CN104780937A - 涉及由多核苷酸编码的免疫原性多肽的新型初免-加强方案 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特别适用于疫苗组合物的施用方案，该组合物包含编码免疫原性多肽的多核苷酸。所述施用方案涉及重复施用疫苗组合物并增强针对免疫原性多肽的免疫应答。

Description

涉及由多核苷酸编码的免疫原性多肽的新型初免-加强方案

本发明涉及特别适用于疫苗组合物的施用方案，所述组合物包含编码免疫原性多肽的多核苷酸。所述施用方案涉及重复施用疫苗组合物并增强针对免疫原性多肽的免疫应答。

发明背景

感染性疾病仍然是对人类的主要威胁。用于预防或治疗感染性疾病的一种方式是通过接种人工诱导免疫应答，所述接种是将抗原物质施用给个体使得产生针对相应抗原的适应性免疫应答。抗原物质可以是病原体（例如微生物或病毒），它们是结构上完整的但灭活的（即非感染性的）或者它们是减毒的（即具有降低的感染性），或者是已被发现为高免疫原性的病原体纯化组分。诱导针对病原体的免疫应答的另一种方法是提供包含一种或更多种载体的表达系统，所述载体编码病原体的免疫原性蛋白质或肽。这样的载体可以是裸质粒DNA的形式，或者免疫原性蛋白质或肽是通过使用病毒载体而递送的，例如基于修饰的牛痘病毒（例如修饰的安卡拉牛痘病毒（Vaccinia Ankara)；MVA）或腺病毒载体。这样的表达系统具有的优点是包含对环境条件低敏感性的熟知组分。

具体的目标是当研发基于载体的表达系统时，这些表达系统应用于患者引发了针对相应病原体感染的保护性免疫应答。然而，尽管诱导了针对病原体的免疫原性应答，但一些表达系统不能引发强得足以完全防止病原体感染的免疫应答。因此，仍然需要能够诱导针对病原体的保护性免疫应答的改进表达系统，以及引发增强的免疫应答的已知表达系统的新型施用方案。

发明概述

在第一方面，本发明涉及疫苗组合，其包含：

(a）包含第一载体的初免组合物，所述第一载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，以及

(b）包含第二载体的至少一种加强组合物，所述第二载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，

其中包含在第一载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在第二载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，其用于初免-加强接种方案，其中

(i）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；

(ii）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

(ii）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；或者

(iv）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

在另一方面，本发明涉及疫苗组合，其包含：

(a）包含载体的初免组合物，所述载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，以及

(b）包含至少一种免疫原性多肽的至少一种加强组合物，

其中包含在初免组合物中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在加强组合物中的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，其用于初免-加强接种方案，其中初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后施用。

发明详述

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。

优选地，本文所使用的术语是按照"A multilingual glossary of biotechnological terms:（IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.和Klbl, H.编辑（1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)中所描述的进行定义。

在本说明书和随后的权利要求书全文中，除非上下文另有要求，词语“包含（comprise)”和变型例如“包含（comprises)”和“包含（comprising)”都将被理解为暗含包括所述的整数或步骤或者一组整数或步骤，但不排除任何其他的整数或步骤或者一组整数或步骤。

在本说明书的文本全文中引用了几篇文献。每篇本文所引用的文献（包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等），无论在上文或下文，都由此通过引用以其整体并入。本文没有任何内容被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这些公开内容。在本发明一方面的上下文中提供的所有定义也适用于本发明的其他方面。

在本发明的基础研究中已经发现，特定的施用方案显著增加了通过疫苗组合物所赋予的免疫力，所述疫苗组合物包含载体，所述载体包含编码免疫原性肽的多核苷酸。

因此，在第一方面，本发明涉及疫苗组合，其包含：

(a）包含第一载体的初免组合物，所述第一载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，以及

(b）包含第二载体的至少一种加强组合物，所述第二载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，

其中包含在第一载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在第二载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，

其用于初免-加强接种方案，其中：

(i）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；

(ii）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

(ii）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；或者

（iv）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

在一些情况下，优选的初免-加强接种方案是(i)，因为它提供了特别有效的保护性免疫，例如通过引发鼻内和上呼吸道内的强免疫应答。

载体

本文所使用的术语“载体”是指至少一种多核苷酸或至少一种多核苷酸和至少一种蛋白质的混合物，它能够将包含在其中的多核苷酸引入到细胞中。载体所包含的至少一种多核苷酸是由编码至少一种免疫原性蛋白质的至少一种核酸构建体组成，或者包含编码至少一种免疫原性蛋白质的至少一种核酸构建体。除了包含本发明核酸构建体的多核苷酸或由其组成之外，还可以将另外的多核苷酸和/或多肽引入到细胞中。如果需要所述另外的多核苷酸和/或多肽以将本发明的核酸构建体引入到细胞中，或者如果另外的多核苷酸和/或多肽的引入增加了由本发明核酸构建体所编码的免疫原性多肽的表达，那么另外的多核苷酸和/或多肽的添加是特别希望的。

在本发明的上下文中优选的是，由所引入的核酸构建体编码的一种或多种免疫原性多肽在引入载体后在细胞内表达。合适载体的例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

在某些优选的实施方案中，包含本发明核酸构建体的第一和第二载体选自由质粒、粘粒、噬菌体、病毒和人工染色体组成的组。更优选地，适用于实施本发明的载体是噬菌体载体，优选λ噬菌体和丝状噬菌体载体，或病毒载体。

合适的病毒载体是基于天然存在的载体，它们被修饰为不能复制的，也被称为非复制型的。非复制型病毒需要提供反式蛋白来复制。通常那些蛋白质是在病毒生产细胞系中稳定或瞬时表达的，由此允许病毒的复制。因此，病毒载体优选是感染性的和非复制型的。本领域技术人员知道如何致使各种病毒不能复制。

在本发明的优选实施方案中，载体选自腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体（例如腺相关病毒AAV 5型和2型）、甲病毒载体（例如委内瑞拉马脑炎（equine encephalitis）病毒（VEE)、辛德毕斯（sindbis）病毒（SIN)、西门利克森林（semliki forest）病毒（SFV）和VEE-SIN嵌合体）、疱疹病毒载体（例如源自巨细胞病毒的载体，如恒河猴巨细胞病毒（RhCMV)（14)）、沙粒（arena）病毒载体（例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）载体（15)）、麻疹病毒载体、痘病毒载体（例如牛痘病毒、修饰的安卡拉牛痘病毒（MVA)、NYVAC（源自牛痘哥本哈根株）和禽痘病毒载体：金丝雀痘病毒（ALVAC)和鸡痘病毒（FPV）载体），水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、病毒样颗粒和细菌孢子。

在具体的实施方案中，优选的载体是腺病毒载体，具体而言是源自人或非人的类人猿和痘病毒载体的腺病毒载体，优选MVA。腺病毒所来源的优选类人猿是黑猩猩（Chimpanzee)（Pan)、大猩猩（Gorilla）和猩猩（orangutans)（Pongo)、优选倭黑猩猩（Bonobo)（Pan paniscus）和普通黑猩猩（Pan troglodytes)。一般而言，天然存在的非人的类人猿腺病毒是从相应类人猿的粪便样本中分离的。最优选的载体是基于hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAdlO、ChAd11、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2和PanAd3载体的非复制型腺病毒载体或者复制型Ad4和Ad7载体。人腺病毒hAd4、hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35和hAd49是现有技术中熟知的。基于天然存在的ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的载体在WO 2005/071093中详细描述了。基于天然存在的PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147的载体在WO 2010/086189中详细描述了。

术语“非复制型腺病毒”是指已经变得不能复制的腺病毒，因为它已被工程化以包含病毒复制所必需的基因产物的至少功能性缺失或者完全去除，例如选自El、E2、E3和E4的腺病毒基因之一或更多种。

优选使用的第一载体是腺病毒载体，更优选非人的类人猿例如黑猩猩或倭黑猩猩来源腺病毒载体，具体而言是基于ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3的非复制型腺病毒载体，或者基于hAd4和hAd7的复制型载体。最优选的载体是基于PanAd3的。

优选地，第二载体是痘病毒载体，具体地是MVA或者腺病毒载体，优选非人的类人猿来源的腺病毒载体。优选的非复制型载体是基于ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAdlO、ChAd11、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2和PanAd3载体或者复制型Ad4和Ad7载体。

如果第一和第二载体都是腺病毒载体，有时优选使用免疫学上不同的腺病毒载体作为第一和第二载体。如果两种载体是免疫学上是相同的，可能存在的潜在风险是在免疫应答的初免期间针对第一载体产生的抗体损害了用于加强免疫应答的第二载体对患者的转导。腺病毒和由此的腺病毒载体通常包含三种包膜蛋白，即六邻体、五邻体和纤维蛋白。针对给定腺病毒的宿主免疫应答主要由六邻体蛋白来确定。因此，如果两种腺病毒的六邻体蛋白的至少一个表位不同，那么认为这两种腺病毒在本发明的意义上就是免疫学上不同的。六邻体的T细胞和B细胞表位都已经作图。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，第一载体是腺病毒载体，具体而言是PanAd3，并且第二载体是痘病毒载体，具体而言是MVA或腺病毒载体。

在本发明的一个优选实施方案中，第一载体是PanAd3并且第二载体是MVA。MVA的描述可以在Mayr A, Stickl H, Müller HK, Danner K, Singer H. "The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defence mechanism." Zentralbl Bakteriol B.1978 Dec;167(5-6):375-90和Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H.（1975) “Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA.” Infection 3, 6-14中找到。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本申请全文中可互换使用。多核苷酸被理解为由核苷酸单体制成的聚合物大分子。核苷酸单体是由核碱基、五碳糖（例如但不限于核糖或2'-脱氧核糖），和一至三个磷酸基团构成。一般而言，多核苷酸是通过个体核苷酸单体之间的磷酸二酯键而形成的。在本发明的上下文中，优选的核酸分子包括但不限于核糖核酸（RNA）及和脱氧核糖核酸（DNA)。而且，术语“多核苷酸”还包括DNA或RNA的人工类似物，诸如肽核酸（PNA)。

