scaffold proteins
CN1474831A (zh) 2000-11-20 2004-02-11 ����ŵ˹������ѧ�йܻ� 膜支架蛋白
MXPA03004836A (es) 2000-12-01 2005-09-08 Max Planck Gesellschaft Moleculas pequenas de arn que median la interferencia de arn.
AU2001297693A1 (en) 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
DE10065475A1 (de) 2000-12-28 2002-07-18 Switch Biotech Ag Verwendung von "intermediate-conductance" Kaliumkanälen und Modulatoren zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten mit gestörter Keratinozytenfunktion
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20060019917A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7514099B2 (en) 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US7238472B2 (en) 2001-05-25 2007-07-03 Nanosphere, Inc. Non-alloying core shell nanoparticles
CA2449054C (en) 2001-05-30 2011-01-04 The Scripps Research Institute Integrin targeting liposome for nucleic acid delivery
AU2002345847B2 (en) 2001-06-21 2008-05-29 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
AU2002364927A1 (en) 2001-07-10 2003-06-30 North Carolina State University Nanoparticle delivery vehicle
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
EP1420829A4 (en) 2001-08-07 2006-05-17 Dynavax Tech Corp IMMUNOMODULATING COMPOSITIONS, FORMULATIONS AND METHOD FOR THEIR USE
US20030044354A1 (en) 2001-08-16 2003-03-06 Carpenter Alan P. Gas microsphere liposome composites for ultrasound imaging and ultrasound stimulated drug release
ES2335979T3 (es) 2001-09-14 2010-04-07 Cytos Biotechnology Ag Empaquetamiento de cpg inmunoestimuladores en particulas similares a virus: metodo de preparacion y su uso.
US20030134810A1 (en) 2001-10-09 2003-07-17 Chris Springate Methods and compositions comprising biocompatible materials useful for the administration of therapeutic agents
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US6942972B2 (en) 2001-10-24 2005-09-13 Beckman Coulter, Inc. Efficient synthesis of protein-oligonucleotide conjugates
TW200303759A (en) 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
AU2002343792A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND PROCESS FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE-KNOCKDOWN CELLS AND THE LIKE USING THE SAME
GB2401433B (en) 2001-12-17 2006-10-25 Tao Chen Codon-based sequence analysis
EP2455467B1 (en) 2002-02-01 2016-10-05 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US8088388B2 (en) 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2003101386A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Kinase suppressor of ras inactivation for therapy of ras mediated tumorigenesis
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004014322A2 (en) 2002-08-12 2004-02-19 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, methods of making, and methods of use thereof
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
DE10238298A1 (de) 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2502649A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Nucleonics Inc. Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
BR0315810A (pt) 2002-10-29 2005-09-13 Coley Pharmaceutical Group Ltd Uso de oligonucleotìdeos cpg no tratamento de infecção por vìrus da hepatite c
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US20040158051A1 (en) 2002-11-19 2004-08-12 Mihri Ozkan Mono and dual conjugation of nanostructures and methods of making and using thereof
GB0227738D0 (en) 2002-11-28 2003-01-08 Univ Liverpool Nanoparticle conjugates and method of production thereof
WO2004058179A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
EP2572715A1 (en) 2002-12-30 2013-03-27 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory Combinations
US20060105343A1 (en) 2003-01-09 2006-05-18 Children's Medical Center Corporation Methods for diagnosis and prognosis of cancer
US7138520B2 (en) 2003-01-13 2006-11-21 Massachusetts Institute Of Technology Coordination complexes having tethered therapeutic agents and/or targeting moieties, and methods of making and using the same
WO2004064782A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
JP2006528697A (ja) 2003-05-16 2006-12-21 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド イムノマーを化学療法剤と組み合わせて用いる、癌の相乗的処置
WO2005008222A2 (en) 2003-05-30 2005-01-27 Nanosphere, Inc. Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes
US7727969B2 (en) 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
WO2005001055A2 (en) 2003-06-11 2005-01-06 Hybridon, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
US20050096263A1 (en) 2003-10-30 2005-05-05 Keay Susan K. Novel antiproliferative factor and methods of use
KR20060031607A (ko) 2003-07-10 2006-04-12 사이토스 바이오테크놀로지 아게 패킹된 바이러스-양 입자
EP2363141A1 (en) 2003-07-15 2011-09-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compsition comprising two oligonucleotides linked directly at their 3'ends wherein at leat one oligonucleotide has an accessible 5'end and the compound further comprising IL-2 used for synergistically stimulating an immune response in a patient.
