CN105861530A - 承载GAD65 p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列和构建的Tetramer - Google Patents
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Abstract
本发明提供了承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7果蝇细胞高表达基因序列，包含如SEQ NO.1所示的MHC II‑α‑Fos‑BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271‑284‑MHC II‑β‑Jun融合基因序列。还提供了承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7的Tetramer，将SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分别克隆到表达载体中，再同时转染到果蝇细胞中表达，将得到的MHC II‑α‑Fos‑BSP和GAD65p271‑284‑MHC II‑β‑Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合，即形成承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7的Tetramer。本发明通过探讨种属偏好性表达，拟找到最佳的表达序列，最终提高重组蛋白的表达效率。
Description
技术领域：
本发明属于MHC-肽四聚复合物(tetramer)制备技术领域，具体涉及承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列和构建的Tetramer。
背景技术：
抗原特异性T细胞的传统检测分析方法均为间接的活性测定，费时费力。如同位素杀伤分析(51Cr释放杀伤实验)一般在CD8+经体外刺激增殖后进行,只可定性，不可定量；有限稀释分析法(LDA)，包括酶联免疫斑点法(elispot)和细胞内细胞因子染色(ICS)，都是间接检测T细胞的数目和功能，不能检测没有增殖潜力的T细胞前体，大大低估了目的细胞的数目。Altman等首创的可溶性MHC-肽四聚复合物(tetramer)能够直接定量检测抗原特异性T细胞的比率，并通过流式分选及收集目的细胞，具有高度的灵敏度和特异性，能检测出没有活化的T细胞前体。被赞誉为检测抗原特异性T细胞方面的一项革命，是目前定量检测病毒特异性T细胞的金标准。
Tetramer构建的基本过程是通过基因工程技术把长度为15个氨基酸的BirA酶底物肽(BirA substrate peptide，BSP)加在GAD65p271-284肽段的I-Ag7(I-Ag7是NOD小鼠的MHC-II类分子，是异二聚体，分别由α和β亚基组成)的融合蛋白上；把生物素标记在BSP的赖氨酸残基上，再将生物素标记的MHC一肽复合物与荧光素标记的链亲素以4：1结合，即形成GAD65p271-284肽段的I-Ag7tetramer；形成的MHC-肽四聚体与抗原特异性T细胞上的TCR结合；最后通过流式细胞术分析抗原特异性抗原特异性T细胞。
通过培养细胞，获得重组蛋白质的表达仍然是大量生产蛋白质的重要方法之一。细菌、酵母、哺乳动物细胞以及目前已经开展的昆虫细胞的相关研究都各有其限制。最早在Sf9昆虫细胞得到了杆状病毒辅助重组蛋白质的表达。这种最广泛使用的系统，用于大在较高比例的重组蛋白的表达真核生物中，即重组哺乳动物细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞中，缺点也十分明显。重组哺乳动物细胞系只有在转染后的漫长过程中获得，选择，放大，克隆选择和优化。在诱导启动子后常常表现出基础组成性活性(特别是当存在高拷贝数)，并且在诱导之后，经常表达的蛋白只有中等水平。外源蛋白的表达往往与多种因素相关，包括转录和翻译的效率。密码子优化涉及的优化点可以从基因合成、载体构建、基因转录、mRNA翻译、翻译后修饰等过程着手，目的只有一个，就是便于相关过程的高效表达。本发明通过探讨种属偏好性表达，拟找到最佳的表达序列，最终提高重组蛋白的表达效率。
发明内容：
本发明的目的是提供承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列和构建的Tetramer，该经过改造后的基因序列能够高表达承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7蛋白，最终提高重组蛋白的表达效率。
承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列，包含如SEQ NO.1所示的MHC II-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合基因序列。
如SEQ NO.3所示的序列为本发明如SEQ NO.1所示的MHC II-α-Fos-BSP融合基因序列改造前的序列，如SEQ NO.4所示的序列为本发明如SEQ NO.2所示的GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合基因序列改造前的序列。
承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，将上述SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分别克隆到表达载体中，再同时转染到果蝇细胞中表达，将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合，即形成承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。
所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His。果蝇细胞为S2。
所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，具体构建过程如下：
1)提取NOD鼠脾脏细胞的总RNA；
2)反转录获得cDNA；
3)引物和酶切位点设计
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-α链并加入EcoRI和SalI酶切位点，引物如下所示：
forward primer：5’-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3’；(SEQNO.5)
reverse primer：5’-AAA AAAGTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3’；(SEQNO.6)
采用重叠PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位点进行克隆,同时在EcoRI酶切位点之后加入SalI酶切位点，首先采用