更多合适的载体在PCT/EP2011/074307中详细描述。该申请的公开内容通过引用将它与本文披露的表达系统相关的公开内容一起并入。

多肽

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸的任何肽连接链，不管共翻译或翻译后修饰的长度。

本文所使用的术语“翻译后”是指核苷酸三联体翻译成氨基酸并与序列中前一氨基酸形成肽键后发生的事件。这样的翻译后事件可以发生在整个多肽形成后，或者已经在翻译过程期间发生在已被翻译的多肽的那些部分上。翻译后事件通常改变或修饰了所得多肽的化学或结构特性。翻译后事件的例子包括但不限于诸如氨基酸的糖基化或磷酸化，或者肽链的切割，例如通过内肽酶。

本文所使用的术语“共翻译”是指在核苷酸三联体的翻译成氨基酸链的过程中发生的事件。那些翻译后事件通常改变或修改了所得氨基酸链的化学或结构特性。共翻译事件的例子包括但不限于可能完全终止翻译过程或中断肽键形成而得到两种分离的翻译产物。

本文所使用的术语“多聚蛋白质”或“人工多聚蛋白质”是指氨基酸链，其包含或基本上由未天然彼此连接的两个氨基酸链组成。多聚蛋白质可以包含一个或更多个另外的氨基酸链。每个氨基酸链可以是完整的蛋白质，即跨越整个ORF，或其片段、结构域或表位。多聚蛋白质的各个部分可以是永久或暂时地彼此连接。永久连接的多聚蛋白质的部分是从单个ORF翻译的且不在共翻译或翻译后随后分离。暂时连接的多聚蛋白质的部分也可以来源于单个ORF，但由于翻译过程中的分离而共翻译地分开，或者由于肽链切割（例如通过内肽酶）而在翻译后分开。额外地或可选地，多聚蛋白质的部分也可以来源于两个不同的ORF，并在翻译后连接起来，例如通过共价键。

本发明中可用的蛋白质或多聚蛋白质（包括蛋白质衍生物、蛋白质变体、蛋白质片段、蛋白质片段、蛋白质表位和蛋白质结构域）可以通过化学修饰进行进一步修饰。因此，这样的化学修饰多肽可以包含在20种天然存在的氨基酸中找到的残基之外的化学基团。这样的其他化学基团的例子包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。相比于亲本多肽，多肽的化学修饰可以提供有利的特性，例如增强的稳定性、增加的生物半衰期或增加的水溶性的一种或更多种。适用于本发明中可用的变体的化学修饰包括但不限于：PEG化，非糖基化亲本多肽的糖基化，或亲本多肽中存在的糖基化模式的修饰。适用于本发明中可用的变体的这类化学修饰可以共翻译或翻译后发生。

在本申请中提到的“免疫原性多肽”是含有至少一个表位的如上定义的多肽。“表位”，也称为抗原决定簇，是由免疫系统识别的多肽的那部分。优选地，该识别是通过抗体、B细胞、或T细胞对所述表位的结合而介导的。在该上下文中，术语“结合”优选涉及特异性结合。优选地，抗体对表位的特异性结合是由抗体的Fab（片段，抗原结合的）区介导的，B细胞的特异性结合是由B细胞受体所包含的抗体的Fab区介导的与，并且T细胞的特异性结合是由T细胞受体的可变（V）区介导的。

根据本发明的免疫原性多肽优选来源于选自病毒、细菌和原生动物的病原体。在具体的实施方案中，它来源于病毒，并且在一个特别有利的实施方案中，它来源于呼吸道合胞病毒（RSV）。然而，本发明的可选实施方案中，免疫原性多肽是由癌表达的多肽或多肽片段。

优选的免疫原性多肽诱导B细胞应答或者T细胞应答或者B细胞应答和T细胞应答。

表位通常由分子的化学活性表面基团组成，诸如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。术语“表位”是指构象以及非构象表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，前者的结合会丧失而后者不会。

如果两个或更多个免疫原性多肽被相同的抗体、T细胞或B细胞识别，那么它们是“免疫学上相同的”。由相同的抗体、T细胞或B细胞对两个或更多个免疫原性多肽的识别也被称为所述抗体、T细胞或B细胞的“交叉反应”。由相同的抗体、T细胞或B细胞对两个或更多个免疫学上相同的多肽的识别是由于所有多肽中相同或相似表位的存在。相似表位共有足够的结构和/或电荷特征以被相同抗体或B细胞受体的Fab区或者被相同T细胞受体的V区结合。抗体、T细胞受体或B细胞受体的结合特征通常通过受体对所述表位的结合亲和力来定义。如果具有较低亲和常数的多肽的亲和常数是具有较高亲和常数的多肽的亲和常数的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％，那么这两个免疫原性多肽是如本申请所理解的“免疫学上相同的”。用于确定多肽对受体的结合亲和力的方法是现有技术中熟知的，诸如平衡透析或酶联免疫吸附测定（ELISA）。

优选地，两个或更多个“免疫学上相同的”多肽包含至少一个相同的表位。如果免疫原性多肽包含相同的表位，或者如果它们具有相同的氨基酸序列，通常可能获得最强的接种效果。

如本文所使用的，其氨基酸序列与另一个多肽的氨基酸序列“基本上相同”的多肽是多肽变体，它与另一个多肽（或区段、表位或结构域）相比的不同之处在于氨基酸序列中的一个或多个改变。蛋白质变体所来源的多肽也被称为亲本多肽。一般而言，变体是人工构建的，有利地是通过基因-技术手段。一般而言，亲本多肽是野生型蛋白质或野生型蛋白质结构域。在本发明的上下文中，亲本多肽（或亲本区段）也可以是两个或更多个野生型多肽（或野生型区段）共有序列。进一步地，本发明中可用的变体也可以来源于亲本多肽的同源物、直系同源物、或旁系同源物，或者来源于人工构建的变体，只要变体显示出亲本多肽的至少一种生物学活性。优选地，变体所共有的亲本多肽的至少一种生物活性是（或包括）至少一个表位的存在，这导致了如上述所定义的“免疫学上相同的”两个多肽。

氨基酸序列中的变化可以是氨基酸交换、插入、缺失、N-末端截短、或C-末端截短、或者这些变化的任意组合，这可以发生在一个或几个位点。在某些有利的实施方案中，可用于本发明的变体显示出总数高达200（高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200）个氨基酸序列的变化（即交换、插入、缺失、N-末端截短、和/或C末端截短）。氨基酸交换可以是保守的和/或非保守的。在某些有利的实施方案中，可用于本发明的变体不同于其来源的蛋白质或结构域高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸交换，优选保守氨基酸变化。

可选地或额外地，本文所使用的“变体”可以通过与其来源的亲本多肽或亲本多核苷酸一定程度的序列同一性来表征。更确切地说，与另一个多肽“基本上相同”的蛋白质变体表现出与那个多肽至少80％的序列同一性。多核苷酸变体在本发明的上下文中表现出与其亲本多核苷酸至少80％的序列同一性。优选地，蛋白质变体的序列同一性是连续延伸的20、30、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。优选地，多核苷酸变体的序列同一性是连续延伸的60、90、120、135、150、180、210、240、270、300或更多个核苷酸。

在本发明的优选实施方案中，与其亲本多肽“基本上相同”的多肽具有所述亲本多肽的至少80％的序列同一性。更优选地，所述多肽是免疫学上与亲本多肽相同的，并具有与亲本多肽至少80％的序列同一性。

术语“至少80％的序列同一性”用于整个说明书中关于多肽和多核苷酸序列的比较。这种表述是指与各个参考多肽或各个参考多核苷酸至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。优选地，所述多肽和参考多肽在连续延伸的20、30、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸或者在参考多肽的全长上表现出所示的序列同一性。优选地，所述多核苷酸和参考多核苷酸在连续延伸的60、90、120、135、150、180、210、240、270、300个或更多个核苷酸或者在参考多肽的全长上表现出所示的序列同一性。

多肽的变体可以额外地或可选地包含氨基酸缺失，其可以是N-末端截短、C-末端截短或内部缺失或者这些缺失的任意组合。包含N-末端截短、C-末端截短和/或内部缺失的这类变体在本申请的上下文中被称为“缺失变体”或“片段”。术语“缺失变体”和“片段”在本文中可互换使用。片段可以是天然发生的（例如剪接变体），或者它可以被人工构建，例如通过基因技术手段。片段（或缺失变体）与亲本多肽相比可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸缺失，优选在N-末端、在N-和C-末端、或在C-末端或者在内部。在比较了两个序列并且没有指定与之相比来计算序列同一性百分比的参考序列的情况下，序列同一性的计算要参照待比较的两个序列的更长者来进行，如果没有具体另外说明。如果指明了参考序列，则序列同一性是在由SEQ ID表示的参考序列的全长基础上确定的，如果没有具体另外说明。

额外地或可选地，缺失变体的产生可以不是由于上述各个氨基酸的结构性缺失，而是由于这些氨基酸被抑制或者以其他方式无法实现其生物学功能。一般而言，这样的功能性缺失的发生是由于氨基酸序列中的插入或交换改变了所得蛋白质的功能特性，诸如但不限于所得蛋白质化学性质的改变（即疏水性氨基酸到亲水性氨基酸的交换），所得蛋白质的翻译后修饰的改变（例如翻译后切割或糖基化模式），或者二级或三级蛋白质结构的改变。优选地，如上所述的功能性缺失是由至少一个氨基酸的插入或交换引起的，其导致了免疫原性多肽表位的破坏。

核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对来确定。这样的比对可以用几个本领域已知的算法进行，优选用Karlin和Altschul的数学算法 （Karlin & Altschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)，用hmmalign（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）或者用CLUSTAL算法（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J.（1994）Nucleic Acids Res.22, 4673-80)，可获得于例如http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/上或者http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上或者http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html上。使用的优选参数是如它们在http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上所设定的默认参数。序列同一性（序列匹配）的等级可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ（或BlastX）来计算。类似算法被并入到Altschul等(1990）J. Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST核苷酸搜索是使用BLASTN程序进行的，得分=100，字长=12，以获得与编码F、N或M2-1的那些核酸同源的多核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索是用BLASTP程序进行的，得分=50，字长=3，以获得与F多肽、N多肽、或M2-1多肽同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对（gapped alignments）用于比较目的，使用了Altschul等（1997）Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已知的同源作图技术进行补充，如Shuffle-LAGAN（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62）或者Markov随机场。当序列同一性的百分比在本申请中被提到时，这些百分比是相对于较长序列的全长进行计算的，如果没有具体另外说明的话。

