BRPI0621413A2

BRPI0621413A2 - método de processamento de uma amostra biológica e/ou quìmica

Info

Publication number: BRPI0621413A2
Application number: BRPI0621413-4A
Authority: BR
Inventors: Jurgen Pipper; Tseng-Ming Hsieh; Pavel Neuzil
Original assignee: Agency Science Tech & Res
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2011-12-06
Also published as: CN101371124B; EP1989529A4; WO2007094739A1; US20090289213A1; JP2009526970A; CN101371124A; EP1989529A1; US8216855B2

Abstract

MéTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA BIOLóGICA E/OU QUìMICA. A presente invenção oferece um método para o processamento de uma amostra biológica e/ou química. O método inclui proporcionar uma gotícula de fluido, que inclui uma fase interna e uma fase externa. A fase externa é imiscível com a fase interna, e a fase externa está circundando a fase interna. A fase interna inclui a amostra biológica e/ou química. A gotícula de fluido também compreende matéria capaz de ser magneticamente atraida. O método também inclui proporcionar pelo menos uma superficie, cuja textura e molhabilidade para o fluido da fase interna da gotícula de fluido são de tal forma que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com a ela. O método inclui ainda dispor a gotícula de fluido sobre a pelo menos uma superficie. O método também inclui realizar um processo na amostra química e/ou biológica na gotícula de fluido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA E/OU QUÍMICA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para o processamento de uma amostra biológica e/ou química em uma gotículca de fluido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A miniaturização dos dispositivos nas áreas química, farmacêutica e biotecnológica levou ao desenvolvimento de dispositivos microfluídicos que controlam o fluido de líquido e permitem a realização de uma série de reações químicas e biológicas. Entretanto, tais dispositivos não permitem reduzir a escala de um laboratório químico convencionai de uso geral em um único microchip devido à feita de microcomponentes apropriados, tais como microseparadores ou microfiltros. Além disso, tais dispositivos geralmente não atendem às exigências de mistura. Portanto, um projeto de poços abertos, geralmente uma placa multipoços, é freqüentemente empregado em combinação Com dispositivos automatizados de mistura e lavagem. Entretanto, tal projeto de poços impõe desafios maiores à miniaturização adicional e um de seus principais problemas é a evaporação.

Recentemente, a manipulação das gotículas tem recebido considerável atenção devido à possibilidade de se isolar e manipular volumes até a faixa de picolitros/fentolitros (como, por exemplo, o pedido de patente internacional WO 2004/030820). Vários sistemas, como o "lab-on-a-chip" (LOC), micro análise total (μΤΑ8) e microeletrônicos biológicos (BioMEMS) foram desenvolvidos para mover, combinar/misturar, dividir e aquecer gotículas sobre superfície, tal como o umedecimento eletrônico em dielétrico (EWOD) [Pollack, M.G. e col., AppL Phys. Lett. (2000), 77, 1725-1726], ondas acústicas superficiais (SAW) [Wixforth, A. e col., mstnews (2002), 5, 42- 43], dieletroforese [Cascoyne, P.R.C. e col., Lab-on-a-Chip (2004), 4, 299-309], e ambientes localmente assimétricos [Daniel, S. e col., Langmuir (2005), 21, 4240-4228]. Entretanto, esses métodos carecem da operação mais importante para realizar processos biológicos seqüenciais: A capacidade de separar/purificar/isolar o material inicial e/ou os produtos da reação das misturas brutas ou complexas. Para permitir tal separação, é necessário introduzir uma fase sólida como parte do sistema baseado em gotículas.

Sendo assim, um dos objetivos da presente invenção é o de propor um método para o processamento de uma amostra química e/ou biológica que evite as desvantagens apresentadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção oferece um método para o processamento de uma amostra biológica e/ou química. O método inclui proporcionar uma gotícula de fluido. A 25 ase externa é imiscível com a fase interna. A fase externa encontra-se circundando a fase interna. A fase interna inclui a amostra biológica e/ou química. A fase interna é protegida do ambiente pela fase externa. A gotícula de fluido inclui ainda matéria capaz de ser magneticamente atraída. O método também inclui proporcionar pelo menos uma superfície. A superfície tem tal textura e molhabilidade para o fluido da fase interna da gotícula de fluido que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com a superfície. O método inclui ainda dispor a gotícula de fluido sobre a pelo menos uma superfície. O método também inclui realizar um processo na amostra química e/ou biológica na gotícula de fluido. Em algumas concretizações, o método adicionalmente inclui controlar a posição da gotícula de fluido em relação à pelo menos uma superfície por meio da exposição da gotícula de fluido a um campo magnético ou eletromagnético.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma gotícula de fluido. A gotícula de fluido inclui uma fase interna e uma fase externa, e pelo menos uma partícula capaz de ser atraída magneticamente. A fase externa da gotícula de fluido é imiscível com a fase interna da gotícula de fluido. A fase externa da gotícula de fluido encontra-se circundando a fase interna. A fase interna da gotícula de fluido é protegida do ambiente pela fase externa. A pelo menos uma partícula capaz de ser atraída magneticamente inclui um ligante que é capaz de ligar uma amostra biológica e/ou química. Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um método para formar uma gotícula de fluido. A gotícula de fluido inclui uma fase interna, uma fase externa, e pelo menos uma partícula capaz de ser atraída magneticamente. O método inclui proporcionar um primeiro fluido e proporcionar um segundo fluido que é imiscível com o primeiro fluido. O método adicionalmente inclui colocar o primeiro fluido e o segundo fluido em contato, com isso formando uma gotícula de fluido que inclui uma fase interna e uma fase externa. O primeiro fluido está 1formando a fase interna, circundado pelo segundo fluido formando a fase externa. O método adicionalmente inclui proporcionar pelo menos uma partícula capaz de ser magneticamente atraída. A partícula capaz de ser atraída magneticamente inclui um ligante que é capaz de ligar uma amostra biológica e/ou química. O método adicionalmente inclui dispor a pelo menos uma partícula capaz de ser atraída magneticamente na gotícula de fluido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será melhor entendida com referência à descrição detalhada quando considerada em combinação com os exemplos não limitantes e os desenhos apensos, nos quais:

A Figura 1 representa esquematicamente vários ângulos de conato θ de uma gotícula sobre uma superfície (5), que é plana (A, B, C), convexa (D) e côncava (Ε). A gotícula inclui uma fase interna (2) e uma fase externa (3). A Figura 2 representa uma gotícula de alto ângulo de contato θ sobre uma superfície (5) numa vista lateral (A) e vista de cima (Β). A gotícula inclui uma fase interna (2) e uma fase externa (3). A gotícula também inclui partículas capazes de ser magneticamente atraídas (1).

A Figura 3A ilustra uma gotícula de uma fase interna (2) e uma fase externa (3) que inclui partículas funcionalizadas capazes de serem magneticamente atraídas (8) numa vista lateral. A posição da gotícula abaixo de uma superfície (5) é controlada por meio de um ímã permanente (20), em uma posição relativa à superfície (5).

A Figura 3B ilustra uma gotícula (6) de uma fase interna (2), uma fase externa (3) e partículas capazes de serem magneticamente atraídas (8) no topo de uma superfície (5).

A Figura 3C ilustra uma gotícula (6), conforme representada na Fig. 3A ou 3B, sobre um eletroímã (7), que é membro de um arranjo de eletroímãs vistos de cima ou de baixo, respectivam ente.

A Figura 4 representa um processo de lavagem (vide também Fig. 18) de uma amostra em uma gotícula (6) por meio de uma segunda gotícula (16) numa vista de cirna (A), bem como numa vista lateral (B), representando um ímã (20) sob uma superfície (5). Uma segunda gotícula envolvida em um processo de lavagem pode estar localizada em uma superfície que difere da superfície (5), na qual está localizada (C) a gotícula de fluido que inclui partículas magnéticas (1), uma fase interna (2) e externa (3). A Figura 5 ilustra esquematicamente o isolamento da matéria-alvo de uma amostra. Um leucócito (10) transportando um antígeno de superfície (11) é ligado por um anticorpo (9), acoplado a uma partícula capaz de ser atraída magneticamente (1).

A Figura 6 representa uma análise genética de uma amostra de gotícula de sangue utilizando' o método da invenção. Os leucócitos são ligados às partículas íuncionalizadas capazes de serem magneticamente atraídas (1) nas gotículas, isolados, lavados, termicamente submetidos à Iise por meio de aquecedores de película fina (14) controlados por sensores de película fina (15) e processados por transcrição reversa (RT), seguido da reação em cadeia da polimerase (PCR) e do pirosequenciamento (PSQ). As setas indicam a direção na qual a amostra é movida.

A Figura 7 representa o isolamento dos glóbulos brancos do sangue (WBCs), partindo de 0,1 μΐ de sangue total humano capilar fresco, que é misturado com uma pasta semifluida de partículas superparamagnéticas íuncionalizadas de anti-CD15 e CD45 (21), e incubado à temperatura ambiente por 10 min. Após duas lavagens com PBS/1 % BSA, as WNCs estavam prontas para aplicações posteriores.

A Figura 8 representa glóbulos brancos do sangue coradas com DAPI (22) imobilizadas no topo das contas magnéticas (Dynabeads) CD15 e CD 45 após a lavagem. A Figura 9 representa números absolutos (eixo das ordenadas à esquerda) e rendimento absoluto (eixo das ordenadas à direita) dos leucócitos isolados de uma gota de sangue humano (■) e 100 nl (·); para 1000 nl de sangue, o rendimento relativo dos leucócitos isolados é de 85% após 10 min.

A Figura 10 representa a análise de amplificação de uma RT-PCR em uma gotícula por detecção em tempo real.

A Figura 11 representa uma análise de curva de fusão dos produtos obtidos da PCR. Um pico (TM = 87,6 0C, valor obtido usando um termociclador Opticon 2 da MJ Research: Tm = 84,6 0C) indica um produto da PCR e poucos co-produtos.

A Figora 12 representa a verificação da identidade do fragmento cDNA amplificado (Fig. 10) por eletroforese capilar. 100 nl de CD45/15 com cerca de 1400 glóbulos brancos do sangue (■) ou um controle negativo (sem modelo) (NTC. ·, cinza), 1 μl de mistura PCR e 5 μl de óleo mineral foram utilizados,, a amostra resultando em um produto da PCR de 208 bp (rendimento de 20,5 iig/μl). 1: marcador de 15 bp, 2: dímero iniciador, 3: marcador de 600 bp.

A Figura 13 representa uma análise de pirograma obtida pelo pirosequenciamento de fluido-fase do produto da PCT (CdsDNA = 20,5 ng/μl).

A Figura 14 representa uma análise de pirograma das primeiras três posições de base obtidas pelo pirosequenciamento baseado em gotículas utilizando o método da invenção.

A Figura 15 representa o anti-IgG de camundongo produzido em cabra (molécula inteira) marcado com fluoresceína (FITC) ligada à superfície, covalentemente acoplado no topo de partículas superparamagnéticas micromer®-M (micromod).

A Figura 16 ilustra a solução incolor de uma gotícula (23) contendo a solução do substrato A (3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB)) e B (peróxido de hidrogênio) ficando escura (azuíada/esverdeada, 24) após ter reagido com partículas superparamagnéticas revestidas com GtxMs IgG FITC/RbtxGt IgG Fc HRP. Para interromper a reação, as partículas superparamagnéticas (25) são removidas da mistura reagente.

A Figura 17 representa um perfil de temperatura/tempo durante a PCR usando o método da presente invenção. Devido à baixa massa térmica do chip, que é de cerca de 0,5 g, é possível obter grande velocidade de aquecimento e resfriamento (± 20-50 K s"1).

A Figura 18 representa exemplos adicionais da realização de um processo na amostra biológica e/ou química em uma gotícula de fluido, que inclui mover a gotícula de fluido, unir a gotícula de fluido com uma gotícula de fluido adicional, misturar o interior da gotícula de fluido, lavar a gotícula de fluido por meio de outra gotícula de fluido, e dividir a gotícula de fluido em gotículas de fluido filhas (vide os Exemplos para detalhes). A Figura 19 ilustra um aparelho exemplificativo usando um estágio x,y para manipular as gotículas de fluido no método da presente invenção. Uma lâmina de vidro revestida com Teflon AF (fluorpolímero amorfo), fixada por fita, é movida em relação a um ímã permanente estático (A), que é posicionado em um estágio x, y, ζ (Β, em detalhes).

A Figura 20 ilustra o teor da solução de lavagem obtida por uma lavagem inicial (A) e uma solução de lavagem adicional obtida por uma lavagem adicional subseqüente (B) dos leucócitos ligados às partículas superparamagnéticas. A solução de lavagem adicional dificilmente contém eritrócitos. Ela ilustra a eficiência da lavagem com uma gotícula única para remover os eritrócitos, que é de aproximadamente cinco ordens de grandeza.

A Figura 21 ilustra o mecanismo do pirosequenciamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção oferece um método para o processamento de uma amostra biológica e/ou química. O método é adequado a qualquer processo, especialmente a um processo que possa ser realizado em um fluido numa escala miniaturizada (vide abaixo).

A amostra pode ser de qualquer origem. Ela pode, por exemplo, mas sem a isto se restringir, ser derivada de humanos, animais, plantas, bactérias, vírus, esporos, fungos ou protozoários, ou de materiais orgânicos ou inorgânicos de origem sintética ou biológica. Logo, qualquer uma das amostras seguintes selecionadas, mas sem se limitar, do grupo consistindo de amostra de solo, amostra de ar, amostra ambiental, amostra de cultura celular, amostra de medula óssea, amostra de precipitação pluviométrica, amostra de precipitação radioativa, amostra de água de esgoto, amostra de lençol aquático, amostra de abrasão, amostra arqueológica, amostra alimentícia, amostra de sangue, amostra de soro, amostra de plasma, amostra de urina, amostra de fezes, amostra de sêmen, amostra de fluido linfático, amostra de fluido cerebroespinhal, amostra de secreção nasofaríngea, amostra de escarro, amostra de esfregaço bucal, amostra de esfregaço da garganta, amostra de esfregaço nasal, amostra de lavagem broncoalveolar, amostra de secreção brônquica, amostra de leite, amostra de líquido amniótico, amostra de biópsia, amostra de câncer, amostra de tumor, amostra de tecido, amostra de células, amostra de cultura celular, amostra de lisado celular, amostra de cultura viral, amostra ungueal, amostra de cabelo, amostra de pele, amostra forense, amostra de infecção, amostra de infecção nosocomial, amostra de produção, amostra de preparação de fármaco, amostra de produção de molécula biológica, amostra de preparação de proteínas, amostra de preparação de lipídeos, amostra de preparação de carboidratos, amostra espacial, amostra extraterrestre ou qualquer combinação dos mesmos, pode ser processada no método. Quando desejado, uma respectiva amostra pode ter sido pré-processada a qualquer grau. Como exemplo ilustrativo, uma amostra de tecido pode ter sido digerida, homogeneizada ou centrifugada antes de ser usada com o dispositivo da presente invenção. A amostra pode, além disso, ter sido preparada na forma de um fluido, tal como uma solução.

Exemplos incluem, sem a isto se restringir: uma solução ou pasta semifluida de nucleotídeo, polinucleotídeo, ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, arninoácido, proteína, polímero sintético, composição bioquímica, composição química orgânica, composição química inorgânica, metal, lipídeo, carboidrato, produto químico combinado, molécula candidata a fármaco, molécula de fármaco, metabólito de fármaco ou qualquer combinação destes. Exemplos adicionais incluem, sem a isto se limitar: suspensão de um metal, suspensão de liga metálica, e solução de um íon metálico ou qualquer combinação destes, bem como uma suspensão de uma célula, um vírus, um microorganismo, um patógeno, um composto radioativo ou de quaisquer combinações destes= Deve-se entender que uma amostra pode também incluir qualquer combinação dos exemplos supracitados.

Muitas vezes, mas não necessariamente, a amostra incluirá, ou espera-se que a amostra inclua matéria-alvo ou um precursor desta. Tais concretizações deverão ser ilustradas por uma série de exemplos: A matéria-aivo pode, por exemplo, ser uma célula ou molécula adicionada ou incluída na amostra, e pode ser desejado obtê-la numa forma purificada ou enriquecida. Como outro exemplo, a matéria-alvo pode ser um composto conhecido ou que teoricamente pode ser obtido a partir de um composto precursor por meio de um processo químico. Neste caso, a amostra pode, por exemplo, incluir uma solução de tal composto precursor. Como outro exemplo, um meio de cultura celular pode estar suspeito de contaminação. Neste caso, o método da presente invenção pode ser utilizado para identificar o tipo de contaminante.

