BR122024009210A2 - Método para identificar uma cepa microbiana, composição e método para aumentar a fixação de nitrogênio em uma planta não leguminosa - Google Patents

Abstract

São fornecidos métodos e sistemas para geração e utilização de uma composição bacteriana que compreende pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola que foi fertilizado com mais do que 9,07 kg de nitrogênio por acre.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório N° 62/445.570, depositado em 12 de janeiro de 2017; Pedido U.S. Provisório N° 62/445.557, depositado em 12 de janeiro de 2017; Pedido U.S. Provisório N° 62/447.889, depositado em 18 de janeiro de 2017; Pedido U.S. Provisório N° 62/467.032, depositado em 3 de março de 2017; Pedido U.S. Provisório N° 62/566.199, depositado em 29 de setembro de 2017; e Pedido U.S. Provisório N° 62/577.147, depositado em 25 de outubro de 2017, cujos pedidos são incorporados nesse relatório descritivo por referência.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada pelo presente por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 3 de janeiro de 2018, é denominada 47736-707_601_SL.txt e tem aproximadamente 599 kb de tamanho.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À PESQUISA COM FINANCIAMENTO FEDERAL

[003] Essa invenção foi feita com o suporte do governo dos Estados Unidos United sob a SBIR concessão 1520545 outorgada pela “National Science Foundation”. O governo possui certos direitos no assunto revelado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] As plantas estão ligadas ao microbioma por meio de um metaboloma compartilhado. Um relacionamento multidimensional entre um traço de plantio particular e o metaboloma subjacente é caracterizado por uma paisagem com diversos máximos locais. A otimização de um máximo local inferior para outro que representa um traço melhor por alteração da influência do microbioma sobre o metaboloma pode ser desejável por várias razões como, por exemplo, para otimização do plantio. É necessário que abordagens economicamente, ambientalmente e socialmente sustentáveis para a agricultura e produção de alimentos atendam às necessidades de uma população global em crescimento. Por volta de 2050 a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas projeta que a produção total de alimentos deva aumentar por 70% até atender às necessidades da população em crescimento, um desafio que é exacerbado por diversos fatores, incluindo a diminuição de fontes de água fresca, a competição crescente por terra arável, o aumento dos preços da energia, os custos crescentes de insumos e a necessidade provável de que os plantios se adaptem às pressões de um clima global mais seco, mais quente e mais extremo.

[005] Uma área de interesse é no aprimoramento da fixação de nitrogênio. O gás nitrogênio (N2) é um componente importante da atmosfera da Terra. Além disso, o nitrogênio elementar (N) é um componente importante de muitos compostos químicos que constituem organismos vivos. No entanto, muitos organismos não conseguem usar N2 diretamente para sintetizar as substâncias químicas em processos fisiológicos, por exemplo, crescimento e reprodução. A fim de utilizar o N2, o N2 deve ser combinado com hidrogênio. A combinação de hidrogênio com N2 é denominada fixação de nitrogênio. A fixação de nitrogênio, seja ela obtida quimicamente ou biologicamente, exige um investimento de grandes quantidades de energia. Em sistemas biológicos, uma enzima conhecida como nitrogenase catalisa a reação que resulta em fixação de nitrogênio. Um objetivo importante da pesquisa em fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo às plantas não leguminosas, particularmente às gramíneas agronômicas importantes como, por exemplo, trigo, arroz e milho. Apesar do enorme progresso na compreensão do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbios e legumes, o caminho para utilizar aquele conhecimento para induzir nódulos de fixação de nitrogênio em plantios não leguminosos ainda não está claro. Enquanto isso, o desafio do fornecimento de fontes suplementares suficientes de nitrogênio, por exemplo, em fertilizante, continuará a aumentar com a necessidade crescente por uma produção aumentada de alimentos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Um aspecto da invenção fornece uma composição bacteriana que compreende pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola que foi fertilizado com mais do que 20 lbs (9,07 kg) de nitrogênio por acre.

[007] Outro aspecto da invenção fornece uma composição bacteriana que compreende pelo menos uma cepa bacteriana que foi criada para fixar nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola que foi fertilizado com mais do que 20 lbs (9,07 kg) de nitrogênio por acre.

[008] Um aspecto adicional da invenção fornece uma composição bacteriana que compreende pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico, a (pelo menos um) cepa bacteriana modificada geneticamente compreendendo DNA adicionado exogenamente, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 80% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[009] Um aspecto adicional da invenção fornece uma composição de semente que compreende uma semente de uma planta que é inoculada com uma composição bacteriana.

[010] Outro aspecto da invenção fornece um método de crescimento de um plantio usando diversas sementes que possuem uma composição de semente que é inoculada com uma composição bacteriana.

[011] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aplicação de uma composição bacteriana a um campo.

[012] Um aspecto adicional da invenção fornece a composição de fertilizante que compreende uma composição bacteriana.

[013] Outro aspecto da invenção fornece um método de manutenção dos níveis de nitrogênio do solo. O método compreende o plantio, no solo de um campo, de um plantio inoculado por uma bactéria modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico. O método também compreende a colheita do referido plantio, em que no máximo 90% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[014] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de liberação de um suplemento probiótico a uma planta de plantio. O método compreende o revestimento de uma semente de plantio com um revestimento de semente, tratamento de semente ou tratamento químico de sementes. O referido revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente compreende representativos vivos do referido probiótico. Adicionalmente, o método compreende a aplicação, no solo de um campo, das referidas sementes de plantio.

[015] Em um aspecto adicional da invenção, a cepa bacteriana modificada geneticamente é uma cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente. Em alguns casos, a cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente possui um nível de expressão alterado de um regulador de um cluster Nif. Em alguns casos, a cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente expressa uma quantidade diminuída de um regulador negativo de um cluster Nif. Em alguns casos, a cepa bacteriana modificada geneticamente expressa uma quantidade diminuída de GlnR. Em alguns casos, o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”. Em alguns casos, o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”. Em alguns casos, o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”. Em alguns casos, o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”.

[016] Outro aspecto da invenção fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não- leguminosa. O método compreende a aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, a referida pluralidade compreendendo bactérias não-intergenéricas que (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta. Além disso, cada membro das diversas bactérias não- intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não- intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[017] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não- leguminosa. O método compreende a aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, a referida pluralidade compreendendo bactérias não-intergenéricas que (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e/ou (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta. Além disso, cada membro das diversas bactérias não- intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não- intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[018] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de melhoramento de cepas microbianas para aprimorar traços específicos de relevância agronômica. O método compreende o fornecimento de diversas cepas microbianas que possuem a habilidade para colonizar um plantio desejado. O método também compreende o aprimoramento de redes reguladoras que influenciam o traço por meio de rearranjo intragenômico. Além disso, o método compreende a avaliação de cepas microbianas dentro da pluralidade de cepas microbianas para determinar uma medição do traço. Adicionalmente, o método compreende a seleção de uma ou mais cepas microbianas da pluralidade de cepas microbianas que geram um aprimoramento no traço na presença do plantio desejado.

[019] Outro aspecto da invenção fornece um método de melhoramento de cepas microbianas para aprimorar traços específicos de relevância agronômica. O método compreende o fornecimento de diversas cepas microbianas que possuem a habilidade para colonizar um plantio desejado. O método também compreende a introdução de diversidade genética na pluralidade de cepas microbianas. Adicionalmente, o método compreende a avaliação de cepas microbianas dentro da pluralidade de cepas microbianas para determinar uma medição do traço. Além disso, o método compreende a seleção de uma ou mais cepas microbianas da pluralidade de cepas microbianas que geram um aprimoramento no traço na presença do plantio desejado.

[020] Outro aspecto da invenção fornece um método de aumento da quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta não-leguminosa. O método compreende a exposição da referida planta não-leguminosa a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio ou pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[021] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho. O método compreende a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente que compreendem variações genéticas criadas geneticamente dentro de pelo menos dois genes selecionados do grupo que consiste em nifL, glnB, glnE e amtB.

[022] Outro aspecto da invenção fornece um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho. O método compreende a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente que compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, produzem pelo menos 5% de nitrogênio fixado na referida planta de milho, como medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[023] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não- leguminosa. O método compreende a aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, a referida pluralidade compreendendo bactérias não-intergenéricas que (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora. Além disso, as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta. Adicionalmente, cada membro das diversas bactérias não-intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não-intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[024] Outro aspecto da invenção fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não- leguminosa. O método compreende a aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias, a referida pluralidade compreendendo bactérias que: (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e/ou (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, as diversas bactérias, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[025] Um aspecto adicional da invenção fornece uma população bacteriana não intergenérica capaz de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, que compreende uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas que (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e/ou (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta desenvolvida na presença das diversas bactérias não-intergenéricas. Além disso, cada membro das diversas bactérias não-intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não-intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[026] Um aspecto adicional da invenção fornece uma população bacteriana capaz de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, a população bacteriana compreendendo uma pluralidade de bactérias que: (i) possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou (ii) produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora. Adicionalmente, as diversas bactérias, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[027] Em outro aspecto da invenção, é fornecida uma bactéria que: (i) possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e/ou (ii) produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[028] Em um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma bactéria não intergenérica que compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que a bactéria não intergenérica seja capaz de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno, e em que a referida bactéria (i) possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e/ou (ii) produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[029] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para aumento da fixação de nitrogênio em uma planta, que compreende a administração à planta de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284295; e/ou uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303; e em que a planta administrada com a quantidade eficaz da composição exibe um aumento na fixação de nitrogênio, como comparada com uma planta que não recebeu a administração da composição.

[030] Um aspecto adicional da invenção fornece uma bactéria isolada que compreende uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295; e/ou uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

[031] Outro aspecto da invenção fornece um método de detecção de uma sequência de junção não nativa, que compreende: a amplificação de uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

[032] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de detecção de uma sequência de junção não nativa, que compreende: a amplificação de uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para pelo menos um fragmento de 10 pares de bases contíguas contido nos IDS. DE SEQ. Nos: 372-405, o referido fragmento de pares de bases contíguas sendo composto por nucleotídeos na interseção de: uma sequência upstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 304-337 e sequência downstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 338-371.

[033] Um aspecto adicional da invenção fornece uma sequência de junção não nativa que compreende uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

[034] Um aspecto adicional da invenção fornece uma sequência de junção não nativa que compreende uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para pelo menos um fragmento de 10 pares de bases contíguas contido nos IDS. DE SEQ. Nos: 372-405, o referido fragmento de pares de bases contíguas sendo composto por nucleotídeos na interseção de: uma sequência upstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 304-337 e sequência downstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 338-371.

[035] Um aspecto adicional da invenção fornece uma composição bacteriana que compreende pelo menos uma cepa bacteriana remodelada que fixa nitrogênio atmosférico, a (pelo menos uma) cepa bacteriana remodelada compreendendo DNA adicionado exogenamente, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 80% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[036] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de manutenção dos níveis de nitrogênio do solo. O método compreende o plantio, no solo de um campo, de um plantio inoculado por uma bactéria remodelada que fixa nitrogênio atmosférico. O método também compreende a colheita do referido plantio, em que no máximo 90% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[037] Outro aspecto da invenção fornece um método de liberação de um suplemento probiótico a uma planta de plantio. O método compreende o revestimento de uma semente de plantio com um revestimento de semente, tratamento de semente ou tratamento químico de sementes, em que o referido revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente compreende representantes vivos do referido probiótico. O método também compreende aplicação das referidas sementes de plantio no solo de um campo.

[038] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aumento da quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta não-leguminosa. O método compreende a exposição da referida planta não-leguminosa a micróbios não intergenéricos remodelados, os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio ou pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[039] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho. O método compreende a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos remodelados que compreendem variações genéticas remodeladas dentro de pelo menos dois genes selecionados do grupo que consiste em nifL, glnB, glnE e amtB.

[040] Outro aspecto da invenção fornece um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho. O método compreende a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos remodelados que compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, produzem pelo menos 5% de nitrogênio fixado na referida planta de milho, como medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[041] Aspectos adicionais da invenção fornecem gênero de micróbios que são evoluídos e otimizados para fixação de nitrogênio in planta em plantios de não leguminosas. Em particular, são revelados métodos de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa. Os métodos podem compreender a exposição da planta a uma pluralidade de bactérias. Cada membro da pluralidade compreende uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes de polinucleotídeos não-codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio de bactérias, de modo que as bactérias sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno. As bactérias não são microorganismos intergenéricos. Adicionalmente, as bactérias, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[042] Aspectos adicionais da invenção fornecem micróbios isolados e composições microbianas benéficas. Em particular, são fornecidos microorganismos isolados e biologicamente puros que possuem aplicações, inter alia, no aumento da fixação de nitrogênio em um plantio. O microorganismo revelado pode ser utilizado em seus estados isolados e biologicamente puro, bem como serem formulado em composições. Além disso, a revelação fornece composições microbianas que contêm pelo menos dois membros dos microorganismos revelados, bem como métodos de utilização das referidas composições microbianas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[043] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são incorporados neste relatório descritivo por referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[044] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações em anexo. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à descrição detalhada seguinte que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e nos desenhos que a acompanham, dos quais:

[045] As Figuras 1A-B retratam o enriquecimento e isolamento de bactérias de fixação de nitrogênio. (A) Placa de ágar de Nfb foi usada para isolar colônias únicas de bactérias de fixação de nitrogênio. (B) Ágar Nfb semi-sólido fundido em tubo de Balch. A seta aponta para película de bactérias de fixação de nitrogênio enriquecidas.