本发明的多核苷酸编码蛋白质、肽或其变体，它们包含按照根据WIPO标准ST.25的标准单字母或三字母密码子命名的氨基酸，除非另有说明。如果没有另外说明，单字母或三字母密码子是针对天然存在的L-氨基酸的，并且氨基酸序列是从相应蛋白质、肽或其变体的N-末端到C-末端的方向进行说明的。

本文所使用的术语“共有”是指代表多序列比对结果的氨基酸或核苷酸序列，其中相关序列进行了相互比较。这样的共有序列是由每个位置上最常观察到的氨基酸或核苷酸构成的。在本发明的上下文中优选的是，在获得共有序列的序列比对中使用的序列是分离自各种不同的世界性疾病爆发中的不同病毒亚型/血清型菌株的序列。在序列比对中使用的每个个体序列被称为特定病毒“隔离群”的序列。如果对于给定位置不能确定“共有核苷酸”或“共有氨基酸”，例如因为只有两个隔离群相比较，那么优选使用每一个隔离群的氨基酸。

短语“T细胞应答的诱导”是指病原体特异性的（优选病毒特异性的）CD4+或CD8+ T细胞的产生或再刺激。在本发明的一个实施方案中，初免组合物和/或加强组合物可以诱导或再刺激T细胞介导的针对MHC I类或II类表位的获得性应答，所述表位存在于由核酸构建体表达的一种或多种多肽中。这样的T细胞应答可以通过本领域已知的方法来测量，例如通过用跨越整个多肽的合成肽先体外后体内（ex-vivo）再刺激T细胞以及增殖或干扰素-γ产生的分析。

短语“B细胞应答的诱导”是指病原体特异性的（例如病毒特异性的）B细胞的产生或再刺激，该B细胞产生IgG或IgA类免疫球蛋白。在本发明的一个实施方案中，初免组合物和/或加强组合物可以诱导或再刺激B细胞，该B细胞产生由核酸构建体表达的病原性（例如病毒）抗原特异性的抗体。这样的B细胞应答可以通过用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原的ELISA进行测量。可选地，所诱导的抗体效价可以通过病毒中和测定进行测量。

短语“抗病原性B细胞应答的诱导”是指病原体特异性的（例如病毒特异性的）B细胞的产生或再刺激，该B细胞产生IgG或IgA类免疫球蛋白，它们灭活、清除、封闭和/或中和相应的病原体，使得由病原体引起的疾病不会爆发和/或症状被减轻。这也被称为针对病原体的“保护性免疫应答”。在本发明的优选实施方案中，本发明的初免和/或加强组合物可以诱导或再刺激B细胞，该B细胞产生由核酸构建体表达的病原性（例如病毒）抗原特异性的抗体。这样的B细胞应答可以通过ELISA用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原进行测量。可选地，所诱导的抗体效价可以通过病毒中和测定进行测量。

短语“增强免疫应答”是指针对免疫原（优选病原体，诸如病毒）的体液和/或细胞免疫应答的加强或强化。免疫应答的增强可以通过比较由本发明表达系统引发的免疫应答与单独表达相同抗原/免疫原的表达系统的免疫应答，通过使用本文表述的测试和/或本技术领域中熟知的测试进行测量。

合适的免疫原性多肽在PCT/EP2011/074307中详细描述。该申请的公开内容通过引用将它与此文披露的免疫原性多肽相关的公开内容一起并入本文。

在某些优选的实施方案中，使用以下缩写在下面描述免疫原性多肽：“F”、或“F0”在本文可互换使用并且是指副粘病毒（优选RSV）的融合蛋白；“G”是指副粘病毒（优选肺炎病毒亚科的，更优选RSV）的糖蛋白；“H”是指副粘病毒（优选麻疹病毒）的血凝素蛋白；“HN”是指副粘病毒（具体地是呼吸道病毒、禽副粘病毒和腮腺炎病毒）的血凝素-神经氨酸酶蛋白；“N”是指副粘病毒（优选RSV）的核衣壳蛋白；“M”是指副粘病毒（优选RSV）的糖基化基质蛋白；关于副粘病毒，缩写“M2”或“M2-1”是指副粘病毒（优选RSV）的非糖基化基质蛋白；“P”是指副粘病毒（优选RSV）的磷蛋白；关于副粘病毒，缩写“NS1”和“NS2”是指副粘病毒（优选RSV）的非结构蛋白1和2；“L”是指副粘病毒（优选RSV）的聚合酶的催化亚基；“HA”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的血凝素；“HA0”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的血凝素亚基HA1和HA2的前体蛋白；“H1p”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的修饰性血凝素；“NA”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的神经氨酸酶；“NP”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的核蛋白；“M1”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的基质蛋白1；关于正粘病毒，缩写“M2”是指是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的基质蛋白M2；关于正粘病毒，缩写“NS1”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的非结构蛋白1；“NS2/NEP”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的非结构蛋白2（也称为NEP，核输出蛋白）；“PA”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的聚合酶亚基蛋白；“PB1”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的聚合酶亚基蛋白；“PB2”是指正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的聚合酶亚基蛋白；“PB1-F2”或“PB1F2”是指通过正粘病毒（优选流感病毒，更优选A型流感病毒）的PB1基因区段中的可选读码框所编码的蛋白质。

在其他优选的实施方案中，免疫原性多肽是肿瘤特异性蛋白质或病原体特异性蛋白质。在某些实施方案中，病原体是病毒，特别是副粘病毒或其变体，优选选自肺炎病毒亚科、副粘病毒亚科、枪头蛇病毒（Fer-de-Lance-Virus)、那立发病毒（Nariva-Virus)、Salem病毒、Tupaia副粘病毒、北龙病毒（Beilong-Virus)， J-病毒，梅那哥病毒（Menangle-Virus)、Mossmann病毒和Murayama病毒的亚家族。在更优选的实施方案中，肺炎病毒亚科选自肺病毒（优选人类呼吸道合胞病毒（RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV、火鸡rinotracheitis病毒）以及变性肺病毒（优选人类变性肺病毒（hMPV）和禽偏变性肺病毒）。在更优选的实施方案中，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒（优选人副流感病毒1和3）、以及腮腺炎病毒（优选人副流感病毒2和4）；细菌或原生动物，优选溶组织内阿米巴（Entomoeba histolytica)，口腔滴虫（Trichomonas tenas)、人毛滴虫（Trichomonas hominis)、阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis)、冈比亚锥虫（Trypanosoma gambiense)、罗得西亚锥虫（Trypanosoma rhodesiense)、克鲁斯锥虫（Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani)、热带利什曼原虫（Leishmania tropica)、巴西利什曼原虫（Leishmania braziliensis)、肺囊虫性肺炎（Pneumocystis pneumonia)、鼠弓形虫（Toxoplasma gondii)、Theileria lawrenci、小泰勒虫（Theileria parva)、间日疟原虫（Plasmodium vivax)、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum)和三日疟原虫（Plasmodium malaria)。

核酸构建体

术语“核酸构建体”是指编码至少一种免疫原性多肽的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸还包含指导由所述核酸构建体编码的至少一种多肽的转录和翻译的元件。这样的元件包括启动子和增强子元件，以指导mRNA在无细胞或基于细胞的系统中的转录，优选基于细胞的系统。在另一实施方案中，其中提供核酸构建体作为可翻译的RNA，可以预期核酸构建体包含那些对于RNAs的翻译和/或稳定化来说必需的元件，所述RNAs编码至少一种免疫原性多肽，例如聚腺苷酸PolyA尾、IRES、帽结构等。

如上所述，优选本发明的载体是病毒载体以及，因此，核酸构建体优选被更大的多核苷酸所包含，该更大的多核苷酸还包括指导免疫原性多肽表达的病毒载体和/或调节元件的复制所需要的核酸序列。

在本发明的一个实施方案中，核酸构建体编码单个免疫原性多肽。

在本发明具体的优选实施方案中，核酸构建体编码至少两个免疫原性多肽。

编码免疫原性多肽的合适的核酸构建体在PCT/EP2011/074307中详细描述。该申请的公开内容通过引用将它与此文披露的免疫原性多肽相关的公开内容一起并入本文。

已经在PCT/EP2011/074307的基础研究中令人惊奇地发现，诱导针对诱导B细胞应答的免疫原性多肽的T细胞应答的免疫原性多肽的添加增强了针对诱导B细胞应答的免疫原性多肽的B细胞应答。在上文描述了用于确定针对抗原的B细胞应答强度的方法。所述抗原的特异性抗体的效价可以在用至少一种诱导B细胞应答的免疫原性多肽和至少一种诱导T细胞应答的免疫原性多肽的组合进行免疫后至少2周、至少4周、至少8周、至少4个月、至少8个月或至少1年时进行确定。优选地，诱导B细胞应答的免疫原性多肽的特异性抗体的效价通过该组合增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％或至少200％相比，相比单独用至少一种诱导B细胞应答的免疫原性多肽进行免疫。

因此，在本发明的优选实施方案中，核酸构建体编码至少一种诱导B细胞应答的免疫原性多肽和至少一种诱导T细胞应答的免疫原性多肽。

诱导B细胞应答的免疫原性多肽优选为由病毒或其片段或变体所包含的结构蛋白。例如，在包膜病毒的情况下，结构性病毒蛋白可以有利地选自融合蛋白（F）和附着糖蛋白G、H和HN。

附着糖蛋白见于所有包膜病毒中，并通过它们结合到宿主细胞质膜上的蛋白质或其他分子的碳水化合物部分或细胞粘附结构域，来介导病毒包膜与宿主细胞质膜之间的初始相互作用。因此，附着糖蛋白桥接了病毒与宿主细胞膜之间的间隙。命名为“H”的附着糖蛋白具有血凝素活性，并在麻疹病毒和恒尼波病毒（henipaviruses)中发现，命名为“HN”的糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，并在呼吸道病毒、腮腺炎病毒和禽副粘病毒中发现。当他们既没有血细胞凝集也没有神经氨酸酶活性时，附着糖蛋白被命名为“G”。G附着糖蛋白可以在肺炎病毒亚科的所有成员中发现。