US20080057128A1 (en) 2003-07-18 2008-03-06 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefore, and hydrogels and biomaterials made there from
US7611728B2 (en) 2003-09-05 2009-11-03 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Osmotic delivery of therapeutic compounds by solubility enhancement
KR20060132802A (ko) 2003-09-09 2006-12-22 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
EP1663316A2 (en) 2003-09-25 2006-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid lipophilic conjugates
US6979738B2 (en) 2003-10-22 2005-12-27 Academia Sinica Quadruplex stabilizer
WO2005060377A2 (en) 2003-12-08 2005-07-07 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
US7846412B2 (en) 2003-12-22 2010-12-07 Emory University Bioconjugated nanostructures, methods of fabrication thereof, and methods of use thereof
NZ549622A (en) 2004-02-18 2010-09-30 Chromocell Corp Methods and materials using signaling probes
CN1918293A (zh) 2004-02-20 2007-02-21 莫洛根股份公司 用于对人及高等动物进行治疗性和预防性免疫刺激的取代的非编码核酸分子
EP1718660B1 (en) 2004-02-26 2010-12-01 Layerlab Aktiebolag Oligonucleotides related to lipid membrane attachments
US8084599B2 (en) 2004-03-15 2011-12-27 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20060019916A1 (en) 2004-04-02 2006-01-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
WO2005108614A2 (en) 2004-04-07 2005-11-17 Northwestern University Reversible and chemically programmable micelle assembly with dna block-copolymer amphiphiles
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
GB0409940D0 (en) 2004-05-04 2004-06-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1744620A2 (en) 2004-05-12 2007-01-24 Genentech, Inc. Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
WO2005116226A2 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Midatech Ltd Nanoparticles comprising rna ligands
GB0411537D0 (en) 2004-05-24 2004-06-23 Midatech Ltd Nanoparticles comprising rna ligands
JP2008500364A (ja) 2004-05-25 2008-01-10 キメラコア， インコーポレイテッド 自己集合性ナノ粒子薬物送達システム
US20060008907A1 (en) 2004-06-09 2006-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Control of gene expression via light activated RNA interference
JP4942646B2 (ja) 2004-06-15 2012-05-30 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫賦活オリゴヌクレオチドマルチマー
US7427405B2 (en) 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
WO2006016978A1 (en) 2004-06-30 2006-02-16 Applera Corporation Analog probe complexes
WO2006012695A1 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Panvax Limited An immunogenic composition
WO2006015560A1 (de) 2004-08-09 2006-02-16 Mologen Ag Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen
US20060083781A1 (en) 2004-10-14 2006-04-20 Shastri V P Functionalized solid lipid nanoparticles and methods of making and using same
TW200616606A (en) 2004-10-19 2006-06-01 Schering Ag Treatment and prevention of multi-drug resistance
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR100721928B1 (ko) 2004-11-05 2007-05-28 주식회사 바이오씨에스 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 피부질환의치료 또는 예방용 약학적 조성물
CA2586913A1 (en) 2004-11-09 2006-05-18 University Of Southern California Targeted innate immunity
ATE521621T1 (de) 2004-11-29 2011-09-15 Changchun Huapu Biotechnology Co Ltd Cpg-einzelstrang-desoxynukleotide zur verwendung als adjuvans
CN101080240A (zh) 2004-12-17 2007-11-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于分子成象和治疗的靶向造影剂或靶向治疗剂