forward primer：5-CAGAATAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3’；(SEQ NO.7)
reverse primer：5’-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTT CGCGGA-3’(SEQ NO.8)
互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用
forward primer：5’-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAGCGAGCTT-3’；(SEQ NO.9)
reverse primer：5’-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGA TCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3’；(SEQ NO.10)
进行扩增；
随后，第三轮以第二轮产物为模板采用
forward primer：5’-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3’；(SEQ NO.11)
reverse primer：5’-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3’；(SEQ NO.12)
最终获得带有EcoRI/Sal I和Not I酶切位点的Fos+BSP融合基因序列；
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-β链，加入EcoRI 和SalI酶切位点，引物为：
forward primer：5’-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3’；(SEQNO.13)
reverse primer：5’-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA-3’；(SEQNO.14)
采用重叠PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位点进行克隆；首先采用，
forward primer：5’-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3’；(SEQ NO.15)
reverse primer：5’-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT-3’；(SEQ NO.16)
互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用，
forward primer：5’-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG-3’；(SEQ NO.17)
reverse primer：5’-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3’；(SEQ NO.18)
进行扩增；随后，第三轮以第二轮产物为模板采用，
forward primer：5’-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3’；(SEQNO.19)
reverse primer：5’-GCG GCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3’，(SEQNO.20)
最终获得带有Sma I和Not I酶切位点的基因序列；
4)PCR扩增获得目的片段；
5)目的片段采用载体进行连接；
6)将获得的基因序列进行密码子优化改造；(获得如SEQ NO.1所示的MHC II-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合基因序列)
7)转化到感受态细胞中，再进行质粒抽提；
8)双酶切获得目标片段；
9)重组转化:将MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因分别克隆入表达载体；
10)将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun融合基因双质粒转染果蝇细胞表达蛋白；
11)步骤10)获得的蛋白经过纯化后用于制备承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。
步骤5)中的载体为pmD18-t。
步骤9)的具体过程如下：
对于MHC II-α-Fos-BSP的克隆，先将Fos+BSP用EcoRI和NotI克隆入表达载体，然后用EcoRI和SalI将α链克隆入带有Fos+BSP融合基因的表达载体；对于GAD65p271-284-MHCII-β链-Jun基因的克隆，要先用SmaI和NotI克隆GAD65p271-284-Jun融合基因克隆进表达载体，然后把β链通过EcoRI和Sal I酶切位点插入GAD65p271-284-Jun融合基因之间。
步骤9)利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入100ng pMT/BiP/V5-His质粒，10μl 10 ×反应buffer和1μl连接酶，补足水到20μl；在16℃水浴中连接24h，并转化感受态细胞。
步骤10)的具体过程：
A.选取培养好的健康的S2细胞，将3×106个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Schneider’s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；
B.使用Life technology公司提供的磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染；
a)对于每个转染反应，采用一个无菌的1.5ml的离心管，依次加入双蒸水236μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μlα链质粒9μl，1μg/μlβ链质粒9μl；
b)缓慢的将这些混合物混合1min后转移到一个含有200μl的2×HEPES HBS的离心管，然后混匀；该过程使质粒DNA逐渐进入细胞中；
c)将混合物在室温放置30-40min；
d)缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；
e)在28℃的恒温培养箱中培养1天；
f)给细胞的培养基进行换液；
i)将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；