A matéria-alvo ou precursor desta pode, assim, ser de qualquer natureza. Exemplos incluem, mas sem a isto se limitar, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polinucleotídeo, um ácido nucléico, um peptídeo, um polipeptídeo, um aminoácido, uma proteína, um polímero sintético, uma composição bioquímica, uma glicoproteína, um composto radioativo, um polieletrólito, um policátion, um policatanion, um patógeno, uma composição química orgânica, uma composição química inorgânica, um lipídeo, um carboidrato, um produto químico combinado, uma molécula candidata a fármaco, uma molécula de fármaco, um metabólito de- fármaco, uma célula, um vírus, um microorganismo ou quaisquer combinações dos mesmos. Nas concretizações em que a matéria- alvo é, por exemplo, uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um ácido nucléico, um polinucleotídeo ou um oligonucleotídeo, ela pode conter uma marca de afinidade. Exemplos de marcas de afinidade incluem, sem a isto se limitar, dinitrofenol ou digoxigenina. Quando a matéria-alvo é uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo, exemplos adicionais de marca de afinidade incluem, mas sem a isto se limitar: oligohistidina (tal como marca penta ou hexahistidina), polihistidina, marca de ligação à streptavidina, tal como a STREP-TAGS®, descrita no pedido de patente US 2003/0083474, patente US 5,506,121 ou 6,103,493, um domínio de imunoglobulina, proteína de ligação à maltose, giutationa-S-transferase (GST), peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), peptídeo FLAG (por exemplo, da seqüência Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), o epítopo T7 (Ala- Ser-Met-Tbr-Giy-Gly-GIn-Gln-Met-Gly), proteína de ligação à maltose (MBP), o epítopo HSV da seqüência Gln-Pro-Glu-Leu- Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp da glicoproteína D do vírus da herpes simples, o epítopo da Glicoproteína do Vírus da Estomatite Vesicular (VSV-G) da seqüência Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn- Arg-Leu-Gly-Ly s, o epítopo da hemaglutinina (HA) da seqüência Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala e o epítopo "myc" do fator de transcrição c-myc da seqüência Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser- G1 U-Glu-Asp-Leu. Quando a matéria-alvo é um ácido nucléico, um polinucleotídeo ou um oíigonucleotídeo, uma marca de afinidade pode também ser uma marca de oíigonucleotídeo. Tal marca de oíigonucleotídeo pode, por exemplo, ser utilizada para hibridizar-se em um oíigonucleotídeo imobilizado com uma seqüência complementar. Uma respectiva marca de afinidade pode estar localizada dentro ou ligada a qualquer parte da matéria-alvo. Como exemplo ilustrativo, ela pode ser operavelmente fusionada ao terminal amino ou ao terminal carboxi de qualquer uma das proteínas exemplificativas supram encionadas.

No método da presente invenção, a amostra biológica e/ou química é incluída em uma gotícula de fluido, tal como uma gotícula líquida. Como exemplo ilustrativo, ela pode ser incluída em uma fase interna de tal gotícula de fluido (vide abaixo). Ela pode ser depositada na gotícula de fluida por qualquer meio (vide abaixo).

O método da invenção inclui proporcionar uma gotícula de fluido. Em uni aspecto adicional, a presente invenção também se refere a urna gotícula de fluido conforme descrita neste documento. Como ficará claro na descrição a seguir, uma gotícula de fluido, conforme descrita neste documento, funciona como uma câmara de reação virtual auto-organizável. A gotícula de fluido pode ser de qualquer volume desejado. Ela pode, por exemplo, ter um volume na faixa de cerca de 1 pl a cerca de lml, um volume ria faixa de cerca de 0,1 nl a cerca de 500 μΐ ou um volume na faixa de cerca de 100 nl a 100 μΐ. A manipulação de gotículas com volume acima de 1 ml no ar pode, em algumas concretizações, exigir adaptações adicionais no ambiente da gotícula. Sob esse aspecto, os versados na técnica estarão cientes de que ao utilizar uma gotícula de maior volume (tal como, por exemplo, de 2 ml), a respectiva gotícula pode se dividir em gotículas menores ao entrar em contato com uma superfície. Quando tal divisão for indesejada ao realizar o método da invenção, volumes adequados para uma gotícula de um fluido escolhido podem ser determinados facilmente por experimentação.

A gotícula de fluido inclui matéria capaz de ser magneticamente atraída. Geralmente, apenas uma fase da gotícula de fluido contém matéria capaz de ser atraída magneticamente, isto é, ou a fase externa ou interna da gotícula de fluido. Como exemplo ilustrativo, em algumas concretizações, um campo magnético, tal como um ferrofluido, pode ser incluído na gotícula de fluido. O ferrofluido pode ser encontrado para venda, por exemplo, na forma de uma suspensão coloidal de partículas capazes de serem magneticamente atraídas em subdomínio em um veículo líquido pela Ferrotec (Nashua, NH, U.S.A.). Um respectivo ferrofluido pode, por exemplo, ser baseado em um líquido apoiar e formar a fase externa de uma gotícula de fluido. Neste caso, a fase interna pode ser, por exemplo, uma solução aquosa. Como exemplo ilustrativo adicional, uma bactéria rica em ferro pode ser incluída em uma fase da gotícula de fluido. Muitas espécies bacterianas contêm ferro, pois é necessário para seu metabolismo. Um grande número delas, incluindo a Neisseria meningitidis e a N. gonorrhoeae, contém, por exemplo, sistemas de absorção de ferro por transferrina e/ou lactoferrina. Tais bactérias podem, em apenas certas concretizações, conter ferro o suficiente para serem utilizadas no método da presente invenção. Outras bactérias reduzem ou oxidam o ferro, e, portanto, contêm uma quantidade maior dele. Um exemplo ilustrativo de uma bactéria redutora de ferro (anaeróbica) é a Geohacter metallireducens. Essa bactéria pode ser tipicamente incluída em uma fase aquosa, seja ela a fase interna ou externa de uma gotícula líquida. Quando a fase externa da gotícula de fluido é, por exemplo, escolhida para ser um líquido apoiar, essa bactéria será geralmente incluída na fase interna de uma respectiva gotícula de fluido (vide também abaixo). Uma respectiva bactéria pode conter, por exemplo, por meio de técnicas de expressão recombinante, uma proteína de superfície que é capaz de atrair a matéria-alvo.

Como um exemplo ilustrativo ainda adicional, as partículas capazes de serem atraídas magneticamente podem ser incluídas na gotícula de fluido. Tais partículas podem ser capazes de atrair a matéria-alvo. Em algumas concretizações, as partículas magnéticas podem ser funcionalizadas com afinidade específica pela matéria-alvo e capturar a matéria-alvo, agindo, portanto, como meios de ligação (vide abaixo).

Por questões de conveniência, as partículas capazes de serem atraídas magneticamente são chamadas aqui de "partículas magnéticas" ou "contas magnéticas". As partículas magnéticas podem conter material diamagnético, ferromagnético, paramagnético ou superparamagnético. O material superparamagnético responde a um campo magnético com um campo magnético induzido sem uma magnetização permanente resultante. As partículas magnéticas baseadas em oxido de ferro podem ser encontradas para venda, por exemplo, como a Dynabeads® da Dynal Biotech, como MicroBeads magnéticas da Miltenyi Biotec, como contas de vidro porosas magnéticas da CPG Inc., assim como de várias outras origens, tal como a Roche Applied Science, a BIOCLON, a BioSource International Inc., a micromod, a AMBION, a Merck, a Bangs Laboratories, a Polysciences, ou a Novagen Inc., apenas para citas algumas. As nanopartículas magnéticas baseadas em Co e FeCo superparamagnético, bem como em nanocristais de Co ferromagnético, foram descritas, por exemplo, por Hütten, A. e col. (J. Biotecb. (2004), 112, 47-63).

As contas magnéticas podem ser projetadas para servir à função de atrair a matéria-alvo através da quimissorção, por exemplo, uma ligação covalente, ou físissorção, por exemplo, atração eletrostática. As partículas magnéticas usadas em tais concretizações podem oferecer uma superfície com afinidade por certa matéria, permitindo, por exemplo, a absorção/dessorção de proteínas, peptldeos, ácidos nucléicos e outros compostos. Exemplos incluem, mas sem a isto se limitar, atrações por meios físicos, tal como, por exemplo, empilham en to-π, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, van-der-Waals, cargas opostas ou ligação-Η, por exemplo, atrações por ligação entre anticorpo- antígeno, e atrações por afinidade formadas entre um ligante com atividade de ligação pela matéria-alvo e o alvo, tal como por exemplo, um ligante e um metal. Como dois exemplos ilustrativos adicionais, ligações físico-químicas, por exemplo, entre ouro e tiol, ou meios geométricos, por exemplo, exclusão de tamanho, pode ser empregadas. Diferentes áreas das mesmas partículas magnéticas ou diferentes também podem ser projetadas para atrair ou "capturar" a matéria-alvo.

Em algumas concretizações, as partículas magnéticas incluem um ligante que é capaz de ligar a matéria- alvo de ligação cuja inclusão é suspeita ou conhecida na amostra biológica e/ou química. Tal ligante pode, em algumas concretizações, ser capaz de ligar seletivamente tal matéria-alvo, tal como, mas sem a isto se limitar, um íon, um poliíon, um metal, DNA, RNA, uma proteína (incluindo um análogo sintético desta), células bacterianas, esporos, vírus, moléculas orgânicas de baixo peso molecular, ou compostos inorgânicos. Um respectivo ligante pode ser imobilizado na superfície da pelo menos uma partícula capaz de ser atraída magneticamente. A Fig. 5 representa esquematicamente um exemplo de ligação da matéria-alvo a um ligante imobilizado em uma partícula magnética. A matéria-alvo é um leucócito transportando um marcador de superfície celular (por exemplo, CD45/15). A partícula magnética inclui Y-Fe2O3, Fe3O4 e polistirol enxertado com polimetilmetacrilato, e nela é imobilizado um anticorpo direcionado contra o marcador de superfície celular (por exemplo, anti-CD45/15). A Figura 15 ilustra a ligação da matéria-alvo marcada, um anticorpo fluorescente, a uma partícula magnética.

Um respectivo ligante pode, por exemplo, ser baseado em hidrocarboneto (incluindo polimérico) e incluir grupos nitrogênio, fósforo, enxofre, carbeno, halogênio ou pseudohalogênio. Ele pode ser um álcool, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, uma amina, uma fosfina, um tiol, um dissulfeto, um alcano, um aminoácido, um peptídeo, um oligopeptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucléico, um lipídeo, um sacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Como exemplos adicionais, ele também pode ser um cátion, um ânion, um policátion, lira poliânion, um policátion, um eletrólito, um polieletrólito, um nanotubo de carbono, uma nanoespuma de carbono, uma partícula de sílica, uma partícula de vidro ou um alumosilicato. Geralmente, tal ligante tem maior afinidade pela matéria-aivo do que por outra matéria. Exemplos de um respectivo ligante incluem, mas sem a isto se limitar, um éter coroa, um anticorpo, um fragmento deste e uma molécula de ligação proteinácea com funções similares à de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpos (recombinantes) são os fragmentos Fab, os fragmentos Fv, os fragmentos Fv de cadeia simples (scFv), diacorpos ou anticorpos de domínio (Holt, LJ e col., Trends Biotechnol. 21(11), 2003, 484-490). Um exemplo de molécula de ligação proteinácea com funções similares à de um anticorpo c uma muteína (proteína modificada por engenharia genética) baseada em um polipeptídeo da família lipocalina. Refira-se, por exemplo, a Beste e col., Proc. Natl. Acad. Sei. IJSA 96, 1999, 1898-1903 e WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255 ou WO 2005/019256. As IipocaHnas descritas nessas referências, tal como a proteína de ligação à bilina, a lipocalina associada à gelatinase de neutrofiIos humanos, a Apolipoproteína D humana, a lipocalina da lágrima humana, ou glicodelina, possui sítios de ligação ao ligante naturais que podem ser modificados de modo que eles se liguem as pequenas regiões protéicas selecionadas, conhecidas como haptenos Outros exemplos não limitantes de moléculas de ligação proteinácea adicionais são os chamados glucorpos (vide a WO 96/23879), proteínas baseadas no esqueleto da anquirina (Hryniewicz- Jankowska, A e col., Folia Histochem. Cytobiol. 40, 2002, 239- 249) ou no esqueleto cristalino (WO 01/04144) as proteínas descritas em Skerra, J MoL Recognit 13, 2000, 167-187 e os avímeros. Os avímeros contêm os chamados domínios-A que ocoiTem na forma de cadeias de múltiplos domínios em vários receptores de superfície celular (Silverman, J, e col., (2005) Nature Biotechno Iogy, 23, 1556-1561). Outros exemplos de um ligante adequado incluem, mas sem a isto se limitar, uma estrutura molecular impressa, uma matriz extracelular, uma lectina, proteína A, proteína G, um metal, um íon metálico, derivados do ácido nitrilo triacético (NTA), motivos protéicos RGD, dextranos, polieti leneimina (PEÍ), polieletrólitos, redoxpolímeros, glicoproteínas, aptâmeros, enzimas, um corante, streptavidina, amilose, maltose, celulose, quitina, glutationa, calmodulina, gelatina, polimixina, heparina, NAD, NADP, lisina, arginina, benzimidina, poli U ou oligo-dT. Lectinas, como a ConcavaSina A, são conhecidas por se ligarem aos polissacarídeos e às proteínas glicosiladas. Um exemplo ilustrativo de um corante é o corante triazina, tal como o azul F3G-A (CB) ou Vermelho ΗΕ-3Β de Cibracron, que se liga especificamente às enzimas dependentes do NADH. O Verde A se liga às proteínas Côa, à soroalbumina humana e às desidrogenases. Os corantes 7- aminoactinomicina D e 4',6-diamidino-2-fenilindol se ligam ao DNA. Cátions de metais, tais como Ni, Cd, Zn, Co ou Cu5 são geralmente usados para ligar marcas de afinidade, tal como uma seqüência contendo oligohistidina, incluindo a hexahistidina ou a marca His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys (marca ΜΑΤ), o hexapeptídeo His-Ser-Gln-Lys-Val-Phe (cádmio de ligação) e éster metílico de N-metacriloil-(L)-cisteína. Além disso, uma partícula magnética pode ser revestida com um agente modiflcante que aumenta ainda mais a afinidade do substrato para qualquer ou uma certa, classe, etc., de matéria-alvo.

Em algumas concretizações, a matéria-alvo é uma molécula cuja presença é suspeita ou conhecida dentro de outra matéria (indesejada), da qual ela precisa ser extraída. A extração de uma molécula a partir de um organismo, de uma parte de um organismo ou de um embrião pode, por exemplo, incluir o uso de um composto que facilita a transferência de uma molécula desejada a partir de um organismo ou uma parte deste para um fluido. Um exemplo ilustrativo de uma extração de uma molécula a partir de uma parte de um organismo é uma extração de proteínas (inteiramente ou parcialmente) integradas na membrana celular. Muitas vezes se deseja transferir tais proteínas para uma solução aquosa para processamento adicional. Um composto que facilita a transferência de tais proteínas para uma solução aquosa é um detergente. A colocação de uma membrana celular respectiva com uma solução aquosa, à qual é adicionado um detergente, tipicamente resultará numa extração das proteínas da membrana.

Quando partículas magnéticas são utilizadas, elas podem ao mesmo tempo agir como veículo para a matéria- alvo, ou como alternativa, elas mesmas agirem como uma marca ou amplifícador no contexto de tecnologias de sensor. Exemplos incluem, mas sem a isto se limitar, magnetorresistência gigante (GMR) [Chiriac, H, e col., (2005) Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293, 671-676], espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS), ressonância de plásmon intensificada pela superfície (eSPR) e eletroforese capilar bidimensional. Como exemplo ilustrativo, a matéria-alvo pode ser ligada a ligantes imobilizados em diferentes partículas magnéticas em uma gotícula de fluido de acordo com a presente invenção. Por meio de ligantes de maior afinidade, estejam eles ligados em uma fase estacionária, em solução, ou de outra maneira a matéria- alvo pode ser separada junto com as partículas magnéticas ligadas a ela. Quando as partículas magnéticas são expostas a um campo magnético, elas desenvolvem um campo dipolar. Esse campo dipolar pode ser detectado por um sensor dipolar. Ao quantificar a amplitude da impedância do sensor, a quantidade de matéria-alvo pode ser quantificada.

A gotícula de fluido inclui também uma fase interna e uma fase externa. A fase externa encontra-se circundando a fase interna. Em algumas concretizações, a fase externa é uma fase de enchimento que acomoda a fase interna. Em outras concretizações, a fase externa está circundando a fase interna como uma película. O fluido da fase externa pode ser um líquido ou um gás. O fluido da fase interna é geralmente um líquido.