BRPI0519047A2 (pt) 2004-12-17 2008-12-23 Koninkl Philips Electronics Nv mÉtodo para a produÇço de um agente de contraste marcador ou agente terapÊutico marcador, agentes de contraste marcadores e uso de agentes de contraste marcadores ou de agentes terapÊuticos marcadores
EP1674128A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 Steinbeis-Transferzentrum für Herz-Kreislaufforschung Magnetic pole matrices useful for tissue engineering and treatment of disease
US8007829B2 (en) 2005-01-19 2011-08-30 William Marsh Rice University Method to fabricate inhomogeneous particles
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
JP2008532936A (ja) 2005-02-14 2008-08-21 ワイス インターロイキン−１７ｆ抗体及び他のｉｌ−１７ｆシグナル伝達拮抗物質並びにそれらの使用
KR100704011B1 (ko) 2005-02-16 2007-04-04 한국과학기술원 금속나노입자와 양자점의 ｆｒｅｔ에 의한 생체분자특이결합 검출 방법
EP2007421A2 (en) 2005-03-04 2008-12-31 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients.
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
EP1880019A1 (en) 2005-05-12 2008-01-23 Arizona Board Regents, a body corporate of the State of Arizona, acting for and on behalf of Arizona State University Self-assembled nucleic acid nanoarrays and uses therefor
WO2006138145A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
EA200800268A1 (ru) 2005-07-07 2008-06-30 Коли Фармасьютикал Груп, Инк. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛОМ ПРОТИВ CTLA-4 И СОДЕРЖАЩИМ CpG-МОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИМ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
JP2009511023A (ja) 2005-10-06 2009-03-19 ユニバーシティー、オブ、デラウェア ハンチントン病の治療のためのｇに富むポリヌクレオチド
JP2007101498A (ja) 2005-10-07 2007-04-19 Fujifilm Corp 蛍光プローブ及び蛍光検出方法
US20090221095A1 (en) 2005-10-13 2009-09-03 Northwestern University Colorimetric Screening of DNA Binding/Intercalating Agents with Gold Nanoparticle Probes
US20070093439A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
WO2007050059A2 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Idera Pharmaceuticals Short immunolomodulatory oligonucleotides
FR2892819B1 (fr) 2005-10-28 2008-02-01 Centre Nat Rech Scient Nanoparticules a luminescence persistance pour leur utilisation en tant qu'agent de diagnostic destine a l'imagerie optique in vivo
CA2630118A1 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Sudhir Agrawal Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
JP5184366B2 (ja) 2005-11-07 2013-04-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾された免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに基づく化合物の免疫刺激特性
US7470674B2 (en) 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
US7776834B2 (en) 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
JP5122474B2 (ja) 2005-12-01 2013-01-16 プロネイ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 両性リポソーム製剤
WO2007067733A2 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods to monitor rna delivery to cells
NZ569741A (en) 2005-12-14 2012-02-24 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
WO2007075626A2 (en) 2005-12-20 2007-07-05 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of palindromic immune modulatory oligonucleotides (imo tm) contiaining different lengths of palindromic segments
JP2009520502A (ja) 2005-12-20 2009-05-28 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃｇジヌクレオチド修飾物を含有するトール様受容体の新規な合成アゴニスト
US20070148251A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Hossainy Syed F A Nanoparticle releasing medical devices
EP1986609A2 (en) 2006-01-26 2008-11-05 University of Massachusetts Rna silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
DK2405002T3 (en) 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Compositions and methods for oligonukleotidformuleringer