ii)3000r/min离心3min，后去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中；
iii)将混合物重新加入到新的离心管中；
iv)用2ml培养基重新清洗一次；
v)用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；
g)28℃培养两天。
步骤10)转染后的细胞培养在含2mg/ml G418、10％胎牛血清的SFM培养基中，分为10个T225细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目长到4x 106cells/ml时准备诱导；准备诱导时，将10个细胞培养瓶分为20个细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目为2x106cells/ml；培养基换成含1％胎牛血清的SFM培养基；加入终浓度500mM的CuSO4诱导MHCII-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun形成的异源二聚体的表达，4天后收集5L细胞上清；将细胞培养物上清液通过切向流超滤浓缩后，再通过镍离子亲和纯化色谱靶向获得。
本发明高表达优化策略及实验验证
首先通过GCG工作站和Aμgustus软件、以及在线的密码子分析软件EMBOSS和CodonW分析计算密码子频率。采用专有算法优化替换了稀有密码子和可优化等方面的参数。根据序列的开放阅读框，对序列采用专有算法优化，针对mRNA结构替换了密码子和可优化等方面的参数，筛选了表达克隆密码子优化 的基因。软件根据1、翻译选择(选择的压力存在于翻译基因过程中，即密码子偏好性不同位点(同义，非同义和基因区内)的多态性和分歧之间的关系；2、构成基因的G、C含量；3、基因长度；4、物种的tRNAs的丰度、5、氨基酸保守性；6、编码基因在基因组DNA的位置；7、密码子碱基组成的上下文关系等因素构建的偏好性表达序列，改造MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p 271-284-MHC II-β链-Jun双链基因。分别在诱导表达后第四天分别吸取100ul细胞上清，Dot blot检测。
种属偏好性表达研究
鉴于果蝇和小鼠2种生物对兼并密码子不同的偏好性(图1)，利用GC软件包生物信息学软件优化碱基序列，结果显示了合成GAD65肽段-MHC II-β-Jun序列，改造前后(如图2和3)果蝇偏好性序列可见密码子得分率普遍提高(图2和3)。
Dot blot结果显示，在转染后，2组改造前序列的蛋白表达量均明显低于第1组改造优化后的序列(图4)。证明偏好性改造序列可以显著提高目的基因的表达量。
实时定量显示，在转染后，第1组和第2组在mRNA表达水平上没有显著差异(图5)。也就是说密码子优化是在翻译水平而不是转录水平对基因的表达进行了改进。
附图说明
图1小鼠和果蝇不同密码子的偏好性(灰色-小鼠，黑色-果蝇，纵坐标为密码子使用频率)；
图2优化前目的基因部分序列密码子在果蝇中表达的偏好性(纵坐标为密码子使用频率，灰色表示密码子使用频率低于20，黑色表示密码子使用频率高于20)；
图3优化后目的基因部分序列密码子在果蝇中表达的偏好性(纵坐标为密码子使用频率，灰色表示密码子使用频率低于20，黑色表示密码子使用频率高于20)；
图4抗his-tag抗体Dot blot检测2组不同密码子偏好表达差异；
1.果蝇偏好性序列；2.未改造序列；
图5实时定量PCR检测2组不同密码子偏好mRNA表达差异；
1.果蝇偏好性序列；2.未改造序列；
图6不同浓度的GAD65p271-284抗原肽对刺激抗原特异性T细胞的增值具有不同效果；
图7 pMT/BiP/V5-His质粒图谱。
具体实施方式：
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、构建GAD65p271-284肽段的I-Ag7蛋白
1、实验方法
1)获取NOD鼠脾组织并获得PBMC
断颈处死NOD鼠，放置于75％酒精中3-5分钟，无菌操作外科手术方法取出小鼠脾脏。将新鲜的NOD鼠脾浸泡在含有链霉素和青霉素的PBS中，过400目筛孔，制备单细胞悬液。
2)MHC II-α-Fos-BSP和GAD65肽段-MHC II-β-Jun的克隆和鉴定
2.1总RNA提取
采用RNA trizol提取NOD鼠脾脏细胞的总RNA，具体操作如下：
1.在脾脏单核细胞中加入1ml RNA Trizol，用枪头反复吸打直至细胞充分和裂解液混合。室温放置5min以充分裂解。
2.加入200μl三氯甲烷，颠倒混匀，之后，室温放置5min。
3.放入高速冷冻离心机，12000r/min离心15min。
4.取上清液到另外一个无RNA酶的EP管中(约500μl上清液)。
5.在新的EP管中加入500μl异丙醇，颠倒混匀。之后，-20℃放置2h以沉淀RNA。
6.放入高速冷冻离心机，12000r/min离心10min。
7.弃去上清，这时可以看到管底有沉淀，即为RNA。
8.加入1ml DEPC处理过的无菌水和无水乙醇配制的75％乙醇，用枪头反复吹打。
9.5000r/min离心3min，弃去上清。
10.重复10-11步骤一次。
11.小心用枪头吸去剩余的75％乙醇后，用50μL DEPC处理过的水溶解RNA。
提取好的RNA，采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。当28s和18s两条带明显清晰且28s亮于18s的条带时，被认定为RNA质量较好。另外，采用分光光度计分析了RNA的浓度以便于控制后续的cDNA反转录时的加样量。
2.2反转录
反转录采用Promega试剂盒进行操作。在反转录之前，用1μg DNase I进行消化。具体操作如下：取1μg RNA加入1μg DNase I在PCR仪上37℃消化20min，之后用0.1mM EDTA终止反应，随即进行反转录反应：
在无RNA酶的0.5ml离心管中加入DNase I消化后的RNA1μg，加入oligo DT17 1μl，dNTP 1μl，然后补足DEPC处理过的水到16μl。
PCR仪上70℃5min。
迅速放置在冰上。
当离心管样品冷却后，依次加入2μl 10X RT buffer，RNAse inhibitor 1μl，MMLVReverse Transcriptase 1μL。
42℃PCR仪上反转录60min，之后90℃10min以停止反转录反应。
将反转录好的cDNA于-20℃保存，或者立即使用。
2.3引物和酶切位点设计
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点。采用PCR扩增MHC II-α链并加入EcoRI和SalI酶切位点。引物如下所示：
forward primer：5’-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3’；
reverse primer：5’-AAA AAAGTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3’。