Nas concretizações em que a fase externa é uma película, ela tipicamente tem um volume na faixa de várias grandezas abaixo até várias grandezas acima do volume da fase interna. A razão de volume da fase interna para a externa pode ser escolhida, por exemplo, na faixa de cerca de 1000:1 a cerca de 1:1000, tal como a faixa de cerca de 10:1 a cerca de 1:10. Como exemplo, para aplicações envolvendo uma ou mais gotículas líquidas à temperatura ambiente, pode ser desejado escolher uma grande razão de volume da fase interna para a fase externa, por exemplo, urna razão de cerca de 1000:1. Para aplicações envolvendo uma ou mais gotículas líquidas na faixa de cerca de 100 0C, pode ser desejado escolher uma baixa razão de volume da fase interna para a externa, por exemplo, uma razão de cerca de 1:1000. Em algumas concretizações, uma respectiva película é também de espessura uniforme. Em outras concretizações, a película inclui irregularidades, tal como um cone. Respectivas interfaces irregulares são, por exemplo, conhecidas para interfaces entre a água e alguns líquidos iônicos, tal como hexafluorfosfatos octilsubsstituídos. A fase externa é imiscível com a fase interna. Tipicamente, o fluido da fase externa é imiscível com o fluido da fase interna. Qualquer fluido pode ser utilizado para a respectiva fase, contanto que ele seja (a) imiscível com a fase externa, de modo que duas fases separadas possam se formar, e (b) o fluido não impeça o processo desejado de ser realizado. Um exemplo ilustrativo de dois gases imiscíveis são o hélio e o dióxido de carbono, que geralmente formam duas fases imiscíveis em faixas de composição estendidas, contanto que a temperatura esteja abaixo do ponto crítico da mistura binária e a pressão esteja acima da pressão de vapor do dióxido de carbono líquido puro. O processo é tipicamente realizado na fase interna (vide também abaixo). Assim, um fluido selecionado pode ser de qualquer propriedade. No caso de uma fase for selecionada como sendo um líquido ou gás, ela pode ser, por exemplo, um líquido ou gás polar ou apoiar, respectivamente. Geralmente, os líquidos são classificados em líquidos polares e apolares de modo a caracterizar propriedades tais como a solubilidade e a miscibilidade com outros líquidos. Os líquidos polares tipicamente contêm moléculas com uma distribuição irregular de densidade de elétrons. A mesma classificação pode ser aplicada aos gases. A polaridade de uma molécula é refletida por sua constante dielétrica ou seu momento dipolar. As moléculas polares são tipicamente adicionalmente classificadas em moléculas próticas e não-próticas (ou apróticas). Um fluido, por exemplo, um líquido que contém em grande proporção moléculas próticas polares pode, portanto, ser chamado de fluido prótico polar. Um fluido, por exemplo, um líquido que contém em grande proporção moléculas não-próticas polares pode ser denominado fluido não-prótico polar. As moléculas próticas contêm um átomo de hidrogênio que pode ser um hidrogênio ácido quando a molécula é dissolvida, por exemplo, em água ou álcool. As moléculas apróticas não contêm tais átomos de hidrogênio.

Exemplos de líquidos apolares incluem, mas sem a isto se limitar, hexano, heptano, ciclohexano, benzeno, tolueno, diclorometano, teíracloreto de carbono, dissulfeto de carbono, dioxano, éter dietíüco ou diisopropiléter. Exemplos de líquidos apróticos dipolares são metil etii cetona, clorofórmio, tetra idro for ano, éter monobutílico de etileno glibol, piridina, metil isobutil cetona, acetona, ciclohexanona, acetato de etila, isobutirato de isobutila, etileno glicol diacetato, dini eti 1 formam ida, acetonitrilo, Ν,Ν-dimetil acetamida, nitrometano, acetonitrilo, N-metiipirrolidona, metanol, etanol, propanoL isopropanol, butanol, N5N-d i i sopropri Ieti Iam i na e sulfóxido de dimetila. Exemplos de líquidos próticos polares são a água. o metanol, o isopropanol, o álcool ter-butílico, o ácido fórmico, o ácido clorídrico, o ácido sulfórico, o ácido acético, o ácido trifluoracético, o ácido dimetilarsínico [(CH3)2AsO(OH)], acetonirila, fenol ou clorofenol. Os líquidos iônicos geralmente têm um cátion orgânico e um ânion, que podem ser tanto orgânicos quanto inorgânicos. A polaridade dos líquidos iônicos (vide abaixo para exemplos) é conhecida por ser determinada em grande parte pelo ânion associado. Enquanto que, por exemplo, os haletos, pseudohaletos, BF4", sulfato de metila, NO3" ou ClO4" são líquidos polares, os hexafluorfosfatos, AsF6", bis(perfluoralquil)- imidas e [C4F6SO3]" são líquidos apolares. Cada fase também pode conter mais de um fluido. Se, por exemplo, mais de um líquido for usado para a fase interna ou externa, a mistura selecionada dos líquidos ainda é capaz de formar uma fase separada a partir da respectiva outra fase da gotícula, e os líquidos são geralmente miscíveis um com o outro na razão escolhida. Como exemplo ilustrativo, a amônia, um gás polar, se dissolve imediatamente na água, um líquido polar, de modo que esses dois fluidos podem ser incluídos em uma fase comum.

Duas fases imiscíveis podem, por exemplo, ser obtidas quando um fluido polar, tal como um fluido hidrófilo (vide abaixo) é selecionado para uma fase e o fluido apoiar, tal como um líquido hidrófobo, é selecionado para a outra fase. Como exemplo ilustrativo, o dióxido de carbono (CO2), um gás apoiar, não se dissolve (exceto em quantidades vestigiais) na água, um líquido polar. Sob certas circunstanciais, tal como sob pressão aumentada, o dióxido de carbono pode, no entanto, ser dissolvido na água (vide, por exemplo, bebidas carbonatadas). Em algumas concretizações, o fluido da fase interna pode ser um líquido polar e o fluido da fase externa da gotícula de fluido pode ser um líquido apoiar. Líquidos polares adequados incluem, mas sem a isto se limitar, água, óxido de deutério, óxido de trício, um álcool, um ácido orgânico (incluindo um sal deste), um ácido inorgânico (incluindo um sal deste), um éster de um ácido orgânico, um éster de um ácido inorgânico, um éter, uma amina (incluindo um sal desta), uma amida, um nitrilo, uma cetona, um detergente iônico, um detergente aniônico, dióxido de carbono, sulfona dimetílica, sulfóxido de dimetila, um tiol, um dissulfeto e um líquido iônico polar. Líquidos apolares adequados incluem, mas sem a isto se limitar, um óleo mineral, um óleo de silicone, um óleo natural, um líquido de carbono perfiuorado, um líquido de carbono parcialmente halogenado, por exemplo, fluorado, um alcano, um alceno, um alcino, um cicloalcano, um composto aromático, dissulfeto de carbono e um líquido iônico apoiar.

Como exemplo ilustrativo, o fluido da fase interna da gotícula de fluido pode ser um líquido hidrófilo e o fluido da fase externa da gotícula de fluido pode ser um líquido hidrófobo. Os líquidos hidrófilos, também chamados de lipofílicos, contêm moléculas que podem formar interações dipolo-dipolo com moléculas de água e, dessa forma se dissolver nelas. Os líquidos hidrófobos, também chamados de lipofóbicos, têm a tendência de se separar da água. Exemplos de líquido hidrófilo incluem, sem restrição, água, acetona, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, tetraidrofurano, piridina, clorofórmio, éter monobutílico de etileno glicol, piridina, acetato de etila, acetonitrila, dimetilformamida, Ν,Ν-dimetil acetamida, N-metilpirrolidona, ácido fórmico, formamida e um líquido iônico polar. Exemplos de um líquido iônico polar incluem, sem a isto se limitar, 1-etil-3-metilimidazólio tetrafluorborato, N-butil-4- metilpiridínio tetrafluorborato, 1,3-dialquilimidazólio- tetrafluorborato, 1,3-dialquilimidazólio-hexafluorborato,

bis(pentafluoretil)fosfinato de l-etil-3-metilimidazólio, l-butil-3- metilimidazólio tetracis(3,5-bis(trifluormetilfenil)borato,

tetrabutil-amônio bis(trifluormetil)-imido, trifluormetanosulfonato de etil-3-metilimidazólio, octilsulfato de 1-butil-3-metilimidazólio metilsulfato, 1-n-butil-3-metilimidazólio ([bmim]), and tetrafluorborato de 1-n-buril-3-metilimidazólio. Exemplos de líquido apoiar incluem, mas sem a isto se limitar, óleo mineral, hexano, heptano, ciclohexano, benzeno, tolueno, diclorometanol, clorofórmio, tetracloreto de carbono, dissulfeto de carbono, dioxano, éter dietílico, éter diisopropílico, metil propil cetona, metil isoamil cetona, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutil isobutirato, etileno glicol diacetato e um líquido iônico apoiar. Exemplos de líquidos iônicos apolares incluem, mas sem a isto se limitar, 1-etil-3-metilimidazólio bis[(trifluormetil)-sulfonil] amida bis(triflil)amida, trifluoracetato de 1-etil-3-metilimidazólio bis[(trifluormetil)-sulfonil]amida, hexafluorfosfato de 1-butil-3- metilimidazólio, 1 -hexil-3-metilimidazólio bis(trifluormetilsulfonil)imida, l-butil-3-metilimidazólio bis- (trifluormetilsulfonil)imida, trihexil(tetradecil)fosfônio bis[oxalato(2-)]borato, 1 -hexil-3-metil imidazólio tris(pentafluoretil)trifluorfosfato, hexafluorfosfato de 1-butil-3- metilimidazólio, tris(pentafluoretil)trifluorfosfato, trihexil- (tetradecil)fosfônio, N"-etil-N,N,N',N'-tetrametilguanidínio, trifluorfosfato de 1-butil-1-metil pirrolidínio tris(pentafluoretil), 1 -butil-1 -metil pirrolidínio bis(trifluorometilsulfonil)imida, imidazólio hexafluorfosfato de l-butil-3-metila, l-etil-3- metilimidazólio bis(trifluormetilsulfonil)imida e l-n-butil-3- metii-imidazólio.

Uma fase da gotícula de fluido pode incluir matéria adicional, por exemplo, dissolvida, emulsificada ou suspensa nela. Como exemplo ilustrativo, quando uma fase aquosa é utilizada, ela pode incluir um ou mais compostos tampão. Diversos compostos tampão são usados na técnica e podem ser usados para realizar os vários processos descritos neste documento. Exemplos de tampões incluem, mas sem a isto se limitar, soluções de sais de fosfato, carbonato, sucinato, citrato, acetato, formato, barbiturato, oxalato, lactato, ftalato, maleato, cacodilato, borato, N-(2-acetamido)-2-amino-etanesuIfonato (também chamado de (ACES), ácido N-(2~hidroxietil)~ peperazina-N'-2-etanosulfònico (também chamado de HEPES), ácido 4-(2-hidroxietil)-l -piperazina-propanosulfônico (também chamado de HEPPS), piperazina-l,4-bis(2-ácido etanosulfônico) (também chamada de PIPES), ácido (2-[Tris(hidroximetil)- metilamino]-l-etansulfônico (também chamado de TES), ácido 2- ciclohexilamino-etansulfônico (também chamado de CHES) e N- (2-acetamido)-iminodi acetato (também chamado de ADA). Qualquer contra-íon pode ser utilizado nesses sais; amônio, sódio, e potássio podem servir de exemplos ilustrativos. Outros exemplos de tampões incluem, mas sem a isto se limitar, trietanolamina, dietanolamina, etilamina, trietilamina, glicina, glicilglicina, gistidina, tris(hidroximetil)aminomeanol (também chamado de TRIS), bis-(2-hidroxietil)-imino-

tris(hidroximetil)metanol (também chamado de BIS-TRIS) e N- [Tris(hidroximetil)-metil]-glicina (também chamado de TRICINE), para citar alguns. Os tampões podem ser soluções aquosas de tais compostos ou soluções tampão em um solvente orgânico polar adequado. Como exemplo ilustrativo, um tampão pode ser depositado na forma sólida, por exemplo, seco por congelamento. Em tal caso, o tampão sólido, por exemplo, um pó, pode ser dissolvido em uma fase aquosa por união e/ou mistura, por exemplo, auxiliada ou realizada por meio de ultra-som. Em tal caso, a quantidade de volume de uma respectiva fase aquosa utilizada pode, por exemplo, ser utilizada para obter a concentração de tampão final desejada.

Outros exemplos de matéria incluída em uma fase da gotícula de fluido incluem, mas sem a isto se limitar, reagentes, catalisadores e reagentes, para realizar um processo químico ou biológico. Como exemplo ilustrativo, sais, substratos ou detergentes podem ser adicionados a fim de manter as células ou proteínas num estado intacto. Como exemplo ilustrativo adicional, compostos quelantes podem ser necessários, por exemplo, para proteger os organismos contra vestígios de sais tóxicos ou para aumentar o rendimento de uma reação química. Como exemplos ilustrativos ainda adicionais, inibidores da protease, da RNase ou da DNase podem ser adicionados de modo a manter as proteínas, o RNA ou o DNA no estado intacto. Um exemplo adicional de um possível aditivo para uma fase da gotícula de fluido inclui partículas que podem ser atraídas magneticamente (vide acima).

A fase interna da gotícula de fluido é protegida do ambiente pela fase externa. A fase externa pode, dessa forma, agir, por exemplo, como uma barreira ou vedação. O termo "ambiente" refere-se a qualquer fluido ou matéria sólida, tal como por exemplo, um gás (de qualquer densidade ou pressão desejada) ou um líquido que não faça parte da fase interna, da fase externa ou de uma superfície, na qual a gotícula de fluido é disposta. Como exemplo ilustrativo, a fase externa pode impedir ou reduzir a evaporação da fase interna ao ar circundante. Como exemplo adicional, a fase externa pode proporcionar uma barreira em termos de contato ou difusão etc. A fase externa pode, por exemplo, impedir o contato com matéria sólida, tal como partículas de areia ou poeira, ou com fluidos que seriam miscíveis com a fase interna da gotícula de fluido. A fase externa da gotícula também pode oferecer acesso de energia, tal como a radiação eletromagnética de certo comprimento de onda à fase interna. A fase externa também pode servir para proteger uma superfície na qual a gotícula de fluido é posicionada contra a contaminação com componentes da fase interna da gotícula de fluido. Além do mais, a fase externa pode permitir que uma amostra, tal como um líquido do corpo, por exemplo, sangue, escarro, etc., se mova em uma superfície apoiar (por exemplo, PTFE). Em algumas concretizações, a fase externa também pode manter a esterilidade da fase interna, mesmo quando a gotícula de fluido como um todo está sendo manipulada ou exposta a condições não estéreis. A fase externa pode também permitir o contato e fusão com outra gotícula de fluido que inclua duas fases de polaridades similares (por exemplo, hidrofobicidades similares). Como exemplo, quando a fase externa é um líquido hidrófobo e a fase interna é um líquido hidrófilo, a fase externa pode ser capaz de se mesclar com a fase externa de uma gotícula de fluido adicional que é hidrófila e circunda uma fase interna que é hidrófila. Em tal caso, pode ocorrer uma fusão espontânea das gotículas exempiificativas.

A gotícula de fluido pode ser obtida por qualquer meio. A formação da gotícula de fluido inclui obter o fluido da fase interna, obter o fluido da fase externa e obter a amostra. A gotícula de fluido que inclui duas fases, conforme utilizada na presente invenção, é um sistema autoorganizável, cuja formação é conduzida pela energia superficial. Sendo assim, a fase interna ou a fase externa, ou a amostra, pode ser obtida numa primeira etapa, numa segunda etapa ou numa etapa final. Como alternativa, qualquer uma ou mais (ou partes) dentre a fase interna, a fase externa ou a amostra podem ser obtidas simultaneamente. Como exemplo ilustrativo, a formação da gotícula de fluido pode incluir obter um primeiro fluido e obter um segundo fluido que é imiscível com o primeiro fluido. A formação da gotícula de fluido também pode incluir dispensar uma alíquota, por exemplo, uma gotícula, do primeiro fluido sobre o segundo fluido, desse modo formando uma ou mais gotícula(s) de fluido do primeiro fluido circundado pelo segundo fluido, formando assim uma ou mais gotículas de fluido compreendendo uma fase interna e uma fase externa. Em algumas concretizações, a formação da gotícula de fluido também pode incluir coletar a gotícula do referido primeiro fluido, ou parte dele, do referido segundo fluido que está formando a fase externa. Neste caso, pode ser formada uma gotícula que inclui uma fase externa circundando a fase interna como uma película. Em algumas concretizações, uma gotícula maior inicial pode ser formada formando uma gotícula de fluido do primeiro fluido no segundo fluido. Nessas concretizações, a partir dessa gotícula maior inicial, várias gotículas menores podem então ser coletadas. Devido ao fato de a gotícula de fluido ser um sistema autoorganizável, geralmente não há meios adicionais necessários para obter o respectivo posicionamento de um volume inicial.

