CN105925500A - 一种干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于牧草饲料加工贮藏技术领域的一种干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。所述的干酪乳杆菌的菌株为LC，分类命名为Lactobacillus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10472。所述的干酪乳杆菌从苜蓿青贮饲料中分离得到，是一株新的干酪乳杆菌。所述的干酪乳杆菌能明显提高苜蓿青贮的发酵品质，且具有发酵效率高、成本低廉等优点，可应用于我国优质苜蓿青贮饲料的生产中。
Description
技术领域
本发明属于牧草饲料加工贮藏技术领域，特别涉及一种干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa)是目前国内外栽培面积较大的牧草之一。紫花苜蓿不仅产量高，且草质优良，富含维生素、矿物质等营养元素，平均蛋白含量可达20％，各种畜禽均喜食。然而在中国苜蓿的主要种植区，其第2、3茬苜蓿刈割期正值雨季，频繁降雨使苜蓿水分散失缓慢，干草品质下降，甚至失去饲喂价值；相比之下，青贮便于机械化操作，受气候条件影响较小。青贮苜蓿作为苜蓿产品的一种重要形式，不仅能解决我国苜蓿干草加工及雨淋造成的损失，而且能增加苜蓿草产品的多样性，延长青绿多汁饲料的利用。
紫花苜蓿由于可溶性碳水化合物(WSC)含量低，附着乳酸菌数量少等原因，常规青贮难以成功。很多添加剂被用来促进苜蓿青贮的发酵过程，其中研究最广泛的就是乳酸菌青贮添加剂。与传统的化学添加剂相比，乳酸菌剂具有生态安全、应用简易，成本低廉的特点。添加乳酸菌剂可确保苜蓿青贮发酵初期充足的乳酸菌数，促进乳酸发酵，降低pH值，抑制梭菌发酵，使苜蓿青贮快速达到稳定。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，其目的在于提供一株干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌菌株为LC，分类命名为Lactobacillus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10472。
所述的干酪乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
所述的干酪乳杆菌的生物学特性为：菌株在MRS固体培养基上30℃培养48h，生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢；氧化酶阴性，具有较强的生长及产酸性能；在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能生长，在10℃条件下呈现微弱生长，在15℃-45℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％NaCl的条件下生长状况良好。
所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料中应用。
所述苜蓿青贮饲料的制备方法为：在苜蓿中接种干酪乳杆菌LC后，将其在15-25℃下固体厌氧发酵30-60d即可。
所述的干酪乳杆菌LC的接种量为：每克苜蓿中接种105-106cfu干酪乳杆菌LC。
所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料添加剂中的应用。
所述的苜蓿青贮饲料添加剂为制备苜蓿青贮饲料中添加的菌剂。
所述苜蓿青贮饲料添加剂的制备方法为：将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在温度为30-37℃的条件下，厌氧培养18-24h；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.0g L-1蛋白胨、10.0g L-1牛肉膏、5.0g L-1酵母膏、2.0g L-1柠檬酸氢二铵、20.0g L-1葡萄糖、1.0g L-1吐温-80、5.0g L-1乙酸钠、2.0g L-1磷酸氢二钾、0.58g L-1硫酸镁和0.25g L-1硫酸锰；
所述MRS液体培养基的初始pH值为6-7。
本发明的有益效果为：与自然的苜蓿青贮饲料相比，每克苜蓿中接种106cfu 的干酪乳杆菌LC后，苜蓿青贮饲料的pH明显降低，乳酸含量提高58.6％，氨态氮降低24.5％，大肠菌数量明显降低，明显提高了苜蓿青贮的发酵品质；同时干酪乳杆菌LC具有发酵效率高、成本低廉等优点，可应用于绿色环保生物饲料的生产中。
生物材料保藏说明
分类命名：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；菌株编号：LC。
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年1月30日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10472。
附图说明
图1：干酪乳杆菌LC在MRS液体培养基中生长时MRS液体培养基pH值的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC的分离与鉴定
取北京地区苜蓿青贮20g，加入180mL蒸馏水，用震荡器震荡30min，10-1-10-6梯度稀释。分别从各梯度稀释液中取1mL至培养皿中，加入10-15mL灭菌后的MRS固体培养基，摇匀，待其冷却凝固，静置厌氧培养48h，挑取菌 落形态、大小、颜色和光泽度有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。
对分离筛选得到的菌株进行鉴定，根据菌株的细胞形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列进行综合分析，鉴定菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，命名为LC，是一株新的干酪乳杆菌。
菌株LC的生物学特性为：LC菌株在MRS固体培养基上培养24h，菌株生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢；氧化酶阴性，具有较强的生长及产酸性能。
将菌株LC接种于MRS液体培养基中37℃培养48h后，按1.5％的比例接种到灭菌后的200mL MRS液体培养基中，置于37℃培养箱中培养，每3h取样测定MRS培养基的pH值，并在600nm下测定其吸光度，结果如图1所示。从图中可知，菌株LC在MRS液体培养基中培养24h后，MRS液体培养基的pH值低于4.0。
根据GB4789.35-2010对菌株不同碳源的同化能力进行检测，其对碳源发酵的实验结果如表l所示；16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
表1：LC菌株的碳源发酵实验结果