EP1820804A1 (en) 2006-02-20 2007-08-22 Humboldt-Universität zu Berlin Lipidated oligonucleotides
US20100167051A1 (en) 2006-03-31 2010-07-01 Goia Dan V Process for Manufacture of Silver-Based Particles and Electrical Contact Materials
GB0607866D0 (en) 2006-04-20 2006-05-31 Isis Innovation Nanostructures
KR20090012265A (ko) 2006-05-11 2009-02-02 몰로겐 아게 면역자극용 멀티머
US20110052697A1 (en) 2006-05-17 2011-03-03 Gwangju Institute Of Science & Technology Aptamer-Directed Drug Delivery
WO2008097328A2 (en) 2006-06-23 2008-08-14 Northwestern University Asymmetric functionalized nanoparticles and methods of use
JP2010507361A (ja) 2006-07-31 2010-03-11 キュアバック ゲーエムベーハー 具体的には免疫刺激剤／アジュバントとしての、一般式（Ｉ）：ＧｌＸｍＧｎ、または一般式（ＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎで表される核酸
JP2010500375A (ja) 2006-08-08 2010-01-07 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 活性剤の多段階送達
WO2008030624A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 The Research Foundation Of State University Of New York Nanoparticles for two-photon activated photodynamic therapy and imaging
LT2468300T (lt) 2006-09-26 2018-02-12 Infectious Disease Research Institute Vakcinos kompozicija, kurioje yra sintetinio adjuvanto
US20100099858A1 (en) 2006-09-28 2010-04-22 Mirkin Chad A Maximizing Oligonucleotide Loading on Gold Nanoparticle
JP2010512421A (ja) 2006-12-12 2010-04-22 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｔｌｒ９の合成アゴニスト
US20080181928A1 (en) 2006-12-22 2008-07-31 Miv Therapeutics, Inc. Coatings for implantable medical devices for liposome delivery
US8415461B2 (en) 2007-01-19 2013-04-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Amphiphilic substances and functionalized lipid vesicles including the same
EP2111218B1 (en) 2007-01-24 2014-07-02 Syddansk Universitet Dna controlled assembly of lipid membranes
JP5512285B2 (ja) 2007-02-09 2014-06-04 ノースウェスタン ユニバーシティ 細胞内標的を検出するための粒子
MX2009009127A (es) 2007-02-27 2009-10-19 Univ Northwestern Unión de moléculas a nanopartículas.
WO2008124639A2 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Poly (amino acid) targeting moieties
US8323694B2 (en) 2007-05-09 2012-12-04 Nanoprobes, Inc. Gold nanoparticles for selective IR heating
WO2008141289A1 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Northwestern University Silver nanoparticle binding agent conjugates based on moieties with triple cyclic disulfide anchoring groups
EP2170353B1 (en) 2007-05-18 2015-06-03 AdiuTide Pharmaceuticals GmbH Phosphate-modified oligonucleotide analogs with immunostimulatory activity
CA3055145A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
ES2660906T3 (es) 2007-05-31 2018-03-26 Anterios, Inc. Nanopartículas de ácido nucleico y usos de las mismas
WO2009045579A2 (en) 2007-06-14 2009-04-09 The Regents Of The University Of California Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
US20080317768A1 (en) 2007-06-21 2008-12-25 Boeing Company Bioconjugated nanoparticles
JP5737937B2 (ja) 2007-07-09 2015-06-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
CA2731399A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Aarhus Universitet Nanoparticle-mediated treatment for inflammatory diseases
ES2539353T3 (es) 2007-08-01 2015-06-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Nuevos agonistas sintéticos de TLR9
TR201820474T4 (tr) 2007-08-13 2019-01-21 Zoetis Belgium S A Spesifik immün modülatör profilleri indükleyen tanımlı nükleotitler arası bağlar bağlamında rna sekansı motifleri.