[046] A Figura 2 retrata uma avaliação por PCR representativa de nifH. Bandas positivas foram observadas a aproximadamente 350 bp para duas colônias nessa avaliação. Bandas inferiores representam dímeros de iniciadores.

[047] A Figura 3 retrata um exemplo de uma avaliação por PCR de colônias de mutagênese CRISPR-Cas-selecionada. Colônias de CI006 foram avaliadas com iniciadores específicos para o lócus de nifL. O produto de PCR do tipo selvagem é esperado a aproximadamente 2,2 kb, enquanto o mutante é esperado a aproximadamente 1,1 kb. Sete de dez colônias avaliadas exibem inequivocamente a deleção desejada.

[048] As Figuras 4A-D retratam fenótipos in vitro de várias cepas. As atividades no Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) de mutantes da cepa CI010 (Figura 4A) e mutantes da cepa CI006 (Figura 4B) desenvolvidos em meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina. As atividades no ARA de cepas adicionais são mostradas na Figura 4C, e o perfil de excreção de amônio através do tempo de duas cepas é mostrado na Figura 4D.

[049] A Figura 5 retrata o perfil de expressão em cultura de 9 genes diferentes em cepas CI006 envolvidas em fixação de nitrogênio diazotrófica. Os números representam contagens de cada transcrito. Várias condições (0, 1, 10 mM de Glutamina e 0%, 10%, 20% de ar atmosférico em N2) são indicadas.

[050] A Figura 6 retrata a colonização por CI006 de raízes de milho. Plântulas de milho foram inoculadas com CI006 que abriga um plasmídeo de expressão de RFP. Após duas semanas de crescimento e manutenção do plasmídeo por meio de irrigação com o antibiótico apropriado, as raízes foram colhidas e tiveram imagens obtidas por meio de microscopia de fluorescência. É observada colonização do espaço intercelular da raiz.

[051] A Figura 7 retrata o nível de nitrogênio derivado de micróbio na cepa WT (CI050) e otimizada (CM002).

[052] A Figura 8 mostra uma configuração experimental para um ensaio de massa de frutificação Micro-Tom.

[053] A Figura 9 mostra uma avaliação de 10 cepas quanto ao aumento em massa do fruto da planta por Micro-Tom. Resultados para seis réplicas são apresentados. Para a coluna 3, p = 0,07. Para a coluna 7, p = 0,05.

[054] As Figuras 10A-C retratam resultados adicionais para atividades no ARA de micróbios candidatos e mutantes candidatos correspondentes desenvolvidos em meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina.

[055] A Figura 11 retrata um mutante duplo que exibe excreção de amônia maior do que o mutante único do qual foi derivado.

[056] A Figura 12 retrata NDFA obtido do experimento de Captação de Gás 15N (extrapolado de volta usando dias expostos) para medir NDFA em plantas de milho em condição fertilizada.

[057] A Figura 13 retrata o valor de NDFA obtido do experimento de Captação de Gás 15N (extrapolado de volta usando dias expostos) para medir NDFA em plantas de Setaria em condição fertilizada.

[058] A Figura 14A retrata a taxa de incorporação de gás 15N. Plantas inoculadas com cepa evoluída mostraram aumento na incorporação de gás 15N, comparadas com plantas não inoculadas.

[059] A Figura 14B retrata 4 semanas após o plantio, até 7% do nitrogênio em plantas inoculadas com uma cepa evoluída são derivados de nitrogênio fixado de forma microbiana.

[060] A Figura 14C retrata que a área da folha (e outra medição de biomassa, dados não mostrados) está aumentada em plantas inoculadas com uma cepa evoluída, quando comparadas com plantas não inoculadas ou plantas do tipo selvagem inoculadas.

[061] A Figura 15A retrata cepas evoluídas que exibem produção de nifH significantemente maior no tecido de raiz, como medido por estudo transcriptômico in planta.

[062] A Figura 15B retrata que a taxa de nitrogênio fixado encontrada em tecido de plantas está correlacionada com a taxa na qual aquela particular planta é colonizada por cepa HoME optimizada.

[063] A Figura 16A retrata um mapa de textura do solo de vários solos de campo testados quanto à colonização. Solos nos quais poucos micróbios são originalmente derivados estão indicados como estrelas.

[064] A Figura 16B retrata a taxa de colonização da Cepa 1 e da Cepa 5 que são testadas através de quatro tipos de solos diferentes (círculos). Ambas as cepas mostraram perfil de colonização relativamente robusto através de vários tipos de solos.

[065] A Figura 16C retrata a colonização de Cepa 1 como testada em um experimento de campo ao longo da duração de uma estação de cultivo. A Cepa 1 persiste no tecido de milho até 12 semanas após o plantio e começa a exibir declínio em colonização após aquele tempo.

[066] A Figura 17A retrata uma representação esquemática de melhoramento de micróbios, de acordo com modalidades.

[067] A Figura 17B retrata uma visão expandida da medição de composição do microbioma como mostrado na Figura 17A.

[068] A Figura 17C retrata amostragem de raízes utilizadas no Exemplo 7.

[069] A Figura 18 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006.

[070] A Figura 19 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019.

[071] A Figura 20 retrata um mapa de calor das libras de nitrogênio liberadas por acre-estação por micróbios da presente revelação registradas em função de micróbios por g de peso fresco por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que uma libra de nitrogênio por acre- estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que uma libra de nitrogênio por acre-estação. A tabela abaixo o mapa de calor dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora) juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os micróbios utilizados no mapa de calor foram testados quanto à produção de N em milho. Para as cepas WT CI006 e CI019, dados da colonização da raiz de milho foram obtidos de um único local do campo. Para as cepas restantes, presumiu-se que a colonização é a mesma que o nível de campo WT. A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio ARA in vitro a 5 mM de glutamina.

[072] A Figura 21 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas à cepa CI006. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[073] A Figura 22 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas à cepa CM029. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[074] A Figura 23 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas à cepa CM038. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[075] A Figura 24 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas à cepa CI019. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[076] A Figura 25 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas à cepa CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[077] A Figura 26 retrata o rendimento de planta de plantas que foram expostas às cepas CM029 e CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[078] A Figura 27 retrata o rendimento de planta de plantas como o ganho/perda agregado por alqueire. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde do tratamento com MRTN particular. O eixo-x é o valor-p e o eixo-i é a taxa de sucesso.

[079] As Figuras 28A-28E ilustram micróbios derivados que fixam e excretam nitrogênio in vitro sob condições similares aos solos agrícolas ricos em nitrato. A Figura 28A ilustra a rede reguladora que controla a fixação e assimilação de nitrogênio em PBC6.1, que é mostrado, incluindo os nós cruciais NifL, NifA, GS, GlnE retratados como a enzima de dois domínios ATase-AR, e AmtB. Figura 28B ilustra o genoma de Kosakonia sacchari; isolado PBC6.1 é mostrado. As três trilhas que circunscrevem o genoma transmitem dados de transcrição de PBC6.1, PBC6.38 e a expressão diferencial entre as cepas, respectivamente. A Figura 28C ilustra o grupamento do gene de fixação de nitrogênio e os dados de transcrição estão expandidos para um detalhe mais fino. A Figura 28D ilustra a atividade de nitrogenase sob concentrações variáveis de nitrogênio exógeno, que é medida com o ensaio de redução de acetileno. A cepa do tipo selvagem exibe repressão da atividade de nitrogenase à medida que as concentrações de glutamina aumentam, enquanto cepas derivadas exibem graus variáveis de robustez. Barras de erro representam erro-padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas. A Figura 28E ilustra que a excreção temporal de amônia por cepas derivadas é observada em concentrações de mM. Parece que cepas do tipo selvagem não excretam nitrogênio fixado, e amônia desprezível se acumula nos meios. Barras de erro representam erro-padrão da média.

[080] As Figuras 29A-29C ilustram experimentos em estufa que demonstram fixação microbiana de nitrogênio em milho. A Figura 29A ilustra a colonização por micróbios seis semanas após inoculação de plantas de milho por cepas derivadas de PBC6.1. Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos oito réplicas biológicas. A Figura 29B ilustra transcrição in planta de nifH medida por extração de RNA total de raízes e subsequente análise por Nanostring. Somente cepas derivadas exibem transcrição nifH no ambiente da raiz. Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos 3 réplicas biológicas. A Figura 29C ilustra a fixação microbiana de nitrogênio medida pela diluição de traçador isotópico em tecidos de plantas. Micróbios derivados exibem transferência substancial de nitrogênio fixado à planta. Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos dez réplicas biológicas.

[081] A Figura 30 ilustra a colonização de PBC6.1 até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz em raízes de milho. Os dados de abundância se baseiam em on sequenciamento do amplicon 16S da rizosfera e endosfera de plantas de milho inoculadas com PBC6.1 e desenvolvidas em condições de estufa.

[082] A Figura 31 ilustra taxas transcricionais de nifA em cepas derivadas de PBC6.1 correlacionadas com redução de taxas de acetileno. Um ensaio ARA foi realizado como descrito nos Métodos, e depois as culturas tiveram amostras coletadas e submetidas à análise por qPCR para determinar os níveis de transcrito de nifA. Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas em cada medição.

[083] A Figura 32 ilustra resultados de um experimento de testagem de campo do verão de 2017. Os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação podem servir como um substituto de fertilizante potencial. Por exemplo, a utilização de um micróbio da revelação (ou seja, 6-403) resultou em um rendimento maior do que a cepa do tipo selvagem (WT) e um rendimento maior do que o controle não tratado (UTC). O tratamento “-25 lbs N” utiliza 25 libras menos N por acre do que práticas agrícolas padronizadas da região. O tratamento UTC “100% N” visa retratar práticas agrícolas padronizadas da região, nas quais 100% da utilização-padrão de N são distribuídos pelo fazendeiro. O micróbio “6-403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela A. Esse é um Kosakonia sacchari mutante (também denominado CM037) e é uma cepa mutante da prole de CI006 WT.

[084] A Figura 33 ilustra resultados de um experimento de testagem de campo do verão de 2017. Os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação têm um desempenho consistente através de localizações. Além disso, os resultados de rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm um bom desempenho tanto em um ambiente com estresse de nitrogênio, quanto em um ambiente que possui abastecimentos suficientes de nitrogênio. O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “6-404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela A. A condição de “Estresse de Nutriente” corresponde ao regime de 0% de nitrogênio. A condição de “Fertilizante Suficiente” corresponde ao regime de 100% de nitrogênio.

[085] A Figura 34 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006 (também denominada “6”, Kosakonia sacchari WT).

[086] A Figura 35 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019 (também denominada “19”, Rahnella aquatilis WT).

[087] A Figura 36 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI137 (também denominada (“137”, Klebsiella variicola WT).

[088] A Figura 37 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 1021 (Kosakonia pseudosacchari WT).

[089] A Figura 38 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 910 (Kluyvera intermedia WT).

[090] A Figura 39 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 63 (Rahnella aquatilis WT).

[091] A Figura 40 retrata um mapa de calor das libras de nitrogênio liberadas por acre-estação por micróbios da presente revelação registradas em função de micróbios por g de peso fresco por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que uma libra de nitrogênio por acre- estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que uma libra de nitrogênio por acre-estação. A Tabela C no Exemplo 12 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora) juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os dados na Figura 40 são derivados de cepas microbianas testadas quanto à produção de N em milho em condições de campo. Cada ponto representa libras de N/acre produzidas por um micróbio usando dados da colonização da raiz de milho de um único local do campo. A atividade de fixação de N foi determinada usando ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

[092] A Figura 41 retrata um mapa de calor das libras de nitrogênio liberadas por acre-estação por micróbios da presente revelação registradas em função de micróbios por g de peso fresco por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que uma libra de nitrogênio por acre- estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que uma libra de nitrogênio por acre-estação. A Tabela D no Exemplo 12 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora) juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os dados na Figura 41 são derivados de cepas microbianas testadas quanto à produção de N em milho em condições de laboratório e de estufa. Cada ponto representa libras de N/acre produzidas por uma única cepa. Pontos brancos representam cepas nas quais os dados da colonização da raiz de milho foram reunidos em condições de estufa. Pontos pretos representam cepas mutantes para as quais os níveis de colonização da raiz de milho são derivados de níveis de campo médios de colonização da raiz de milho da cepa progenitora do tipo selvagem. Pontos hachurados representam as cepas progenitoras do tipo selvagem em seus níveis de campo médios de colonização da raiz de milho. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada por ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[093] Embora várias modalidades da invenção tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que essas modalidades são oferecidas apenas como exemplo. Diversas variações, alterações e substituições podem ocorrer àqueles habilitados na técnica, sem se afastar da invenção. Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas.