融合蛋白“F”在所有包膜病毒中发现，并介导病毒包膜与宿主细胞质膜的融合。F是I型糖蛋白，其识别存在于它所结合的宿主细胞的细胞表面上的受体。F由邻接跨膜结构域位置的融合多肽组成，接着两个七肽重复（HR）区域，HR1和HR2。一旦融合肽插入宿主细胞的质膜，HR1区域就形成三聚卷曲螺旋结构，HR2区域折叠回进入该螺旋结构的疏水性沟槽中。因此，形成的发夹结构将病毒脂质双层和细胞质膜更紧密地拉在一起，并允许融合孔的形成以及接下来两种脂质双层的完全融合，这使得病毒衣壳能够进入宿主细胞的细胞质中。所有这些特征都是包膜病毒的融合介导蛋白质所共有的。

在本发明的优选实施方案中，F包含、基本上由或者由一种RSV隔离群的F氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV隔离群的共有氨基酸序列组成。在某些优选的实施方案中，F蛋白质的氨基酸序列优选根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其变体。

诱导T-细胞应答的免疫原性多肽优选为由病毒或其片段或变体所包含的内部蛋白质。所述结构病毒蛋白质可以选自核蛋白N、基质蛋白M和M2、磷蛋白P、非结构蛋白NS1和NS2、以及聚合酶（L）的催化亚基。

核蛋白N具有几种功能，其包括将RNA基因组衣壳化成RNA酶抗性的核衣壳。N也与M蛋白在病毒组装过程中相互作用，并与P-L聚合酶在基因组转录和复制过程中相互作用。

基质蛋白M是副粘病毒中最丰富的蛋白质，并被认为其通过与整合膜蛋白的细胞质尾部和核衣壳相互作用是病毒形态的中心组织者。M2是第二膜结合蛋白质，其为非糖基化的并主要见于肺炎病毒中。

磷蛋白P结合到N和L蛋白上，并形成所有副粘病毒中的RNA聚合酶复合物的一部分。大蛋白L是RNA依赖性的RNA聚合酶的催化亚基。

非结构蛋白NS1和NS2的功能尚未被确定；然而，也有迹象表明它们参与病毒复制循环。

在某些优选的实施方案中，N包含一种RSV隔离群的N的氨基酸序列，或者两种或更多种不同RSV隔离群的共有氨基酸序列，例如根据SEQ ID NO:3，并且其中M2包含一种RSV隔离群的M2的氨基酸序列，或者两种或更多种不同RSV隔离群的共有氨基酸序列，例如根据SEQ ID NO:5。在一个进一步优选的实施方案中，N包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列并且M2包含根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，至少两种不同的免疫原性多肽是由相同数量的开放读码框（ORF）所编码的，即每个多肽由单独的开放读码框所编码。在这种情况下，优选每个ORF与允许所述多肽表达的合适表达控制序列相结合。

在本发明的另一优选实施方案中，至少两种不同的免疫原性多肽是由单一ORF所编码的并通过肽接头相连接。因此，核酸构建体的转录和翻译产生了具有功能性（即免疫原性）结构域的单个多肽。术语“不同的免疫原性多肽”是指不是由它们所来源的病毒或生物体中的连续核酸序列所编码的如本申请上述所定义的免疫原性多肽。在它们所来源的病毒或生物体中，它们可以由不同的ORF所编码。可选地，它们可以来源于由单个ORF所编码的多肽的不同结构域，其通过缺失在其天然环境中连接所述结构域的氨基酸序列以及通过肽接头替换所述连接氨基酸序列。后一实施方案允许产生比天然存在的多肽更短的多肽，其仍含有诱导免疫应答所必需的所有表位。举个例子：天然存在的多肽包含用于引发免疫应答的两个表位，其通过没有免疫原性的90个氨基酸的氨基酸序列相连接。通过10或15个氨基酸的肽接头替换所述90个氨基酸产生了更短的多肽，尽管如此，它仍然包含两个重要表位。

在本发明的一个具体优选的实施方案中，至少两种不同的免疫原性多肽是由单一ORF所编码的并通过切割位点相连接。因此，核酸构建体的转录和翻译产生了单个多肽，其在共翻译中或翻译后被切成不同的更小多肽。

上述切割位点优选的是自切割或内肽酶切割位点。

术语“开放读码框”（ORF）是指可以被翻译成氨基酸的核苷酸序列。一般而言，这样的ORF包含起始密码子、通常具有长度为3个核苷酸的倍数的紧接区域，但给定读码框中不包含终止密码子（TAG、TAA、TGA、UAG、UAA、或UGA）。一般而言，ORF是天然存在的或人工构建的，即通过基因技术手段。ORF编码的是它可以翻译成的氨基酸所形成的肽连接链的蛋白质。

“肽接头”（或者简称：“接头”）在本发明的上下文中是指1至100个氨基酸之间的氨基酸序列。在优选的实施方案中，根据本发明的肽接头具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸的最小长度。在进一步优选的实施方案中，根据本发明的肽接头具有至少100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、或15个或者更少氨基酸的最大长度。优选的是肽接头提供了连接在一起的两个氨基酸蛋白质、片段、区段、表位和/或结构域之间的柔性。如果氨基酸是小氨基酸，这种柔性通常会增加。因此，优选地，本发明的肽接头具有增加含量的小氨基酸，特别是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。优选地，肽接头超过20％、30％、40％、50％、60％或更多的氨基酸是小氨基酸。在优选的实施方案中，接头的氨基酸选自甘氨酸和丝氨酸。在特别优选的实施方案中，上面指出的优选的根据本发明的最小和最大长度的肽接头可以组合。技术人员会立即明白哪些组合在数学上是有意义的。在某些优选的实施方案中，本发明的肽接头是无免疫原性的；当设计来施用给人时，肽接头通常选择为对人类无免疫原性的。

本文所使用的术语“切割位点”是指氨基酸序列，其中该序列指导分裂，例如因为它被切割酶识别、和/或可以被分裂。一般而言，多肽链是通过连接氨基酸的一个或更多个肽键的水解而被切割的。肽键的切割可以源自化学或酶切割。酶切割是指通过蛋白水解酶内肽酶或外肽酶或者蛋白酶（例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶）而实现的这类切割。一般而言，酶切割的发生是由于自切割或者由独立的蛋白水解酶实现。蛋白质或多肽的酶切割可以在共翻译中或翻译后发生。因此，本文使用的术语“内肽酶切割位点”是指氨基酸或核苷酸序列中的切割位点，其中该序列被内肽酶（例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶）切割或者是可切割的。可选地或额外地，本发明的多肽可以通过自体蛋白酶切割，即切割同一蛋白质分子中的肽键的蛋白酶，该蛋白质分子也包含该蛋白酶。这样的自体蛋白酶的例子是来自黄病毒的NS2蛋白酶或者双核糖核酸病毒的VP4蛋白酶。

可选地，术语“切割位点”是指阻止氨基酸之间的肽键形成的氨基酸序列。例如，键形成的阻止可以由于多肽或多聚蛋白质的共翻译自加工，其产生了来源于单个开放读码框的单个翻译事件的两个不连续翻译产物。一般而言，这样的自加工是通过由伪终止密码子序列引起的“核糖体跳跃”所实现的，该伪终止密码子序列诱导翻译复合物从一个密码子移动到下一个密码子而不形成肽键。诱导核糖体跳跃的序列的例子包括但不限于病毒2A肽或2A样肽（两者本文中都被统称为“2A肽”或者可互换的“2A位点”或“2A切割位点”），这是几个病毒家族所使用的，包括小RNA病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫。最有名的是细小RNA病毒科家族的鼻病毒和口蹄疫病毒的2A位点，其通常用于从单个ORF产生多个多肽。

因此，本文所使用的术语“自切割位点”是指氨基酸或核苷酸序列中的切割位点，其中该序列在这种切割不涉及任何额外分子的情况下被切割或可被切割，或者其中该序列中肽键或磷酸二酯键的形成首先被阻止（例如通过如上所述的共翻译自加工）。

应当理解，切割位点通常包含几个氨基酸或由几个密码子进行编码（例如，在那些情况下，其中“切割位点”不翻译成蛋白质，但将导致翻译的中断）。因此，切割位点还可以用作肽接头的目的，即在空间上分隔两个肽。因此，在一些实施方案中，“切割位点”是肽接头，并同时提供上述的切割功能。在该实施方案中，切割位点可以包含另外的N-和/或C-末端氨基酸。

在本发明的一个具体优选的实施方案中，自切割位点选自由小RNA病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒2A肽或2A样肽组成的组。在一个优选的例子中，2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。

在本发明的优选实施方案中，由第一和/或第二载体所包含的核酸构建体编码至少两种免疫原性多肽，其中至少一种所述多肽诱导T细胞应答并且至少另一种多肽诱导B细胞应答。

在本发明的优选实施方案中，由第一和第二核酸构建体所编码的免疫原性多肽的氨基酸序列是基本上相同的。

在本发明的另一个优选实施方案中，至少一种核酸构建体编码选自（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的至少一种多肽。

在本发明具体优选的实施方案中，由第一和第二载体所包含的核酸构建体编码选自（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的相同的一种或多种多肽。术语“相同的一种或多种多肽（the same polypeptide or polypeptides）”是指如上所定义的免疫学上相同的多肽，或者具有如上所定义的基本上相同的氨基酸序列的多肽。术语“相同的一种或多种多肽”是指具有相同的氨基酸序列的多肽。

在本发明的具体优选的实施方案中，至少一种核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。在一个优选的实施方案中，所述核酸构建体不编码除前述三种多肽之外的任何多肽。例如，载体不包含前述核酸构建体之外的另外的核酸构建体，前述核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

在本发明的一个极优选的实施方案中，两种核酸构建体都编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。对于该实施方案的例子，两种核酸构建体都不编码除前述三种多肽之外的任何多肽。例如，两种载体都不包含前述核酸构建体之外的另外的核酸构建体，前述核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