KR20100066512A (ko) 2007-08-15 2010-06-17 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 톨 유사 수용체 조절자
US8563527B2 (en) 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
US20110300154A1 (en) 2007-08-21 2011-12-08 Children's Medical Center Corporation Treatment of airway hyperreactivity
WO2009046446A2 (en) 2007-10-05 2009-04-09 Wayne State University Dendrimers for sustained release of compounds
JP5336500B2 (ja) 2007-10-17 2013-11-06 韓国科学技術院 核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子、その製造方法、及びこれを用いた核酸の伝達方法
EP2217248B1 (en) 2007-10-29 2016-11-30 Regulus Therapeutics Inc. Targeting micrornas for the treatment of liver cancer
EP2222283A2 (en) * 2007-10-29 2010-09-01 University of Massachusetts Yeast cell wall protein (ycwp) encapsulated multilayered nanoparticles for nucleic acid delivery (sirna)
US7553875B2 (en) 2007-10-31 2009-06-30 Meta Cosmetics, Llc Prostaglandin analog compositions and methods to treat epithelial-related conditions
JP2011503070A (ja) 2007-11-09 2011-01-27 ノースイースタン・ユニバーシティ 全身遺伝子送達のための自己構築型ミセル様ナノ粒子
WO2009072657A1 (ja) 2007-12-06 2009-06-11 The University Of Tokushima ナノ機能性シリカ粒子およびその製造方法
US20090148384A1 (en) 2007-12-10 2009-06-11 Fischer Katrin Functionalized, solid polymer nanoparticles comprising epothilones
CN105903029A (zh) 2007-12-12 2016-08-31 大学健康网络 高密度脂蛋白样肽磷脂支架（“hpps”）纳米颗粒
WO2009091582A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Indigene Pharmaceuticals, Inc. PRODUCTION OF R-α-LIPOIC ACID BY FERMENTATION USING GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS
CN101965195A (zh) 2008-03-05 2011-02-02 巴克斯特国际公司 用于药物投送的组合物和方法
JP5759890B2 (ja) 2008-03-25 2015-08-05 ジュバリス・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッドＪｕｖａｒｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． カチオン性脂質−ｄｎａ複合体（ｃｌｄｃ）の投与による免疫応答の増強
EP2105145A1 (en) 2008-03-27 2009-09-30 ETH Zürich Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides
JP5539962B2 (ja) 2008-04-25 2014-07-02 ノースウェスタン、ユニバーシティ コレステロールを隔離するのに適したナノ構造体
WO2009143157A2 (en) 2008-05-19 2009-11-26 Cornell University Self-assembly of nanoparticles through nucleic acid engineering
US8268796B2 (en) 2008-06-27 2012-09-18 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use thereof
AU2009304552B2 (en) 2008-10-16 2015-02-19 Dalhousie University Combination adjuvant formulation
CN106955360A (zh) 2008-11-24 2017-07-18 西北大学 多价rna纳米颗粒组合物
MX2011006088A (es) 2008-12-09 2011-06-21 Coley Pharm Group Inc Oligonucleotidos inmunoestimuladores.