[094] A utilização aumentada de fertilizantes traz com ela preocupações ambientais e também provavelmente não é possível para muitas regiões do globo que sofrem economicamente. Além disso, muitos participantes da indústria na arena microbiana estão concentrados na criação de micróbios intergenéricos. No entanto, há uma carga reguladora pesada colocada sobre micróbios modificados geneticamente que sejam caracterizados/classificados como intergenéricos. Esses micróbios intergenéricos enfrentam não apenas uma carga reguladora maior, o que torna a adoção e implementação disseminadas difíceis, mas também enfrentam um grande escrutínio da percepção pública.

[095] Atualmente, não há micróbios modificados geneticamente no mercado que sejam não intergenéricos e que sejam capazes de aumento da fixação de nitrogênio em plantios de não leguminosas. Essa carência de um micróbio desse tipo é um elemento ausente no auxílio a conduzir para um sistema agrícola do século XXI verdadeiramente ambientalmente amigável e mais sustável.

[096] A presente revelação soluciona os problemas mencionados anteriormente e fornece um micróbio não intergenérico que foi modificado geneticamente para fixar prontamente nitrogênio em plantios. Esses micróbios não são caracterizados/classificados como micróbios intergenéricos e, dessa forma, não enfrentarão as cargas reguladoras pesadas destes. Além disso, os micróbios não intergenéricos ensinados servirão a ajudar aos fazendeiros do século XXI a serem menos dependentes da utilização de quantidades sempre crescentes de fertilizante de nitrogênio exógeno. Definições

[097] Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucléico” e “oligonucleotídeo” são usados de forma intercambiável. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definidos por análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA interferente curto (siRNA), RNA de hairpin curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucléico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação.

[098] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson Crick, ligação de Hoogstein, ou qualquer outra forma sequência-específica de acordo com a complementaridade de bases. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura de duplexo, três ou mais fitas que formam um complexo de múltiplas fitas, uma única fita auto-hibridizante, ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extenso, por exemplo, a iniciação de PCR, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequência é denominada o “complemento” da primeira sequência. O termo “hibridizável”, como aplicado a um polinucleotídeo, se refere à habilidade do polinucleotídeo para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo em uma reação de hibridização.

[099] “Complementaridade” se refere à habilidade de um ácido nucléico para formar ligação (ou ligações) hidrogênio com outra sequência de ácidos nucléicos por Watson-Crick tradicional ou por tipos não tradicionais. Um percentual de complementaridade indica a percentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucléico que pode formar ligações hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson- Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucléicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 que são 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). “Perfeitamente complementar” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucléicos terão ligação hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucléicos. O termo “substancialmente complementar”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou se refere a dois ácidos nucléicos que hibridizam sob condições rigorosas. A “identidade de sequência”, por exemplo, com o objetivo de avaliar o percentual de complementaridade, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado incluindo, sem limitação, o algoritmo de Needleman-Wunsch (veja, por exemplo, o alinhador “EMBOSS Needle” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados), o algoritmo de BLAST (veja, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com ajustes padronizados), ou o algoritmo de Smith-Waterman (veja, por exemplo, a alinhador “EMBOSS Water” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/ nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados). O alinhamento ótimo pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padronizados.

[100] Em geral, “condições rigorosas” para hibridização se referem às condições sob as quais um ácido nucléico que possui complementaridade para uma sequência-alvo hibridiza predominantemente com uma sequência-alvo, e substancialmente não hibridiza para sequências não-alvo. Condições rigorosas são geralmente sequência-dependentes, e variam dependendo de diversos fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, maior a temperatura na qual a sequência hibridiza especificamente para sua sequência-alvo. Exemplos não limitantes de condições rigorosas são descritos em detalhe em Tijssen (1993), “Laboratory Technniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I”, Segundo Capítulo “Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assay”, Elsevier, N.Y.

[101] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (por exemplo, em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente denominados “produto gênico”. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, “expressão” pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[102] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, por formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, por exemplo, conjugação com um componente de marcação. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido” se refere aos aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos incluindo, glicina e os isômeros ópticos tanto D quanto L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[103] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “cerca de” é usado de forma sinônima com o termo “aproximadamente.” Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de” com relação a uma quantidade indica que valores ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% até 10%.

[104] O termo “cultura biologicamente pura” ou “cultura substancialmente pura” se refere a uma cultura de uma espécie bacteriana descrita nesse relatório descritivo que não contém nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.

[105] O termo “produtividade de planta” se refere geralmente a qualquer aspecto de crescimento ou desenvolvimento de uma planta que é uma razão pela qual a planta é desenvolvida. Para plantios de alimentos, por exemplo, grãos ou vegetais, “produtividade de planta” pode se referir ao rendimento de grãos ou frutos colhidos de um plantio particular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “produtividade de planta aumentada” se refere amplamente a aumentos no rendimento de grãos, frutos, flores, ou outras partes de plantas colhidas para várias finalidades, aumentos no crescimento de partes de plantas, incluindo caules, folhas e raízes, promoção de crescimento de plantas, manutenção de alto teor de clorofila em folhas, aumento dos números de frutos ou sementes, aumento do peso unitário de frutos ou sementes, redução da emissão de NO2 em função de utilização reduzida de fertilizante de nitrogênio e aumentos similares do crescimento e desenvolvimento de plantas.

[106] Micróbios dentro e em torno de plantios de alimentos podem influenciar os traços daqueles plantios. Traços de plantas que podem ser influenciados por micróbios incluem: rendimento (por exemplo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento do fruto, florescimento); nutrição (por exemplo, aquisição de nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal, tolerância térmica); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). Estratégias para alteração de traços de plantio incluem: aumento das concentrações de metabólitos cruciais; alteração da dinâmica temporal da influência do micróbio sobre metabólitos cruciais; ligação da produção/degradação de metabólitos microbianos a novas pistas ambientais; redução de metabólitos negativos; e aumento do equilíbrio de metabólitos ou proteínas subjacentes.

[107] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência de controle” se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.

[108] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “in planta” se refere a na planta, e em que a planta ainda compreende partes de plantas, tecido, folhas, raízes, caules, semente, óvulos, pólen, flores, fruto etc.

[109] Em algumas modalidades, sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente revelação são substituídas com uma ou mais sequências de controle intragenéricas.

[110] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “introduzido” se refere à introdução por meio de biotecnologia moderna, e não uma introdução de ocorrência natural.

[111] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação foram modificadas de tal modo que não são bactérias de ocorrência natural.

[112] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 ufc, 104 ufc, 105 ufc, 106 ufc, 107 ufc, 108 ufc, 109 ufc, 1010 ufc, 1011 ufc ou 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 ufc, cerca de 104 ufc, cerca de 105 ufc, cerca de 106 ufc, cerca de 107 ufc, cerca de 108 ufc, cerca de 109 ufc, cerca de 1010 ufc, cerca de 1011 ufc ou cerca de 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta.

[113] Os fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente revelação podem compreender as seguintes moléculas que contêm nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina etc. As fontes de nitrogênio da presente revelação podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio etc.

[114] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “nitrogênio exógeno” se refere ao nitrogênio não atmosférico facilmente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições não limitantes de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio etc.

[115] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “condições não limitantes de nitrogênio” se refere ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meios em concentrações maiores do que cerca de 4 mM de nitrogênio, como revelado por Kant e cols. (2010. J. Exp. Biol. 62 (4): 1.499-1.509), que é incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[116] Como usado nesse relatório descritivo, um “microorganismo intergenérico” é um microorganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos de gêneros taxonômicos diferentes. O termo “mutante intergenérico” pode ser usado de forma intercambiável com “microorganismo intergenérico”. Um “microorganismo intergenérico” exemplar inclui um microorganismo que contém um elemento genético móvel que foi primeiro identificado em um microorganismo em um gênero diferente do microorganismo receptor. Explicações adicionais podem ser encontradas, inter alia, em 40 C.F.R. § 725.3.

[117] Em alguns aspectos, os micróbios ensinados nesse relatório descritivo são “não intergenéricos”, o que significa que os micróbios não são intergenéricos.

[118] Como usado nesse relatório descritivo, um “microorganismo intragenérico” é um microorganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos dos mesmos gêneros taxonômicos. O termo “intragenérico mutante” pode ser usado de forma intercambiável com “microorganismo intragenérico”.

[119] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “material genético introduzido” significa material genético que é adicionado, e permanece como um componente, do genoma do receptor.

[120] Em algumas modalidades, a rede genética regulatória de fixação e assimilação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificadoras que dirigem, modulam e/ou regulam fixação e/ou assimilação microbiana de nitrogênio e pode compreender sequências de polinucleotídeos do cluster nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC, ... nifZ), polinucleotídeos que codificam Proteína C reguladora de nitrogênio, polinucleotídeos que codificam Proteína B reguladora de nitrogênio, sequências de polinucleotídeos do cluster gln (por exemplo, glnA e glnD), draT, e transportadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o cluster Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV. Em alguns casos, o cluster Nif pode compreender um subconjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[121] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46% 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58% 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio por peso.

[122] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de nitrogênio por peso.

[123] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende cerca de 5% a 50%, cerca de 5% a 75%, cerca de 10% a 50%, cerca de 10% a 75%, cerca de 15% a 50%, cerca de 15% a 75%, cerca de 20% a 50%, cerca de 20% a 75%, cerca de 25% a 50%, cerca de 25% a 75%, cerca de 30% a 50%, cerca de 30% a 75%, cerca de 35% a 50%, cerca de 35% a 75%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 75%, cerca de 45% a 50%, cerca de 45% a 75% ou cerca de 50% a 75% de nitrogênio por peso.

[124] Em algumas modalidades, os aumentos da fixação de nitrogênio e/ou da produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta são medidos em relação a plantas de controle, que não foram expostas às bactérias da presente revelação. Todos os aumentos ou diminuições em bactérias são medidos em relação a bactérias de controle. Todos os aumentos ou diminuições em plantas são medidos em relação a plantas de controle.

[125] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Há várias vantagens com a utilização de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, por exemplo: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores pontuáveis, permitindo a fácil detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que é parte de um sistema regulador da transcrição; produção de compostos que exigem atividade ubíqua no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplares não limitantes incluem, promotor de CaMV 35S, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor de álcool desidrogenase etc.

[126] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor não constitutivo” é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células, e/ou durante certos estágios do desenvolvimento. Por exemplo, promotores tecido- específicos, tecido-preferidos, tipo de célula-específicos, tipo de célula-preferidos, promotores induzíveis, e promotores sob controle do desenvolvimento são promotores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos.

[127] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor “induzível” ou “reprimível” é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certas substâncias químicas, a presença de luz, condições ácidas ou básicas etc.

[128] Como usado nesse relatório descritivo, um promotor “tecido-específico” é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos tecidos. Diferentemente da expressão constitutiva de genes, a expressão tecido-específica é o resultado de vários níveis de interação de regulação gênica. Dessa forma, na técnica algumas vezes é preferível usar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para obter expressão eficiente e confiável de transgenes em tecidos particulares. Essa é uma das principais razões para a grande quantidade de promotores tecido-específicos isolados de tecidos particulares encontradas tanto na literatura científica quanto de patentes.

[129] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligado operacionalmente” se refere à associação de sequências de ácidos nucléicos em um único fragmento de ácido nucléico, de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente com uma sequência codificadora quando ele é capaz de regular a expressão daquela sequência codificadora (ou seja, que a sequência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor). Sequências codificadoras podem ser ligadas operacionalmente às sequências regulatórias em uma orientação senso ou anti-senso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da revelação podem ser ligadas operacionalmente, diretamente ou indiretamente, 5‘ para o mRNA-alvo, ou 3‘ para o mRNA-alvo, ou dentro do mRNA-alvo, ou uma primeira região complementar está 5 ‘ e seu complemento está 3‘ para o mRNA-alvo.

[130] Em alguns aspectos, “aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas”, inclui qualquer meio pelo qual a planta (incluindo partes de plantas como, por exemplo, uma semente, raiz, caule, tecido etc.) é colocada em contato (ou seja, exposta) com as referidas bactérias em qualquer estágio do ciclo de vida da planta. Consequentemente, “aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas”, inclui qualquer um dos seguintes meios de exposição da planta (incluindo partes de plantas como, por exemplo, uma semente, raiz, caule, tecido etc.) às referidas bactérias: pulverização na planta, imersão na planta, aplicação como um revestimento de semente, aplicação a um campo que então será plantado com semente, aplicação a um campo já plantado com a semente, aplicação a um campo com plantas adultas etc.