采用重叠PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位点进行克隆,同时在EcoRI酶切位点之后加入SalI酶切位点。首先采用
forward primer：5’-CAGAA TAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3’；
reverse primer：5’-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTT CGCGGA-3’互为模板进行扩增。然后第二轮以第一轮产物为模板采用
forward primer：5’-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAG CGAGCTT-3’；
reverse primer：5’-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGA TCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3’进行扩增。随后，第三轮以第二轮产物为模板采用
forward primer：5’-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3’；
reverse primer：5’-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3’。
最终获得带有EcoRI/Sal I和Not I酶切位点的Fos+BSP融合基因序列。
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点。采用PCR扩增MHC II-β链和α链的获得方式相似，加入EcoRI和SalI酶切位点。引物为：
forward primer：5’-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3’；
reverse primer：5’-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA-3’。
采用重叠PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位点进行克隆。首先采用
forward primer：5’-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3’；
reverse primer：5’-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT-3’互为模板进行扩增。然后第二轮以第一轮产物为模板采用
forward primer：5’-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG-3’；
reverse primer：5’-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3’进行扩增。随后，第三轮以第二轮产物为模板采用
forward primer：5’-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3’；
reverse primer：5’-GCG GCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3’。
最终获得带有Sma I和Not I酶切位点的基因序列。
2.4PCR扩增获得目的片段
反转录的cDNA用PCR扩增获得目的片段，具体操作如下：
反应条件：94℃变性5min，之后进入40个循环，循环条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。在40个循环之后，72℃最终延伸10min。PCR的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.5PCR产物胶回收
1.在PCR反应之后，使用凝胶电泳除去PCR模板，以及其它不需要的产物。
2.准备500ml 1×TAE(10ml的50倍TAE稀释到500ml的双蒸水中)。
3.配制1％的琼脂糖凝胶。加热至将近沸腾时候，混匀后继续加热，直到肉眼看不到漂浮的颗粒为止(在微波炉上高火加热1-2min即可)。小心拿出装有琼脂糖凝胶的三角瓶，当温度冷却到50℃时，加入3μl溴化乙锭，导入成胶模具并插入大齿梳子。
4.按比例在样品中加入样品1/6体积的上样染料。
5.上样染料和样品混匀上样，小心点样到琼脂糖凝胶上，并将凝胶运行在90伏特的电泳仪上大约30min。
6.凝胶成像，然后切出和预测大小位置一致的条带，放入2ml Eppendorf离心管(EP管)中。切割时使用紫外线灯来定位目的条带。佩戴护目镜，使用清洁的手术刀在目的带周围垂直向下切下，尽量减少多余的琼脂糖。
7.凝胶切除后需要立即称重，并去除空2ml的EP管的重量，并记好标签。
8.使用上海生工生物有限公司的胶回收提取试剂盒回收样品带。如果该凝胶重量超过400mg，则分开2管，一式两份进行回收。
9.在离心管中加入600ml binding Buffer，放入55℃恒温干燥箱进行溶解。每隔1min轻轻摇晃离心管。大约10min后胶块完全溶解。
10.溶解后的溶液用移液枪加入到试剂盒提供的过滤管中，放置2min。
11.高速冷冻离心，10000r/min离心1min。
12.弃去液体，加入wash buffer 600μl，高速冷冻离心机10000r/min离心1min。
13.重复12步骤一次。
14.弃去液体，13000r/min离心2min。
15.将滤膜套入到离心管中，在滤膜中央加入30μl双蒸水以溶解DNA，放置2min后，13000r/min离心1min。离心管中剩余的液体即含有回收的DNA片段。
2.6连接
采用pmD18-t载体首先进行连接：
1.在离心管中加入以下组分(总量5μl)。pmD18-t载体(购于invitrogen公司)1μl，胶回收产物1μl，反应缓冲液2.5μl，双蒸水0.5μl。
2.16℃孵育反应30min。
注：
(1)连接反应可以在5min内完成，但是连接效率可能会稍微降低。
(2)如果连接片段是超过2kb的延长连接反应时间至数小时。
3.连接好的载体在-20℃保存，或者立即用来做转化实验。
2.7将获得的基因序列进行密码子优化改造；(获得如SEQ NO.1所示的MHC II-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合基因序列)
2.8感受态制备
采用氯化钙法制备大肠杆菌DH5α感受态：
第一天：
1.在冰上融化甘油冷冻的DH5α菌株，然后划线到LB平板上(注意，这时的平板没有添加任何抗生素，且所有操作均为无菌操作)。在培养箱中37℃过夜培养。
2.对下列物品进行高压灭菌
1L LB培养基
1L 100mM的氯化钙
1L 100mM的氯化镁
100ml 85mM氯化钙(含15％甘油，体积/体积)
4个离心瓶和瓶盖
大量离心管