Sob esse aspecto, a presente invenção também se refere a um método para formar uma gotícula de fluido conforme definido acima. O método inclui formar uma gotícula de fluido como justamente descrito, isto é, obtendo dois fluidos imiscíveis um com o outro, colocando o primeiro fluido e o segundo fluido em contato, formando assim uma gotícula de fluido de um primeiro fluido circundado por um segundo fluido (supra). Em uma concretização do método, a colocação do primeiro fluido em contato com o segundo fluido inclui dispensar uma gotícula do primeiro fluido no segundo fluido. Em algumas concretizações, o método também pode incluir coletar a gotícula do primeiro fluido do segundo fluido, formando assim uma gotícula de fluido que inclui uma fase interna e uma fase externa, a última circundando a fase interna como uma película. O primeiro fluido forma a fase interna, o segundo fluido a fase externa. O método inclui ainda obter pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente, a qual inclui um ligante capaz de se ligar à matéria-alvo (supra). O método também inclui dispor a pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente no primeiro fluido formando a fase interna da gotícula de fluido. Conforme indicado acima, a pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente pode ser disposta no primeiro ou no segundo fluido a qualquer momento durante esse método, uma vez que a gotícula de fluido é um sistema autoorganizável. Uma partícula magnética pode, por exemplo, ser disposta na gotícula, por exemplo, no primeiro fluido, antes de a gotícula do primeiro fluido ser dispensada no segundo fluido.

Como mencionado acima, a fase interna da gotícula pode entrar diretamente em contato com a matéria que está incluída em pelo menos uma superfície na qual a gotícula será ou pretende ser disposta. Dois exemplos ilustrativos de tal matéria são uma superfície sólida ou a superfície de um fluido. A pelo menos uma superfície pode ter qualquer forma e geometria, contanto que ela tenha uma, por exemplo, áspera e ondulada, tal que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com ela. Como exemplo ilustrativo, será geralmente necessário proporcionar uma superfície com uma aspereza para o fluido da fase interna da gotícula de fluido que seja suficientemente baixa para permitir que uma gotícula de fluido que entra em contato com a mesma permaneça intacta. O termo "intacto" refere-se à existência de uma gotícula definida incluindo duas fases. Assim, entende-se que a gotícula de fluido permanece intacta, enquanto é, por exemplo, espalhada ao nível desejado, ou unida à outra gotícula. A pelo menos uma superfície pode, por exemplo, ser côncava ou convexa arredondada (vide Figuras ID e 1E) ou uma combinação destes (Fig. 4C). Em uma concretização, a pelo menos uma superfície é essencialmente plana (vide, por exemplo, Figuras IA- 1C). Em outra concretização, a pelo menos uma superfície tem a forma de um cilindro, ao longo da qual uma gotícula pode ser rotacionada.

O método da presente invenção inclui obter pelo menos uma superfície, tal como descrito acima. Em algumas concretizações, mais de uma superfície é proporcionada, tal como, por exemplo, duas, três, quatro, etc. Em uma concretização, pelo menos duas superfícies estão de frente uma para a outra. A(s) superfície(s) podem ser feitas de qualquer material, contanto que ela tenha tal molhabilidade para o fluido da fase interna da gotícula de fluido que a gotícula de fluido permaneça intacta ao entrar em contato com ela(s). Em uma concretização, quando mais de uma superfície é proporcionada, por exemplo, duas superfícies de frente uma para a outra, todas as respectivas superfícies tem uma textura e molhabilidade tal para o fluido da fase interna que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com elas.

Quando, por exemplo, a fase interna da gotícula de fluido é um líquido polar, tal como um fluido aquoso, a pelo menos uma superfície pode ser apoiar. Em uma concretização, a fase interna da gotícula de fluido é um fluido aquoso, por exemplo, água, e a pelo menos uma superfície é apoiar. Uma respectiva superfície apoiar pode, em algumas concretizações, ser selecionada dentre o grupo consistindo de silicone (incluindo silicone de superfície modificada), um polímero tal como plástico (seja ele um biopolímero ou um polímero sintético, incluindo um polímero parcialmente fluorado, um polímero perfluorado e um polímero de superfície modificada), óxido de silício de superfície modificada, hidreto de silício de superfície modificada, papel de superfície modificada, vidro de superfície modificada, tal como, por exemplo, pyrex de superfície modificada, quartzo de superfície modificada, mica de superfície modificada, metal de superfície modificada, liga de superfície modificada, óxido metálico de superfície modificada, cerâmica de superfície modificada e qualquer composto destes. Como exemplo ilustrativo adicional, a fase interna da gotícula de fluido pode ser hidrófila e a pelo menos uma superfície pode ser hidrófoba ou oleofóbica. Como ainda outro exemplo ilustrativo, a fase interna da gotícula de fluido pode ser apoiar e a pelo menos uma superfície pode ser polar. Uma modificação de superfície é tipicamente obtida por um tratamento realizado para alterar as características de uma superfície sólida. Tal tratamento pode incluir vários meios, tais como meios físicos, por exemplo, mecânicos, térmicos ou elétricos, meios químicos, ou meios eletroquímicos. Como exemplo, uma superfície de materiais plásticos pode se tornar hidrófila via um tratamento com ácido sulfurico diluído, ácido crômico, uma solução de permanganato de potássio ou ácido nítrico diluído. Como outro exemplo, uma superfície de polidimetilsiloxano (PDMS) pode transformada em hidrófila por oxidação com oxigênio ou plasma de ar. A superfície de um polímero hidrófobo, tal como polimetilmetacrilato, politetraíluoretileno, tereftalato de polietileno e policarbonato, também pode ser transformada em hidrófila por meio de radiação iônica na presença de um gás reativo, conforme descrito por Kim e col. (2003 ECI Conference on Heat Exchanger Fouling and Cleaning: Fundamentais and Applications [2003], Vol. RP1, 107- 114). O silício pode ser transformado em hidrófilo por imersão em H2O/H2O2/NH4OH. Além do mais, as propriedades de superfície de qualquer superfície hidrófoba podem se tornar mais hidrófilas por revestimento com monocamadas autoorganzáveis hidrófilas, um polímero hidrófilo ou por tratamento com surfactantes ou tratamento com plasma com precursores poliméricos.

Quando um método de acordo com a presente invenção está para ser combinado com outro método, tal como um método analítico ou preparativo (vide também abaixo), pode ser desejado proporcionar uma superfície que permita, ou que seja vantajosa para realizar tanto tal método adicional quanto o método de acordo com a presente invenção. Durante, ou antes da realização de tal método adicional, a integridade das duas fases da gotícula de fluido pode ser afetada ou degradada. Como conseqüência, a matéria que está localizada na fase interna da gotícula de fluido pode ser exposta à outra fase de fluido e entrar em contato com a superfície. A disponibilidade das várias fases internas e externas adequadas para a gotícula de fluido utilizada na presente invenção geralmente possibilita uma seleção flexível de um tratamento químico de superfície, incluindo um revestimento. Portanto, normalmente é possível utilizar a mesma superfície tanto durante o método da presente invenção quanto em um método subseqüente.

Como exemplo ilustrativo, pode ser desejado realizar uma separação eletroforética ou uma focalização isoelétrica, por exemplo, submetendo as partículas magnéticas, quer estejam elas incluídas da gotícula de fluido utilizada na presente invenção, ou não, ao referido processo. Pode ser desejado, por exemplo, obter uma superfície com interações mínimas para qualquer matéria presente, que seja detectável pelo método selecionado. Quando for desejado, por exemplo, analisar a pureza de uma proteína isolada aplicando-se um campo eletromagnético (tal como um método eletroforético), os resultados da análise podem ser falsificados por uma superfície que interage de forma significativa com as proteínas. Dois exemplos ilustrativos de um revestimento de superfície adequado com o mínimo de interações protéicas são o polímero polar poli- N-hidroxietilacrilamida e alquiltriclorosilano terminado em poli(etileno glicol). Também é similarmente sabido que as propriedades de uma superfície de um dispositivo usado para focalização isoelétrica afetam a eficiência na obtenção de regiões estreitas isoladas tanto durante os processos de focalização quanto de mobilização. Exemplos de tratamentos de superfície que podem ser usados para obter uma alta separação usando um gradiente de pH na focalização isoelétrica incluem, mas sem a isto se limitar, um revestimento polimérico altamente polar tal como poliacrilamida, polivinilpirrolidona, polietileno glicol, álcool polivinílico ou um revestimento de fluorcarbono.

Exemplos de tratamento químico de superfície incluem, mas sem a isto se limitar, exposição ou reação com hexametildisilazano, anidrido 2-hidroxi-4-(3-trietóxi- sililpropóxi)difenilcetona, 3-trietoxisilil)propilsuccínicco, 2- [metoxi(poli-etileneoxi)propil]trimetoxisilano, (heptadecafluor- 1,1,2,2-tetrahidrodecil)trietoxi-silano, (tridecafluor-1,1,2,2- tetrahidroocril)trietoxisilano, (heptadecafluor-1,1,2,2- tetrahidrodecil)tricloro-silano, (tridecafluor-1,1,2,2- tetrahidrooctil)triclorosilano, metacroiloximetiltris(trimetilsiloxi)silano, PlusOne™ Repel- Silane ES (solução de 2% de dimetildiclorosilano dissolvida em octametil ciclo-octasilano, GE Healthcare), SIGMACote® (um organopolisiloxano clorinado em heptano), 3-mercapto- propiltrimetoxisilano, octadecilsiiano, octadeciltrimetoxisilano, epoxipropoxipropil-trimetoxisilano, 2- (difenilfosfmo)etiltrietoxisilano, bis(2-hidroxietil)-3-aminopropil- trietoxisilano, aminobutiltrietoxi silano, (3- acriloxipropil)trimetoxi silano, trimetilclorosilano, dimetildiclorosilano, propiltriclorosilano, tetraetoxisilano, glicidoxipropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrietoxisilano, 2- (3,4-epoxi ciclohexil)etiltrimetoxisilano, 3-(2,3-epoxi propoxil)propiltrimetoxisilano, polidimetilsiloxano (PDMS), γ- (3,4-epoxiciclohexil)etiltrimetoxisilano, poli(metil metacrilato) ou um copolímero de polimetacrilato, uretano, poliuretano, fluorpoliacrilato, Teflon AF 1600, 2400 e 2200, poli(ácido acrílico) (PAA), poli(metoxi polietileno glicol metacrilato), poli(dimetil acrilamida), poli N-acroil-arninoetoxietanol (AAEE), poliacrilamida enxertada com benzofenona e Pluronic-F-68 (Li e col., Electrophoresis 2005, 26, 1800-1806), poli[N-(2- hidroxipropil)metacrilamida] (PHPMA), a-fosforilcolina-o-(N,N- dietilditiocarbamil)undecil oligoDMAAm-oligo-STblock co- oligômero (vide, por exemplo, Matsuda, T e col., Biomaterials, (2003), 24, 4517-4527), poli(3,4-epoxi-l-buteno), 3,4-epoxi- ciclohexilmetilmetacrilato, 2,2-bis[4-(2,3-epóxi propóxi)fenil]propano, 3,4-epóxi-ciclohexilmetilacrilato, carboxilato de (3',4'-epoxiciclohexilmetil)-3,4-epoxiciclohexila, di-(3,4-epoxiciclohexilmetil)adipato, um copolímero de polietilnoglicol e polipropilenoglicol, tal como UCON (Analabs, Norwalk, CT, USA), bisfenol A (2,2-bis-(p-(2,3-epóxi propóxi) fenil) propano), 2,3-epóxi-1-propanol, álcool polivinílico, piiTolidona polivinílica, dextrano, surfactantes tal como o hidróxido de dodecildimetil (3-sulfopropil) amônio (C12N3SO3), hidróxido de hexadecildimetil (3-sulfopropil) amônio (C16N3SO3), e coco (amidopropil)hidroxil dimetilsulfobetaína (RCONH(CH2)3N+(CH3)2CH2CH(OH)CH2SO3- com R=C8-C18), incluindo um surfactante polimérico tal como, por exemplo, o Supelcoat PS2 (Supelco, Bellefonte, PA, USA), metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose ou hidroxipropilmethilcelulose. Um revestimento com um polímero pode, por exemplo, ser realizado por meio de deposição química de vapor ou por polimerização na superfície, seguido da exposição da superfície a um reagente bifuncional, conforme revelado no pedido de patente US 2005/0249882. No último caso, gera-se uma ligação covalente estável entre a superfície e o revestimento polimérico. Pode ser desejado, por exemplo, escolher essa técnica nas concretizações em que a superfície é áspera ou contém micro ou nanocavidades.

Além do mais, a pelo menos uma superfície pode proporcionar áreas com diferentes características de superfície. No exemplo ilustrativo anterior de uma fase interna da gotícula de fluido sendo um líquido polar (por exemplo, hidrófilo), algumas áreas da superfície podem, por exemplo, serem menos polar (por exemplo, hidrófobas) do que outras, ou algumas regiões podem ser polar (por exemplo, hidrófílas). Como exemplo ilustrativo, uma área de superfície de polaridade aumentada pode ser desejada para obter o espalhamento de uma gotícula sobre um arranjo de DNA para hibridização. Qualquer parte da pelo menos uma superfície também pode ser tratada de tal maneira que ela proporcione as respectivas características de superfície polar ou apoiar. Por exemplo, uma superfície sólida pode ser respectivamente tratada.

Uma forma comum de se definir a molhabilidade de uma superfície para um fluido, tal como um líquido, é o ângulo de contato (também chamado de ângulo de molhabilidade) entre· uma gotícula do fluido em equilíbrio térmico sobre uma superfície horizontal, que é geralmente lisa e homogênea, tipicamente circundada por um gás, como o ar. Sob esse aspecto, os versados na técnica estarão cônscios do fato de que quanto maior a aspereza de uma superfície, geralmente maior é o ângulo de contato.

Dependendo do tipo de superfície e do fluido, a gotícula pode ter uma variedade de formas, conforme ilustrado na Figura 1. A Figura 1 também ilustra o respectivo ângulo de contato θ da fase interna das gotículas de fluido representadas. Esse ângulo de contato é geralmente determinado de forma individual para cada respectiva fase de interesse (vide abaixo), por exemplo, a fase interna e a fase externa de uma gotícula de fluido a ser utilizada na presente invenção. Em algumas concretizações, a molhabilidade de uma superfície para uma gotícula de fluido que inclui uma fase interna e uma fase externa pode ser determinada da mesma maneira, em particular quando a fase externa for uma fase de enchimento. Entretanto, é mais conveniente determinar o ângulo de contato de cada fase separadamente. Um ângulo de contato θ é dado pelo ângulo entre a interface da gotícula e a superfície horizontal.

Tal ângulo de contato θ é uma variável termodinâmica que depende das tensões interfaciais das superfícies envolvidas. Ela reflete o equilíbrio das forças exercidas pela atração das moléculas dentro da gotícula umas com as outras versus a atração ou repulsão que essas moléculas de gotículas sofrem em relação às moléculas da superfície.

A técnica em geral mais utilizada para determinar o ângulo de contato é o chamado método da gota séssil ou estática em uma configuração de fase única, que lembra a fase interna conforme ilustrada na Fig. 1. A medição geralmente envolve a adição sucessiva de gotículas de fluido até que seja obtida uma estabilização no ângulo de contato. O valor em uma respectiva estabilização é chamado de ângulo de contato de avanço. Outro valor que é considerado menos importante nesse aspecto é o chamado ângulo de contato retrocedente. Ele é obtido pela continuação de um experimento de ângulo de contato de avanço monitorando-se de forma imediatamente subseqüente o ângulo de contato à medida que as gotículas de fluido de volume equivalente são sucessivamente retraídas da gotícula. Outros meios para determinação do ângulo de contato incluem o método de Wlhemly Plate, o Método de Bolha de Ar Cativa, o método de Ascensão Capilar e a medição de Gota Inclinada.