[131] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “MRTN” é um acrônimo para retorno máximo para nitrogênio e é utilizado como um tratamento experimental nos Exemplos. MRTN foi desenvolvido pela “Iowa State University” e informações podem ser encontradas em: http://cnrc.agron.iastate.edu/. O MRTN é a taxa de nitrogênio na qual o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado. A abordagem para o cálculo do MRTN é uma abordagem regional para o desenvolvimento de diretrizes para a taxa de nitrogênio do milho em estados individuais. Os dados do experimento da taxa de nitrogênio foram avaliados para Illinois, Iowa, Michigan, Minnesota, Ohio e Wisconsin, onde um número adequado de experimentos de pesquisa estava disponível para plantios de milho após soja e plantios de milho após milho. Os experimentos foram realizados com nitrogênio aplicado no brotamento, em cobertura, ou dividido na pré-semeadura/em cobertura, e os locais não foram irrigados, exceto para aqueles que foram indicados para areias irrigadas em Wisconsin. MRTN foi desenvolvido pela “Iowa State University” em função das diferenças aparentes em métodos para determinação de taxas de nitrogênio sugeridas necessárias à produção de milho, percepções equivocadas em relação às diretrizes da taxa de nitrogênio e preocupações sobre as taxas de aplicação. Pelo cálculo do MRTN, os profissionais podem determinar o seguinte: (1) a taxa de nitrogênio na qual o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado, (2) a taxa de nitrogênio econômica ótima, que é o ponto em que o último incremento de nitrogênio retorna um aumento de rendimento suficientemente grande para pagar pelo nitrogênio adicional, (3) o aumento do valor de grão de milho atribuído à aplicação de nitrogênio, e o rendimento máximo, que é o rendimento no qual a aplicação de mais nitrogênio não resulta em um aumento do rendimento de milho. Dessa forma, os cálculos de MRTN dão aos profissionais os meios para maximizar as safras de milho em regiões diferentes maximizando, ao mesmo tempo, os ganhos financeiros de aplicações de nitrogênio.

[132] O termo “mmol” é uma abreviação para milimol, que é um milésimo (10-3) de um mol, abreviado nesse relatório descritivo como mol.

[133] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “microorganismo” ou “micróbio” devem ser considerados de forma ampla. Esses termos, usados de forma intercambiável, incluem, sem limitação, os dois domínios procarióticos, Bactérias e Archaea. O termo também pode englobar fungos e protistas eucarióticos.

[134] O termo “consórcios microbianos” ou “consórcio microbiano” se refere a um subconjunto de uma comunidade microbiana de espécies microbianas individuais, ou cepas de uma espécie, que podem ser descritas como realizando uma função comum, ou podem ser descritas como participantes, ou que levam ou correlacionadas com um parâmetro reconhecível, por exemplo, um traço fenotípico de interesse.

[135] O termo “comunidade microbiana” significa um grupo de micróbios que compreende duas ou mais espécies ou cepas. Diferentemente dos consórcios microbianos, uma comunidade microbiana não precisa realizar uma função comum, ou não precisa ter que participar, ou levar ou se correlacionar com um parâmetro reconhecível, por exemplo, um traço fenotípico de interesse.

[136] Como usado nesse relatório descritivo, os termos “isolado”, “isolado”, “micróbio isolado” e termos semelhantes visam significar que os (um ou mais) microorganismos foram separados de pelo menos um dos materiais com os quais estão associados em um ambiente particular (por exemplo, solo, água, tecido de plantas etc.). Dessa forma, um “micróbio isolado” não existe em seu ambiente de ocorrência natural; ao invés disso, é por meio das várias técnicas descritas nesse relatório descritivo que o micróbio foi removido de seu ambiente natural e colocado em um estado de existência de ocorrência não natural. Dessa forma, a cepa isolada ou o micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em alguns aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação com um carreador aceitável, que pode ser um carreador agronomicamente aceitável.

[137] Em certos aspectos da revelação, os micróbios isolados existem como “culturas isoladas e biologicamente puras”. Será observado por aqueles habilitados na técnica que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio particular significa que a referida cultura é substancialmente livre de outros organismos vivos e contém somente o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do referido micróbio. A presente revelação observa que os micróbios isolados e biologicamente puros frequentemente “necessariamente diferem de materiais menos puros ou impuros”. Veja, por exemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970)(que discute prostaglandinas purificadas); veja também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979)(que discute micróbios purificados); veja também, Parke-Davis & Co. v. H.K. Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911) (“Learned Hand” que discute adrenalina purificada), que fornece, em parte, revisão, em parte, 196 F. 496 (2aCir. 1912), cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência. Além disso, em alguns aspectos, a revelação fornece certas medições quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas dentro de uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certas modalidades, é um atributo adicional que distingue os micróbios atualmente revelados daqueles micróbios que existem em um estado natural. Veja, por exemplo, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4a Cir. 1958) (que discute limitações de pureza para vitamina B12 produzida por micróbios), incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[138] Como usado nesse relatório descritivo, “isolados individuais” significam uma composição, ou cultura, que compreende uma predominância de um único gênero, espécie ou cepa, de micro-organismo, após separação de um ou mais outros microorganismos.

[139] Os micróbios da presente revelação podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente revelação incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Como usados nesse relatório descritivo, os termos “esporo” ou “esporos” se referem às estruturas produzidas por bactérias e fungos que estão adaptadas para sobrevida e dispersão. Esporos são geralmente caracterizados como estruturas adormecidas; no entanto, esporos são capazes de diferenciação por meio do processo de germinação. A germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são capazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Esporos fúngicos são unidades de reprodução assexual e, em alguns casos, são estruturas necessárias em ciclos de vida fúngicos. Esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que podem habitualmente ser não condutivas à sobrevida ou crescimento de células vegetativas.

[140] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “composição microbiana” se refere a uma composição que compreende um ou mais micróbios da presente revelação. Em algumas modalidades, uma composição microbiana é administrada às plantas (incluindo várias partes de plantas) e/ou em campos agrícolas.

[141] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “carreador”, “carreador aceitável” ou “carreador agronomicamente aceitável” se referem a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, que não afeta prejudicialmente o micróbio. Regulação da fixação de nitrogênio

[142] Em alguns casos, a via de fixação de nitrogênio pode atuar como um alvo para engenharia genética e otimização. Um traço que pode ser visado for regulação pelos métodos descritos nesse relatório descritivo é a fixação de nitrogênio. O fertilizante de nitrogênio é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior condutor de rendimentos maiores em plantios em fileira como, por exemplo, milho e trigo. São descritos nesse relatório descritivo produtos microbianos que podem liberar formas renováveis de nitrogênio em plantios de não leguminosas. Embora alguns endófitos tenham a genética necessária para a fixação de nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que endófitos do tipo selvagem de cereais e gramíneas interrompem a fixação de nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis residuais de nitrogênio em solos de campo sinalizam os micróbios para fechar a via bioquímica para fixação de nitrogênio.

[143] Alterações dos níveis transcricionais e pós- tradução de componentes da rede reguladora da fixação de nitrogênio podem ser benéficas para o desenvolvimento de um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio ao milho na presença de fertilizante. Para essa finalidade, é descrita nesse relatório descritivo a tecnologia de Evolução de Micróbio-Hospedeiro (HoME) para evoluir precisamente redes reguladoras e despertar novos fenótipos. Também são descritas nesse relatório descritivo bibliotecas proprietárias únicas de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, pareadas com dados ômicos extensos que circundam a interação de micróbios e planta hospedeira sob condições ambientais diferentes como, por exemplo, estresse e excesso de nitrogênio. Em algumas modalidades, essa tecnologia permite a evolução da precisão da rede genética regulatória de endófitos para produzir micróbios que fixam ativamente nitrogênio, até mesmo na presença de fertilizante no campo. Também são descritas nesse relatório descritivo avaliações do potencial técnico da evolução de micróbios que colonizam tecidos da raiz de milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas padronizadas de formulação e solos diversos para determinar a praticabilidade de integração dos micróbios em estratégias modernas de gerenciamento de nitrogênio.

[144] A fim de utilizar nitrogênio elementar (N) para a síntese química, as formas de vida combinam gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Por causa da natureza intensiva de energia da fixação de nitrogênio biológica, diazotróficos (bactérias e arquéias que fixam gás nitrogênio atmosférico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rígida do cluster do gene nif em resposta ao oxigênio ambiental e nitrogênio disponível. Os genes nif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (por exemplo, o complexo de nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8 (4): 84-94) revela descrições detalhadas de genes nif e seus produtos, e é incorporado nesse relatório descritivo por referência. São descritos nesse relatório descritivo métodos de produção de uma planta com um traço aprimorado que compreendem o isolamento de bactérias de uma primeira planta, introdução de uma variação genética em um gene das bactérias isoladas para aumentar fixação de nitrogênio, exposição de uma segunda planta às bactérias variantes, isolamento de bactérias da segunda planta que possui um traço aprimorado em relação à primeira planta, e repetição das etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[145] Em proteobactérias, a regulação da fixação de nitrogênio é centralizada em torno da proteína de ligação ao intensificador 054-dependente NifA, o regulador transcricional positivo do cluster nif. Os níveis intracelulares de NifA ativa são controlados por dois fatores cruciais: a transcrição do óperon de nifLA, e a inibição da atividade de NifA por interação proteína-proteína com NifL. Ambos esses processos são responsivos aos níveis intracelulares de glutamina por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que percebe diretamente glutamina e catalisa a uridililação ou desuridililação de duas proteínas reguladoras PII- GlnB e GlnK - em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina ligada. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB não modificada sinaliza a desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, GlnB é modificada pós-tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do óperon de nifLA. Dessa forma, a transcrição de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. No nível pós-tradução da regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA de forma dependente do nível global de GlnK livre dentro da célula.

[146] NifA é transcrita pelo óperon de nifLA, cujo promotor é ativado por NtrC fosforilada, outro regulador 054- dependente. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que interage com GlnB desuridililada, mas não GlnB uridililada. Sob condições de excesso de nitrogênio, um nível intracelular elevado de glutamina leva à desuridililação de GlnB, que então interage com NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando em desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um nível baixo de glutamina intracelular resulta em uridililação de GlnB, o que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e a transcrição do óperon de nifLA. Dessa forma, a expressão de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo. Esses processos também podem ser responsivos aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[147] A atividade de NifA também é regulada pós-tradução em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente por meio de inibição mediada por NifL da atividade de NifA. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização de proteína PII por meio de GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significantemente entre diazotróficos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível global de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnK desuridililada interage com o transportador de amônio AmtB, que serve tanto para bloquear a captação de amônio por AmtB quanto para sequestrar GlnK à membrana, permitindo a inibição de NifA por NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililada é necessária para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridililação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazotróficos desprovidos do gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente por interação com as formas desuridililadas tanto de GlnK quanto de GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Em algumas bactérias, o cluster Nif pode ser regulado por glnR, e ainda em alguns casos isso pode compreender regulação negativa. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-tradução de NifA é um regulador importante do cluster nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Adicionalmente, nifL, amtB e glnK são genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo.

[148] Além de regular a transcrição do cluster do gene nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-tradução e inibição diretas da própria enzima nitrogenase, conhecido como interruptor de nitrogenase. Isso é mediado por ribosilação do ADP da proteína de Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que rompe sua interação com o complexo de proteína MoFe (NifDK) e abole a atividade de nitrogenase. DraT catalisa a ribosilação do ADP da proteína de Fe e do interruptor de nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e a reativação de nitrogenase. Como ocorre com a transcrição de nifLA e a inibição de NifA, o interruptor de nitrogenase também é regulado por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB desuridililada interage e ativa DraT, enquanto GlnK desuridililada interage tanto com DraG quanto com AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG à membrana. Sob condições de limitação de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, onde ela remove a ADP-ribose e ativa nitrogenase. Os métodos descritos nesse relatório descritivo também contemplam a introdução da variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[149] Embora alguns endófitos possuam a habilidade para fixar nitrogênio in vitro, frequentemente a genética é silenciada no campo por níveis elevados de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se desacoplar o sensoriamento de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo. O aumento da integral da atividade de nitrogenase através do tempo serve para aumentar ainda mais a produção de nitrogênio para utilização pelo plantio. Alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo incluem um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[150] Um alvo adicional para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para a expressão de genes de fixação de nitrogênio. O aumento da produção de NifA (constitutivamente ou durante condição de amônia elevada) contorna a via de sensoriamento de amônia nativa. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um inibidor de NifA conhecido, também leva a um nível aumentado de NifA livremente ativa. Além disso, o aumento do nível de transcrição do óperon de nifAL (constitutivamente ou durante condição de amônia elevada) também leva a um nível global maior de proteínas NifA. O nível elevado da expressão de nifAL é obtido por alteração do próprio promotor ou por redução da expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no fechamento do óperon de nifAL durante condição de nitrogênio elevado). O nível elevado de NifA obtido por esses ou quaisquer outros métodos descritos nesse relatório descritivo aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.