氯化钙和氯化镁冷却过夜。
第二天：
3.挑菌落培养。选择从新鲜LB平板上挑选大肠杆菌单菌落，接种到10mL的液体LB培养基中，在37℃摇床过夜培养。
第三天：
4.接种1ml菌液用1L培养基扩大化培养，37℃继续振荡。在培养一小时后测量OD600，然后每隔15-20min，测量OD值。
5.当OD600达到0.35-0.4时，立即置于冰浴。冷却20-30min，偶尔轻轻震荡以保证冷却均匀，离心瓶时刻保持在冰上。
6.将1L培养基分为四个平行管(每个管为0.25L)，用高速冷冻离心机以4000r/min的速度，在4℃下离心15min。
7.弃去上清液，每管用100ml冷却的氯化镁轻轻悬浮，将悬浮液转移到新的离心管中。
8.高速冷冻离心机以3000r/min的速度，在4℃下离心15min。
9.去除上清液，用200ml的氯化钙轻轻悬浮，并在冰上沉淀20min。
10.在4℃下15min，通过3000r/min的速度离心收获细菌。
11.去除上清液，用50ml含15％甘油的氯化钙重新悬浮细菌。
12.在4℃下15min，通过以2000r/min的速度离心收获细菌。倒出上清，用2ml含15％甘油的氯化钙重新悬浮。
13.分装到1.5ml EP管中，在-80℃冰箱中冷冻保存。
2.9转化实验
取出贮存在-80℃的DH5α大肠杆菌，在冰上解冻。每个离心管中有100μl的感受态细胞。对于每一个转化反应，吸取5μl的质粒到感受态中，并在冰上孵育20-25min，使得DNA吸附到细胞表面。准备42℃水浴。当感受态预备好后，在42℃水浴中热激90s。随后立即放入冰浴中，冰上2min后加入1ml的LB培养基，并且振荡混匀，让细胞从热休克恢复并重新开始生长。37℃摇床上培养45-60min，液体会出现浑浊。涂布100μl到含有氨苄青霉素的平板上。在37℃恒温培养箱中培养过夜。培养过夜后的单菌落用枪头小心挑到含有800μl LB培养基的EP管中。37℃摇床上培养4小时，随后采用PCR技术检测是否有目的片段。鉴定为阳性的送上海生工生物有限公司测序。
2.10质粒抽提
1.重悬细菌在250μl P1缓冲液中。确保核糖核酸酶A已被添加到缓冲液P1中。
2.加入250μl缓冲液P2，轻轻颠倒混合4-6次，不要漩涡震荡，因为这将导致基因组DNA的断裂。如有必要，继续颠倒EP管直到溶液变粘和透明，不要让裂解反应时间超过5min。
3.加入350μl缓冲液P3，并立即轻轻颠倒试管4-6次。
4.离心10min，紧凑的白色沉淀就会形成。
5.将上清转移至带有滤膜的离心柱中，下面套一个EP管。
6.离心30-60s，丢弃EP中的液体。
7.加0.5ml缓冲液PB，离心30-60s，丢弃EP管中的液体。
8.加入含75％乙醇的wash buffer，离心1min以除去残留的缓冲液，重复一次。然后高速离心1-2min，以彻底除去乙醇残留，乙醇会影响DNA的洗脱。
9.将离心柱放入无菌的1.5ml EP管中。为了洗脱DNA，加入50μl缓冲液EB(10mM，pH值8.5)或无菌双蒸水于离心柱的滤膜中心，静置1min，并离心1min。
10.EP管中所获得的即为含质粒溶液，将其保存在-20℃中。
2.11双酶切
在提取质粒后进行双酶切反应：胶回收片段2.0ug，加入10×buffer 10μl，两种酶各1μl，补足无菌双蒸水至反应体系100μl。37℃反应2小时，并采用凝胶电泳回收酶切片段。回收后的片段通过测序验证以确定为目标片段。
2.12重组转化
将MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因分别克隆入表达载体The Induciblevectors(pMT/BiP/V5-His)(购于invitrogen公司)。
对于MHC II-α-Fos-BSP(即α链融合基因)的克隆，先将Fos+BSP用EcoRI和NotI克隆入表达载体，然后用EcoRI和SalI将α链克隆入带有Fos+BSP融合基因的表达载体；对于GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因(即β链融合基因)的克隆，要先用SmaI和NotI克隆GAD65p271-284-Jun融合基因克隆进表达载体，然后把β链通过EcoRI和Sal I酶切位点插入GAD65p271-284-Jun融合基因之间。
利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入100ng induciblevectors质粒，10μl 10×反应buffer和1μl连接酶，补足水到20μl。在16℃水浴中连接24h，并转化感受态细胞。
2.13重组质粒的鉴定
转化子用PCR检测，如果包含可能为阳性的片段即送到上海生工生物有限公司进行测序。
3)果蝇S2细胞复苏和传代
3.1S2细胞复苏从液氮罐中取出冻存的细胞株在37℃恒温下解冻；用70％乙醇擦拭并消毒细胞瓶外侧，转移细胞液到4ml室温下的完全培养基中，重悬细胞并在1000g离心2-3分钟，去除培养基中的DMSO.接 种细胞到5ml新鲜完全培养基中28℃，无CO2培养箱中培养细胞到密度6～20x106cells/ml。
3.2S2细胞传代细胞密度到达5x106cells/ml时，细胞成簇状生长，这并不影响细胞的生长，传代过程中可吹打开成团细胞。按1：2至1：5比例传代细胞。28℃培养细胞直至密度达到6-20x106cells/ml。
4)重组载体的转染和诱导表达及鉴定
4.1α链和β链融合基因双质粒转染果蝇细胞
在果蝇S2细胞中的表达参照DES果蝇表达系统的操作方案进行(Life technology公司)，具体操作如下:
1.选取培养好的健康的S2细胞，将3×106的细胞种在60mm组织培养皿中。培养基为针对S2细胞的Schneider’s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培养基。28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养。
2.使用Life technology公司提供的磷酸钙转染试剂盒(K2780-01)进行细胞转染，操作均参照试剂盒提供说明书进行。
a)对于每个转染反应，采用一个无菌的1.5ml的离心管，依次加入双蒸水236μl，氯化钙240mM 36μl，α链质粒(1μg/μl)9μg即9μl，β链质粒(1μg/μl)9μg即9μl。
b)缓慢的将这些混合物混合1min后转移到一个含有200μl的2×HEPES HBS，然后混匀。该过程使质粒DNA逐渐进入细胞中。
c)将混合物在室温放置30-40min。
d)缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀。
e)在28℃的恒温培养箱中培养1天。
f)给细胞的培养基进行换液。
i)将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中。
ii)3000r/min离心3min，后去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中。
iii)将混合物重新加入到新的离心管中。
