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CN106635910B - 一种缺陷短波单胞菌、菌剂及其应用 - Google Patents

一种缺陷短波单胞菌、菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1‑8，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13002。本发明还公开了所述缺陷短波单胞菌1‑8的固体菌剂及其在降解原油污染水体和原油污染土壤中的应用。本发明提供的缺陷短波单胞菌不但易于规模化生产，而且降解效率高，环境适应性强。该菌及其具体菌剂能在原油浓度达1mL/100mL的原油污染水体中体现出较优的降解效果，其固体菌剂也可对原油污染土壤具有良好的降解修复效果，实现原油污染的修复处理，在原油污染的生物修复中展现了良好的应用前景。

Description

一种缺陷短波单胞菌、菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种缺陷短波单胞菌、菌剂及其应用。
背景技术
石油中的所包含的烷烃、芳香烃、含硫化合物以及含硫或含氮的杂环化合物等均具有毒性，对人类和环境的危害极大。而原油是未经加工的石油，是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种粘稠的黑色或深棕色的液体或固体，一般情况下大多存在于地下或海底，且带有刺激性气味，主要成分是碳氢原子结合形成的链状化合物，其对水体、土壤、空气等人类生存的环境具有极大的危害。
目前，对石油污染的水体、土壤等的修复技术主要有物理修复技术、化学修复技术、光催化修复技术和生物修复技术；生物修复技术是一个具有政策、经济和技术吸引力的处理方法，被认为是最具发展潜力的技术方法，并且逐步发展成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。
普遍来说一种微生物仅能降解一种或少数几种原油烃，且不同微生物对同种污染组分的降解效果也不同，多种微生物在降解过程中还可能出现协同或竞争作用。但是原油和其炼油产物，所含的原油经种类非常复杂，而且不同源产地的原油其原油经成份也有很大的差异。因此微生物修复技术在迅速发展的同时还存在一些局限性，特定的微生物只能降解特定的化合物类型，微生物的繁殖与代谢活性受环境因素的影响较大，常常在投加至土壤的初始阶段出现大量死亡。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种可用于降解原油污染水体的缺陷短波单胞菌，将该菌种直接投加入污染水体中，达到较好的降解效果，实现原油污染的治理。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种缺陷短波单胞菌，已于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13002；命名为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8。
将所述缺陷短波单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株1-8在牛肉膏蛋白胨的平板上呈浅黄色，随着培养时间的延长，菌落颜色略有加深，表面光滑、湿润，菌落呈圆形，中央突起，边缘整齐，呈现半透明状。菌体细胞呈短杆、棒状，细胞呈单个排列，大小为0.5μm×(0.1-0.3)μm，为革兰氏阴性菌。
所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8的16S rDNA测序结果如SEQID No.1所示。
(二)一种缺陷短波单胞菌菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂，且以缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8为活性成分。
(三)所述缺陷短波单胞菌在降解原油污染水体中的应用。
(四)所述缺陷短波单胞菌菌剂在降解原油污染水体中的应用。
(五)所述缺陷短波单胞菌菌剂在降解原油污染土壤中的应用
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的缺陷短波单胞菌不但易于规模化生产，而且降解效率高，环境适应性强。所提供的缺陷短波单胞菌能在大量有机物存在的条件下顺利生长，以原油为碳源，达到较好的降解效果。该菌及其具体菌剂能在原油浓度达1mL/100mL的原油污染水体中体现出较优的降解效果，其固体菌剂也可对原油污染土壤具有良好的降解修复效果，实现原油污染的修复处理，在原油污染的生物修复中展现了良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明的缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；
图2为本发明的缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1600倍；
图3为本发明实施例3中I号原油的波长-吸光度曲线图；图中，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度，单位为1；
图4为本发明实施例3中I号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1；
图5为本发明实施例4中II号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1菌株的分离纯化
(1)菌株来源
本发明提供一种缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)，分离自延长石油集团的七里洞采油场集油站落地原油污染土壤中，土壤的理化性质为：铵态氮15.09ppm，硝态氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，钾含量17.45ppm，有机质含量1.43％，pH为7.65。