US8298765B2 (en) 2009-01-01 2012-10-30 Cornell University Multifunctional nucleic acid nano-structures
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
WO2010081049A1 (en) 2009-01-08 2010-07-15 Northwestern University Inhibition of bacterial protein production by polyvalent oligonucleotide modified nanoparticle conjugates
US20110293565A1 (en) 2009-01-30 2011-12-01 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of tlr9
EP2419535B1 (en) 2009-04-15 2022-08-17 Northwestern University Delivery of oligonucleotide-functionalized nanoparticles
EP2246433A1 (de) 2009-04-30 2010-11-03 Mologen AG Concatemere zur Immunmodulation
CN102612561A (zh) 2009-06-01 2012-07-25 艾德拉药物股份有限公司 使用tlr7和tlr9的免疫调节寡核苷酸(iro)拮抗剂强化自身免疫性及炎症性疾病治疗
CN103977394B (zh) 2009-07-17 2016-03-09 翰林大学校产学协力团 包含脂质体包胶的寡核苷酸和表位的免疫刺激性组合物
US20120277283A1 (en) 2009-08-04 2012-11-01 Mirkin Chad A Localized Delivery of Gold Nanoparticles for Therapeutic and Diagnostic Applications
WO2011017690A2 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Northwestern University Intracellular delivery of contrast agents with functionalized nanoparticles
HUE026020T2 (en) 2009-08-27 2016-05-30 Idera Pharmaceuticals Inc Preparation for inhibiting gene expression and its uses
US20120244230A1 (en) 2009-09-01 2012-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Polyvalent polynucleotide nanoparticle conjugates as delivery vehicles for a chemotherapeutic agent
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US20120288935A1 (en) 2009-09-23 2012-11-15 Northwestern University "Click" Nanoparticle Conjugates
US10525152B2 (en) 2009-10-09 2020-01-07 Signablok, Inc. Methods and compositions for targeted imaging
US20110111974A1 (en) 2009-10-23 2011-05-12 Northwestern University Short Duplex Probes for Enhanced Target Hybridization
KR20120136345A (ko) 2009-10-30 2012-12-18 노오쓰웨스턴 유니버시티 주형화된 나노컨쥬게이트
SMT201800220T1 (it) 2009-12-01 2018-07-17 Translate Bio Inc Rilascio di mrna per l'aumento di proteine ed enzimi in malattie genetiche umane
WO2011079290A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Northwestern University Oligonucleotide specific uptake of nanoconjugates
WO2011091065A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Northwestern University Synthetic nanostructures including nucleic acids and/or other entities
EP2399608B1 (en) 2010-03-05 2020-07-08 Sebastian Fuchs Immunomodulating nanoparticulate composition for use in inhalation therapy
US20130101512A1 (en) 2010-03-12 2013-04-25 Chad A. Mirkin Crosslinked polynucleotide structure
WO2011127405A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods and compositions for enhanced delivery of compounds
ES2816898T3 (es) 2010-05-13 2021-04-06 Sarepta Therapeutics Inc Compuestos que modulan la actividad de señalización de las interleucinas 17 y 23
US20110293723A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarrier combination vaccines
US20130089614A1 (en) 2010-06-14 2013-04-11 Xuefeng Zhang Magnetic Nanoparticles and Uses Thereof
BR112013002298A2 (pt) 2010-07-30 2016-05-24 Curevac Gmbh complexação de ácidos nucleicos com componentes catiônicos reticulados com dissulfeto para transfecção e estimulação imunológica.
WO2012031205A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
GB201021873D0 (en) 2010-12-23 2011-02-02 Mologen Ag DNA expression construct
GB201021867D0 (en) 2010-12-23 2011-02-02 Mologen Ag Non-coding immunomodulatory DNA construct
DK2663548T3 (en) 2011-01-11 2017-07-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc PEGYLED LIPIDS AND THEIR USE FOR PHARMACEUTICAL SUPPLY
US9675561B2 (en) 2011-04-28 2017-06-13 President And Fellows Of Harvard College Injectable cryogel vaccine devices and methods of use thereof
US9517277B2 (en) 2011-07-15 2016-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Immune-stimulating photoactive hybrid nanoparticles
EP2548571A1 (en) 2011-07-22 2013-01-23 Institut Curie Compositions having means for targeting at least one antigen to dendritic cells