iv)用2ml培养基重新清洗一次。
v)用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养。
g)28℃培养两天。
4.2重组载体的小量表达、纯化和鉴定
用β链融合基因质粒进行小量表达及诱导，β链融合基因按上述方法转染S2细胞，潮霉素筛选稳定表达细胞株并培养3或4周后，以2×106cell/ml的量将细胞种于5ml培养基中，采用500mM CuSO4诱导。诱导后第2、3、4、5天，分别用Western blot检测His标签表达，因为融合基因上带有His标签蛋白。结果显示第4天的诱导效果最好。
摸好表达时间点之后，将α链和β链融合基因双质粒转染果蝇S2细胞进行小量表达。潮霉素筛选稳定表达细胞株并培养到3或4周后，以2×106cell/ml的量将细胞种于5ml培养基中，采用500mM CuSO4诱导。诱导4天后，将5ml上清用超滤管(30kDa，Amicon)浓缩至1ml左右，加入缓冲液(100mM NaCl and20mM Tris pH 8)至5ml，再浓缩至1ml，重复一次后加入缓冲液至5ml。加入100ul 50％镍离子琼脂糖珠(Qiagen)，室温孵育20min结合异源二聚体。离心得到镍离子琼脂糖珠，用缓冲液冲洗珠子2次后，用Western blot检测His标签蛋白和BSP蛋白的表达。
4.3重组蛋白的大量表达、纯化和鉴定
在小量表达摸好时间点和检验重组蛋白双链明确表达之后，将α链和β链融合基因双质粒转染果蝇S2细胞的稳定表达细胞扩增进行大量表达。MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun形成的异源二聚体可以将细胞培养物上清液通过切向流超滤浓缩后通过镍离子亲和纯化色谱靶向获得。
转染后的细胞培养在含2mg/ml G418、10％胎牛血清(FCS)的SFM培养基中，分为10个T225细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目长到大约为4x 106cells/ml时准备诱导。
准备诱导时，将10个细胞培养瓶分为20个细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目大约为2x 106cells/ml。培养基换成含1％FCS的SFM培养基。SDM培养基会影响细胞的诱导和随后的浓缩过程。
加入500mM CuSO4(终浓度)诱导MHC class II的表达，4天后收集5L细胞上清。并用切向流浓缩(Minimate切向流超滤膜包，有效过滤面积50cm2，流速30-40mL/min)至6ml。根据目的蛋白的分子量，选择膜包的合适截留分子量10kD，按仪器的说明书操作将样品容器、膜包和压力计用无吸附硅胶软管连接，蠕动泵实现加压动力并从其中的部分软管绕过。根据说明书的洗涤程序，用洗涤溶液首先平衡膜包，最后以PBS平衡管道系统，将需要过滤的细胞表达上清倒入样品容器，打开蠕动泵系统，缓慢启动蠕动泵至30-40mL/min的流量，当样品量浓缩到50ml体积左右时，在样品容器中分次缓缓加入His柱结合缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白样品度浓缩到约6ml左右。回收样品经4℃，12,000g离心12min，上清即为目的蛋白的浓缩液。
亲和层析，使用Novagen公司His-结合纯化试剂盒(Novagen，70239-3)。其原理是游离的铜离子可以和带His标签的蛋白螯合，使蛋白固定到固相载体上。
将4ml 50％Ni-NTA His·Bind树脂悬液与Ni-NTA结合缓冲液混合完全，上样到1×10cm的玻璃柱中。等待树脂凝固后进行后续操作。
用6ml蒸馏水，清洗该层析柱。
加425-600μm直径的玻璃珠(Sigma公司,G9268)到树脂床的顶部。
随后，加入6毫升1×binding buffer，清洗层析柱。用盖子封闭活栓到柱子的底部，并在柱子顶部固定盖子。将层析柱装到层析架上；并在灌注管上，取出管路。使用注射器，吸取样本流体到管口；松开顶管， 打开龙头，使流体从底部滴落。使用活塞来调节流量，以2ml/min的量让液体流过，收集流过的液体。
通过的浓缩滤器，在3500rpm/min离心5min收集产物。
分子筛层析纯化，将2倍柱体积的缓冲液(PBS pH7.45)预先平衡层析柱至280nm吸收值无明显变化(一般<0.001AU)，将检测器的吸收值归零。编辑层析运行和收集器的方法，将样品液(已经预先对缓冲液透析)注入样品环中，转动进样器将“Load”状态切换至“Inject”，系统流速为2.0ml/min。同时开启收集器的程序。自动收集器自动将280nm吸收值大于0.005AU的蛋白峰按每管800ul体积收集。采用SDS-PAGE和anti his抗体和抗BSP抗体Western blot分析检测得到的MHC class II蛋白(即MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun形成的异源二聚体)。
4.4重组载体表达蛋白的鉴定
分离胶的制备
1.玻璃板用肥皂和水清洗干净，然后用乙醇再清洗一次。并组装好。
2.首先配制6％的分离胶10ml。加入配制好的分离胶(包含0.008ml TEMED和0.1ml10％APS)。将分离胶倒入两玻璃板中间，并密封胶，在分离胶的上面倒入异丁醇以使分离胶的顶端平整。密封10min后准备倒入浓缩胶。
浓缩胶的制备：
1.倒出分离胶上端的异丁醇。并用水清洗掉异丁醇。用滤纸擦干内表面。
2.在浓缩胶中加入APS/TEMED，混匀，然后倒在分离胶的上面。
3.垂直插入梳子，然后在梳子两侧倒入少许浓缩胶，以完全密封梳子的两侧，并去除气泡。
4.等待20-30min以使得浓缩胶重复凝集。
凝胶电泳：
1.将制胶模具放入电泳仪，倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
2.小心除去电泳槽周围的气泡。
3.小心拔出梳子，并用注射器去除孔周围的气泡。
4.样品和loading buffer共同加热煮沸以变性5min。
5.一开始用20mA的电流进行预电泳。当染色条带跑到分离胶时候，将电流转到30mA。当显色带跑到快到凝胶底端时停止电泳。
6.凝胶用考马斯亮蓝进行染色。将凝胶放入考马斯亮蓝中，染色1h。之后，加入脱色剂(40％乙醇、10％乙酸和50％双蒸水)，分三次脱色，每次1h。脱色完后，拍照观察。
采用跑好而且并未染色的SDS-PAGE凝胶进行转膜并孵育抗体。
1.将凝胶拿出，放入转膜仪。在转膜仪上倒入转膜液体(本实验所用转膜为湿转技术)。在底层铺设6层滤 纸，中间放上醋酸纤维薄膜，上层放凝胶，之后，上层再铺上6层滤纸。
2.以电流0.25A、250V电压转膜40min。
3.转好后的膜小心取出。用TBST溶液小心清洗3次，每次5min。随后进入后续操作。
抗体孵育及显色：
1.首先用脱脂牛奶封闭。加入5％的脱脂牛奶，封闭30min。
2.将醋酸纤维薄膜用封膜机封闭好。
3.在封闭袋中加入1ml 1:500稀释后的抗His标签及抗BSP蛋白抗体进行孵育，-4℃下孵育过夜。
4.醋酸纤维薄膜用TBST清洗三次，每次10min。