Um ângulo de contato θ igual a zero resulta em molhagem, ao passo que um ângulo de contato θ entre cerca de 0 e cerca de 90 resulta geralmente no espalhamento da gotícula de fluido, em particular em valores na faixa abaixo de cerca de 45 graus. Ângulos de contato θ maiores do que cerca de 90 graus indicam que o fluido tende a formar contas ou se afastar da superfície sólida (vide a Fig. IC para ver um exemplo). Como já indicado acima, o ângulo de contato é geralmente determinado para uma fase única do fluido. Logo, o ângulo de contato da fase interna e externa da gotícula de fluido é geralmente determinado de forma separada. Em algumas concretizações, a pelo menos uma superfície utilizada na presente invenção tem uma molhabilidade tal para o fluido da fase interna da gotícula de fluido que uma gotícula de fluido de fase única, consistindo do respectivo fluido, quando disposta sobre a mesma, pode ser caracterizada por um ângulo de contato de avanço θ de cerca de 50 graus ou maior. Assim, a molhabilidade da superfície é caracterizada por um ângulo de contato de avanço θ na interface de uma gotícula de fluido, que é constituída da fase interna da gotícula de fluido definida acima, com a pelo menos uma superfície de cerca de 50 graus ou maior. Em algumas concretizações, a pelo menos uma superfície utilizada na presente invenção tem uma molhabilidade tal para o fluido da fase externa da gotícula de fluido que uma gotícula de fluido consistindo do fluido da fase externa é caracterizada por um ângulo de contato de avanço θ de cerca de 50 graus ou maior. Em algumas concretizações, a pelo menos uma superfície utilizada na presente invenção tem uma molhabilidade para a gotícula de fluido como um todo que é tal baixa que ela é caracterizada por um ângulo de contato de avanço θ na interface da referida gotícula de fluido com a pelo menos uma superfície de cerca de 50 graus ou maior.

Em algumas concretizações, a superfície, por exemplo, uma superfície sólida, é também inerte contra o fluido da fase interna ou externa da gotícula de fluido. Tais concretizações permitem várias reutilizações do dispositivo. Um exemplo ilustrativo de um material que é inerte contra a maioria dos meios corrosivos é um íluorpolímero, tal como o fluoretilenopropileno (FEP), politetrafluoretileno (PFTE, Teflon), etileno-tetraflouretileno (ETFE), tetraflouretileno-perflour metilvinileter (MFA), copolímero de fluoreto de vinilideno- hexafluor-propileno, copolímero de tetrafluoretileno- hexafluorpropileno, terpolímero de fluoreto de vinilideno- hexafluorpropileno-tetrafluoretileno, copolímero de éter perfluormetil vinílico-tetrafluoretileno, copolímero de perfluoralcóxi (PF A), poli(fluoreto de vinila), policlorotrifluoretileno, fluorsilicones ou fluorfosfazenos.

Além disso, e particularmente, quando uma respectiva fase é uma fase líquida, a fase interna ou externa da gotícula de fluido pode incluir um surfactante iônico ou aniônico, por exemplo, um surfactante de perfluorcarbono. Tipicamente, o surfactante adsorve primariamente nas interfaces sólido-líquido, líquido-líquido e líquido-vapor próximo à região da linha de contato, conforme aplicável. Como exemplo ilustrativo, pode ser desejado utilizar um surfactante de modo a reduzir interações não- específicas de uma amostra incluída na fase interna da gotícula de fluido com uma superfície. Numerosos surfactantes, que são parcialmente hidrófilos e parcialmente lipofílicos, são utilizados na técnica, tal como, por exemplo, sulfonatos de alquil benzeno, alquil fenóxi polietóxi etanóis, alquil glicosídeos, aminas secundárias e terciárias tal como a dietanolamina, Tween, Triton 100 e trietanolamina, ou, por exemplo, fluorsurfactantes, tal como ZONYL® FSO-IOO (DuPont).

O método da presente invenção inclui ainda dispor a gotícula de fluido sobre a pelo menos uma superfície. A gotícula de fluido pode ser disposta por qualquer meio. Como exemplo, um dispensador pode ser utilizado. O dispensador pode utilizar-se de qualquer dispositivo ou mecanismo adequado a fim de proporcionar e dispensar uma gotícula de fluido de tamanho desejado. Exemplos incluem, mas não se limitam a pipetadores piezoelétricos, pipetadores baseados em bomba de seringa, bombas peristálticas, dispensação sem contato, dispensação mediada por pressão, dispensação por jato de tinta (incluindo dispensação por seringa-solenóide), "pin-transfer" (transferência por agulhas) (confira Rose, D, Drug Discovery Today (1999), 4, 411-419 para análise). A disposição da gotícula de fluido também pode contar com, ou ser auxiliada pelas propriedades da matéria que pode ser magneticamente atraída incluída nela. Sendo assim, é possível utilizar um campo magnético, eletromagnético, elétrico ou eletrostático. Como exemplo ilustrativo, um conector magnético pode ser injetado por ação capilar sob a influência de um campo magnético, eletromagnético ou elétrico, por exemplo, por dieletroforese. Por meio do dispensador, a gotícula de fluido pode, em uma concretização, ser disposta sobre a superfície sem entrar em contato com esta. Em ainda outra concretização, a gotícula de fluido pode ser dispensada diretamente sobre uma superfície por meio de dispensação por contato. Quando desejado, as quantidades desejadas podem ser medidas, por exemplo, por meio de uma câmera, conforme revelado no pedido de patente US 2003/0209560.

As Figuras 7, 16 e 18 representam exemplos ilustrativos de gotículas de fluido, conforme utilizadas na presente invenção, sobre uma superfície. A superfície pode, antes, durante ou após a dispensação de uma gotícula de fluido sobre ela, assumir qualquer orientação em relação ao solo. Nas concretizações em que uma superfície essencialmente plana é proporcionada e a gotícula de fluido é manipulada em um gás, tal como o ar, pode ser desejado, por questões de conveniência, dispor a gotícula de fluido sobre a respectiva superfície. De modo similar, em tal caso, pode ser desejado manter a respectiva superfície numa posição essencialmente horizontal de modo a ajudar a controlar a posição da gotícula de fluido, principalmente quando for desejado posicionar a gotícula de fluido por meio de um campo magnético e, em seguida, terminar o campo magnético. Em tal caso, a gotícula de fluido é tipicamente manipulada abaixo ou acima da respectiva superfície, conforme revelado na Fig. 3A e na Fig. 3B. Nas concretizações em que uma superfície côncava ou convexa é proporcionada e a gotícula de fluido é manipulada em um gás, tal como o ar, pode ser desejado, por conveniência, dispor a gotícula de fluido na posição superior ou inferior de um entalhe, em relação à direção de ação da gravitação.

Uma vez que o método da presente invenção normalmente não exige nenhuma peça mecânica adicional, ele se baseia em um sistema microfluídico que é robusto. O método da invenção geralmente também não necessita de válvulas, fazendo com que não ocorra volume morto. Sendo assim, o método da presente invenção é bem adequado ao processamento de volumes de amostra na escala de nanolitros e inferior (sura) sem nenhuma perda de material.

Tipicamente, o método da invenção envolve controlar a posição da gotícula de fluido, em particular em relação à pelo menos uma superfície. Essa posição pode, por exemplo, ser controlada por meios geométricos, tal como uma superfície côncava (confira a Fig. 1E). Outros meios para controlar a posição da gotícula de fluido incluem força mecânica. Tal força mecânica pode, por exemplo, ser aplicada colocando a gotícula de fluido em contato com uma superfície adicional, como por exemplo, a superfície da ponta de uma pipeta. Outro meio de controle da posição da gotícula de fluido inclui a aplicação de ondas acústicas, conforme revelado por Guttenberg, Z e col., Lab on a Chip (2005) 5, 308-317. Ainda outro meio de controle da posição da gotícula de fluido inclui a aplicação de um gradiente térmico, por exemplo, da pelo menos uma superfície. Um respectivo gradiente térmico pode, por exemplo, ser obtido por meio de um laser IV.

Em algumas concretizações, o método da invenção controlando a posição da referida gotícula de fluido em relação à pelo menos uma superfície adicionalmente inclui expor a gotícula de fluido a um campo magnético ou eletromagnético. Isso exerce uma força sobre as partículas magnéticas, fazendo com que a gotícula, como um todo, seja forçada a seguir qualquer movimento das partículas magnéticas. Com isso, a posição da gotícula de fluido pode ser controlada. Em algumas concretizações, um campo magnético ou eletromagnético constante é aplicado, ao passo que em outras concretizações, o campo magnético ou eletromagnético é alterado durante o método da invenção. Em algumas concretizações, o controle da posição da gotícula de fluido inclui mover a superfície, por exemplo, sob um campo magnético ou eletromagnético constante. Como conseqüência, a posição da gotícula de fluido em relação à superfície pode ser alterada. Em algumas concretizações, vários meios para controlar a posição de uma gotícula de fluido podem ser combinados (confira também a seguir para exemplos adicionais). Em algumas concretizações, o processo só é realizado assim que a gotícula de fluido tiver sido posicionada por meio do campo magnético ou eletromagnético. Em uma dessas concretizações, o campo magnético ou eletromagnético é terminado após a gotícula de fluido ter sido colocada na posição desejada. Como exemplo ilustrativo, uma região da pelo menos uma superfície pode ser exposta a uma condição, tal como a uma temperatura alterada, a um campo magnético (alterado), a um campo elétrico (alterado) (incluindo um campo eletrostático), a um campo eletromagnético (alterado), a uma pressão alterada, a um comprimento de onda (alterado), a uma freqüência (alterada), a uma amplitude (alterada), a uma concentração química (alterada), e a uma composição química (alterada) (tal como um fluxo de gás). Em tal caso, o controle da posição da gotícula de fluido pode incluir mover a gotícula de fluido para a região da pelo menos uma superfície que está sendo exposta a essa condição.

Em algumas concretizações do método da invenção, a exposição da gotícula a um campo elétrico/magnético inclui repelir a gotícula. Em algumas dessas e em outras concretizações, a exposição da gotícula a um campo elétrico/magnético inclui atrair a gotícula. A atração ou repulsão da gotícula por meio de um campo magnético ou elétrico pode, por exemplo, ser obtida por meio de uma barra imantada, um eletroímã, um arranjo de barras imantadas ou eletroímãs ou qualquer combinação destes. Um respectivo ímã pode ser movido de modo a mover uma ou mais gotícuias de fluido. As forças de atração ou repulsão de um ou mais ímãs de um arranjo também podem ser modificadas de modo a controlar a posição de uma gotícula de fluido.

Em algumas concretizações, quando pelo menos duas superfícies, conforme definido acima, são proporcionadas, as gotículas de fluido podem ser transferidas de uma superfície para outra e serem movidas entre elas. Em tais concretizações, o controle da posição da gotícula de fluido pode incluir mover a gotícula de fluido entre duas superfícies por meio de um campo magnético ou eletromagnético.

O método da invenção também inclui realizar um processo na amostra química e/ou biológica na gotícula de fluido. E possível realizar qualquer processo capaz de ser realizado em uma gotícula de fluido. Exemplos de processos que podem ser realizados incluem, mas sem a isto se limitar, uma detecção física da matéria-alvo cuja presença é suspeita ou conhecida na amostra, uma reação química, uma Iise celular, uma extração de uma molécula a partir de um organismo ou parte de um organismo, uma liberação de uma molécula a partir de um organismo e qualquer combinação destes. Exemplos de detecção física incluem, mas sem a isto se limitar, uma detecção espectroscópica, fotoquímica, fotométrica, fluorométrica, radiológica, acústica, eletroquímica, colorimétrica, difracional, interferométrica, elipsométrica e termodinâmica, e inclui, por exemplo, o uso de rótulos fotoativos, fluorescentes radioativos ou enzimáticos. Dois exemplos ilustrativos de um método espectroscópico são a microscopia Raman e a microscopia por dispersão coerente de Raman anti-Stokes (CARS). A última técnica é adequada, por exemplo, para a obtenção seletiva de imagens de moléculas específicas de interesse. Exemplos de reações químicas incluem, mas sem a isto se limitar, uma síntese química, uma degradação química, uma síntese enzimática, uma degradação enzimática, uma modificação química, uma modificação enzimática, uma interação com uma molécula de ligação e qualquer combinação destas. Exemplos de síntese enzimática incluem, mas sem a isto se limitar, uma síntese protéica, um ácido nucléico, síntese, uma síntese de peptídeo, uma síntese de um composto farmacêutico e qualquer combinação destes. O método da invenção é compatível, por exemplo, com qualquer transformação bioquímica ou formato de análise, por exemplo, o sistema dois-híbrido de levedura, o RNA interferente pequeno (siRNA), transfecção, ligação, etc.

A realização de um processo pode incluir exposição à energia, por exemplo, para que um processo seja iniciado ou catalizado. Exemplos de energia que podem ser aplicadas incluem, mas sem a isto se limitar, radiação por infravermelho, radiação por microondas ou energia fotolítica. Como exemplo ilustrativo, a superfície, junto com uma gotícula de fluido, podem ser colocadas em biochip em um resfriador/aquecedor de película fina. Logo, é possível realizar sínteses químicas induzidas por temperaturas elevadas ou que necessitem de temperaturas reduzidas, por exemplo, ajustando-se a temperatura do ambiente da gotícula respectivamente. Como outro exemplo, é possível realizar reações bioquímicas controladas por temperatura entre 4 e 100°C. Portanto, é possível armazenar, por exemplo, amostras biológicas sensíveis à temperatura. Outros exemplos incluem, sem a isto se limitar, isolamento celular (vide Fig. 9), incubação celular, lise celular (Fig. 6), transcrição reversa, reação em cadeia da polimerase (Fig. 10, 12) e pirosequenciamento (Fig. 13). O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento de ácido nucléico em tempo real, que se baseia na detecção do pirofosfato liberado durante a reação de polimerização do ácido nucleio (para obter uma visão geral, confira, por exemplo, Ronahi, M, Genome Reserach (2001), 11, 3-11). Além disso, a implementação de diversos sistemas de detecção óptica, por exemplo, fotodiodos (PD), fotomultiplicadores (PMT), módulos de contagem de fótons (PCM), espectrômetros e dispositivos de carga emparelhada (CCDs) permite o monitoramento dessas reações bioquímicas em paralelo e em tempo real.

Como exemplo ilustrativo, um patógeno, uma bactéria, um vírus ou uma seqüência de DNA pode ser detectado usando a presente invenção para identificar um estado de doença. Entre as doenças que podem ser detectadas estão as doenças comunicáveis, como a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS), a Hepatite A, B e C, HIV/AIDS, Dengue, febre suína, doença da boca e dos pés, gripe aviária, antrax, samonela, malária, poliomielite, tuberculose e influenza; condições congenitais que podem ser detectadas em pré-natal (por exemplo, via a detecção de anormalidades cromossômicas) como a anemia falciforme, malformações cardíacas como o defeito septal atrial, a estenose aórtica supravalvular, a cardiomiopatia, a síndrome de Down, pé torto, polidactilia, sindactilia, dedos atrópicos, mãos e pés fendidos (tipo lagosta), etc. A presente invenção também é adequada para a detecção e exame de câncer, para identificar o pedigree de um animal, por exemplo, por meio de uma marca de DNA, ou para a detecção e análise de substâncias no sangue, por exemplo, doping.

Em outras concretizações, o método da presente invenção pode ser empregado na detecção, reação (incluindo uma reação de ligação com uma célula biológica ou parte desta), síntese, ou qualquer combinação destes, de um ou mais compostos farmacêuticos, como fármacos. Uma síntese de um composto, tal como um composto farmacêutico, pode, por exemplo, ser realizada como uma reação de fase sólida ou contas derivatizadas. Os compostos farmacêuticos podem ser usados, por exemplo, na forma de uma biblioteca. Exemplos de tais bibliotecas são as coleções de várias moléculas orgânicas pequenas, sintetizadas quimicamente como compostos-modelo, ou moléculas de ácido nucléico contendo um grande número de variantes de seqüência. Como exemplo, cada composto de tal biblioteca pode ser disposto em uma gotícula. Tais gotículas podem ser proporcionadas de forma automatizada por máquinas comercialmente disponíveis, bem conhecidas pelos versados na técnica. O método da invenção pode, por exemplo, ser usado no exame de drogas ou para determinar a presença de uma droga numa amostra de urina ou de sangue.

Como outro exemplo, um meio de cultura celular pode ser suspeito de contaminação (supra). Neste caso, pode ser desejado identificar o tipo de contaminante e usar o dispositivo da invenção para essa finalidade. Em tais concretizações, a matéria que pode ser atraída magneticamente pode ser, por exemplo, partículas que podem ser magneticamente atraídas transportando um ligante com afinidade pelo contaminante ou com afinidade por outra matéria que tenha afinidade pelo contaminante.