(2)菌株的分离纯化
将10g石油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d。其中，富集液体培养基的成分为：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，I号原油1％(体积比)，pH 7.0。其中，I号原油采自延长石油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL；牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选菌落进行平板划线纯化分离。将菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。
(3)溶油圈法筛选石油降解菌
将上述纯菌菌种接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10-15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的石油降解能力。将初步筛选的石油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。
实施例2菌株的鉴定
(1)菌株的形态特征
如图1所示，将所述缺陷短波单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株1-8在牛肉膏蛋白胨的平板上呈浅黄色，随着培养时间的延长，菌落颜色略有加深，表面光滑、湿润，菌落呈圆形，中央突起，边缘整齐，呈现半透明状。如图2所示，菌体细胞呈短杆、棒状，细胞呈单个排列，大小为0.5μm×(0.1-0.3)μm。
(2)生化特性
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对缺陷短波单胞菌进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。
表1缺陷短波单胞菌1-8菌株的生理生化鉴定结果
Figure BDA0001196489210000051
Figure BDA0001196489210000061
注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性。
(3)菌株的16S rDNA鉴定
用DNA提取试剂盒提取菌株1-8的基因组DNA，然后进行16S rDNA基因克隆、测序，其16S rDNA测序结果如SEQ ID No.1所示，具体如下：
Figure BDA0001196489210000062
Figure BDA0001196489210000071
之后在GenBank中进行Blast比对，结果显示，与其序列相似度达到98.56％均为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)，将其归属为单胞菌类并命名为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8。
实施例3缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8对I号原油污染水体的降解
试验方法：
(1)缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8菌悬液的制备
在无菌条件下，挑取分离纯化获得的原油降解菌1-8，接种于100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床扩大培养培养48h；其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4-7.6。pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。培养基灭菌条件是：温度为121～126℃，时间为25min。
(2)I号原油最大吸收波长的测定
石油及其产品在紫外光区有一定的吸收特征，石油组分中带有苯环的芳香族化合物波长一般为250～260nm，而带有共轭双键的化合物波长一般在215～230nm之间，有研究表明，在使用紫外分光光法测定时，255nm左右为原油和重质油的选择范围，225nm左右与为轻质油及炼油厂的油品的选择范围。在100mg/L浓度下，依据获得的波长与吸光度数据，绘制供试I号原油的波长-吸光度曲线如图3所示，其中，I号原油采自延长石油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL。
(3)I号原油标准曲线的绘制
分别取0、2、2.5、5、6、7mg I号原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此时的浓度分别为0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波长下，以石油醚为参比溶液，测定标准浓度的吸光度，横坐标为浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度，绘制I号原油的浓度(mg/L)-吸光度(A)的标准曲线如图4所示。
(4)原油降解率的测定
取扩大培养的1-8菌悬液3mL，接种于100mL含油无机盐液体培养基中，含油无机盐培养基的成分是：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，I号原油1.5mL，pH 7.0；在30℃，120rpm恒温水浴振荡器中培养7d。培养液用5:1(V/V)的硫酸溶液调节PH值为2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后转入50mL容量瓶并定容。
将石油醚萃取液经系列稀释后，以石油醚为参比，通过紫外分光光度法测定其相应的吸光度，根据I号原油的浓度(mg/L)-吸光度的标准曲线，确定石油醚提取液相应样品的浓度，依据浓度计算降解效率。
原油降解率的计算方法参考以下公式：
η(％)＝(1-Ct/Co)×100％