[151] Outro alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível intracelular de glutamina é percebido por meio da cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. Mutações do sítio ativo em GlnD que abolem a atividade de remoção de uridilil de GlnD rompem a cascata de sensoriamento de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração GlnB produz um curto-circuito da cascata de sensoriamento de glutamina. Essas mutações “enganam” a células na percepção do estado de nitrogênio limitado aumentando, dessa forma, a atividade do nível de fixação de nitrogênio. Esses processos também podem ser responsivos aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[152] A proteína amtB também é um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. A captação de amônia do ambiente pode ser reduzida por diminuição do nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de perceber o nível alto de amônia, evitando a infra-regulação de genes de fixação de nitrogênio. Qualquer amônia que tente entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível de glutamina intracelular é o principal componente do sensoriamento de nitrogênio. A diminuição do nível de glutamina intracelular evita que as células percebam níveis elevados de amônio no ambiente. Esse efeito pode ser obtido por aumento do nível de expressão de glutaminase, uma enzima que converte glutamina em glutamato. Além disso, a glutamina intracelular também pode ser reduzida por diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte amônia em glutamina). Em diazotróficos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato para serem usados para processos celulares. Rupturas na assimilação de amônia podem permitir o desvio do nitrogênio fixado a ser exportado da célula como amônia. A amônia fixada é assimilada predominantemente em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, e subsequentemente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. GS é regulada pós-tradução por GS adenilil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada por glnE que catalisa tanto a adenililação quanto a desadenililação de GS por meio da atividade de sua adenilil-transferase (AT) e domínios de remoção de adenilil (AR), respectivamente. Sob condições limitantes de nitrogênio, glnA é expressa, e o domínio de AR de GlnE causa da desadenilação GS, permitindo que ela seja ativa. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desligada, e o domínio de AT de GlnE é ativado alostericamente por glutamina, causando a adenililação e desativação de GS.

[153] Além disso, o gene draT também pode ser um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. Após as enzimas fixadoras de nitrogênio serem produzidas pela célula, o interruptor de nitrogenase representa outro nível no qual a célula infra- regula a atividade de fixação em condição de nitrogênio elevado. Esse interruptor poderia ser removido por diminuição do nível de expressão de DraT.

[154] Métodos para a transmissão de novos fenótipos microbianos podem ser realizados nos níveis da transcrição, tradução e pós-tradução. O nível de transcrição inclui alterações no promotor (por exemplo, alteração da afinidade do fator sigma ou de sítios de ligação para fatores de transcrição, incluindo deleção de todo ou de uma porção do promotor) ou alteração dos terminadores e atenuadores da transcrição. O nível de tradução inclui alterações nos sítios de ligação ao ribossomo e alterações de sinais de degradação de mRNA. O nível pós-tradução inclui a mutação de um sítio ativo da enzima e alteração de interações proteína-proteína. Essas alterações podem ser obtidas de várias formas. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser obtida por troca do sítio ou promotor de ligação ao ribossomo (RBS) nativo com outro com potência/eficiência menor. Sítios de início ATG podem ser trocados por um códon de início GTG, TTG ou CTG, o que resulta em redução na atividade de tradução da região codificadora. A abolição completa da expressão pode ser feita por knockout (deleção) da região codificadora de um gene. O frameshifting do quadro de leitura aberta (ORF) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo do ORF criando, dessa forma, um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada in-frame também irá criar, similarmente, um produto truncado não funcional. A adição de um tag de degradação no terminal N ou C também pode ser feita para reduzir a concentração efetiva de um gene particular.

[155] Inversamente, o nível de expressão dos genes descritos nesse relatório descritivo pode ser obtido por utilização de um promotor mais forte. Para assegurar uma atividade maior do promotor durante condição de nível elevado de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição do genoma inteiro em uma condição de nível elevado de nitrogênio poderia ser obtido, e promotores ativos com um nível desejado de transcrição podem ser escolhidos daquele conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Códons de início fracos podem ser removidos com um códon de início ATG para uma melhor eficiência de iniciação da tradução. Sítios de ligação ao ribossomo (RBS) fracos também podem ser removidos com um RBS diferente com eficiência de iniciação da tradução maior. Além disso, a mutagênese sítio- específica também pode ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.

[156] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessária para produção de plantio e reduzir as emissões de gás-estufa (por exemplo, óxido nitroso). Geração de populações bacterianas Isolamento de bactérias

[157] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos por extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Micróbios podem ser obtidos por trituração de sementes para isolar micróbios. Micróbios podem ser obtidos por plantio de sementes em amostras de solo diversas e recuperação de micróbios de tecidos. Adicionalmente, micróbios podem ser obtidos por inoculação de plantas com micróbios exógenos e determinação de quais micróbios aparecem em tecidos de planta. Exemplos não limitantes de tecidos de planta podem incluir uma semente, plântula, folha, muda, planta, bulbo ou tubérculo.

[158] Um método de obtenção de micróbios pode ser por meio do isolamento de bactérias de solos. Bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solos. Em alguns exemplos, o solo pode ser caracterizado por traços como, por exemplo, fertilidade alta ou baixa, níveis de umidade, níveis de minerais, e várias práticas de manejo. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de plantios, em que cultivos diferentes são plantados no mesmo solo em estações de plantio sucessivas. O crescimento sequencial de diferentes plantios no mesmo solo pode evitar a depleção desproporcional de certos minerais. As bactérias podem ser isoladas das plantas que crescem em solos selecionados. As plantas da plântula podem ser colhidas em 2-6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em uma rodada de colheita. Tipos de solo e de planta revelam o fenótipo da planta, bem como as condições, permitindo o enriquecimento downstream de certos fenótipos.

[159] Micróbios podem ser isolados de tecidos de plantas para avaliar traços microbianos. Os parâmetros para o processamento de amostras de tecido podem ser variados para isolar tipos diferentes de micróbios associativos, por exemplo, bactérias rizosféricas, epífitas ou endófitos. Os isolados podem ser cultivados em meios livres de nitrogênio para enriquecer para bactérias que realizam fixação de nitrogênio. Alternativamente, micróbios podem ser obtidos de bancos de cepas globais.

[160] Analíticas in planta são realizadas para avaliar traços microbianos. Em algumas modalidades, o tecido de planta pode ser processado para avaliação por processamento de alto rendimento para DNA e RNA. Adicionalmente, medições não invasivas podem ser usadas para avaliar características da planta, por exemplo, colonização. Medições em micróbios selvagens podem ser obtidas planta-por-planta. As medições em micróbios selvagens também podem ser obtidas no campo usando métodos de rendimento médio. Medições podem ser feitas sucessivamente ao longo do tempo. Um sistema de planta modelo pode ser usado incluindo, sem limitação, Setaria.

[161] Micróbios em um sistema de planta podem ser avaliados por meio de definição de perfil transcricional de um micróbio em um sistema de planta. Exemplos de avaliação através de definição de perfil transcricional são a utilização de métodos de reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), códigos de barras moleculares para detecção do transcrito, Sequenciamento da Geração Seguinte e marcação de micróbios com marcadores fluorescentes. Fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a colonização na estufa incluindo, sem limitação, microbioma, fatores abióticos, condições do solo, oxigênio, umidade, temperatura, condições do inóculo e localização da raiz. A fixação de nitrogênio pode ser avaliada em bactérias por medição de gás 15N/fertilizante (diluição) com IRMS ou NanoSIMS, como descrito nesse relatório descritivo. NanoSIMS é espectrometria de massa de íon secundário de alta resolução. A técnica de NanoSIMS é uma forma de investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise da redução de reações de oxidação que dirigem o metabolismo de microorganismos pode ser investigada no nível celular, subcelular, molecular e de elementos. NanoSIMS pode fornecer resolução espacial elevada de mais do que 0,1 μm. NanoSIMS pode detectar o uso de traçadores de isótopos como, por exemplo, 13C, 15N e 18O. Portanto, NanoSIMS pode ser usada para o nitrogênio da atividade química na célula.

[162] Estufas automatizadas podem ser usadas para analíticas de plantas. A métrica de plantas em resposta à exposição microbiana inclui, sem limitação, biomassa, análise de cloroplasto, câmera CCD, medições de tomografia volumétrica.

[163] Uma forma de enriquecimento de uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em cadeia de polimerase (PCR) com um iniciador direcionado ou iniciador específico. Iniciadores projetados para o gene de nifH podem ser usados para identificar diazotróficos, pois diazotróficos expressam o gene de nifH no processo de fixação de nitrogênio. Uma população microbiana também pode ser enriquecida por meio de abordagens de cultura de célula única-independente e abordagens de isolamento guiado por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento direcionado de micróbios pode ser realizado por cultivo dos micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas para o enriquecimento de populações microbianas para traços desejados podem ser guiadas por dados de bioinformática e são descritas nesse relatório descritivo. Enriquecimento para micróbios com capacidades de fixação de nitrogênio com o uso de bioinformática

[164] Ferramentas de bioinformática podem ser usadas para identificar e isolar rizobactérias que promovem o crescimento de plantas (PGPRs), que são selecionadas com base em sua habilidade para realizar fixação de nitrogênio. Micróbios com alta habilidade de fixação de nitrogênio podem promover traços favoráveis em plantas. Modos de análise por bioinformática para a identificação de PGPRs incluem, sem limitação, genômica, metagenômica, isolamento direcionado, sequenciamento gênico, sequenciamento de transcriptoma e modelagem.

[165] A análise por genômica pode ser usada para identificar PGPRs e confirmar a presença de mutações com métodos de Sequenciamento da Geração Seguinte, como descrito nesse relatório descritivo, e controle da versão de micróbio.

[166] Metagenômica pode ser usada para identificar e isolar PGPR usando um algoritmo de predição para colonização. Metadados também podem ser usados para identificar a presença de uma cepa modificada geneticamente em amostras ambientais e de estufa.

[167] O sequenciamento do transcriptoma pode ser usado para prever genótipos que levam aos fenótipos de PGPR. Adicionalmente, dados transcriptômicos são usados para identificar promotores para alteração da expressão gênica. Dados transcriptômicos podem ser analisados em conjunto com a Sequência do Genoma Inteiro (WGS) para gerar modelos de metabolismo e redes reguladoras de genes.

Domesticação de micróbios

[168] Micróbios isolados da natureza podem passar por um processo de domesticação no qual os micróbios são convertidos em uma forma que é geneticamente rastreável e identificável. Uma forma para domesticar um micróbio é modificá-lo geneticamente com resistência antibiótica. O processo de criação por engenharia genética de resistência antibiótica pode começar por determinação da sensibilidade antibiótica na cepa microbiana do tipo selvagem. Se as bactérias são sensíveis ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato à criação por engenharia genética de resistência antibiótica. Subsequentemente, um gene resistente ao antibiótico ou um vetor suicida contra- selecionável pode ser incorporado no genoma de um micróbio usando métodos de recombinação por engenharia genética (“recombineering”). Um vetor suicida contra-selecionável pode consistir em uma deleção do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador contra-selecionável sacB. A contra-seleção pode ser usada para trocar sequências de DNA microbianas nativas com genes resistentes ao antibiótico. Um método de rendimento médio pode ser usado para avaliar vários micróbios simultaneamente, permitindo a domesticação paralela. Métodos alternativos de domesticação incluem o uso de nucleases teleguiadas para evitar que as sequências do vetor suicida saiam ou a obtenção de sequências de vetor intervenientes.

[169] Vetores de DNA podem ser introduzidos em bactérias por meio de vários métodos, incluindo eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca-padrão de vetores pode ser usada para transformações. Um exemplo de um método de edição gênica é CRISPR precedido por testagem de Cas9 para assegurar a atividade de Cas9 nos micróbios. Modificação genética não transgênica de micróbios

[170] Uma população microbiana com traços favoráveis pode ser obtida por meio de evolução dirigida. Evolução direta é uma abordagem na qual o processo de seleção natural é mimetizado para evoluir proteínas ou ácidos nucléicos em direção a um objetivo definido pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são introduzidas em uma população microbiana, os micróbios com os traços mais favoráveis são selecionados, e o crescimento dos micróbios selecionados é continuado. Os traços mais favoráveis em rizobactérias promotoras de crescimento (PGPRs) podem estar em fixação de nitrogênio. O método de evolução dirigida pode ser iterativo e adaptivo com base no processo de seleção após cada iteração.

[171] Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs) com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem ser geradas. A evolução de PGPRs pode ser realizada por meio da introdução de variação genética. Variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia de polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química, e combinações destas. Essas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população microbiana. Por exemplo, mutantes podem ser gerados usando DNA ou RNA sintético por meio de mutagênese oligonucleotídeo- dirigida. Mutantes podem ser gerados usando ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Genes de interesse podem ser identificados com o uso de bibliotecas de outras espécies com traços aprimorados incluindo, sem limitação, propriedades de PGPR aprimoradas, colonização de cereais aumentadas, sensibilidade ao oxigênio aumentada, fixação de nitrogênio aumentada e excreção de amônia aumentada. Genes intragenéricos podem ser projetados com base nessas bibliotecas usando software como, por exemplo, o software de design Geneious ou Platypus. Mutações podem ser geradas com o auxílio de aprendizado de máquina. Mutações podem ser geradas com o auxílio de um modelo metabólico. O design automatizado da mutação pode ser feito usando ao estilo Platypus e guiará RNAs para mutagênese Cas- dirigida.

[172] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o micróbio hospedeiro. Adicionalmente, sistemas repórteres também podem ser transferidos para o micróbio. Os sistemas repórteres caracterizam promotores, determinam o sucesso da transformação, avaliam mutantes e atuam como ferramentas de seleção negativas.