Nas concretizações em que se deseja remover a matéria, tais como subprodutos ou matéria indesejada da amostra, o processo pode ser um processo de lavagem ou um processo incluindo uma etapa de lavagem. Ele também pode incluir dividir a gotícula de fluido em pelo menos duas gotículas de fluido filhas. Como exemplo ilustrativo, um ácido nucléico pode ser extraído de uma célula e ser ligado por um ligante unido às partículas magnéticas, enquanto que os resíduos celulares e os reagentes estão para serem descartados. A Fig. 4A ilustra um exemplo de uma etapa de lavagem de uma gotícula de fluido usando outra gotícula de fluido adicional. Essa gotícula de fluido adicional também pode incluir duas ou mais fases de fluido. Ela pode ser proporcionada na mesma superfície que a gotícula de fluido que inclui duas fases, matéria magnética e a amostra, ou pode ser proporcionada em outra superfície (Fig. 4B). Ela é movida em direção à gotícula de fluido que inclui duas fases, matéria magnética e a amostra (Fig. 4A(1)). A seta na Fig. 4A indica a posição atual de um ímã permanente. As duas gotículas de fluido se misturam (Fig. 4A(2)) e formam uma gotícula de fluido maior (Fig. 4A(3)). Para assegurar a mistura e lavagem completa, pode- se aplicar uma força magnética fraca suficiente, por exemplo, para erguer as partículas magnéticas dentro da gotícula sem elevar toda a gotícula de fluido. Ao mover ainda mais as partículas magnéticas para um lado (Fig. 4A(4)), inicia-se uma divisão da gotícula (Fig. 4A(5)). A razão de partículas magnéticas/fase externa, a razão de volume das gotículas de fluido interagentes, sua composição bioquímica, a morfologia de superfície, a química de superfície e a potência do gradiente do campo (eletro)magnético ditam se as gotículas de fluido correspondentes se movem, se misturam, são "lavadas" ou se dividem. Durante essas manipulações, o volume morto é zero, isto é, nenhum material é perdido mesmo se volumes na faixa de nanolitros forem processados. Quando desejado, unidades funcionais adicionais podem ser facilmente implementadas no método da invenção, por exemplo, atuadores baseado em piezoelétrico para auxiliar na mistura ou realizá-la.

A fase interna da gotícula pode ser lavada ou intercambiada com qualquer fluido (vide, por exemplo, a Fig. 18), por exemplo, um solvente, um ácido ou uma base, contanto que o fluido permita que (a) a fase interna permaneça essencialmente intacta e (b) as partículas magnéticas mantenham sua propriedade de atração com um ímã. Nas concretizações em que a fase externa forma uma película circundando a fase interna (supra), também pode ser desejado manter a fase externa intacta como uma película. Nas concretizações em que um ligante unido às partículas magnéticas é usado para ligar a matéria-alvo, também pode ser desejado que um fluido permita ao ligante permanecer intacto e ligar-se à matéria-alvo desejada. Em qualquer momento antes, durante ou após a realização de um processo, é possível realizar uma mistura da gotícula de fluido, por exemplo, mediante a exposição da gotícula de fluido a ondas ultra-sônicas. Uma vez que a gotícula se baseia em um sistema autoorganizável, tal mistura não afeta a integridade da gotícula, e em vez disso ajuda a obter uma distribuição uniforme da matéria dentro de uma fase dentro da gotícula.

A possibilidade de realizar transferências de matéria, tal como lavagem, permite a realização de processo complexos. Uma vez que a matéria-alvo desejada pode ser ligada a ligantes imobilizados em partículas magnéticas, a possibilidade de acrescentar, remover ou trocar fluido, por exemplo, líquido, possibilita o isolamento de qualquer matéria, por exemplo, peptídeos, proteínas, DNA, RNA, pequenas moléculas orgânicas, íons metálicos, etc. (supra) em qualquer estágio ou etapa desejada, tomando-se possível realizar transformações bioquímicas na seqüência (Fig. 4). Além do mais, o volume da gotícula de fluido pode ser modificado em várias ordens de grandeza. Sendo assim, o método da presente invenção oferece uma interface entre o mundo macroscópico e microscópico sem nenhuma brecha na tecnologia.

Quando desejado, a concentração de matéria- alvo em uma amostra pode ser aumentada por redução de volume segundo técnicas bem conhecidas, tal como filtração em gel, ultrafiltração ou diálise. Um pequeno volume, conforme utilizado no método da presente invenção, especialmente em combinação com uma alta concentração da matéria-alvo, torna possível o biosensoriamento de biomoléculas em números absolutos pequenos.

Como um exemplo ilustrativo adicional, mas não restritivo, o método da presente invenção pode ser usado para realizar um imunoensaio enzimático (ELISA) do tipo "sanduíche". Os usos e aplicabilidades desse ensaio são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ao combinar várias gotículas de fluido, em que cada gotícula contém pelo menos um ou mais dos reagentes necessários às etapas de ligação, lavagem e detecção, é possível analisar a presença da matéria-alvo em uma amostra. Conforme descrito acima, o reagente de captura pode ser acoplado a contas magnéticas. Em uma concretização específica, o reagente de captura é um anticorpo direcionado a um antígeno de interesse. Mais especificamente, o anticorpo pode ser direcionado a um antígeno presente em um vírus HIV e a amostra de sangue ou soro suspeito de conter esse vírus HIV. A detecção de um antígeno pode ser monitorada através de análise colorimétrica e/ou espectroscópica. Isso pode ocorrer após a eluição dos substratos capturados na sonda ou dentro do próprio dispositivo sem recorrer a uma etapa de eluição.

A Fig. 6 ilustra o uso do método da presente invenção para uma reação em cadeia da polimerase. O controle de temperatura pode ser obtido por meio de aquecedores de película fina e sensores de temperatura. O módulo 1 representa uma matriz de partículas superparamagnéticas, que são modificadas com ligantes. Esses Iigantes são receptores direcionados contra diferentes marcadores de superfície celular. Qualquer célula de interesse pode, dessa forma, ser isolada dos fluidos ou tecido corporal conforme descrito acima. Uma gota de sangue inteiro capilar humano pode ser obtida por pontada no dedo com uma lanceta. Essa gota de sangue é colocada sobre o módulo 2. Em seguida, os leucócitos podem ser isolados de acordo com a ligação de seus marcadores de superfície celular ao ligante imobilizado nas partículas magnéticas (confira acima, vide também a Fig. 5 e a Fig. 7). A Figura 8 ilustra, na forma de ampliação, um exemplo de leucócitos ligados a ligantes imobilizados em partículas magnéticas. Os leucócitos podem ser termicamente submetidos à Iise em um dos quatro aquecedores de película fina do módulo 3 A reação em cadeia da polimerase (PCR) é realizada no sentido horário guiando a amostra ao longo de três regiões de temperatura diferente (configura o módulo 3 na Fig. 6). A Fig. 17 representa um perfil de temperatura medido utilizando-se o método da presente invenção. A Fig. 11 constata que um produto da PCR obtido pelo método da presente invenção tem uma qualidade que não difere da de um produto obtida pelos métodos convencionais utilizados na técnica. O uso de conversão de tempo-espaço torna possível a multiplexação das amostras. Um produto biotinilado da PCR pode ser gerado, o qual pode ser ligado às partículas superparamagnéticas revestidas com streptavidina. O produto da amplifícação pode ser quimicamente desnaturado no módulo 4 e anelado para um oligonucleotídeo iniciador (primer) de sequenciamento para pirosequenciamento (PSQ), que pode ser realizado no sentido horário 5 movendo-se a amostra através de quatro VRCs diferentes contendo as bases G, A, T e C. A Figura 13 ilustra um exemplo de uma respectiva análise. O uso de conversão de tempo-espaço torna possível a multiplexação das amostras. Se desejado, as amostras podem ser armazenadas no módulo 6 após o pirosequenciamento, novamente em um formato similar ao de uma matriz. Como alternativa, elas também podem ser adicionalmente processadas.

Outro exemplo da realização de um processo na amostra biológica e/ou química em uma gotícula de fluido consiste em misturar o interior da gotícula de fluido. O termo "mistura" refere-se a uma intercombinação passiva, isto é, por difusão, para mistura ativa por meio, por exemplo, da aplicação de energia ou forças externas, bem como a suas combinações. A mistura ativa dentro de uma gotícula fixa ou móvel pode incluir, por exemplo, agitar as partículas superparamagnéticas. Tal agitação pode ser obtida, por exemplo, alterando-se um campo magnético ou eletromagnético ao qual a gotícula é exposta. Ela também pode ser obtida alterando-se a posição relativa de uma gotícula em um campo magnético ou eletromagnético constante movendo-se a respectiva superfície (supra). Ainda outro meio de mistura ativa se baseia no ultra-som, que é ilustrado nos desenhos apensos.

Ainda outro exemplo da realização de um processo na amostra biológica e/ou química em uma gotícula de fluido é a filtragem da gotícula de fluido através de outra gotícula de fluido, conforme ilustrado na Fig. 18. Tal filtração é geralmente realizada movendo uma gotícula menor contendo partículas superparamagnéticas fimcionalizadas com a matéria- alvo imobilizada através de uma gotícula de fluido maior. Dessa forma, os componentes indesejados, como por exemplo, os subprodutos, impurezas, substratos, reagentes, solventes ou componentes do solvente, sais, enzimas resíduos ou tampões podem ser diluídos na gotícula maior. Ao mover ainda mais as partículas magnéticas para fora da gotícula maior, basicamente somente as partículas superparamagnéticas incluindo a matéria- alvo imobilizada estão sendo removidas da gotícula maior, enquanto que a maioria da matéria indesejada está sendo deixada para trás. Devido à natureza autoorganizável do sistema, a fase externa ou uma parte dela é similarmente removida da gotícula maior. No caso de uma fase externa na forma de uma película, uma película fina da fase externa pode, por exemplo, circundar uma pequena quantidade restante da fase interna. Dessa forma, é possível remover substancialmente a matéria da gotícula de fluido que não está imobilizada pelas contas magnéticas (configura os Exemplos e a Fig. 20). O efeito de purificação subjacente lembra o mecanismo conhecido da cromatografía por afinidade, em que a matéria-alvo é retida pelo material de coluna funcionalizado formando a fase estacionária, e enxaguada/lavada várias vezes com uma solução de lavagem, formando a fase móvel. Ao contrário da cromatografía por afinidade, no método da presente invenção, a solução de lavagem é a fase estacionária, enquanto que o material funcionalizado é a fase móvel. Deve-se observar também que não ocorre nenhum volume morto ao utilizar o método da presente invenção. Além do mais, ao contrário da cromatografía por afinidade, o método da presente invenção permite a eluição da matéria-alvo em volumes na faixa de nanolitros. Essa vantagem é crucial em aplicações como o biosensoriamento, quando, por exemplo, uma alta concentração da matéria-alvo está presente em minúsculos volumes, ou quando cinéticas rápidas precisam ser analisadas.

Qualquer parte do método da presente invenção pode ser realizada de forma manual ou automatizada. A distribuição automatizada dos componentes, fluidos e reagentes, incubadores automatizados e leitoras de fluorescência de alto desempenho, incluindo leitoras de placa, já estão bem consolidados na técnica. Geralmente, tal equipamento pode ser usado diretamente com um aparelho da presente invenção. Quando necessário, adaptações tanto do referido equipamento quanto do aparelho da invenção a uma aplicação específica podem ser realizadas facilmente pelos versados na técnica.

A detecção em tempo real pode oferecer um gráfico de amplificação representando o sinal de fluorescência versus o tempo de reação expresso em números de ciclo (vide Fig. 16).Um aumento na fluorescência acima da linha de base indica a detecção do produto de amplificação acumulativo. Quando um limiar de fluorescência fixo é definido acima da linha de base, o sinal de fluorescência passa então esse limiar em um determinado momento. Uma vez que o tempo é expresso em termos de números de ciclo, obtém-se o chamado número (ou valor) limiar de ciclo ou valor Ct.Quanto menor esse número, mais à esquerda estará uma respectiva curva de fluorescência localizada no gráfico de amplificação e mais rápido ocorrerá a amplificação. Quanto maior esse número, mais lento ocorrerá uma amplificação e menos distinguível ela se tornará das reações secundárias não específicas.Uma ilustração dos sinais de fluorescência obtidos usando o método da presente invenção é representada na Figura 10.

O método da invenção pode ser combinado com tais métodos analíticos e preparativos, como por exemplo, ressonância de plásmon de superfície, espelho ressonante, interferência reflectométrica, Magneto-resistência gigante, espectroscopia de massa, elipsometria, focalização isoelétrica, métodos de cromatografia, e métodos eletrocromatográficos, de cromatografia eletrocinética e eletroforéticos. Exemplos de métodos eletroforéticos incluem, por exemplo, a Eletroforese de Fluxo Livre (FFE), a eletroforese em gel de campo pulsado, a eletroforese em gel de Poliacrilamida (PAGW), a Eletroforese em Gel Capilar ou Zona Capilar. A imobilização de superfície das partículas magnéticas por proteínas carregadas é, por exemplo, conhecida por multiplicar sua mobilidade eletroforética. A combinação com tais métodos pode incluir uma etapa comum ou um dispositivo comum. Como exemplo, uma separação das proteínas pode ser realizada em um micro chip, por exemplo, por focalização isoelétrica. Subseqüentemente, uma amostra do meio de separação, por exemplo, uma solução de anfólitos em água, conhecida ou suspeita de conter uma matéria de interesse, tal como uma proteína, pode ser utilizada, por exemplo, como a fase interna de uma gotícula de fluido da presente invenção. No caso do meio de separação ser um gel, a matéria de interesse pode precisar ser extraída. A variedade de fluidos adequados para a fase interna e externa da gotícula de fluido utilizada na presente invenção geralmente permite a seleção de um material de superfície bem apropriado para uso como uma superfície para focalização isoelétrica. Como conseqüência, uma superfície comum pode ser compartilhada para ambos os métodos quando desejado. Exemplos de um método de cromatografía incluem, por exemplo, fíltração em gel, cromatografía por exclusão de tamanho, cromatografía por troca iônica, cromatografía por afinidade, cromatografía por interação hidrófoba ou cromatografía por indução de carga hidrófoba. Como exemplo ilustrativo, um respectivo método analítico ou preparativo pode ser realizado antes ou após o processamento de uma amostra utilizando-se o método da presente invenção.

Para que a invenção seja facilmente entendida e colocada em prática, concretizações específicas serão descritas a seguir na forma dos exemplos não restritivos seguintes.

EXEMPLOS

Manipulação da gotícula Um arranjo de eletroímãs construído localmente, um ímã de disco de neodímio-ferro-boro M1219-X permanente (Assemtech), fixo no ponteiro de um despertador analógico (Citizen) por fita de dupla face (3M) (vide Fig. 18A) ou um sistema de estágio motorizado ProScanII (Anterior), que foi movido relativamente a um ímã de disco de neodímio-ferro-boro permanente estacionário (Famell) e controlado pro um joystick ou software Lab VIEW 8 (National Instruments) foi usado para manipular as gotículas de fluido contendo partículas superparamagnéticas (vide Fig. 19).

As gotículas de fluido continham uma fase líquida interna polar e uma fase líquida externa apoiar. A fase interna era aquosa e continha tampão, reagente(s) e partículas superparamagnéticas (vide abaixo). Óleo mineral ultrafiltrado (Fluka) foi utilizado como líquido imiscível formando a fase externa na forma de uma película fina circundando a fase interna. Para aplicações à temperatura ambiente (rt), a razão de volume da fase aquosa para a fase imiscível foi de 10:1, ao passo que para aplicações que exigem temperaturas elevadas, por exemplo, o pirosequenciamento (PSQ), a transcrição reversa (RT)5 a lise celular e a reação em cadeia da polimerase (PCR), ela foi de 1:5.

As manipulações microfluídicas incluíram união, mistura, lavagem/filtragem e divisão das gotículas. A mistura dentro da gotícula foi obtida tanto por meio da agitação das partículas superparamagnéticas pela alteração do campo magnético/eletromagnético quanto por cavitação acústica/corrente por ondas ultra-sônicas. Em alguns casos, ambas as técnicas de mistura foram combinadas.

Para gerar as ondas ultra-sônicas, um gerador de forma de onda arbitrário/funcional de 80 MHz 33250A (Agilent), equipado com um amplificador interno incorporado, e um disco de titanato zirconato de chumbo (PZT) (Philips), colado no substrato por um adesivo epóxi (Alteco), foram utilizados. Dependendo do experimento, as diferentes formas de onda na faixa dos kHz proporcionam uma mistura rápida e eficiente. Com exceção da solução PCR, todas as gotículas, ou seja, de sangue, partículas superparamagnéticas funcionalizadas, óleo mineral, soluções de revestimento, soluções de lavagem, substratos, etc., foram dispostas sobre a superfície ao início do experimento e a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi sucessivamente unida, misturada, lavada/filtrada e dividida com essas gotículas.