5.在封闭袋中加入1ml 1:2000稀释后的羊抗鼠IgG二抗，-4℃下孵育过夜。
6.醋酸纤维薄膜用TBST清洗三次，每次10min。
7.采用HRP法进行显色。A、B液混合后，放入醋酸纤维薄膜以化学显色。在醋酸纤维薄膜上方放置胶片，并用封胶盒子封闭。20-30min后漂洗并扫描。
4.5蛋白浓度的测定
蛋白浓度测定采用二辛可宁酸(BCA)法进行，所有试剂由Pierce公司提供。首先配制试剂：
试剂A：1g BCA，2g碳酸钠，0.16g酒石酸钠，0.4g NaOH和0.95g碳酸氢钠，用100ml蒸馏水稀释。将用10M NaOH将pH值调节至11.25。
试剂B:4g BCA溶解于蒸馏水10ml。
试剂C：0.4g硫酸铜(5×水合)溶解于蒸馏水10ml。
1.准备含有0.2至50μg蛋白质在500μl样品。
2.添加500μl工作液和500μl样品混匀，孵育60min。
3.冷却后样品读取562nm处吸光值。
制备吸光度与蛋白质的标准曲线，并确定拟合曲线公式。确定原始样品的量的蛋白质，以及计算体积/样品和稀释因子的浓度。
5)构建GAD65p271-284肽段的I-Ag7tetramer
5.1蛋白的生物素化、纯化、定量和保存
5ml蛋白(即MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun形成的异源二聚体)加入100mM咪唑/100mM NaCl/20mM Tris pH8的缓冲液中，100μl连接酶BirA(25μM)，200μl生物素(5mM)，200μl ATP(0.5M，溶解于1M Tris pH9.5)，1ml 10X ligase buffer(50mMMgCl2/0.2M Tris pH7.5)，400μl protease inhibitor(25×)，3.1ml H2O，25℃下生物素化60min。
5.2分子筛纯化
用Biosep SEC S-3000的分子筛过柱分离纯化浓缩蛋白。-20℃在16％甘油/150mMNaCl/20mM Tris的溶液中保存。
5.3四聚体的制备鉴定和保存
将生物素化的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun形成的异源二聚体与PE标记的链霉亲和素混匀，其中二聚体80ug，链霉亲和素10ug，每隔五分钟加入一次链亲合素，一共八次。37℃孵育30min。并用非变性PAGE鉴定四聚体的合成。在电泳之前，不能加热变性，以防止四聚体的分解。过分子筛纯化浓缩蛋白至1mg/ml。抗his-tag抗体Weston blot检测收集峰蛋白，鉴定后置于保存液(16％甘油、0.5％BSA tris缓冲液)-20℃保存。
应用GAD65p271-284刺激T细胞做体外增殖获得的抗原特异性T细胞作为对Tetramer功能鉴定，终浓度为0、10、50、300ug/ml的表位肽刺激6天后流式细胞术检测GAD65p271-284抗原特异性T细胞的增值状态。以GAD65p271-284抗原肽MHC II四聚体对不同实验样品进行2色荧光染色。结果显示不同浓度的GAD65p271-284抗原肽对刺激抗原特异性T细胞的增值具有不同效果(见图6)。
Claims (10)
1.承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列，其特征在于，包含如SEQNO.1所示的MHC II-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271-284-MHCII-β-Jun融合基因序列。
2.承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，将权利要求1中SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分别克隆到表达载体中，再同时转染到果蝇细胞中表达，将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合，即形成承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。
3.根据权利要求2所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His。
4.根据权利要求2所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，果蝇细胞为S2。
5.根据权利要求2或3或4所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，具体构建过程如下：
1)提取NOD鼠脾脏细胞的总RNA；
2)反转录获得cDNA；
3)引物和酶切位点设计
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-α链并加入EcoRI和SalI酶切位点，引物如下所示：
forward primer：5’-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3’；
reverse primer：5’-AAA AAA GTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3’；
采用重叠PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位点进行克隆,同时在EcoRI酶切位点之后加入SalI酶切位点，首先采用
forward primer：5-CAGAATAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3’；
reverse primer：5’-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTTCGCGGA-3’；
互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用
forward primer：5’-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAGCGAGCTT-3’；
reverse primer：5’-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGATCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3’；
进行扩增；
随后，第三轮以第二轮产物为模板采用
forward primer：5’
-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3’；
reverse primer：5’-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3’；
最终获得带有EcoRI/Sal I和Not I酶切位点的Fos+BSP融合基因序列；