注：“+”为阳性；“-”为阴性。
实施例2：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC在不同pH、温度及盐浓度环境条件下的生长测定
用1mol L-1的盐酸和1mol L-1的氢氧化钠将MRS培养基的起始pH值分别调至3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37℃恒温静置培养干酪乳杆菌LC 24h，培养过程中不调酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结果显示，干酪乳杆菌LC能够在起始pH3.5-pH8.0的条件下生长。
将活化的干酪乳杆菌LC接种于MRS液体培养基，分别在温度为10℃、15℃、20℃、30℃、40℃和45℃的条件下培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结果显示，干酪乳杆菌LC在温度为10℃的环境下呈现微弱生长，在15℃-45℃条件下生长状况良好。
将活化的干酪乳杆菌LC分别接种于含3wt％和6.5wt％NaCl的MRS液体培养基中培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结果显示，干酪乳杆菌LC能够在含3wt％和6.5wt％NaCl的条件下生长。
表2：干酪乳杆菌LC在不同环境条件下的生长情况
注：“+”为阳性；“-”为阴性；“w”为弱阳性。
实施例3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC制备苜蓿青贮饲料
紫花苜蓿：为安徽蚌埠秋实草业基地种植的维斯顿紫花苜蓿，刈割时期为现蕾期。
l、制备菌粉
无菌条件下，取干酪乳杆菌LC接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养18-24h，得到干酪乳杆菌LC菌悬液；离心得到干酪乳杆菌LC菌体后，加入灭菌的脱脂奶，混匀后冻干，得到LC含量大于1×1012cfu g-1的菌粉。
取0.1000g左右的菌粉，加入1mL灭菌后的生理盐水，10-1-10-11逐级稀释，分别取1mL稀释液至培养皿中，加入灭菌后的MRS固体培养基，混匀冷却，凝固后37℃厌氧培养48h，计数，以此计算出每克菌粉的活菌数。
2、设两个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
处理l(苜蓿中接种干酪乳杆菌LC青贮)：取1000g苜蓿，晾晒至含水量为55％左右，然后按每克苜蓿接种106cfu的干酪乳杆菌LC，取适量步骤l制备的LC菌粉，加5mL蒸馏水溶解活化20-30min，均匀喷洒到苜蓿草上，混匀后取320g装入500ml青贮桶，密封后室温存放。
处理2(苜蓿自然青贮)：取1000g苜蓿，晾晒至含水量为55％左右，加入与处理l同样体积的不含干酪乳杆菌LC的蒸馏水，均匀喷洒到苜蓿上，混匀后取320g装入500ml青贮桶，压实密封后室温存放。
密封60d时开封，记录各处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产物中的活菌数；同时测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成和氨态氮占总氮的百分比。有机酸组成及含量测定条件为：采用色谱柱Column Type：Shodex RS Pak KC-811，柱温：50℃，流速：1.0ml min-1，流动相：3mmol l-1HClO4，注入样品量：5μl，旋光性：非极性，UV检测器210nm。
3、实验结果
测定结果如表3所示。结果表明：与自然青贮相比，接种干酪乳杆菌LC后苜蓿青贮的pH明显降低，乳酸含量提高58.6％，氨态氮降低24.5％，大肠菌数量明显降低，明显提高了苜蓿青贮的发酵品质。
表3.自然青贮和接种干酪乳杆菌LC苜蓿青贮的干物质含量(％)、pH值、有机酸(g kg-1DM)、
氨态氮(％总氮)及微生物含量(log cfu g-1FM)结果
| 处理 | 干物质 | pH | 乳酸 | 乙酸 | 丁酸 | 氨态氮 | 大肠菌 | 霉菌和酵母菌 |
| 对照 | 43.4 | 5.23 | 23.2 | 6.03 | ND | 10.2 | 3.9 | <2.0 |
| LC | 44.1 | 4.65 | 36.8 | 7.10 | ND | 7.7 | <2.0 | <2.0 |
Claims (9)
1.一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌菌株为LC，分类命名为Lactobacillus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10474。
2.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌的生物学特性为：菌株在固体培养基上30℃培养48h，生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢；氧化酶阴性，具有较强的生长及产酸性能；在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能生长，在10℃的条件下呈现微弱生长，在15℃-45℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％NaCl的条件下生长状况良好。
4.权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料的制备方法为：在苜蓿中接种干酪乳杆菌LC后，将其在15-35℃下固体厌氧发酵30-60d。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的干酪乳杆菌LC的接种量为：每克苜蓿中接种105-106cfu的干酪乳杆菌LC。
7.权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的苜蓿青贮饲料添加剂为制备苜蓿青贮饲料中添加的菌剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料添加剂的制备方法为：将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在温度为30-37℃的条件下，厌氧培养18-24h；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.0g L-1蛋白胨、10.0g L-1牛肉膏、5.0g L-1酵母膏、2.0g L-1柠檬酸氢二铵、20.0g L-1葡萄糖、1.0g L-1吐温-80、5.0gL-1乙酸钠、2.0g L-1磷酸氢二钾、0.58g L-1硫酸镁和0.25g L-1硫酸锰；
所述MRS液体培养基的初始pH值为6-7。
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