疫苗

术语“疫苗”是指改善针对具体疾病的免疫能力的生物制剂。所述制剂可以包含杀死或减毒活病原体。它也可以包含来源于适合引发免疫应答的病原体的一种或更多种化合物。在本发明优选的实施方案中，所述化合物是与所述病原体多肽基本上相同或者免疫学上相同的多肽。还优选地，疫苗包含编码免疫原性多肽的核酸构建体，该多肽与所述病原体多肽基本上相同或者免疫学上相同。在后一种情况下，希望的是多肽在用疫苗治疗的个体中表达。接种的原理基本是免疫“记忆”的产生。用疫苗攻击个体的免疫系统将诱导免疫细胞的形成和/或增殖，该免疫细胞特异性识别包含在疫苗中的化合物。至少所述免疫细胞的一部分保持存活一段时间，该时间段可以延长至接种后10年、20年或30年。如果个体的免疫系统在前述时间段内遇到能够引发免疫应答的化合物所来源的病原体，则通过接种所产生的免疫细胞将重新激活，并增强对病原体的免疫应答，相比没有用疫苗攻击且第一次遇到病原体的免疫原性化合物的个体的免疫应答。

初免-加强接种方案

在许多情况下，疫苗的单次施用不足以产生在所述病原体的将来感染的情况下有效保护所需的长效免疫细胞的数量，以保护针对疾病包括肿瘤疾病或者用于治疗性治疗疾病如肿瘤疾病。因此，用特异性针对具体病原体或疾病的生物制剂进行重复攻击是建立针对所述病原体或疾病的持久且保护性的免疫力或者治愈给定疾病所需的。包含针对相同病原体或疾病的疫苗重复施用的施用方案在本申请中称为“初免-加强接种方案”。优选地，初免-加强接种方案涉及针对具体病原体、病原体组或疾病的疫苗或疫苗组合物的至少两次施用。疫苗的第一次施用称为“初免”，并且相同疫苗或者针对与第一次疫苗相同的病原体的疫苗的任何后续施用可以称为“加强”。因此，在本发明优选的实施方案中，初免-加强接种方案涉及用于初免免疫应答的一次疫苗施用以及用于加强免疫应答的至少一次后续施用。应该理解的是，用于加强免疫应答的2、3、4或甚至5次施用也是本发明所预期的。

初免和后续施用之间的时间段优选为1周、2周、4周、6周或8周。更优选地，它是4周。如果进行一次以上的加强，后续加强优选地在前次加强1周、2周、4周、6周或8周后进行施用。例如，时间间隔为4周。

要用根据本发明的初免-加强方案治疗的对象或病人优选哺乳动物或鸟类，更优选灵长类、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、牛、猪、马、鹅、鸡、鸭或火鸡，以及最优选人。

优选地，根据本发明第一或第二方面的疫苗组合使用将建立针对病原体或疾病的保护性免疫力，或者将导致由病原体感染所引起的感染或疾病的抑制和/或根除。

疫苗组合物

在“初免组合物”和“加强组合物”中使用的术语“组合物”是指包含核酸构建体以及选自药学上可接受的载体、药学赋形剂和佐剂的至少一种另外的化合物的载体组合。如果加强组合物包含免疫原性多肽而不是载体，那么加强组合物包含所述的至少一种免疫原性多肽以及选自药学上可接受的载体、药学赋形剂和佐剂的至少一种另外的化合物。

“药学上可接受的”意指经联邦或州政府监管机构批准的或者列在美国药典或其他一般公认的药典中用于动物中，并且更具体是用于人的。

本文使用的术语“载体”是指药理学上无活性的物质，例如但不限于与治疗性活性成分一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。这样的药学载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，诸如在水和油中的盐水溶液，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液以及含水葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当药物组合物是静脉内或通过喷雾器鼻内施用时，盐水溶液是优选的载体。

合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

合适的药学载体的例子是描述于E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。

术语“佐剂”是指在细胞或体液水平增加、刺激、激活、增强（potentiate)或调节对组合物活性成分的免疫应答的试剂，例如刺激免疫系统对真实抗原的应答，但它们本身没有免疫效应。这些佐剂的实例包括但不限于无机佐剂（例如无机金属盐，诸如磷酸铝或氢氧化铝），有机佐剂（例如皂苷或角鲨烯），油基佐剂（例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂），细胞因子（例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ），颗粒佐剂（例如免疫刺激复合物（ISCOMS）、脂质体或可生物降解的微球体），病毒体，细菌佐剂（例如单磷酰脂质A或者胞壁肽），合成佐剂（例如非离子型嵌段共聚物、胞壁肽类似物或者合成脂质A），或者合成的多核苷酸佐剂（例如聚精氨酸和聚赖氨酸）。

“鼻内施用”是向完整呼吸道（包括肺）粘膜施用本发明的疫苗组合物。更优选地，组合物施用到鼻粘膜。优选地，鼻内施用是通过滴注、喷雾或气雾剂实现的。优选地，所述施用不涉及通过机械方式诸如针进行的粘膜穿孔。

术语“肌内施用”是指将疫苗组合物注射入个体的任何肌肉中。优选的肌内注射是施用到三角肌、股外侧肌或者臀部腹腔间和背肩部。

惊奇地发现，多核苷酸载体和蛋白质的施用组合提供了在接种的特性（例如强度）方面的优点。因此，本发明进一步的方面涉及疫苗组合，其包含：

(a）包含、基本上由或者由包含核酸构建体的载体组成的初免组合物，所述核酸构建体编码至少一种免疫原性多肽，以及

(b）包含、基本上由或者由至少一种免疫原性多肽组成的至少一种加强组合物，

其中包含在初免组合物中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在加强组合物中的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，其用于初免-加强免疫接种方案，其中初免组合物是肌内或鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后施用。

在本发明第二方面的上下文中，所有术语具有本发明第一方面有关的上述定义的含义，并在指出的地方具有优选含义。特别地，术语载体、核酸构建体、免疫原性多肽、肌内或鼻内施用、初免加强接种方案具有上述含义。应该理解的是，与免疫原性多肽有关的教导可适用于由载体核酸编码的免疫原性多肽以及如此施用的多肽，而与核酸构建体有关的教导只与包含在载体中的核酸有关。

优选的是至少一种加强组合物是肌内或鼻内施用的。优选地，每种加强组合物都是肌内或鼻内施用的。

优选的施用方案如下：

(i）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；

(ii）初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

(ii）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；或者

(iv）初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用，最优选使用施用方案（i)。

在该方面优选的实施方案中，载体选自腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体（例如AAV 5型和2型）、甲病毒载体（例如委内瑞拉马脑炎病毒（VEE)、辛德毕斯病毒（SIN)、西门利克森林病毒（SFV）和VEE-SIN嵌合体）、疱疹病毒载体（例如源自巨细胞病毒的载体，如恒河猴巨细胞病毒（RhCMV)（14)）、沙粒病毒载体（例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）载体（15)）、麻疹病毒载体、痘病毒载体（例如牛痘病毒、修饰的安卡拉牛痘病毒（MVA)、NYVAC（源自牛痘哥本哈根株）和禽痘病毒载体：金丝雀痘病毒（ALVAC)和鸡痘病毒（FPV）载体），水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、病毒样颗粒和细菌孢子。

非常优选的载体是腺病毒载体，具体而言是源自人或非人的类人猿的腺病毒载体或者痘病毒载体，优选MVA。腺病毒所来源的优选类人猿是黑猩猩(Pan)、大猩猩（Gorilla）和猩猩(Pongo)，优选倭黑猩猩(Pan paniscus）和普通黑猩猩（Pan troglodytes)。一般而言，天然存在的非人的类人猿腺病毒是从相应类人猿的粪便样本中分离的。最优选的载体是基于hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAdlO、ChAd11、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2和PanAd3载体的非复制型腺病毒载体或者复制型Ad4和Ad7载体。

在本发明优选的实施方案中，包含在初免组合物中的核酸构建体具有如上所定义的结构。

在本发明的一个优选实施方案中，核酸构建体编码至少呼吸道合胞病毒（RSV）的融合蛋白F。在具体的例子中，所述核酸构建体不编码除前述多肽之外的任何多肽。例如，载体不包含前述核酸构建体之外的另外的核酸构建体，前述核酸构建体编码呼吸道合胞病毒（RSV）的融合蛋白F。

在本发明具体优选的实施方案中，核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。在这样实施方案的例子中，所述核酸构建体不编码除前述三种多肽之外的任何多肽。例如，载体不包含前述核酸构建体之外的另外的核酸构建体，前述核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

在本发明优选的实施方案中，包含在加强组合物中的至少一种免疫原性多肽具有如上所定义的结构。优选地，它选自呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2，或者具有与前述多肽的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列并与前述多肽免疫学上相同的多肽。

在本发明更优选的实施方案中，包含在加强组合物中的至少一种免疫原性多肽是呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F。例如，加强组合物不包含除了所述多肽（融合蛋白F）之外的免疫原性多肽。

在本发明具体优选的实施方案中，核酸构建体编码（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽，并且包含在加强组合物中的唯一免疫原性多肽是RSV的融合蛋白F。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，免疫应答的初免是通过腺病毒载体（例如选自本文提供的腺病毒载体的列表）的鼻内施用进行的，并且加强是通过免疫原性多肽的肌内施用进行的。例如，优选地，腺病毒载体可以是PanAd3。在该实施方案中，免疫原性多肽有利地可以是RSV的融合蛋白F，并且包含在载体中的核酸构建体有利地编码RSV的融合蛋白F、RSV的核蛋白N和RSV的基质蛋白M2。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，免疫应答的初免是通过腺病毒载体的鼻内施用进行的，并且加强是通过痘病毒载体的肌内施用进行的。还优选使用痘病毒载体进行初免和腺病毒载体进行免疫应答的加强。例如，优选地，腺病毒载体可以是PanAd3并且痘病毒载体可以是MVA。在该实施方案中，包含在两种载体中的核酸构建体优选编码RSV的融合蛋白F、RSV的核蛋白N和RSV的基质蛋白M2。