A Fig. 18 ilustra o movimento, mistura, lavagem/filtragem e a divisão para o exemplo seguinte do isolamento de glóbulos brancos a partir de sangue interno capilar humano utilizando-se partículas superparamagnéticas funcionalizadas (vide abaixo). Uma vez que os glóbulos brancos expressam os antígenos CD15 e CD45 (marcadores de superfície celular) em sua membrana celular, eles podem ser seletivamente removidos por imunoreação com partículas superparamagnéticas revestidas com o anticorpo anti-CD15 ou anti-CD45. Fig. 18A: um ímã de disco de neodímio-ferro-boro Ml219-1 permanente, fixado no ponteiro de um relógio analógico (Citizen) por fita de dupla face (3M), é utilizado para mover, misturar, lavar/filtrar e dividir as gotículas contendo as partículas superparamagnéticas funcionalidades (1), que são colocadas no topo de uma lâmina de vidro revestida com Teflon AF (DuPont) (24x60 mm, espessura ~ 180 μm, vfm CoverSlips, CellPath) acima do ímã; para melhor visibilidade nas figuras seguintes, um papel branco é colocado entre o relógio e o substrato de vidro. Fig. 18B: Uma gotícula contendo 100 nl de Dynabeads® CDl 5 e CD45 (Dynal Biotech) (26) é movida em direção a uma gotícula contendo 100 nl de sangue humano capilar inteiro (27) fresco, e é misturada (Fig. 18C, 18D). Após combinar as duas gotículas, a gotícula combinada (28) é movida em direção a uma gotícula contendo 10 μm de solução de lavagem (Ο,ΟΙΜ PBS/0,1% BSA), (29) (Fig. 18E, Fig. 18F); Durante essa etapa de incubação, os glóbulos brancos do sangue são imobilizados no topo das partículas funcionalizadas, por meio do que a agitação das partículas superparamagnéticas em movimento suporta a mistura ativa. Além disso, a corrente acústica por ondas ultra-sônicas pode ser usada para reduzir o tempo de incubação para esse fim. Deve-se observar que, em uma série de aplicações, é desejável evitar a cavitação acústica em amplitudes maiores, visto que esse modo leva à ruptura/lise dos glóbulos brancos do sangue. Após a combinação (Fig. 18G), os glóbulos brancos do sangue imobilizados são lavados/filtrados. O termo "lavagem"/"filtragem" se refere ao ato de mover as partículas superparamagnéticas funcionalizadas com glóbulos brancos imobilizados através de uma gotícula maior contendo a solução de lavagem (Fig. 18H, Fig. 181). Ao fazer isso, apenas as partículas superparamagnéticas incluindo os glóbulos brancos imobilizados, junto com uma película fina ou líquido imiscível da outra fase por autoorganização, deixam (Fig. 18J) a gotícula maior. Todo o restante da matéria incluída na gotícula maior, tais como impurezas, por exemplo, glóbulos vermelhos, tampão, sais, EDTA (servindo de anticoagulante), heparina, RNases, DNases, etc. permanecem na gotícula maior. A presença de glóbulos vermelhos transforma a cor da solução de lavagem em vermelho (vide a coloração escura da gotícula restante). Ao mesmo tempo, as impurezas, por fim parte da pasta semifluida de partículas superparamagnéticas fúncionalizadas com glóbulos brancos imobilizados, deixando a gotícula maior, estão sendo diluídas. Dessa forma, o fator de diluição dependa da razão de volume das gotículas interagentes: Se, por exemplo, uma gotícula de 0,1 μm de partículas superparamagnéticas funcionalizadas com glóbulos brancos imobilizados for lavada três vezes por 10 μl de solução de lavagem, as impurezas restantes dentro da pasta semifluida são diluídas em um milhão de vezes [(1:1OO)3]). Após isso, as partículas superparamagnéticas funcionalizadas com glóbulos brancos imobilizados deixam a solução de lavagem (29) (Fig. 18J) e são movidas em direção a uma segunda solução de lavagem (30) (Fig. 18K, Fig. 18L) para uma segunda etapa de lavagem. Para aprimorar a lavagem, as partículas superparamagnéticas funcionalizadas com glóbulos brancos imobilizados são movidas para frente e para trás várias vezes dentro da solução de lavagem (Fig. 18M-Fig. 18U) antes de deixarem a solução de lavagem (Fig. 18V, Fig. 18W). Finalmente, os glóbulos brancos purificados estão prontos para aplicações subseqüentes, por exemplo, a RT-PCR. A eficiência de filtração de uma solução de lavagem para a remoção de glóbulos vermelhos (o principal componente do sangue, o que interfere nas aplicações subseqüentes devido à contaminação com RNases e DNases), foi estimada contando os glóbulos vermelhos do sangue usando um hemocitômetro Neubauer (Fig. 20A, Fig. 20B) e é de ~100.000 vezes, isto é, a combinação de duas solução de lavagem de 10 μl cada uma remove todos os glóbulos vermelhos do sangue dentro de um volume de amostra de até 1 ml (o número absoluto de glóbulos vermelhos do sangue em uma amostra de 1 ml é de 5xl09).

Gerenciamento térmico O módulo de controle de temperatura, fabricado internamente, compreendia aquecedores de película fina de platina (Pt) e sensores de temperatura, e um controlador ASIC (circuito integrado de aplicação específica) (vide Fig. 17).

Alternativamente, os experimentos PCR (sem detecção óptica) foram realizados em um Termociclador Pelter PCT-200® (MJ Research, equipado com um adaptador Slide Griddle™ (MJ Research). A configuração do gerenciamento térmico é similar à de outros dispositivos usados na técnica, tal como revelado, por exemplo, por Guttenberg, Z. et al. (supra). Chips PCR sob medida disponíveis para comercialização, incluindo o controlador/software, foram considerados adequados para uso no método da presente invenção. Em alguns testes, os chips PCR da Advalytix (Brunnthal, Alemanha, www.advalytk.com) e do Institute for Physical High Technology e.V. (Jena, Alemanha) foram utilizados.

Detecção óptica

A fluorescência foi detectada por um microscópio de fluorescência Axiotech vario (Zeiss), provido de um sistema de iluminação X-Cite 120 (EXFO Life Sciences), um conjunto de filtros HE 38 FITC (Zeiss), um tubo fotomultiplicador 5784-20 (Hamamatsu) e registrada por um osciloscópio fosforescente digital TDS50054B (Tektronix) segundo as instruções do fabricante.

Para detecção da bioluminescência, utilizou-se, no lugar, um módulo de contagem de fótons H7421-40 (Hamamatsu). Modificação da superfície

Superfície hidrófobas, assim como oleofóbicas, foram obtidas por deposição de vapor químico (CVD) tanto de substratos de vidro (Schott) quanto de silício (Silicon Sense) com (heptadecafluor-l,l,2,2-tetrahidrodecil)trietoxisilano (Gelest) em um forno 15E (Fueld Engineering Systems) a 150°C e 0,5 mbar por 2 horas, ou recobrimento sob rotação de vidro, silício ou substratos poliméricos (General Electric) com uma solução de 1% de Teflon AF (DuPont) em FC-70 (3M). Os ângulos de contato estáticos com a água e o óleo mineral (Fluka), medidos por um dispositivo de medição de ângulo de contato OCA 30 (DataPysiscs) foram >110 e >70°, respectivamente.

A seqüência a seguir, o isolamento dos glóbulos brancos (WBCs) do sangue inteiro humano, a Iise celular dos WBCs, a PCR e a PSQ foram realizadas sucessivamente, sem nenhuma interferência do usuário (Fig. 6).

Isolamento dos glóbulos brancos do sangue

Uma gotícula contendo 0,1 μl de uma suspensão 1:1 de 200 μg μl-1 de Dynabeads CDl5 e CD45 (Dynal Biotech) em 0,01 M de PBS salina tamponada com fosfato (Sigma- Aldrich)/1, soroalbumina bovina (BSA) Roth) foi combinada com uma gotícula contendo 15 μl de sangue inteiro capilar humano fresco, misturada, incubada à temperatura ambiente por 10 min, e lavada sucessivamente em duas gotícuias contendo 10 μl 0,01 M PBS/1 % BSA e uma gotícula contendo 10 μl da mistura PCR (Fig. 7). Os glóbulos brancos do sangue (WBCs), ligados sobre as partículas superparamagnéticas, ficaram então prontos para a Iise celular.

Para contar o número de WBCs isolados, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada (vide abaixo) com uma gotícula contendo 10 μl de uma solução de 4% de paraformaldeído (Roth) em 0,01 M de PBS/1 % de B SA, misturada (vide abaixo) e incubada a 4°C durante 30 min., e levada sucessivamente em três gotículas contendo 10 μl de 0,01 M PBS/1 % BSA. Após a fixação dos WBCs, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 1 μl do meio de montagem VECTASHIELD® com 4',-diamifíno-2-fenilindol (DAPI) (Vector) misturado e incubado a 4°C durante a noite. Finalmente, os WBCs corados com DAPI foram cobertos com uma folha polimérica impressa de alta resolução (Infinite Graphics) com um tamanho de grade de 500x500 μm, colocados sob um microscópio BX51 system (Olympus), fotografados com uma câmera digital DP70 (Olympus), convertidos em tons de cinza (Fig. 8) e contados com o auxílio do software MetaMorph_V6.1 (MolecularDevices) (Fig. 9).

Lise Celular

Após o isolamento dos WBCs, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 1 μl da mistura PCR, misturada e incubada a 95 °C durante 5 minutos. Após a lise térmica dos WBCs, as partículas superparamagnéticas foram removidas da gotícula contendo a mistura PCR. O DNA genômico liberado estava então pronto para a PCR.

PCR

Um gene de manutenção, gliceraldeído-3- fosfato deidrogenase (GAPDH), foi utilizado como alvo, em que o comprimento amplicon foi de 208 bp (Maxim Biotech). Biotina- GTC ATT TCC TGG TAT GAC AAC GA (SEQ ID NO: 1) e GTC TAC ATG GCA ACT GTG AGG AG (Research Biolabs, SEQ ID NO: 2) foram utilizados como oligonucleotídeos iniciadores direto e reverso, respectivamente. A mistura PCR singleplex foi preparada com base no Kit Taq PCR Core (QIAGEN) em uma solução estoque de 50 μl e continha a seguinte composição: 23,0 μl de H2 O tratado com pirocarbonato de dietila (DEPC) (Invitrogen), 10,0 μl 5x Q-solution, 5,0 μl 5x tampão PCR, 5,0 μl 10 % BSA, 1,0 μl 10 mM dNTPs, 0,5 μl 1:100 SYBR Green (Invitrogen), 2,50 μl 10 μΜ de oligonucleotídeo iniciador direto e inverso e 0,5 μl 5 u μl-1 Taq DNA polimerase. Para essa PCR específica, utilizam-se -1400 WBCs isolados conforme descritos acima como modelo.

As condições de termociclagem foram como se segue: 45 ciclos a 95 °C por 1 min, 58 °C por 1 min, 72 °C por 1 min e 80 °C por 15 s. O valor médio da intensidade de fluorescência durante esse intervalo de 80 °C foi extraído para acompanhar a PCR em tempo real (fig. 10). Para a análise de curva de fusão, a amostrada foi resfriada a 65 °C durante 1 minuto, após o que a temperatura foi elevada continuamente a 95 °C com um gradiente de 0,01 K s"1 (Fig. 11). Finalmente, os produtos da PCR foram analisados por eletroforese capilar usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) (Fig. 12). Após o término da PCR, o produto biotinilado da PCR estava pronto para a PSQ.

PSQ

Para a PSQ, utilizou-se o Kit Reagente Pyro Gold 5x96™ incluindo consumáveis (Biotage). CAT GGC AAC TGT GAG GAG (SEQ ID NO: 3) serviu de oligonucleotídeo iniciador de sequenciamento. Uma gotícula contendo 1 μl de uma suspensão de μg μl-1 de Dybaneads® MyOne™ Streptavidina em 2x tampão de ligação foi combinada (supra) com a gotícula contendo a mistura PCR, misturada e incubada a 65 °C por 15 min. Após a imobilização do produto biotinilado da PCR, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 10 μl de Ix solução de desnaturação, misturada, incubada à temperatura ambiente por 1 min e lavada sucessivamente em duas gotículas contendo 10 μl de Ix tampão de lavagem. Alternativamente, o DNA de fita dupla (ds) poderia ser desnaturado termicamente a 95 °C durante 1 min. Após a desnaturação do DNA ds, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 1 μl de uma solução de 0,3 μΜ de oligonucleotídeo iniciador de sequenciamento em Ix tampão de anelamento, misturada, incubada a 80 °C durante 2 min e resfriada à temperatura ambiente. O DNA de fita única (ss), ligado sobre as partículas superparamagnéticas, estava então pronto para a PSQ. Para verificar a imobilização do DNA ss sobre as partículas superparamagnéticas, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi suspensa em 50 μl Ix tampão de anelamento e seqüenciada em um sistema PSQ™ 96MA comercial (Biotage) (Fig. 13).

Finalmente, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 2,5 μl de uma solução de dGTP, misturada e então combinada com a gotícula contendo 10 μΐ de uma solução 1:1 de mistura de enzima e substrato (Fig. 14).

Purificação por afinidade de uma proteína (proteína verde fluorescente)

Esse exemplo ilustra como uma proteína pode ser purificada usando o método da presente invenção.

Uma gotícula de fluido contendo 1 μΐ de uma fase interna aquosa contendo 50 mM de Tris-HCl pH 7,7, 200 raM de NaCl, 5 mM de EDTA e contas de agarose magnéticas modificadas com Streptavidina (QIAGEN, equivalente a uma suspensão de 4% (p/v)), e uma fase externa de óleo mineral ultrafiltrado (Fluka) pode ser preparada após a lavagem das contas de agarose marcadas com 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma gotícula, contendo 1 μl de um lisado bacteriano bruto (E. coli) contendo proteína verde fluorescente recombinante biotinilada (GFP) no tampão acima (50 mM de Tris-HCl pH 7,7, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA) pode ser combinada com a gotícula contendo as contas de agarose magnéticas. A gotícula obtida pode ser incubada à temperatura ambiente durante 45 min. Em seguida, a gotícula pode ser lavada sucessivamente em três gotículas contendo 10 μm do tampão acima (50 mM de Tris-HCl pH 7,7, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA). A eluição da GFP na gotícula obtida de 1 μΐ pode ser realizada pela combinação com uma gotícula de 25 μΐ contendo 10 mM de biotina no tampão acima, e por mistura por exposição a ondas ultra-sônicas, após o que as contas de agarose magnéticas foram removidas. A quantificação pode ser realizada por qualquer método convencional, tal como a razão de absorção UV a 280 e 260 nm segundo Layne, realizando-se uma reação de cor em uma gotícula de referência, por exemplo, segundo Bradford, separação por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS e uma coragem subseqüente, ou por detecção de fluorescência usando uma solução de referência de GFP de concentração conhecida.