其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油浓度；Co-对照原油浓度。
试验结果：
按照上述计算公式计算得缺陷短波单胞菌1-8对原油污染水体的周降解率为85％。
实施例4缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8对II号原油污染水体的降解
试验方法：
(1)缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8菌悬液的制备
同实施例3。
(2)II号原油标准曲线的绘制
II号原油采自长庆油田，密度为0.87g/mL。取0、1、1.5、2、2.5、3mgII号原油于50mL比色管中，用四氯化碳定容至刻度线，系列稀释后使得浓度分别为0、20、40、50、60、70mg/L，在其最大吸收波长288nm下，以四氯化碳为参比溶液，测定标准浓度的吸光度。横坐标为浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度，绘制II号原油的浓度(mg/L)-吸光度的标准曲线如图5所示。
(3)原油降解率的测定
具体的测定方法同实施例3。
试验结果：按照上述计算公式计算得1.2mL和4.2mL的缺陷短波单胞菌1-8菌悬液对II号原油污染水体的周降解率分别为5.13％和26.94％。
实施例5包埋法制备缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8固体菌剂
海藻酸钠(Sodium alginate，SA)是一种具有前途和广泛类型的自然凝胶，并且被公认为价格便宜和对微生物具有无毒性。添加载体材料能增强机械强度、SA凝胶的耐受性以及为微生物提供吸附位点。以海藻酸钠为包埋材料，CaCl2溶液为交联剂，α-乳糖为营养物吸附剂。
制备方法按照以下步骤进行：
①将4g海藻酸钠、1.5g生物质碳、0.5g的α-乳糖混合，并加入100mL蒸馏水缓缓搅拌，搅拌时注意将活性炭搅拌均匀外，搅拌幅度不宜过大，防止大量气泡进入海藻酸钠溶液，搅拌结束后将该溶液置于121℃条件下高压灭菌20min。其中，生物质碳来源于陕西瑛基量生物能源有限公司大荔分公司秸秆热裂解生物质燃油项目，理化性质为：铵态氮2.69ppm，硝态氮4.34ppm；氮含量7.03ppm；磷含量12.54ppm；钾含量417.32ppm；有机质含量3.96％；pH为7.05。
②待灭菌之后，将其冷却至30℃左右，加入20mL的按照实施例3中缺陷短波单胞菌1-8菌悬液制备方法所得到的已活化36h的缺陷短波单胞菌1-8菌悬液，分别将其混合均匀，分别得到混合液。
③用10mL一次性注射器将混合液挤入质量百分数为4％的CaCl2溶液中，交联24h，形成固定微球，即为包埋法制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂。
④过滤，然后用无菌水洗涤三次，浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。
实施例6吸附法制备缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8固体菌剂
以生物质材料及其对应生物炭为目标载体，通过吸附法固定原油降解混合菌。
固定方法按照以下步骤进行：
①将1.5g生物质碳加入装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL锥形瓶中，并加入20mL的按照实施例3中所得到的已活化36h的缺陷短波单胞菌1-8菌悬液，混合。
②将锥形瓶置于30℃条件下、转速为120r/min的摇床中，固定18小时。
③然后在3000rpm条件下离心10min，去掉上清液，将下层沉淀用无菌水水清洗2次。
④将其置于培养皿内于30℃烘箱中烘干，即为吸附法制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂，将其浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。
实施例7缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂对II号原油污染水体的降解
将实施例5和实施例6所制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂用于降解原油污染水体，具体如下：分别取5g包埋法和吸附法制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂，分别接入1mLII号原油/100mL原油无机盐培养基中30℃、120r/min恒温培养7d后，测定其对原油的去除效果，并与缺陷短波单胞菌1-8菌悬液对II号原油污染水体的降解率进行对比，结果如表2所示。
表2缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂和菌悬液对II号原油污染水体的降解率
Figure BDA0001196489210000111
由表2可知，缺陷短波单胞菌1-8的固体菌剂对II号原油污染水体也具有降解修复的作用，将其与菌悬液的降解效果相对比，结果表明固体菌剂的降解效果较佳，且吸附法制备的固体菌剂的降解效果优于包埋法制备的固体菌剂的降解效果。
实施例8缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂对II号原油污染土壤的降解
将实施例5和实施例6所制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂用于降解原油污染土壤，具体如下：
原油污染土样：称取过1mm筛子晾干的土样，按原油污染度及称取土样的质量进行称取加入土样中搅匀，原油污染度为10g/kg，按照C：N：P为100：10：1比例拌入(NH4)2SO4和KH2PO4做为N源和P源。确切来说，微生物的营养物质还包括C，但是石油污染导致了C源的大量增加，足以保证其供应，不需要额外投加。土样的理化性质为：铵态氮5.75ppm，硝态氮4.70ppm；氮含量10.45ppm；磷含量16.41ppm；钾含量76.45ppm；有机质含量2.35％；pH为7.27。