在进一步的方面，本发明提供了包含根据本发明的第一或第二方面的疫苗组合的制品，以及使用说明书。

附图说明

图1：           在重组蛋白F上经Elisa测得的抗F蛋白的抗体血清效价。效价是通过血清池的连续稀释确定的，并表示为得到比背景更高的值的稀释度加上3x标准偏差。条形上的数字表示重组蛋白质的单次施用相关的不同方案的抗体效价的增加倍数。

图2：           使用表达GFP蛋白的重组RSV-A病毒在Hep2细胞上基于FACS的RSV感染测定法测量中和效价。将数据表示为EC50，它是抑制50％病毒感染的血清稀释度。

图3：           用跨越整个F蛋白抗原的肽池先体外后体内再刺激之后在脾和肺淋巴细胞上进行的IFNγ T细胞Elispot。条形表示在经不同方案免疫的三组动物中测得的T细胞应答的平均值加标准误差。只有用PanAd3载体初免的那些动物显示了在脾和肺两者中的T细胞应答。

图4：           在棉鼠的肺（左图）和鼻（右图）中的RSV复制。使用来自不同器官的裂解物在Hep-2细胞中经空斑测定法来确定病毒效价，并表示为每克组织的Log10 pfu的平均值。蓝线表示测定的检测极限。

图5：           用跨越整个RSV疫苗抗原的肽池先体外后体内再刺激之后在脾和肺淋巴细胞上进行的IFNγ T细胞Elispot。黑色条表示经PanAd3肌内免疫接着经MVA-RSV肌内免疫的动物组中测得的T细胞应答的平均值。灰色条表示经PanAd3鼻内免疫接着经MVA-RSV肌内免疫的动物组中测得的T细胞应答的平均值加标准误差。

图6：           在重组蛋白F上经ELISA测量的抗F蛋白的抗体血清效价（图A）。使用表达GFP蛋白的重组RSV-A病毒在Hep2细胞上基于FACSDE RSV感染测定法测量的中和效价（图B）。将数据表达为EC50，它是抑制50％病毒感染的血清稀释度。

图7：           在棉鼠的肺（深灰色条）和鼻（浅灰色条）中的RSV复制。使用来自不同器官的裂解物在Hep-2细胞中经空斑测定法来确定病毒效价，并表示为每克组织的Log10 pfu的平均值。

图8：           在感染小牛的鼻分泌物（左图）和肺（右图）中的RSV复制。使用鼻拭子或来自肺不同部分的裂解物在MDBK细胞中经空斑测定法来确定病毒效价，并表示为每ml样品的Log10 pfu的平均值。蓝线Log10=2表示测定的检测限。

图9：           在棉鼠的鼻中的RSV复制。使用来自鼻粘膜的裂解物在Hep-2细胞中经空斑测定法来确定病毒效价，并表示为每克组织的Log10 pfu的平均值。点线表示测定的检测极限。

图10：       在加强之日（空心三角形=初免后4周）和攻击之日（实心三角形=加强后3、8和12周）测得的RSV血清中和抗体效价。在用人RSV Long株感染的Hep2细胞中经空斑减少测定法来测量中和效价。将数据表示为EC60，它是抑制相对于对照的60％空斑的血清稀释度。

下面的实施例仅旨在阐明发明。它们不应当以任何方式限制权利要求的范围。

实施例1：PanAd3-RSV和MVA-RSV的产生

疫苗设计

为设计本发明的疫苗抗原，从国家生物技术信息中心（NCBI）的RSV资源数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索RSV的F0-、N-和M2-1-蛋白的蛋白质序列。蛋白质序列选自不同RSV亚型A株。

使用MUSCLE版本3.6并应用多数规则比对F蛋白的所有不完全相同的序列而得到F0共有序列。在不同RSV序列的比对基础上设计疫苗的F0共有序列。进行BLAST分析测得疫苗共有FO序列的序列相似性，BLAST代表基本局部比对搜索工具并通过NCBI可公开获得。与数据库中的所有RSV序列进行了比较计算，共有序列的最高平均相似性相对于人呼吸道合胞病毒A2株为100％。

此外，疫苗的F0序列缺少位于氨基酸525至574的允许F0ΔTM分泌的跨膜区。

最后，对疫苗F0ΔTM序列进行了用于真核细胞表达的密码子优化。

使用MUSCLE版本3.6并应用多数规则比对N蛋白的所有不完全相同的序列而得到疫苗的N共有序列。N共有序列的BLAST分析发现了与人呼吸道合胞病毒A2株的最佳比对。然后对疫苗的N序列进行了用于真核细胞表达的密码子优化。

使用MUSCLE版本3.6并应用多数规则比对M2-1蛋白的所有不完全相同的序列而得到M2-1共有序列。M2-1共有序列的BLAST分析发现了与人呼吸道合胞病毒A2株的最佳比对。最后，对疫苗M2-1序列进行了用于真核细胞表达的密码子优化。

疫苗F0ΔTM序列和N序列由口蹄疫病毒的切割序列2A所间隔。疫苗N序列和M2-1序列通过柔性接头(GGGSGGG; SEQ ID NO:6)分开。

最后，将密码子优化的病毒基因被克隆为单个开放读码框F0ΔTM-N-M2-1。

编码F0ΔTM和F0ΔTM-N-M2-1的DNA质粒的产生

将共有F0ΔTM、N和M2-1序列进行了用于哺乳动物表达的优化，包括Kozak序列的添加和密码子优化。将编码多抗原疫苗的DNA序列进行化学合成，然后通过合适的限制性酶EcoRV和NotI将其亚克隆到CMV启动子控制下的pVJTetOCMV穿梭载体中。

PanAd3病毒载体RSV疫苗的产生

产生了含有809个氨基酸多聚蛋白质（SEQ ID NO：7）的病毒载体RSV疫苗PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1，其编码经柔性接头融合的共有F0ΔTM、N和M2-1蛋白质。

倭黑猩猩腺病毒3型（PanAd3）是具有改善的血清阳性率的新型腺病毒株并已在以前描述过。

从质粒载体pVJTetOCMV/F0ΔTM-N-M2-1克隆F0ΔTM-N-M2-1到PanAd3前腺病毒载体中，这是通过切掉同源区两侧的抗原序列并体外酶学重组进行的。

从穿梭质粒载体p94-F0ΔTM-N-M2-1克隆F0ΔTM-N-M2-1到MVA载体中，这是通过体外酶学重组和经荧光显微镜选择阳性重组病毒的两个步骤进行的。

实施例2：在小鼠中用PanAd3-RSV初免和用蛋白F加强

材料和方法

经鼻内滴注或经肌内注射用10⁸ vp的PanAd3-RSV免疫5只BALB/c小鼠组。另一组用配有氢氧化铝的5 μg重组蛋白F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B)肌内免疫 。四周后，所有动物在肌肉中接受配有氢氧化铝的5 μg重组蛋白F。四周后，将所有动物放血并制备血清。经F蛋白ELISA分析每组中动物的血清池：简而言之，用0.5 μg蛋白F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）包被96孔微量板，并用血清的连续稀释液进行孵育。经过大量洗涤后，通过缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠IgG二抗展现特异性结合。使用BALB/c预免疫血清来确定背景值。将抗体效价表示为得到等于背景值加3倍标准偏差之值的稀释度。通过基于FACS的感染测定法来测量中和抗体。简而言之，使用表达GFP的重组RSV-A病毒（Chen M.等，J Immunological Methods 2010; 362:180）以给出20％感染细胞的感染复数（MOI）来感染培养的Hep-2细胞24 h。在添加到细胞中之前，将小鼠血清池的连续稀释液用病毒于37 ℃下孵育1小时。 24小时后，感染细胞的百分比是通过全细胞FACS分析来测量的。将抗体效价表示为给出50％感染抑制（EC50）的血清稀释度。

T细胞应答是通过IFNγ T细胞Elispot测量的。简而言之，将脾和肺的淋巴细胞铺板在包被有抗-IFγ抗体的96孔微量滴定板上，并用跨越整个RSV疫苗抗原的肽池进行先体外后体内刺激。经过大量洗涤后，在板底上形成斑点的分泌IFNγ是通过缀合有碱性磷酸酶的二抗展现的。斑点的数目是通过自动Elispot读数仪进行计数的。

结果

将含有RSV抗原F、N和M2-1的猿腺病毒PanAd3-RSV通过鼻内途径或通过肌内途径施用给BALB/c小鼠的组。用与氢氧化铝一起配制的重组F蛋白经肌内注射免疫单独的组。四周后，用与氢氧化铝一起配制的重组F蛋白经肌内注射加强三组小鼠。加强四周后，通过F-蛋白ELISA分析小鼠血清，并通过基于FACS的RSV中和测定法测量中和抗体效价。通过IFNγ T细胞Elispot测量脾和肺中的T细胞应答。

如图1所示，接受PanAd3-RSV作为初免疫苗的小鼠组达到了非常高水平的血清中抗F抗体效价。用PanAd3-RSV初免增加了用单次F蛋白施用所获得的抗体效价，该系数的范围为从鼻内施用腺病毒的87×到肌内施用腺病毒的158×，而两次施用蛋白F以系数22增加了效价。

使用表达GFP的重组RSV病毒通过在Hep2细胞上基于FACS的细胞培养感染测定法测量RSV中和抗体效价。图2显示了表示为给出50％感染抑制（EC 50）的血清稀释度的中和效价。如所观察到的抗F抗体效价，中和抗体效价在通过蛋白质/蛋白质方案相关的腺病毒初免和蛋白质加强的组合接种的动物中也增加了。

通过脾和肺淋巴细胞上的IFNγ T细胞Elispot测量了相同小鼠组中的T细胞应答。如图3所示，只有在初免时接种了腺病毒载体的那些组产生了全身和局部两种T细胞应答。相反，没有在用蛋白F接种的动物中检测到F特异性T细胞应答。