[173] Os micróbios que carregam a mutação podem ser cultivados por meio de passagem serial. Uma colônia microbiana contém uma única variante do micróbio. As colônias microbianas são avaliadas com o auxílio de um coletor de colônias automatizado e um manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e número de cópias aumentado expressam um genótipo superior do traço desejado. Seleção de micróbios promotores do crescimento de plantas com base na fixação de nitrogênio

[174] As colônias microbianas podem ser avaliadas usando vários ensaios para avaliar a fixação de nitrogênio. Uma forma para medir a fixação de nitrogênio é por meio de um ensaio fermentativo único, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem in line ao longo do tempo. ARA pode ser realizado em placas de alto rendimento de arranjos de microtubo. ARA pode ser realizado com plantas e tecidos de plantas vivos. A formulação dos meios e a concentração de oxigênio dos meios podem ser variadas em ensaios ARA. Outro método de avaliação de variantes microbianas é por utilização de biossensores. NanoSIMS e microespectroscopia Raman podem ser usados para investigar a atividade dos micróbios. Em alguns casos, bactérias também podem ser cultivadas e expandidas usando métodos de fermentação em biorreatores. Os biorreatores são projetados para aumentar a robustez do crescimento de bactérias e diminuir a sensibilidade de bactérias ao oxigênio. Microfermentadores baseados em placas de TP média a alta são usados para avaliar a sensibilidade ao oxigênio, necessidades nutricionais, fixação de nitrogênio e excreção de nitrogênio. As bactérias também podem ser cocultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar vias crípticas. Citometria de fluxo pode ser usada para avaliar bactérias que produzem níveis elevados de nitrogênio usando indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bactérias podem ser cultivadas na presença ou ausência de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com glutamina, amônia, ureia ou nitratos.

Melhoramento de micróbios

[175] O melhoramento de micróbios é um método para identificar e aumentar sistematicamente o papel de espécies dentro do microbioma do plantio. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intra-espécies de redes reguladoras e grupamentos de genes, e 3) avaliação e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de plantio desejados. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies cruciais. O modelo é usado para prever o melhoramento de alvos genéticos e aumentar a frequência de seleção de aprimoramentos em traços de relevância agronômica codificados pelo microbioma. Veja, a Figura 17A para uma representação gráfica de uma modalidade do processo. Em particular, a Figura 17A retrata uma representação esquemática de melhoramento de micróbios, de acordo com modalidades. Como ilustrado na Figura 17A, o aprimoramento racional do microbioma do plantio pode ser usado para aumentar a biodiversidade do solo, ajustar o impacto de espécies fundamentais e/ou alterar o momento e expressão de importante vias metabólicas. Para essa finalidade, os inventores desenvolveram a canal de melhoramento de micróbios para identificar e aumentar o papel de cepas dentro do microbioma do plantio. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intragenômico de redes reguladoras de genes e grupamentos de genes, e 3) avaliação e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de plantio desejados. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, os inventores empregam um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies cruciais. Esse processo representa uma metodologia para melhoramento e seleção de aprimoramentos em traços de relevância agronômica codificados pelo microbioma.

[176] A produção de bactérias para aprimorar traços de plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser obtida por meio de passagem serial. A produção dessas bactérias pode ser feita por seleção de plantas que possuem um traço aprimorado particular que é influenciado pela flora microbiana, além da identificação de bactérias e/ou composições que são capazes de transmitir um ou mais traços aprimorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de bactérias para aprimorar um traço de planta inclui as etapas de: (a) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introdução de uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) exposição das diversas plantas às bactérias variantes; (d) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma das diversas plantas, em que a planta da qual as bactérias são isoladas possui um traço aprimorado em relação a outras plantas nas diversas plantas; e (e) repetição das etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um traço aprimorado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser feitas qualquer número de vezes (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que o traço aprimorado em uma planta alcance um nível desejado. Além disso, as diversas plantas podem ser mais de duas plantas, por exemplo, 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1.000 ou mais plantas.

[177] Além da obtenção de uma planta com um traço aprimorado, uma população bacteriana que compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio) é obtida. Por repetição das etapas descritas acima, pode ser obtida uma população de bactérias que incluem os membros mais apropriados da população que se correlacionam com um traço de planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, por exemplo, por análise genética e/ou fenotípica. A análise genética pode ocorrer de bactérias isoladas na etapa (a). Pode ser obtida informação fenotípica e/ou genotípica usando técnicas que incluem: avaliação de alto rendimento de componentes químicos de origem de plantas, técnicas de sequenciamento que incluem sequenciamento de alto rendimento de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucléico, sequenciamento de RNA (Sequenciamento Aleatório de Transcriptoma Inteiro), e qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). A informação obtida pode ser usada para obter informação da definição de perfil de comunidade sobre a identidade e atividade de bactérias presentes, por exemplo, análise filogenética ou avaliação à base de microarranjo de ácidos nucléicos que codificam componentes de óperons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene de rRNA 16S, gene de rRNA 23S, gene de rRNA 5S, gene de rRNA 5.8S, gene de rRNA 12S, gene de rRNA 18S, gene de rRNA 28S, gene de gyrB, gene de rpoB, gene de fusA, gene de recA, gene de cox1, gene de nifD. Exemplo de processos de definição de perfil taxonômico para determinar a taxa presente em uma população são descritos em US20140155283. A identificação bacteriana pode compreender a caracterização da atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinalização, por exemplo, genes associados com a via de fixação de nitrogênio. Interações sinérgicas (em que dois componentes, em virtude de sua combinação, aumentam um efeito desejado além de uma quantidade aditivo) entre espécies bacterianas diferentes também podem estar presentes nas populações bacterianas.

Variação genética - Localizações e fontes de alteração genômica

[178] A variação genética pode ser um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador transcricional, anti-ativador transcricional, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina, ou NAD+- dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. A introdução de uma variação genética pode compreender a inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um sítio-alvo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou mais nucleotídeos. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação knockout (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, deleção de um gene inteiro), ou ela pode ser a eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo, ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou ela pode alterar ou abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo. Uma ou mais sequências regulatórias também podem ser inseridas, incluindo sequências regulatórias heterólogas e sequências regulatórias encontradas dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano que corresponde às bactérias nas quais a variação genética é introduzida. Além disso, sequências regulatórias podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de um tecido de plantas. A variação genética pode ser uma variação genética predeterminada que é introduzida especificamente em um sítio-alvo. A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do sítio-alvo. A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais) são introduzidas em uma ou mais das bactérias isoladas antes da exposição das bactérias às plantas para avaliação do aprimoramento do traço. As diversas variações genéticas podem ser de qualquer um dos tipos acima, dos mesmos tipos ou de tipos diferentes, e em qualquer combinação. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes são introduzidas serialmente, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento, e assim por diante, de modo a acumular diversas variações genéticas em bactérias, transmitindo progressivamente traços aprimorados nas plantas associadas.

Variação genética - Métodos de introdução de alteração genômica

[179] Em geral, o termo “variação genética” se refere a qualquer alteração introduzida em uma sequência de polinucleotídeos em relação a um polinucleotídeo de referência, por exemplo, um genoma de referência ou porção deste, ou gene de referência ou porção deste. Uma variação genética pode ser denominada uma “mutação”, e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser denominado uma “variante genética” ou “mutante”. Variações genéticas podem ter qualquer número de efeitos, por exemplo, o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular. Variações genéticas podem ser especificamente introduzidas em um sítio-alvo, ou introduzidas aleatoriamente. Diversas ferramentas moleculares e métodos estão disponíveis para introdução de variação genética. Por exemplo, uma variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia de polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, recombinação por engenharia genética, recombinação mediada por Red Lambda, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química, e combinações destas. Métodos químicos de introdução de variação genética incluem exposição de DNA a um mutágeno químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N-metil-N-nitro-N’-nitrosoguanidina, N-óxido de 4- nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda nitrogenada, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12- dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bissulfan e semelhantes. Agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação-Y, raios- X e bombardeamento rápido de nêutrons. A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucléico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento reversível, é outro método adequado para a geração de variação genética. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucléico durante amplificação em um sistema in vitro livre de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) como, por exemplo, PCR error-prone. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucléico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxons, troca de domínio e semelhantes). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um ácido nucléico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, espera-se que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante gere uma frequência elevada de mutações (ou seja, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, sem limitação, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e os homólogos destes em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições exemplares de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas, por exemplo, em Stemple (2004) Nature 5: 1-7; Chiang e cols. (1993) PCR Methods Appl. 2 (3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10.747-10.751; e Patentes U.S. Nos 6.033.861 e 6.773.900.

[180] Variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragenéricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, rearranjadas ou SNPs.

[181] Variação genética pode ser introduzida em diversas vias metabólicas dentro de micróbios para evocar aprimoramentos nos traços descritos acima. Vias representativas incluem vias de captação de enxofre, de biossíntese de glicogênio, a via de regulação de glutamina, a via de captação de molibdênio, a via de fixação de nitrogênio, de assimilação de amônia, de excreção ou secreção de amônia, de captação de nitrogênio, de biossíntese de glutamina, anamox, de solubilização de fosfato, de transporte de ácido orgânico, de produção de ácido orgânico, de produção aglutininas, de genes de limpeza de radical reativo ao oxigênio, da biossíntese de ácido indol acético, de biossíntese de trehalose, enzimas ou vias de degradação da parede celular de plantas, de genes de adesão à raiz, de secreção de exopolissacarídeo, via de glutamato sintase, vias de captação de ferro, via de sideróforo, via de quitinase, de ACC desaminase, de biossíntese de glutationa, de genes de sinalização de fósforo, via de extinção de quórum, vias de citocromo, via de hemoglobina, via de hemoglobina bacteriana-like, pequeno rsmZ de RNA, biossíntese de rizobitoxina, proteína de adesão de lapA, via de percepção de quórum de AHL, de biossíntese de fenazina, de biossíntese de lipopeptídeo cíclico e de produção de antibiótico.

[182] Sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas)/CRISPR-associados (Cas) podem ser usados para introduzir mutações desejadas. CRISPR/Cas9 fornecem bactérias e arquéias com imunidade adaptiva contra vírus e plasmídeos por utilização de RNAs de CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucléicos invasores. A proteína Cas9 (ou funcional equivalente e/ou variante desta, ou seja, proteína Cas9- like) contém naturalmente atividade de DNA endonuclease que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA de ocorrência natural ou sintéticas denominadas crRNA e tracrRNA (também denominado RNAs-guia). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também denominada RNA-guia único (“sgRNA”). Dessa forma, as proteínas Cas9 ou Cas9-like se associam com um RNA de direcionamento de DNA (cujo termo engloba tanto a configuração de RNA-guia de duas moléculas quanto a configuração de RNA-guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou Cas9-like e guia a proteína para uma sequência de ácidos nucléicos-alvo. Se a proteína Cas9 ou Cas9-like retém sua função enzimática natural, ela irá clivar DNA-alvo para criar uma quebra de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição etc.) alterando, dessa forma, a expressão gênica. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes estão englobadas pelo termo Cas9-like) foram alteradas de tal forma que possuem uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, elas clivam uma única fita ao invés de ambas as fitas do DNA-alvo, enquanto, em outros casos, elas foram severamente reduzidas a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Descrições exemplares adicionais de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas, por exemplo, em US8795965.

[183] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia de polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir mutações desejadas. A PCR é realizada por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após amplificação por PCR, seleção de DNA mutado e remoção de DNA de plasmídeo parental podem ser obtidas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante PCR, seguida por digestão com enzimas de restrição para remover apenas DNA parental não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea tanto de um gene de resistência antibiótica quanto do gene estudado, alterando o plasmídeo para resistência antibiótica diferente, a nova resistência antibiótica facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA-modelo metilado parental por enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, pela qual as cadeias mutagenizadas não metiladas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Descrição adicional de métodos exemplares pode ser encontrada, por exemplo, em US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743 e US20100267147.

[184] A mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, também denominada mutagênese sítio-dirigida, tipicamente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA-modelo em tono do sítio de mutação, de modo que pode hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma alteração de base única (uma mutação pontual), alterações de múltiplas bases, deleção ou inserção, ou uma combinação dessas. O iniciador de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutado, e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de DNA para verificar que eles contêm a mutação desejada.

[185] Variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR error-prone. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação de sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o(s) produto(s) da reação resultante contém uma ou mais alterações em sequência, quando comparado com a molécula-modelo, os produtos resultantes são mutagenizados, comparados com o modelo. Outro meio de introdução de mutações aleatórias é a exposição de células a um mutágeno químico, por exemplo, nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res., junho de 1975; 28 (3): 323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.

[186] A mutagênese por saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual tenta-se gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um sítio específico, ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese por saturação é composta pelo mutagênese de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) em uma sequência de polinucleotídeos definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de comprimento). Dessa forma, um grupo de mutações (por exemplo, que varia de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a serem introduzidas em um cassete pode ser diferente ou igual a um segundo agrupamento de mutações a serem introduzidas em um segundo cassete durante a aplicação de uma rodada de mutagênese por saturação. Esses agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons particulares, e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos particulares.