Imunoensaio enzimático (ELÍSA)

Uma gotícula contendo 1 μm de uma suspensão de partículas superparamagnéticas funcionalizadas com carbóxi em 0,1 M de ácido 2-morfolinoetanosulfônico (MES) (Lancaster) foi combinada (supra) com uma gotícula contendo 10 μm de uma solução de 0,2 M de cloridrato de N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (Lancaster) e 0,02 M de N- hidroxisuccinimida (NHS) (AlfaAesar) em 0,1 M MES, misturada, incubada à temperatura ambiente por 1 min, e lavada em uma gotícula contendo 10 μm 0,0 IM de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich). Após a ativação dos grupos carbóxi, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 1 μl de uma solução de 1 μg μl-1 de anti-IgG de camundongo produzido em cabra marcado com fluoresceína (FITC) (molécula inteira) (GtxMs IgG FITC) (Sigma-Aldrich) em 0,01 M de PBS, misturada, incubada à temperatura ambiente por 1 min e lavada em uma gotícula contendo 10 μl de 0,01 M PBS. Após o acoplamento do GtxMs IgG FITC (fig. 15), a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 10 μl de 0,01 M 2-aminoetanol (Sigma- Aldrich), misturada, incubada à temperatura ambiente por 1 min, e lavada sucessivamente em três gotículas contendo 10 μl de 0,01 M PBS/1 % de BSA. Após o capeamento dos grupos éster de succinimida residuais, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 1 μl de uma solução de 1 μg μl- 1 de anti IgG de cabra produzido em coelho marcado com peroxidase (raiz-forte) (HRP) (RbtxGt IgG Fc HRP) (Chemicon) em 0,01 M de PBS/1% de BSA, misturada, incubada à temperatura ambiente por 1 min e lavada sucessivamente em cinco gotículas contendo 10 μl de 0,01 M PBS/1% de BSA ou 10 μl de 0,01 M PBS/0,05% de Tween 20 (Sigma-Aldrich). Após a imunoreação do GtxMs IgG FITC e do RBtxGt IgG Fc HRP, a gotícula contendo as partículas superparamagnéticas foi combinada com uma gotícula contendo 10 μl de uma solução 1:1 de solução de substrato de peroxidase AeB (Bethyl), misturada, incubada por 1-10 min e dividida (vide Fig. 16). Listagem de Seqüência

<110> Agency for Science, Technology and Research <120> Método de processamento de uma amostra biológica e/ou química

<160> 3 <170> MS Word for Windows

<210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <220>

<221> misc_binding <221> misc_ difference <222> 1 <223> oligonucleotídeo iniciador <223> biotinilado

<400> 1

CTCATTTCCT GGTATGACAA CGA 23

<210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> seqüência artificial

<220> <221> misc_binding <223> oligonucleotídeo iniciador <400> 1

GTCTACATGG CAACTGTGAG GAG 23

<210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> seqüência artificial

<220> <221> misc_binding <223> oligonucleotídeo iniciador

<400> 1

CATGGCAACT GTGAGGAG 18

Claims

1. Método de processamento de uma amostra biológica e/ou química, caracterizado por compreender: • proporcionar uma gotícula de fluido, a referida gotícula compreendendo uma fase interna e uma fase externa, em que a fase externa é imiscível com a fase interna, e a fase externa está circundando a fase interna, e em que a fase interna compreende a referida amostra biológica e/ou química, e a fase interna está protegida do ambiente pela fase externa, e em que a referida gotícula de fluido compreende matéria que pode ser atraída magneticamente; • proporcionar pelo menos uma superfície, a superfície tendo tal textura e molhabilidade para o fluido da referida fase interna da gotícula de fluido que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com ela; • dispor a referida gotícula de fluido sobre a referida pelo menos uma superfície; e • realizar um processo na amostra biológica e/ou química na referida gotícula de fluido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase externa da referida gotícula de fluido está circundando a fase interna como uma película.

3. - Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fluido da fase interna da referida gotícula de fluido é um líquido.

4. - Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fluido da fase interna da referida gotícula de fluido é um líquido e o fluido da fase externa da referida gotícula de fluido é um líquido.

5. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a matéria que pode ser atraída magneticamente é selecionada dentre o grupo que consiste de pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente, um fluido magnético, uma bactéria rica em ferro e uma combinação entre eles.

6. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por adicionalmente compreender controlar a posição da referida gotícula de fluido em relação à referida pelo menos uma superfície.

7. - Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que controlar a posição da referida gotícula de fluido em relação à pelo menos uma superfície por meio da exposição da referida gotícula de fluido a um campo magnético ou eletromagnético.

8. - Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que controlar a posição da referida gotícula de fluido em relação à referida pelo menos uma superfície adicionalmente compreende um membro do grupo que consiste em mover a gotícula de fluido alterando o referido campo magnético ou eletromagnético, mover a referida pelo menos uma superfície, e uma combinação entre eles.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que alterar um campo magnético compreende alterar a posição de pelo menos um ímã.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a molhabilidade da referida pelo menos uma superfície para o fluido da referida fase interna da gotícula de fluido é caracterizada por um ângulo de contato de avanço θ na interface de uma gotícula de fluido, que é constituída pelo fluido da fase interna da referida gotícula de fluido, com a referida pelo menos uma superfície de cerca de 50 graus ou maior.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma superfície é selecionada dentre o grupo que consiste de um substrato essencialmente plano, um substrato côncavo, um substrato convexo e qualquer combinação entre eles.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o fluido da referida fase interna da gotícula de fluido é um líquido polar e a referida pelo menos uma superfície é uma superfície apoiar.

13. - Método, de acordo com a reivindicação -12, caracterizado pelo fato de que a superfície apoiar é selecionada dentre o grupo que consiste de silicone, plástico, óxido de silício modificado na superfície, hidreto de silício modificado na superfície, papel modificado na superfície, vidro modificado na superfície, quartzo modificado na superfície, mica modificada na superfície, metal modificado na superfície, óxido metálico modificado na superfície, cerâmica modificada na superfície e qualquer composto desses.

14. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o fluido da referida fase interna da gotícula de fluido é um líquido apoiar e a referida pelo menos uma superfície é uma superfície polar.

15. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que proporcionar a referida gotícula de fluido compreende: proporcionar um primeiro fluido, • proporcionar um segundo fluido que é imiscível com o primeiro fluido, e • dispensar uma gotícula do primeiro fluido sobre o segundo fluido, formando assim uma gotícula de fluido que compreende uma fase interna e uma fase externa, o primeiro fluido formando a fase interna, circundada pelo segundo fluido formando a fase externa.

16. - Método, de acordo com a reivindicação -15, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro fluido é proporcionado primeiro.

17. Método, de acordo com a reivindicação -15, caracterizado pelo fato de que o primeiro fluido, o segundo fluido e a amostra são proporcionados simultaneamente.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que proporcionar a referida gotícula de fluido adicionalmente compreende: • coletar a referida gotícula de fluido compreendendo uma fase interna e uma fase externa, ou parte dela, do referido segundo fluido que está formando a fase externa, formando assim uma gotícula de fluido que compreende uma fase externa circundando a fase interna como uma película.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida fase interna da gotícula de fluido é um líquido polar e a referida fase externa da gotícula de fluido é um líquido apoiar.

20. Método, de acordo com a reivindicação -19, caracterizado pelo fato de que a fase interna da gotícula de fluido é um líquido hidrófilo e a referida fase externa da gotícula de fluido é um líquido hidrófobo.

21. Método, de acordo com a reivindicação -19, caracterizado pelo fato de que o fluido da fase interna é selecionado dentre o grupo que consiste de água, óxido de deutério, óxido de trítio, um álcool, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um éster de um ácido orgânico, um éster de um ácido inorgânico, um éter, uma amina, uma amida, um nitrilo, uma cetona, um detergente iônico, um detergente aniônico, dióxido de carbono, dimetil sulfona, dimetil sulfóxido, um tiol, um dissulfeto e um líquido iônico polar.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o fluido da fase externa é selecionado dentre o grupo que consiste de um óleo mineral, um óleo de silicone, um óleo natural, um líquido de carbono perfluorado, um líquido de carbono parcialmente halogenado, um alcano, um alceno, um alcino, um composto aromático, dissulfeto de carbono e um líquido apoiar iônico.

23. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente é selecionada dentre o grupo que consiste de uma partícula diamagnética, uma partícula ferromagnética, uma partícula paramagnética e uma partícula superparamagnética.

24. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 23, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente compreende um ligante que é capaz de se ligar à matéria-alvo suspeita de estar presente na referida amostra biológica e/ou química.

25. Método, de acordo com a reivindicação -24, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é capaz de ligar seletivamente a matéria-alvo suspeita de estar compreendida na referida amostra biológica e/ou química.

26. Método, de acordo com a reivindicação -24, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é imobilizado na superfície da pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente.

27. Método, de acordo com a reivindicação -26, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é selecionado dentre o grupo que consiste de um éter coroa, um peptídeo, um anticorpo, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, uma proteína baseada na anquirina ou esqueleto cristalino, um avímero, um glucorpo, uma lectina, um ácido nucléico, proteína A, proteína G, uma enzima, um átomo metálico, um nanotubo de carbono, uma nanoespuma de carbono, um corante, streptavidina, amilose, maltose, celulose, quitina, uma matriz extracelular, glutationa, calmodulina, gelatina, poiimixina, heparina, NAD, NADP, lisina, arginina, benzamidina e um alumosilicato.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por adicionalmente compreender expor uma região da referida pelo menos uma superfície a uma condição selecionada dentre o grupo que consiste de uma temperatura alterada, um campo magnético, um campo elétrico, um campo eletromagnético, uma pressão, um comprimento de onda, uma freqüência, uma amplitude, uma concentração química e uma composição química, e em que controlar a posição da referida gotícula de fluido em relação à referida pelo menos uma superfície compreende mover a referida gotícula de fluido para a região da referida pelo menos uma superfície que está sendo exposta à referida condição.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado por adicionalmente compreender proporcionar pelo menos duas superfícies que estão defronte uma à outra, as superfícies tendo tal textura e molhabilidade para o fluido da referida fase interna da gotícula de fluido que a gotícula de fluido permanece intacta ao entrar em contato com elas.

30. Método, de acordo com a reivindicação -29, caracterizado pelo fato de que controlar a posição da referida gotícula de fluido compreende mover a referida gotícula de fluido entre as referidas pelo menos duas superfícies por meio do referido campo magnético ou eletromagnético e/ou movendo pelo menos uma das superfícies.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que realizar um processo na amostra biológica e/ou química compreende uma etapa selecionada dentre o grupo que consiste em combinar a referida gotícula de fluido com uma gotícula de fluido adicional, misturar o interior da gotícula de fluido, filtrar a gotícula de fluido através de outra gotícula de fluido e dividir a gotícula de fluido em pelo menos duas gotículas de fluido filhas.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica e/ou química é exposta a um processo selecionado dentre o grupo que consiste de uma detecção física da matéria- alvo cuja presença é suspeita na amostra, uma reação química, uma reação bioquímica, uma Iise celular, uma extração de uma molécula a partir de um organismo ou uma parte de um organismo e qualquer combinação entre eles.

33. - Método, de acordo com a reivindicação -32, caracterizado pelo fato de que a reação de detecção física é selecionada dentre o grupo que consiste de uma detecção espectroscópica, fotoquímica, fotométrica, fluorométrica, radiológica, elétrica, acústica, eletroquímica, colorimétrica, interferométrica, difraccional e termodinâmica.

34. - Método, de acordo com a reivindicação -32, caracterizado pelo fato de que a reação química é selecionada dentre o grupo que consiste de uma síntese química, uma degradação química, uma síntese enzimática, uma degradação enzimática, uma modificação química, uma modificação enzimática, uma interação com uma molécula de ligação e qualquer combinação entre eles.

35. - Método, de acordo com a reivindicação -34, caracterizado pelo fato de que a síntese enzimática é selecionada dentre o grupo que consiste de uma síntese protéica, uma síntese de ácido nucléico, uma síntese de peptídeo, uma síntese de um composto farmacêutico e qualquer combinação entre eles.

36. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada dentre o grupo que consiste de amostra de solo, amostra do ar, amostra ambiental, amostra de cultura celular, amostra de medula óssea, amostra de precipitação pluviométrica, amostra de precipitação radioativa, amostra de água de esgoto, amostra de lençol aquático, amostra de abrasão, amostra arqueológica, amostra alimentícia, amostra de sangue, amostra de soro, amostra de plasma, amostra de urina, amostra de fezes, amostra de sêmen, amostra de fluido linfático, amostra de fluido cerebroespinhal, amostra de secreção nasofaríngea, amostra de escarro, amostra de esfregaço bucal, amostra de esfregaço da garganta, amostra de esfregaço nasal, amostra de lavagem broncoalveolar, amostra de secreção brônquica, amostra de leite, amostra de líquido amniótico, amostra de biópsia, amostra ungueal, amostra epitelial, amostra de câncer, amostra de tumor, amostra de tecido, amostra celular, amostra de lisado celular, amostra de cultura viral, amostra forense, amostra de infecção, amostra de infecção nosocomial, amostra de produção, amostra de preparação de fármaco, amostra de produção de molécula biológica, amostra de preparação protéica, amostra de preparação de lipídeos, amostra de preparação de carboidratos, solução de um nucleotídeo, solução de polinucleotídeo, solução de um ácido nucléico, solução de um peptídeo, solução de um polipeptídeo, solução de um aminoácido, solução de uma proteína, solução de um polímero sintético, solução de uma composição bioquímica, solução de uma composição química orgânica, solução de uma composição química inorgânica, solução de um lipídeo, solução de um carboidrato, solução de um produto químico combinatório, solução de uma molécula candidata a fármaco, solução de uma molécula de fármaco, solução de um metabólito de fármaco, suspensão de uma célula, suspensão de um vírus, suspensão de um microorganismo, suspensão de um metal, suspensão de uma liga metálica, solução de um íon metálico e qualquer combinação entre eles.

37. Goticuia de fluido, caracterizada por compreender uma fase interna e uma fase externa, e pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente, em que a fase externa é imiscível com a fase interna, e a fase externa está circundando a fase interna e em que a fase interna é protegida do ambiente pela fase externa, e em que a referida partícula que pode ser atraída magneticamente compreende um ligante que é capaz de se ligar à matéria-alvo suspeita de estar presente em uma amostra biológica e/ou química.

38. Gotícula de fluido, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a fase externa da referida gotícula de fluido está circundando a fase interna como uma película.

39. Gotícula de fluido, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que o fluido da fase interna da referida gotícula de fluido é um líquido.

40. Gotícula de fluido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que o fluido da fase interna da referida gotícula de fluido é um líquido e o fluido da fase externa da referida gotícula de fluido é um líquido.

41. Gotícula de fluido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de que a fase interna da gotícula de fluido é um líquido polar e a fase externa da gotícula de fluido é um líquido apoiar.

42. Gotícula de fluido, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a fase interna da gotícula de fluido é um líquido hidrófilo e a fase externa da gotícula de fluido é um líquido hidrófobo.

43. Gotícula de fluido, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o fluido da fase interna é selecionado dentre o grupo que consiste de água, óxido de deutério, óxido de trítio, um álcool, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, ura éster de um ácido orgânico, um éster de um ácido inorgânico, um éter, uma amina, uma amida, um nitrilo, uma cetona, um detergente iônico, um detergente aniônico, dióxido de carbono, dimetil sulfona, dimetil sulfóxido, um tiol, um dissulfeto e um líquido iônico polar.

44. Gotícula de fluido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizada pelo fato de que o fluido da fase externa é selecionado dentre o grupo que consiste de um óleo mineral, um óleo de silicone, um óleo natural, um líquido de carbono perfluorado, um líquido de carbono parcialmente halogenado, um alcano, um alceno, um alcino, um composto aromático, dissulfeto de carbono e um líquido iônico apoiar.

45. Gotícula de fluido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 44, caracterizada pelo fato de que a referida pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente é selecionada dentre o grupo que consiste de uma partícula diamagnética, uma partícula ferromagnética, uma partícula paramagnética e uma partícula superparamagnética.

46. Gotícula de fluido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 45, caracterizada pelo fato de que o referido ligante é imobilizado na superfície da pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente.

47. Gotícula de fluido, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o referido ligante é selecionado dentre o grupo que consiste de um éter coroa, um peptídeo, um anticorpo, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, uma proteína baseada na anquirina ou esqueleto cristalino, um avímero, um glucorpo, uma lectina, um ácido nucléico, proteína A, proteína G, uma enzima, um átomo metálico, um nanotubo de carbono, uma nanoespuma de carbono, um corante, streptavidina, amilose, maltose, celulose, quitina, uma matriz extracelular, glutationa, calmodulina, gelatina, polimixina, heparina, NAD, NADP, lisina, arginina, benzamidina e um alumosilicato.

48. Método para formar uma gotícula de fluido, a qual compreende uma fase interna, uma fase externa e pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente, o referido método sendo caracterizado por compreender proporcionar um primeiro fluido, proporcionar um segundo fluido que é imiscível com o primeiro fluido, colocar em contato o primeiro fluido e o segundo fluido, formando assim uma gotícula de fluido que compreende uma fase interna e uma fase externa, o primeiro fluido formando a fase interna, circundada pelo segundo fluido formando a fase externa, proporcionar pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente, dispor a referida pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente na gotícula de fluido, em que a referida partícula que pode ser atraída magneticamente compreende um ligante que é capaz de se ligar à matéria-alvo suspeita de estar presente em uma amostra biológica e/ou química.

49. - Método, de acordo com a reivindicação -48, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro fluido é proporcionado primeiro.

50. - Método, de acordo com a reivindicação -48, caracterizado pelo fato de que o primeiro fluido e o segundo fluido são proporcionados simultaneamente.

51. — Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma partícula que pode ser atraída magneticamente é disposta no primeiro fluido antes de a referida gotícula do primeiro fluido ser dispensada no segundo fluido.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizado pelo fato de que colocar em contato o primeiro fluido e o segundo fluido inclui dispensar uma gotícula do primeiro fluido sobre o segundo fluido.