实施例3：在棉鼠中用PanAd3-RSV初免和用蛋白F加强

材料和方法

通过鼻内滴注用10⁸ vp的PanAd3-RSV免疫或者用配有氢氧化铝的5μg重组蛋白F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）肌内免疫5只棉鼠（Sygmoidon Hispidus）的组。四周后，所有动物在肌肉中接受与氢氧化铝一起配制的5 μg重组蛋白F。三周后，将两组动物加上未接种的对照组通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株进行感染。感染五天后处死所有动物，并且收集鼻上皮和肺并裂解。使用组织裂解物的连续稀释液来感染培养的Hep2细胞，以便通过计数蚀斑来测量病毒效价。

结果

两组棉鼠的接种是通过i）用配制于氢氧化铝中的蛋白F初免并加强或者ii）用PanAd3-RSV鼻内初免并用配制于氢氧化铝中的蛋白F肌内加强。加强三周后，通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株来攻击动物，连同未接种的对照组。感染五天后将动物处死，并通过鼻和肺组织的裂解物上的蚀斑测定法滴定病毒。如图4所示，在对照动物中，肺和鼻内的RSV效价达到4-5 log10，而接种组中的所有动物都阻止了肺中的病毒复制。相比之下，只有接受了腺病毒和蛋白质的组合的那些动物在上呼吸道中也显示了完全的消除性免疫。

实施例4：用PanAd3初免并用蛋白F加强后在棉鼠中抗RSV的中和抗体的寿命

材料和方法

通过鼻内滴注用10⁸ vp的PanAd3-RSV免疫或者用配有氢氧化铝的5μg重组蛋白F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）肌内免疫5只棉鼠（Sygmoidon Hispidus）的组。四周后，所有动物在肌肉中接受与氢氧化铝一起配制的5μg重组蛋白F。三周后，将两组动物加上未接种的对照组通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株进行感染。感染五天后处死所有动物，并且收集鼻上皮和肺并裂解。使用组织裂解物的连续稀释液来感染培养的Hep2细胞，以便通过计数蚀斑来测量病毒效价。在用RSV Long株感染的Hep2细胞中经蚀斑减少测定法来测量血清中和抗体。将效价表达为给出相对于未抑制对照60％蚀斑减少的血清稀释度。

结果

两组棉鼠的接种是通过i）用PanAd3-RSV鼻内初免并用配制于氢氧化铝中的蛋白F肌内加强或者ii）用配制于氢氧化铝中的蛋白F初免并加强。加强三周、八周和十二周后，通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株来攻击动物，连同未接种的对照组。感染五天后将动物处死，并通过鼻和肺组织的裂解物上的蚀斑测定法滴定病毒。如图9所示，在对照动物中，鼻内RSV的效价达到4-5 log10，而只有接受腺病毒和蛋白质的组合的那些动物显示了上呼吸道中的完全消除性免疫。在加强的天（初免后4周）和攻击的天（加强后3、8和12周）测量血清中和抗体。如图10所示，中和效价保持很高，并且只有在接种了腺病毒和蛋白质的组合的那些组中持续，而接种了蛋白质的那些组中的中和效价随时间慢慢衰减。

实施例5：用PanAd3-RSV鼻内初免且用MVA-RSV加强后的T细胞应答

材料和方法

将含有RSV抗原F、N和M2-1的PanAd3-RSV的10⁸病毒微粒（VP）通过鼻内滴注或通过肌内途径施用给10只CD1小鼠的组。四周后，所有动物在肌内接受含有RSV抗原F、N和M2-1的10⁷蚀斑形成单位（pfu）的MVA-RSV。四周后，将动物处死，从脾和肺分离淋巴细胞，并制备来自血液的血清。如上所述测量T细胞应答、抗F抗体和RSV中和抗体的效价。

结果

将基于初免时鼻内施用PanAd3-RSV并在4周后用MVA-RSV肌内加强的异源初免/加强接种方案与基于PanAd3-RSV初免和MVA-RSV加强的方案进行了比较，两者都是在远交CD1小鼠的肌内施用的。MVA加强四周后，将小鼠处死并在脾内和肺内测量RSV特异性T细胞应答。如图5所示，在初免时鼻内施用PanAd3-RSV在脾和肺两者中都引发了更强的IFN-γ T细胞应答。

鼻内腺病毒初免后的免疫应答的改善是通过抗F蛋白抗体的增加（图7，图BA）和血清中的中和抗体效价的增加（图7B）而确认的。

实施例6：用PanAd3-RSV初免且用MVA-RSV加强后的棉鼠中的免疫力

材料和方法

经鼻内滴注或经肌内注射用10⁸ vp的PanAd3-RSV免疫5只棉鼠（Sygmoidon Hispidus）的组。四周后，所有动物在肌内接受10⁷ pfu的MVA-RSV。三周后，将两组动物加上未接种的对照组通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株进行感染。注射五天后处死动物，并且收集鼻上皮和肺并裂解。使用组织裂解物的连续稀释液来感染培养的Hep2细胞，以便通过计数蚀斑来测量病毒效价。

结果

通过用PanAd3-RSV/MVA-RSV异源初免/加强来接种两组棉鼠，以比较在鼻内或肌内用PanAd3-RSV进行初免之间的差异。以4周的时间间隔在肌内用MVA加强两个组。将未接种动物的第三组用作对照。加强三周后，通过鼻内施用10⁵ pfu的RSV Long株来攻击动物。感染五天后将动物处死，通过鼻和肺组织的裂解物上的蚀斑测定法滴定病毒。如图7所示，在对照动物中，肺和鼻内的RSV效价达到4-5 log10，而接种组中的所有动物都阻止了肺中的病毒复制。相比之下，只有那些在初免时鼻内接受了腺病毒的动物在上呼吸道中也显示了完全的消除性免疫。

实施例7：在牛中用PanAd3-RSV初免后并用MVA-RSV加强的免疫力，与单独用PanAd3-RSV接种相比较

材料和方法

将3和4只新生的（2-4周龄）血清阴性小牛（通过BRSV蚀斑减少测定法筛选）的两组（A和B）用5x10^10 vp的PanAd3-RSV经由喷雾装置的鼻递送进行免疫。初免八周后，B组肌内接受2x10^8 pfu的MVA-RSV。第三组，C组，不进行接种并用作对照组。初免四周后（A组）或加强后（B组），将两组动物加上对照组C通过鼻内和气管内施用10^4 pfu的BRSV Snook株进行感染。感染六天后将所有动物处死。通过鼻拭子收集感染期间每天的鼻分泌物。在处死时，收集气管刮取物和肺冲洗液，加上肺不同部分（右侧顶叶、右心叶、左心叶）的切片，将它们在适当的缓冲液中裂解。使用组织裂解物的连续稀释液来感染培养的牛MDBK细胞，以便通过计数蚀斑来测量病毒效价。

结果

两组2-4周龄的血清阴性小牛的接种是通过i）用PanAd3-RSV单次鼻内施用或ii）用PanAd3-RSV鼻内初免接着在8周后肌内MVA-RSV加强进行的。在通过鼻内和气管内施用10⁴ pfu的BRSV Snook株进行接种四周后攻击动物。感染六天后，当病毒复制在肺内和鼻内达到峰值、引起最多的肺病理学症状时，将动物处死。通过MDBK细胞上的蚀斑测定法的感染过程来确定鼻分泌物中的病毒效价，这是在处死当天的肺中测量的。图8，小图B中的结果清楚地表明，仅接受一剂量鼻内PanAd3-RSV的组就能够几乎完全地减弱肺中的病毒复制。鼻内PanAd3-RSV的施用导致了相对于对照动物在鼻分泌物中峰病毒载量的降低和瞬时水平（图9，小图A）。在鼻内接受PanAd3-RSV接着在肌内接受MVA-RSV的组显示了在上呼吸道和下呼吸道两者中对病毒的消除性免疫（图9）。

结论：

PanAd3-RSV（IN）和重组蛋白（IM）的组合诱导了更强且更持久的免疫力（实施例3和4），与重组蛋白F的两种IM施用同源方案相比。在小鼠中还可显示，通过用PanAd3-RSV的IN初免和用重组蛋白F的IM加强的组合产生了更强的免疫应答。因此，用基于载体的疫苗的免疫应答初免改善了用肽疫苗的加强的效力，与用肽疫苗之初免相比。

如果采用带有腺病毒载体和痘病毒载体的异源初免/加强接种方案，鼻内初免和肌内加强的组合引发了比肌内初免和肌内加强更强的免疫应答，如实施例5中的小鼠和实施例6中的棉鼠所显示的。因此，异源初免/加强接种方案可通过仔细选择两种疫苗的施用途径进行优化，以达到最佳免疫。

               序列表

 

<110> Okairos AG, 等

 

<120> 涉及由多核苷酸编码的免疫原性多肽的新型初免-加强方案

 

<130> 578-49PCT2

 

<150> PCT/EP2012/063196

<151> 2012-07-05

 

<160> 7

 

<170> BiSSAP 1.0

 

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..360

<223> /分子类型="蛋白质"

          /生物体="呼吸道合胞病毒"

 

<400> 1

Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu

1               5                   10                   15   

Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu

            20                   25                  30       

Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu

        35                   40                  45           

Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val

    50                   55                  60               

Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu

65                   70                  75                  80

Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu

                85                   90                  95   

Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn

            100                  105                110       

Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln

        115                  120                125           

Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val

    130                  135                140               

Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu

145                  150                155                  160

His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile

                165                  170                175   

Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser

            180                  185                190       

Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg

        195                  200                205           

Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn

    210                  215                220               

Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met

225                  230                235                  240

Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala

                245                  250                255   

Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn

            260                  265                270       

Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn

        275                  280                285           

Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn

    290                  295                300               

Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn

305                  310                315                  320

Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile

                325                  330                335   

Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys

            340                  345                350       

Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val

        355                  360

 

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..524

<223> /分子类型="蛋白质"

          /生物体="呼吸道合胞病毒"

 

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1               5                   10                   15   

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

            20                   25                  30       

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

        35                   40                  45           

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

    50                   55                  60               

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65                   70                  75                  80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

                85                   90                  95   

Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

            100                  105                110       

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

        115                  120                125           

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

    130                  135                140               

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145                  150                155                  160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

                165                  170                175   

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

            180                  185                190       

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

        195                  200                205           

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

    210                  215                220               

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225                  230                235                  240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

                245                  250                255   

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

            260                  265                270       

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

        275                  280                285            

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

    290                  295                300               

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305                  310                315                  320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