[187] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também denominada embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar rapidamente mutações benéficas. Em um exemplo de um processo de embaralhamento, DNAse é usada para fragmentar um conjunto de genes parentais em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 bp de comprimento. Isso é então seguido por uma reação em cadeia de polimerase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com superposição de sequência homóloga suficiente anelarão uns aos outros e são então estendidos por DNA polimerase. Permite-se que ocorram várias rodadas dessa extensão por PCR, após algumas das moléculas de DNA alcançarem o tamanho dos genes parentais. Esses genes podem então ser amplificados com outra PCR, dessa vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter sequências adicionais acrescentadas às suas extremidades 5’, por exemplo, sequências para sítios de reconhecimento de enzima de restrição necessários à ligação em um vetor de clonagem. Exemplos adicionais de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.

[188] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência de polinucleotídeos visada. Após a ocorrência de quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5’ da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão de fita que se segue, uma extremidade 3’ protuberante da molécula de DNA quebrada então “invade” uma molécula de DNA similar ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, um modelo de recombinação também é fornecido. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado, ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é projetado para servir como um modelo na recombinação homóloga, por exemplo, dentro ou perto de uma sequência-alvo cortada ou clivada por uma nuclease sítio- específica. Um polinucleotídeo-modelo pode ser de qualquer comprimento adequado, por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência-alvo. Quando otimamente alinhado, um polinucleotídeo-modelo pode se sobrepor com um ou mais nucleotídeos de uma sequências-alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência- modelo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência- alvo estão otimamente alinhados, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo-modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais nucleotídeos da sequência-alvo. Exemplos não limitantes de nucleases sítio-dirigidas úteis nos métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, CRISPR nucleases, TALE nucleases e meganuclease. Para uma descrição adicional do uso dessas nucleases, veja, por exemplo, US8795965 e US20140301990.

[189] Mutágenos que criam mutações primariamente pontuais e deleções, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo mutágenos químicos ou radiação, podem ser usados para criar variações genéticas. Mutágenos incluem, sem limitação, metanossulfonato de etila, metilmetano sulfonato, N-etil-N-nitrosureia, trietilmelamina, N-metil- N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalan, mostarda nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N- metil-N’-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2- aminopurina, 7,12-dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano e semelhantes), dicloridrato de 2-metóxi-6-cloro-9 [3-(etil-2-cloro-etil) aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[190] A introdução de variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população de bactérias tratada carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não o fazem. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias que carregam uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção para variantes genéticas bem- sucedidas envolvia a seleção por ou contra alguma funcionalidade transmitida ou abolida pela variação genética, por exemplo, no caso de inserção de gene de resistência antibiótica ou de abolição de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base em uma própria sequência de polinucleotídeos, de modo que somente uma variação genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem necessitar também de um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas desprovidos da variação genética introduzida em um sítio- alvo, de modo que a seleção seja efetivamente dirigida contra a sequência de referência na qual a variação genética visa ser introduzida. Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do sítio-alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10, ou menos nucleotídeos do sítio-alvo, incluindo clivagem no ou dentro do sítio-alvo). A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease sítio-específica selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma CRISPR nuclease, uma TALE nuclease (TALEN) ou uma meganuclease. Um processo desse tipo é similar aos processos para aumento da recombinação homóloga em um sítio-alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, bactérias desprovidas da variação genética desejada têm maior probabilidade de passar por clivagem que, se não reparada, resulta na morte da célula. Bactérias que sobrevivem à seleção podem então ser isoladas para uso na exposição às plantas para avaliação do fornecimento de um traço aprimorado.

[191] Uma CRISPR nuclease pode ser usada como a nuclease sítio-específica para dirigir a clivagem a um sítio-alvo. Uma seleção aprimorada de micróbios mutados pode ser obtida por utilização de Cas9 para matar células não mutadas. As plantas são então inoculadas com os micróbios mutados para reconfirmar a simbiose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem então ser isolados novamente de tecidos de planta. Os sistemas de CRISPR nuclease empregados para seleção contra não-variantes podem empregar elementos similares àqueles descritos acima com relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem dirigida ao sítio-alvo, dessa forma, aumenta a morte de células afetadas.

[192] Outras opções para induzir especificamente clivagem em um sítio-alvo estão disponíveis, por exemplo, nucleases de dedo de zinco, sistemas de TALE nuclease (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. ZFNs podem ser modificadas geneticamente para visar sequências de DNA desejadas e isso permite que nucleases de dedo de zinco clivem sequências-alvo únicas. Quando introduzidas em uma célula, ZFNs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. As nucleases efetoras ativador de transcrição-like (TALENs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação efetor TAL (ativador de transcrição-like) ao DNA a um domínio de clivagem de DNA. TALENS podem ser rapidamente modificadas geneticamente para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma célula, TALENs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. Meganucleases (endonucleases teleguiadas) são endo-desoxirribonucleases caracterizadas por um sítio de reconhecimento grande (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. Meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente direcionada. Por modificação de sua sequência de reconhecimento por meio de modificação genética de proteínas, a sequência visada pode ser alterada. Meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam eles bacterianos, de plantas ou animais, e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (ID. DE SEQ. N°: 1), a família GIY-YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. Endonucleases teleguiadas exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII.

Variação genética - Métodos de identificação

[193] Os micróbios da presente revelação podem ser identificados por uma ou mais modificações ou alterações genéticas, que foram introduzias no referido micróbio. Um método pelo qual a referida modificação ou alteração genética pode ser identificada é por meio de referência a um N° DE ID. DE SEQ. que contém uma porção da sequência genômica do micróbio que é suficiente para identificar a modificação ou alteração genética.

[194] Além disso, no caso de micróbios que não tinham uma modificação ou alteração genética (por exemplo, um do tipo selvagem, WT) introduzida em seus genomas, a revelação pode utilizar sequências de ácidos nucléicos 16S para identificar os referidos micróbios. Uma sequência de ácidos nucléicos 16S é um exemplo de um “marcador molecular” ou “marcador genético”, que se refere a um indicador que é usado em métodos para visualização de diferenças em características de sequências de ácidos nucléicos. Exemplos de outros indicadores desse tipo são marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações de inserção, marcadores microssatélites (SSRs), regiões amplificadas sequência-caracterizadas (SCARs), marcadores ou marcadores de isozima de sequência polimórfica clivada amplificada (CAPS), ou combinações dos marcadores descritos nesse relatório descritivo que definem uma localização genética e cromossômica específica. Marcadores ainda incluem sequências de polinucleotídeos que codificam rRNA 16S ou 18S, e sequências espaçadoras (ITS) internas transcritas, que são sequências encontradas entre genes de rRNA de subunidade pequena e de subunidade grande que se mostraram especialmente úteis na elucidação de relacionamentos ou distinções quando comparadas entre elas. Além disso, a revelação utiliza sequências únicas encontradas em genes de interesse (por exemplo, nif H, D, K, L, A, glnE, amtB etc.) para identificar micróbios revelados nesse relatório descritivo.

[195] A estrutura primária da subunidade de rRNA 16S principal compreende uma combinação particular de regiões conservadas, variáveis e hipervariáveis que evoluem em taxas diferentes e permitem a resolução tanto de linhagens muito antigas como, por exemplo, domínios, quanto linhagens mais modernas como, por exemplo, gêneros. A estrutura secundária da subunidade 16S inclui aproximadamente 50 hélices que resultam em pareamento de bases de cerca de 67% dos resíduos. Essas características estruturais secundárias altamente conservadas são de grande importância funcional e podem ser usadas para assegura homologia posicional em múltiplos alinhamentos e análise filogenética de sequências. Ao longo das décadas prévias recentes, o gene de rRNA 16S se tornou o marcador taxonômico mais sequenciado e é a pedra angular para a classificação sistemática atual de bactérias e arquéias (Yarza e cols. 2014. Nature Rev. Micro. 12: 63545).

[196] Dessa forma, em certos aspectos, a revelação fornece uma sequência, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para qualquer sequência nas Tabelas E, F, G ou H.

[197] Dessa forma, em certos aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 62-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas F, G e H.

[198] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucléicos 16S, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas G e H.

[199] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucléicos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas G e H.

[200] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucléicos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas G e H.

[201] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende, ou iniciador que compreende, ou sonda que compreende, ou sequência de junção não nativa que compreende, uma sequência de ácidos nucléicos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 304-424. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela E.

[202] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de junção não nativa que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela E.

[203] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 77, 78, 81, 82 ou 83. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas F e H.

Variação genética - Métodos de detecção: iniciadores, sondas e ensaios

[204] A presente revelação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detecção dos micróbios ensinados nesse relatório descritivo. Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos de detecção das cepas WT parentais. Em outros aspectos, a revelação fornece métodos de detecção dos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente derivados das cepas WT. Em alguns aspectos, a presente revelação fornece métodos de identificação de alterações genéticas não intergenéricas em um micróbio.

[205] Em alguns aspectos, os métodos de engenharia genética genômica da presente revelação levam à criação de sequências de “junção” de nucleotídeo não naturais nos micróbios não intergenéricos derivados. Essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética particular em um micróbio ensinado nesse relatório descritivo.

[206] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos especializados de PCR quantitativa, incluindo iniciadores e sondas singularmente projetados. Em alguns aspectos, as sondas da revelação se ligam às sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, é utilizada PCR tradicional. Em outros aspectos, é utilizada PCR em tempo real. Em alguns aspectos, é utilizada PCR quantitativa (qPCR).

[207] Dessa forma, a revelação pode cobrir a utilização de dois métodos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que intercalam com qualquer DNA de fita dupla, e (2) sondas de DNA sequência-específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas após hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, somente a junção de nucleotídeo de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico, ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspectos, os iniciadores da revelação são escolhidos de modo que os iniciadores flanqueiem um dos lados de uma sequência de junção, de modo que ocorra uma reação de amplificação, e então a referida sequência de junção está presente.

[208] Aspectos da revelação envolvem moléculas de sequência da junção de nucleotídeo de ocorrência não natural per se, juntamente com outras moléculas de nucleotídeos que são capazes de ligação às referidas sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de ligação às referidas sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas são denominadas “sondas de nucleotídeos”.

[209] Em alguns aspectos, DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação por utilização de qPCR. Os iniciadores utilizados na reação de qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou regiões únicas das cepas mutantes não intergenéricas modificadas geneticamente. A reação de qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando somente iniciadores de amplificação diretos e reversos; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan que contém um marcador de corante FAM na extremidade 5’, um extintor interno ZEN, e um ligante do sulco menor e extintor fluorescente na extremidade 3’ (Integrated DNA Technologies).

[210] Alguns iniciadores, sondas e sequências de junção não nativas estão listados na Tabela E. A eficiência da reação de qPCR pode ser medida usando uma curva-padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma-alvo. Os dados podem ser normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso e volume de extração de tecido.

[211] A reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) é um método de quantificação, em tempo real, da amplificação de uma ou mais sequências de ácidos nucléicos. A quantificação em tempo real do ensaio de PCR permite a determinação da quantidade de ácidos nucléicos que está sendo gerada pelas etapas de amplificação por PCR por comparação dos ácidos nucléicos em amplificação de interesse e uma sequência de ácidos nucléicos de controle apropriada, que pode atuar como um padrão de calibração.

[212] Sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios de qPCR que exigem uma especificidade aumentada para a quantificação de sequências de ácidos nucléicos-alvo. Sondas TaqMan compreendem uma sonda de oligonucleotídeo com um fluoróforo anexado à extremidade 5’ e um extintor anexado à extremidade 3’ da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem dessa forma com as extremidades 5’ e 3 da sonda em contato íntimo estre elas, o extintor evita a transmissão do sinal fluorescente do fluoróforo. Sondas TaqMan são projetadas para anelar dentro de uma região de ácido nucléico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a Taq polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a atividade 5’ para 3’ de exonuclease da Taq polimerase degrada a sonda que anelou ao modelo. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo quebrando, dessa forma, a proximidade íntima ao extintor e permitindo a fluorescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio de qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de modelo de DNA presente na reação.

[213] As características da qPCR permitem que o profissional elimine a etapa pós-amplificação trabalhosa da preparação de eletroforese em gel, que é geralmente necessária para observação dos produtos amplificados de ensaios de PCR tradicionais. Os benefícios da qPCR em relação à PCR convencional são consideráveis, e incluem velocidade aumentada, facilidade de uso, reprodutividade, e habilidade quantitativa.

Aprimoramento de traços

[214] Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou aprimorar um ou mais de diversos traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância térmica, tolerância ao sal, resistência ao estresse por nematódeo, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da plântula, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços aprimorados) desenvolvidas sob condições idênticas.

[215] Um traço preferido a ser introduzido ou aprimorado é a fixação de nitrogênio, como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos descritos nesse relatório descritivo exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições no solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos descritos nesse relatório descritivo exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob condições similares no solo.

[216] O traço a ser aprimorado pode ser avaliado sob condições que incluem a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióticos. Exemplos de estressores incluem estresses abióticos (por exemplo, estresse pelo calor, estresse por sal, estresse por seca, estresse por frio e estresse de poucos nutrientes) e estresses bióticos (por exemplo, estresse por nematódeo, estresse por inseto herbívoro, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano e estresse por patógeno viral).