根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-β链，加入EcoRI和SalI酶切位点，引物为：
forward primer：5’-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3’；
reverse primer：5’-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA-3’；
采用重叠PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位点进行克隆；首先采用，
forward primer：5’-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3’；
reverse primer：5’-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT-3’；
互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用，
forward primer：5’-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG-3’；
reverse primer：5’-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3’；
进行扩增；随后，第三轮以第二轮产物为模板采用，
forward primer：5’-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3’；
reverse primer：5’-GCGGCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3’，
最终获得带有Sma I和Not I酶切位点的基因序列；
4)PCR扩增获得目的片段；
5)目的片段采用载体进行连接；
6)将获得的基因序列进行密码子优化改造；
7)转化到感受态细胞中，再进行质粒抽提；
8)双酶切获得目标片段；
9)重组转化:将MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因分别克隆入表达载体；
10)将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun融合基因双质粒转染果蝇细胞表达蛋白；
11)步骤10)获得的蛋白经过纯化后用于制备承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。
6.根据权利要求5所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步骤5)中的载体为pmD18-t。
7.根据权利要求5所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步骤9)的具体过程如下：
对于MHC II-α-Fos-BSP的克隆，先将Fos+BSP用EcoRI和NotI克隆入表达载体，然后用EcoRI和SalI将α链克隆入带有Fos+BSP融合基因的表达载体；对于GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因的克隆，要先用SmaI和NotI克隆GAD65p271-284-Jun融合基因克隆进表达载体，然后把β链通过EcoRI和Sal I酶切位点插入GAD65p271-284-Jun融合基因之间。
8.根据权利要求5所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步骤9)利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入100ng pMT/BiP/V5-His质粒，10μl 10×反应buffer和1μl连接酶，补足水到20μl；在16℃水浴中连接24h，并转化感受态细胞。
9.根据权利要求5所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步骤10)的具体过程：
A.选取培养好的健康的S2细胞，将3×106个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Schneider’s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；
B.使用Life technology公司提供的磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染；
a)对于每个转染反应，采用一个无菌的1.5ml的离心管，依次加入双蒸水236μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μlα链质粒9μl，1μg/μlβ链质粒9μl；
b)缓慢的将这些混合物混合1min后转移到一个含有200μl的2×HEPES HBS的离心管，然后混匀；该过程使质粒DNA逐渐进入细胞中；
c)将混合物在室温放置30-40min；
d)缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；
e)在28℃的恒温培养箱中培养1天；
f)给细胞的培养基进行换液；
i)将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；
ii)3000r/min离心3min，后去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中；
iii)将混合物重新加入到新的离心管中；
iv)用2ml培养基重新清洗一次；
v)用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；
g)28℃培养两天。
10.根据权利要求5所述的承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步骤10)转染后的细胞培养在含2mg/ml G418、10％胎牛血清的SFM培养基中，分为10个T225细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目长到4x106cells/ml时准备诱导；准备诱导时，将10个细胞培养瓶分为20个细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目为2x106cells/ml；培养基换成含1％胎牛血清的SFM培养基；加入终浓度500mM的CuSO4诱导MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun形成的异源二聚体的表达，4天后收集5L细胞上清；将细胞培养物上清液通过切向流超滤浓缩后，再通过镍离子亲和纯化色谱靶向获得。
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