CN109172819A (zh) 2011-07-29 2019-01-11 西莱克塔生物科技公司 产生体液和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）免疫应答的合成纳米载体
US9901616B2 (en) 2011-08-31 2018-02-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Apoptosis-targeting nanoparticles
WO2013040429A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Rana Therapeutics Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
CN104023749B (zh) 2011-09-14 2019-12-17 西北大学 能穿过血脑屏障的纳米缀合物
CA2850857C (en) 2011-10-06 2022-07-26 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
CN104271591B (zh) 2012-02-17 2017-09-26 梅约医学教育与研究基金会 用于生成能够识别表达HER2/neu多肽的癌细胞的CD8+T细胞的方法和材料
EP3563872A1 (en) 2012-04-05 2019-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Immunostimulatory compositions and methods of use thereof
KR101974577B1 (ko) * 2012-05-21 2019-05-02 삼성전자주식회사 나노입자 제작용 주형 및 이를 이용한 나노입자의 제조 방법
KR20150020180A (ko) 2012-05-23 2015-02-25 더 오하이오 스테이트 유니버시티 안티센스 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 지질 나노입자 조성물
US9931418B2 (en) 2012-08-07 2018-04-03 Northeastern University Compositions for the delivery of RNA and drugs into cells
US9868955B2 (en) 2012-09-29 2018-01-16 Dynavax Technologies Corporation Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
EP3845248A1 (en) 2013-02-05 2021-07-07 1Globe Health Institute LLC Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
JP6251294B2 (ja) 2013-03-01 2017-12-20 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 標的化ナノ粒子
CN103212089B (zh) 2013-04-07 2016-08-24 中国科学院上海应用物理研究所 一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用
US20160310519A1 (en) 2013-04-26 2016-10-27 Nanyang Technological University Modified g-quadruplex nanoparticles
US20160194642A1 (en) 2013-07-25 2016-07-07 Exicure, Inc Spherical nucleic acid-based constructs as immunoregulatory agents
KR101465365B1 (ko) 2013-10-15 2014-11-25 성균관대학교산학협력단 리포좀 내 고분자 충진된 다중 기능 복합 입자체 및 이의 제조방법
JP6527516B2 (ja) 2013-12-03 2019-06-05 ノースウェスタン ユニバーシティ リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
GB2523187A (en) 2014-02-18 2015-08-19 Mologen Ag Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct
EP3110940A1 (en) 2014-02-28 2017-01-04 Bayer Animal Health GmbH Immunostimulatory plasmids
EP3129391A4 (en) 2014-04-03 2017-12-20 Exicure, Inc. Self assembling nucleic acid nanostructures
US10208309B2 (en) 2014-04-04 2019-02-19 Bioneer Corporation Double-stranded oligo RNA targeted to amphiregulin and pharmaceutical composition comprising same for preventing or treating fibrosis or respiratory diseases
PL3164113T3 (pl) 2014-06-04 2019-09-30 Exicure, Inc. Wielowartościowe dostarczanie modulatorów immunologicznych w liposomowych kolistych kwasach nukleinowych do zastosowań profilaktycznych lub terapeutycznych
EP3183007B1 (en) 2014-08-19 2020-06-17 Northwestern University Protein/oligonucleotide core-shell nanoparticle therapeutics
EP3183345B1 (en) 2014-08-20 2021-06-16 Northwestern University Biocompatible infinite coordination polymer nanoparticle-nucleic acid conjugates for antisense gene regulation
EA201790802A1 (ru) 2014-10-06 2017-08-31 Экзикьюр, Инк. Соединения против tnf
SG10202105879XA (en) 2014-10-24 2021-07-29 Astrazeneca Ab Combination
CN113813386A (zh) 2014-12-31 2021-12-21 查克美特制药公司 组合肿瘤免疫疗法
KR20170100033A (ko) 2015-01-23 2017-09-01 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 분지형 및 선형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드, 그것들의 용도 및 제조 방법
WO2016196062A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Dynavax Technologies Corporation Intrapulmonary administration of polynucleotide toll-like receptor 9 agonists for treating cancer of the lung
WO2016196178A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination of an anti-il-10 antibody and a cpg-c type oligonucleotide for treating cancer
CN108025018B (zh) 2015-05-29 2021-08-17 默沙东公司 用于治疗癌症的pd-1拮抗剂和cpg-c型寡核苷酸的组合产品
WO2016207314A2 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Bayer Animal Health Gmbh Methods of modulating cytosolic dna surveillance molecules
WO2017007027A1 (ja) 2015-07-09 2017-01-12 国立研究開発法人物質・材料研究機構 免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体