试验方法：
分别取5g包埋法和5g吸附法制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂，分别接入含水率控制在12％-15％的100g原油II号污染浓度1％的土壤中、120r/min、30℃恒温培养7d、14d、21d后测定其对原油II号的去除效果，得出其降解率。
土壤中石油烃含量测定法，按以下步骤进行：
①称取5g风干土样，放入50mL塑料离心管中。
②用移液管加入10mL四氯化碳(分析纯)，超声萃取1h(温度不超过30℃)，浸提液经无水硫酸钠干燥后过滤到25mL容量瓶中，继续用2×10mL四氯化碳热浸俩次，每次20min，滤液经干燥后并入容量瓶，用四氯化碳定容。
③分光光度计在288nm波长，以四氯化碳为参比测定样品的吸光度值，对照标准曲线反推原油的浓度。
缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂对原油污染土壤的降解试验结果如表3所示。
表3缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂对原油污染土壤的降解率
菌剂制备方法 7d降解率/％ 14d降解率/％ 21d降解率/％
包埋法 12.59 14.41 17.50
吸附法 10.06 12.98 29.11
由表3可知，包埋法和吸附法制备的缺陷短波单胞菌1-8固体菌剂对原油污染土壤均具有降解修复效果，且在降解短时间内包埋法制备的固体菌剂降解效果较佳，而当降解时间达到21天时，吸附法制备的固体菌剂对原油污染土壤的降解率有明显提升，降解效果明显。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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ATGCCGAATG TGCCCTTCGG GGGAAAGATT TATCGCCTTT AGAGCGGCCC GCGTCTGATT 120
AGCTAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG GCGACGATCA GTAGCTGGTC TGAGAGGATG 180
ACCAGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT 240
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CTTCGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGAAG GGGGCTAGCG TTGCTCGGAA TTACTGGGCG 420
TAAAGGGCGC GTAGGCGGAT CGTTAAGTCA GAGGTGAAAT CCCAGGGCTC AACCCTGGAA 480
CTGCCTTTGA TACTGGCGAT CTTGAGTATG AGAGAGGTAT GTGGAACTCC GAGTGTAGAG 540
GTGAAATTCG TAGATATTCG GAAGAACACC AGTGGCGAAG GCGACATACT GGCTCATTAC 600
TGACGCTGAG GCGCGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC 660
CGTAAACGAT GATTGCTAGT TGTCGGGCTG CATGCAGTTC GGTGACGCAG CTAACGCATT 720
AAGCAATCCG CCTGGGGAGT ACGGTCGCAA GATTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC 780
CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCAACG CGCAGAACCT TACCACCTTT 840
TGACATGCCT GGACCGCCAC GGAGACGTGG CTTTCCCTTC GGGGACTAGG ACACAGGTGC 900
TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA 960
CCCTCGCCAT TAGTTGCCAT CATTTAGTTG GGAACTCTAA TGGGACTGCC GGTGCTAAGC 1020
CGGAGGAAGG TGGGGACGAC GTCAAGTCCT CATGGCCCTT ACAGGGTGGG CTACACACGT 1080
GCTACAATGG CAACTACAGA GGGTTAATCC TTAAAAGTTG TCTCAGTTCG GATTGTCCTC 1140
TGCAACTCGA GGGCATGAAG TGGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCCGCAT GCCGCGGTGA 1200
ATACGT 1206

Claims (5)

1.一种缺陷短波单胞菌，其特征在于，于2016年09月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13002；命名为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8。
2.根据权利要求1所述的缺陷短波单胞菌，其特征在于，所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种缺陷短波单胞菌菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂，且以缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)1-8为活性成分。
4.权利要求3所述的缺陷短波单胞菌菌剂在降解原油污染水体中的应用。
5.权利要求3所述的缺陷短波单胞菌菌剂在降解原油污染土壤中的应用。
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