                325                  330                335   

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

            340                  345                350        

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

        355                  360                365           

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val

    370                  375                380                

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385                  390                395                  400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

                405                  410                415   

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

            420                  425                430       

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

        435                  440                445           

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

    450                  455                460               

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465                  470                475                  480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

                485                  490                495   

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

            500                  505                510       

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn

        515                  520               

 

<210> 3

<211> 170

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..170

<223> /分子类型="蛋白质"

          /生物体="呼吸道合胞病毒"

 

<400> 3

Ile Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val

1               5                   10                   15   

Asp Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe

            20                   25                  30       

Glu Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile

        35                   40                  45           

Glu Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly

    50                   55                  60               

Glu Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile

65                   70                  75                  80

Ile Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp

                85                   90                  95   

Arg Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys

            100                  105                110       

Asn Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn

        115                  120                125           

Ser Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys Tyr Pro His Phe Ile Asp Val Phe

    130                  135                140               

Val His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val

145                  150                155                  160

Glu Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn

                165                  170

 

<210> 4

<211> 391

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..391

<223> /分子类型="蛋白质"

          /生物体="呼吸道合胞病毒"

 

<400> 4

Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln

1               5                   10                   15   

Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser

            20                   25                  30       

Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys

        35                   40                  45           

Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu

    50                   55                  60               

Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile

65                   70                  75                  80

Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp

                85                   90                  95   

Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu

            100                  105                110       

Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu

        115                  120                125           

Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu

    130                  135                140               

Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile

145                  150                155                  160

Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg

                165                  170                175   

Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn

            180                  185                190       

Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser

        195                  200                205           

Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys Tyr Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val

    210                  215                220               

His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu

225                  230                235                  240

Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val

                245                  250                255   

Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu

            260                  265                270       

Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr

        275                  280                285           

Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu

    290                  295                300               

Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe

305                  310                315                  320

Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu

                325                  330                335   

Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala

            340                  345                350       

Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu

        355                  360                365           

Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro

    370                  375                380               

Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu

385                  390   

 

<210> 5

<211> 194

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..194

<223> /分子类型="蛋白质"

          /生物体="呼吸道合胞病毒"

 

<400> 5

Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu

1               5                   10                   15   

Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro

            20                   25                  30       

His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys

        35                   40                  45           

Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala

    50                   55                  60               

Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu

65                   70                  75                  80

Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys

                85                   90                  95   

Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys

            100                  105                110       

Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr

        115                  120                125           

Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln

    130                  135                140               

Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr

145                  150                155                  160

Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro

                165                  170                175   

Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp

            180                  185                190       

Thr Thr

       

 

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..7

<223> /分子类型="蛋白质"

          /note="peptide linker"

          /生物体="人工序列"

 

<400> 6

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1               5       

 

<210> 7

<211> 1146

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<221> 来源

<222> 1..1146

<223> /分子类型="蛋白质"

          /注释="免疫原性多聚蛋白质"

          /生物体="人工序列"

 

<400> 7

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1               5                   10                   15   

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

            20                   25                  30       

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

        35                   40                  45           

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

    50                   55                  60               

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65                   70                  75                  80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

                85                   90                  95   

Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

            100                  105                110       

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

        115                  120                125           

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

    130                  135                140               

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145                  150                155                  160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

                165                  170                175   

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

            180                  185                190       

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

        195                  200                205           

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

    210                  215                220               

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225                  230                235                  240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

                245                  250                255   

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

            260                  265                270       

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

        275                  280                285           

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

    290                  295                300               

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305                  310                315                  320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

                325                  330                335   

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

            340                  345                350       

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

        355                  360                365           

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val

    370                  375                380               

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385                  390                395                  400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

                405                  410                415   

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

            420                  425                430       

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

        435                  440                445           

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

    450                  455                460               

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465                  470                475                  480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

                485                  490                495   

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

            500                  505                510       

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Arg Lys Arg Arg

        515                  520                525           

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

    530                  535                540               

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu

545                  550                555                  560

Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr

                565                  570                575   

Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val

            580                  585                590       

Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp

        595                  600                605           

Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser

    610                  615                620               

Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr

625                  630                635                  640

His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile

                645                  650                655   

Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr

            660                  665                670       

Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys

        675                  680                685           

Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp

    690                  695                700               

Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile

705                  710                715                  720

Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg

                725                  730                735   

Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu

            740                  745                750       

Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys Tyr

        755                  760                765           

Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser

    770                  775                780               

Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met

785                  790                795                  800

Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala

                805                  810                815   

Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu

            820                  825                830       

Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly

        835                  840                845           

Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu

    850                  855                860               

Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala

865                  870                875                  880

Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln

                885                  890                895   

Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn

            900                  905                910       

Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu

        915                  920                925           

Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu Gly

    930                  935                940               

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys

945                  950                955                  960

Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser

                965                  970                975   

His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn

            980                  985                990       

Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr

        995                  1000                1005           

Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr

    1010                1015                1020               

Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn

1025                1030                1035                1040

Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr

                1045                1050                1055   

Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu

            1060                1065                1070       

Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu

        1075                1080                1085           

Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu

    1090                1095                1100                

Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His

1105                1110                1115                1120

Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr

                1125                1130                1135   

Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp Thr Thr

            1140                1145   

Claims (26)

1.疫苗组合产品，其包含：

(a）包含第一载体的初免组合物，所述第一载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，以及

(b）包含第二载体的至少一种加强组合物，所述第二载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，

其中包含在所述第一载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在所述第二载体中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，

所述疫苗组合产品用于初免-加强接种方案，其中：

(i）所述初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种所述加强组合物随后肌内施用；

(ii）所述初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种所述加强组合物随后鼻内施用；

(ii）所述初免组合物是肌内施用的，并且至少一种所述加强组合物随后肌内施用；或者

(iv）所述初免组合物是肌内施用的，并且至少一种所述加强组合物随后鼻内施用。

2.权利要求1所述的疫苗组合产品，其中所述第一载体是腺病毒载体。

3.权利要求2所述的疫苗组合产品，其中所述腺病毒载体是非人的类人猿来源的腺病毒载体，优选黑猩猩或倭黑猩猩的腺病毒载体。

4.权利要求1至3任一项所述的疫苗组合产品，其中所述第二载体是痘病毒载体，优选MVA或腺病毒载体。

5.权利要求4所述的疫苗组合产品，其中包含在第一核酸构建体中的腺病毒载体与包含在第二核酸构建体中的腺病毒载体是免疫学上不同的。

6.根据权利要求1至5任一项所述的疫苗组合产品，其中所述第一和/或第二核酸构建体编码至少两种多肽。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合产品，其中所述多肽之一诱导T细胞应答并且另一种多肽诱导B细胞应答。

8.权利要求6或7所述的疫苗组合产品，其中由所述第一和/或第二核酸构建体编码的所述至少两种多肽是通过切割位点连接的。

9.权利要求8所述的疫苗组合产品，其中所述切割位点是自切割位点或内肽酶切割位点。

10.权利要求9所述的疫苗组合产品，其中所述自切割位点是选自小RNA病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒2A肽或2A样肽的2A切割位点，优选地，其中所述2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。

11.权利要求1至10任一项所述的疫苗组合产品，其中由所述第一和第二核酸构建体所编码的免疫原性多肽的氨基酸序列是基本上相同的。

12.根据权利要求1至11任一项所述的疫苗组合产品，其中至少一种所述核酸构建体编码包含（i）呼吸道合胞病毒（RSV)的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

13.根据权利要求12所述的疫苗组合产品，其中所述第一和第二核酸构建体编码包含（i）RSV的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

14.权利要求1至13任一项所述的疫苗组合产品，其中

（i）所述第一载体是腺病毒载体并且所述第二载体是痘病毒载体；或者

所述第一载体是痘病毒载体并且所述第二载体是腺病毒载体；以及

（ii）所述第一和第二核酸构建体编码包含（i）RSV的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

15.权利要求14所述的疫苗组合产品，其中所述初免组合物是鼻内施用的并且至少一种所述加强组合物随后肌内施用；或者所述初免组合物是鼻内施用的并且至少一种所述加强组合物随后鼻内施用。

16.疫苗组合产品，包含：

(a）包含载体的初免组合物，所述载体包含编码至少一种免疫原性多肽的核酸构建体，以及

(b）包含至少一种免疫原性多肽的至少一种加强组合物，

其中包含在所述初免组合物中的由核酸构建体编码的免疫原性多肽的至少一个表位与包含在所述加强组合物中的免疫原性多肽的至少一个表位是免疫学上相同的，

所述疫苗组合产品用于初免-加强接种方案，其中所述初免组合物是肌内或鼻内施用的并且至少一种加强组合物随后施用。

17.根据权利要求16的疫苗组合产品，其中所述至少一种加强组合物是肌内或鼻内施用的。

18.根据权利要求16或17所述的组合产品，其中

(i）所述初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；

(ii）所述初免组合物是鼻内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用；

(ii）所述初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后肌内施用；或者

(iv）所述初免组合物是肌内施用的，并且至少一种加强组合物随后鼻内施用。

19.根据权利要求16至18任一项所述的疫苗组合产品，其中所述载体是腺病毒载体。

20.根据权利要求19所述的疫苗组合产品，其中所述腺病毒载体是非人的类人猿来源的腺病毒载体，优选黑猩猩或倭黑猩猩的腺病毒载体。

21.根据权利要求16至20任一项所述的疫苗组合产品，其中所述核酸构建体编码至少两种多肽。

22.根据权利要求16至21任一项所述的疫苗组合产品，其中所述多肽之一诱导T细胞应答并且另一种多肽诱导B细胞应答。

23.权利要求22所述的疫苗组合产品，其中所述切割位点是自切割位点或内肽酶切割位点。

24.根据权利要求21至23任一项所述的疫苗组合产品，其中所述核酸构建体编码包含（i）RSV的融合蛋白F、(ii）RSV的核蛋白N和（iii）RSV的基质蛋白M2的多肽。

25.根据权利要求16至24任一项所述的疫苗组合产品，其中用于加强免疫应答的多肽是RSV的融合蛋白F。

26.根据权利要求6至13和22至25任一项所述的疫苗组合产品，其用于增强针对诱导B细胞应答的多肽的B细胞应答。