WO2017011618A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 The Curators Of The University Of Missouri Targeted nanoparticle conjugate and method for co-delivery of sirna and drug
WO2017035278A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
US10940201B2 (en) 2015-09-30 2021-03-09 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
CN108367021A (zh) 2015-10-15 2018-08-03 希望之城 包含硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法
US12318489B2 (en) 2015-10-26 2025-06-03 Translate Bio Ma, Inc. Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
WO2018152327A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Northwestern University Enhancing stability and immunomodulatory activity of liposomal spherical nucleic acids
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
US20200291394A1 (en) 2017-05-17 2020-09-17 Northwestern University Conjugation of peptides to spherical nucleic acids (snas) using traceless linkers
WO2019118883A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Northwestern University Structure-function relationships in the development of immunotherapeutic agents

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080292545A1 (en) * 2007-04-04 2008-11-27 Yuehe Lin Functionalized Encoded Apoferritin Nanoparticles and Processes for Making and Using Same
CN102215820A (zh) * 2008-11-17 2011-10-12 安龙制药公司 用于核酸输送系统的可释放融合脂质
US20140005258A1 (en) * 2009-09-01 2014-01-02 Northwestern University Delivery of Therapeutic Agents Using Oligonucleotide-Modified Nanoparticles as Carriers
US20130095039A1 (en) * 2010-09-30 2013-04-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid-mediated shape control of nanoparticles

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNG HANG J. CHOI，等: "Mechanism for the endocytosis of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates", 《PNAS》 *
HENAN LI，等: "Target-Cell-Specific Fluorescence Silica Nanoprobes for Imaging and Theranostics of Cancer Cells", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
NICK PLATT，等: "Role for the class A macrophage scavenger receptor in the phagocytosis of apoptotic thymocytes in vitro", 《PNAS》 *
VIKRAM PRASAD，等: "Oligonucleotides Tethered to a Short Polyguanylic acid Stretch Are Targeted to Macrophages：Enhanced Antiviral Activity of vesicular stomatitis virus-specific antisense oligonucleotide", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 *
杨安钢，等: "《生物化学与分子生物学实验技术》", 30 June 2008, 高等教育出版社 *
王宪泽: "《简明分子生物学教程》", 31 July 2008, 中国农业出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363822A (zh) * 2019-11-20 2020-07-03 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法
CN111363822B (zh) * 2019-11-20 2024-03-19 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170078843A (ko) 2017-07-07
JP2017537619A (ja) 2017-12-21
US11213593B2 (en) 2022-01-04
WO2016081911A3 (en) 2016-06-23
EP3220895B1 (en) 2022-08-31
AU2015349680A1 (en) 2017-06-08
WO2016081911A2 (en) 2016-05-26
US20180344873A1 (en) 2018-12-06
EP3220895A4 (en) 2018-08-01
EP3220895A2 (en) 2017-09-27
CA2968531A1 (en) 2016-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107106493A (zh) 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取
AU2008259907B2 (en) Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US10370661B2 (en) Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
JP6466500B2 (ja) 多価ｒｎａ−ナノ粒子組成物
US20170044544A1 (en) Oligonucleotide specific uptake of nanoconjugates
US20130101512A1 (en) Crosslinked polynucleotide structure
WO2015012912A2 (en) Alkyne phosphoramidites and preparation of spherical nucleic acid constructs
WO2015066708A1 (en) Quantification and spatio-temporal tracking of a target using a spherical nucleic acid (sna)
AU2018279030A1 (en) Nucleic Acid Functionalized Nanoparticles For Therapeutic Applications
AU2014262264B2 (en) Nucleic Acid Functionalized Nanoparticles For Therapeutic Applications

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170829

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载