[217] O traço aprimorado pelos métodos e composições da presente revelação pode ser fixação de nitrogênio, incluindo em uma planta que não era capaz previamente de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo produzem 1% ou mais (por exemplo, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes, ou mais), comparadas com bactérias isoladas da primeira planta antes da introdução de qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível de fixação de nitrogênio desejado pode ser obtido após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes). Em alguns casos, níveis de fixação de nitrogênio aumentados são obtidos na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliação do grau de fixação de nitrogênio são conhecidos, cujos exemplos são descritos nesse relatório descritivo.

[218] O melhoramento de micróbios é um método para identificar e aumentar sistematicamente o papel de espécies dentro do microbioma do plantio. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intra-espécies de redes reguladoras e grupamentos do gene, e 3) avaliação e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de plantio desejados. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies cruciais. O modelo é usado para prever o melhoramento de alvos genéticos e aumentar a frequência de seleção de aprimoramentos em traços de relevância agronômica codificados pelo microbioma.

Medição do nitrogênio liberado em um contexto de campo agronomicamente relevante

[219] No campo, a quantidade de nitrogênio liberada pode ser determinada pela função de colonização multiplicada pela atividade.

[220] A equação acima exige: (1) a colonização média por unidade de tecido de plantas, e (2) a atividade como a quantidade de nitrogênio fixada ou a quantidade de amônia excretada por cada célula microbiana. Para converter para libras de nitrogênio por acre, a fisiologia do crescimento do milho é rastreada ao longo do tempo, por exemplo, tamanho da planta e sistema de raiz associado ao longo dos estágios da maturidade.

[221] As libras de nitrogênio liberadas a um plantio por acre-estação podem ser calculadas pela seguinte equação:

[222] Tecido de Planta (t) é o peso fresco de tecido de plantas de milho ao longo do tempo de crescimento (t). Os valores para se fazer razoavelmente o cálculo são descritos em detalhe na publicação intitulada “Roots, Growth and Nutrient Uptake” (Mengel. Dept. of Agronomy Pub.# AGRY-95- 08 (Rev. de maio de 95, páginas 1-8.).

[223] Colonização (t) é a quantidade dos micróbios de interesse encontrada dentro do tecido de plantas, por grama de peso fresco de tecido de plantas, em qualquer tempo particular, t, durante a estação de cultivo. Quando somente um ponto do tempo está disponível, o único ponto do tempo é normalizado como a taxa de colonização de pico ao longo da estação, e a taxa de colonização dos pontos do tempo restantes são ajustados de acordo.

[224] Atividade (t) é a taxa na qual o N é fixado pelos micróbios de interesse por unidade de tempo, em qualquer tempo particular, t, durante a estação de cultivo. Nas modalidades reveladas nesse relatório descritivo, essa taxa de atividade é aproximada por ensaio in vitro de redução de acetileno (ARA) em meios de ARA na presença de 5 mM de glutamina ou ensaio de excreção de amônio em meios de ARA na presença de 5 mM de íons amônio.

[225] A quantidade de nitrogênio liberada é então calculada integrando-se numericamente a função acima. Quando os valores das variáveis descritas acima são medidos separadamente em pontos do tempo estabelecidos, os valores entre aqueles pontos do tempo são aproximados por realização de interpolação linear.

Fixação de nitrogênio

[226] São descritos nesse relatório descritivo métodos de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta, que compreendem a exposição das planta às bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (por exemplo, 2%, 5%, 10%, ou mais), o que pode representar uma capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes, quando comparada com a planta na ausência das bactérias. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, ureia, nitratos ou amônia. Variações genéticas podem ser qualquer variação genética descrita nesse relatório descritivo, incluindo exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação genética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação knockout ou ela pode abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo, ou ela pode compreender a inserção de uma sequência regulatória heteróloga, por exemplo, inserção de uma sequência regulatória encontrada dentro do genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano. A sequência regulatória pode ser escolhida com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de plantas. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas desenvolvidas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióticos ou abióticos.

[227] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas nesse relatório descritivo pode ser medida de várias formas, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. Evidências de que uma bactéria particular está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta podem incluir: 1) N total da planta amenta significantemente mediante inoculação, preferivelmente com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições limitantes de N mediante inoculação (que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) a fixação de N2 é documentada por meio do uso de uma abordagem de 15N (que pode ser experimentos de diluição de isótopo, ensaios de redução de 15N2, ou ensaios de abundância natural 15N); 4) N fixado é incorporado em uma proteína ou metabólito de planta; e 5) todos esses efeitos não são observados em plantas não inoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa do inóculo.

[228] A cascata reguladora da fixação de nitrogênio do tipo selvagem pode ser representada como um circuito lógico digital em que as entradas de O2 e NH4+ passam através de um portão de NOR, cuja saída entra em um portão de AND em adição ao ATP. Em algumas modalidades, os métodos revelados nesse relatório descritivo rompem a influência de NH4+ sobre esse circuito, em vários pontos na cascata reguladora, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio até mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos revelados nesse relatório descritivo também prevêem a alteração do impacto de ATP ou O2 sobre o conjunto de circuitos, ou a substituição do conjunto de circuitos com outras cascatas reguladoras na célula, ou alteração dos circuitos genéticos diferentes da fixação de nitrogênio. Os agrupamentos gênicos podem ser modificados geneticamente novamente para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Por eliminação dos elementos reguladores nativos fora e dentro de sequências codificadoras de agrupamentos de genes, e substituindo-os com sistemas reguladores alternativos, os produtos funcionais de óperons genéticos complexos e outros agrupamentos de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes das espécies das quais os genes nativos foram derivados. Após a nova modificação genética, os agrupamentos de genes sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas reguladores induzíveis controlando, dessa forma, a expressão dos produtos, como desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portões lógicos, geradores de pulso, osciladores, interruptores ou dispositivos de memória. O cassete de controle de expressão pode estar ligado a um promotor, de tal forma que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, por exemplo, um sensor de oxigênio, de temperatura, de toque, de estresse osmótico, estresse de membrana ou sensor redox.

[229] Como um exemplo, os genes nifL, nifA, nifT e nifX podem ser eliminados do cluster do gene nif. Genes sintéticos podem ser projetados por randomização de códons do DNA que codifica cada sequência de aminoácidos. A seleção de códons é realizada, especificando que o uso de códons seja o mais divergente possível do uso de códons no gene nativo. As sequências propostas são escaneadas quanto a quaisquer características indesejadas, por exemplo, sítios de reconhecimento de enzima de restrição, sítios de reconhecimento de transposon, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios de ligação ao ribossomo crípticos e terminadores rho independentes. Sítios de ligação ao ribossomo sintéticos são escolhidos para combinar com a potência de cada sítio de ligação ao ribossomo nativo correspondente, por exemplo, por construção de um plasmídeo-repórter fluorescente no qual as 150 bp que circundam um códon de início do gene (de -60 a +90) estão fundidas a um gene fluorescente. Essa quimera pode ser expressa sob o controle do promotor Ptac, e a fluorescência medida por meio de citometria de fluxo. Para gerar sítios de ligação ao ribossomo sintéticos, uma biblioteca de plasmídeos repórteres usando 150 bp (-60 a +90) de um cassete de expressão sintético é gerada. Resumidamente, um cassete de expressão sintético pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca de RBS, e a sequência codificadora para cada gene sintético. Múltiplos clones são avaliados para identificar o sítio de ligação ao ribossomo sintético que melhor combina com o sítio de ligação ao ribossomo nativo. Óperons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os óperons nativos são, dessa forma, construídos e testados para complementação funcional. Uma descrição exemplar adicional de óperons sintéticos é fornecida em US 20140329326.

Espécies bacterianas

[230] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns casos, micróbios podem ser bactérias, arquéias, protozoários ou fungos. Os micróbios dessa revelação podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exemplo, uma bactéria fixadora de nitrogênio, arquéia fixadora de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, levedura fixadora de nitrogênio ou protozoário fixador de nitrogênio. Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser micróbios formadores de esporos, por exemplo, bactérias formadoras de esporo. Em alguns casos, bactérias úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser bactérias Gram-positivas ou bactérias Gram-negativas. Em alguns casos, as bactérias podem ser bactérias formadoras de endósporos do filo Firmicute. Em alguns casos, as bactérias podem ser um diazotrófico. Em alguns casos, as bactérias podem não ser um diazotrófico.

[231] Os métodos e composições dessa revelação podem ser usados com uma arquéia como, por exemplo, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[232] Em alguns casos, bactérias que podem ser úteis incluem, sem limitação, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amilolyticus (também conhecido como Paenibacillus amilolyticus) Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (sinônimos: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (também conhecido como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (anteriormente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polimyxa, Paenibacillus popilliae (anteriormente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (anteriormente Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (anteriormente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (anteriormente conhecida como Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (N° de Acesso NRRL B-21663), Bacillus sp. AQ175 (ATCC N° de Acesso 55608), Bacillus sp. AQ 177 (ATCC N° de Acesso 55609), Bacillus sp. AQ178 (ATCC N° de Acesso 53522) e Streptomyces sp. cepa N° de Acesso NRRL B-30145. Em alguns casos a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klebsiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[233] Em alguns casos, a bactéria pode ser uma espécie de Clostridium, por exemplo, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutilicum.

[234] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente revelação podem ser cianobactérias. Exemplos de gêneros de cianobactérias incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo, Nostoc punctiforme) ou Synechocystis (por exemplo, Synechocystis sp. PCC6803).

[235] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente revelação podem pertencer ao filo Chlorobi, por exemplo, Chlorobium tepidum.

[236] Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender um gene homólogo a um gene de NifH conhecido. Sequências de genes de NifH conhecidos podem ser encontradas, por exemplo, na base de dados “Zehr lab NifH”, (https:// wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014), ou na base de dados “Buckley lab NifH” (http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, e Gaby, John Christian, e Daniel H. Buckley. “A Comprehensive Aligned nifH Gene Database: a Multipurpose Tool for Studies of Nitrogen-Fixing Bacteria”. Base de dados 2014 (2014): bau001.). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais do que 99% de identidade de sequência para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/ nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais do que 99% de identidade de sequência para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”, (Gaby, John Christian, e Daniel H. Buckley. “A Comprehensive Aligned nifH Gene Database: a Multipurpose Tool for Studies of Nitrogen-Fixing Bacteria”. Base de dados 2014 (2014): bau001).

[237] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos por extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; trituração de sementes para isolar micróbios; plantio de sementes em amostras de solo diversas e recuperação de micróbios de tecidos; ou inoculação de plantas com micróbios exógenos e determinação de quais micróbios aparecem em tecidos de plantas. Exemplos não limitantes de tecidos de planta incluem uma semente, plântula, folha, muda, planta, bulbo ou tubérculo. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, tais como rizosféricos, epífitos ou endófitos. As bactérias também podem ser originadas de um repositório, por exemplo, coleções de cepas ambientais, ao invés de isolar inicialmente uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, por meio de sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; a definição do perfil da composição de comunidades em plantas; caracterização da funcionalidade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou avaliação das características microbianas usando meios seletivos ou fenotípicos (por exemplo, fenótipos de fixação de nitrogênio ou de solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas por meio de dados de sequências; dados de fenótipo; dados de plantas (por exemplo, genoma, dados de fenótipo e/ou de rendimento); dados do solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K, e/ou comunidades bióticas do solo a granel); ou qualquer combinação destes.

[238] As bactérias e métodos de produção de bactérias descritos nesse relatório descritivo podem ser aplicar às bactérias capazes de se autopropagar eficientemente na superfície da folha, na superfície da raiz ou dentro de tecidos de plantas, sem indução de uma reação de defesa que danifique a planta, ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa da planta. As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser isoladas por cultivo de um extrato de tecido de planta ou de lavagem da superfície da folha em um meio sem nitrogênio adicionado. No entanto, as bactérias podem ser não cultiváveis, ou seja, não conhecidas por serem cultiváveis ou de cultivo difícil usando métodos- padrão conhecidos na técnica. As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser um endófito ou um epífito ou uma bactéria que habita a rizosfera da planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Endófitos são organismos que penetram no interior de plantas sem causar sintomas de doença ou despertar a formação de estruturas simbióticas, e são de interesse agronômico, pois podem aumentar o crescimento de plantas e aprimorar a nutrição de plantas (por exemplo, por meio da fixação de nitrogênio). As bactérias podem ser um endófito transmitido por semente. Endófitos transmitidos por semente incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma gramínea ou planta, por exemplo, como um endófito bacteriano transmitido por semente encontrado em sementes maduras, secas, não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fúngica visível, ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido por semente pode estar associado ou ser derivado da superfície da semente; alternativamente, ou em adição, ele pode estar associado ou ser derivado do compartimento interno da semente (por exemplo, de uma semente com superfície esterilizada). Em alguns casos, um endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de replicar dentro do tecido de planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de sobreviver à dessecação.

[239] O isolado bacteriano de acordo com métodos da revelação pode compreender diversas taxas bacterianas diferentes em combinação. Apenas como exemplo, as bactérias podem incluir proteobactérias (por exemplo, Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (por exemplo, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium) e Actinobactérias (por exemplo, Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas em métodos e composições dessa revelação podem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas dos consórcios bacterianos podem ser capazes de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies dos consórcios bacterianos podem facilitar ou aumentar a habilidade de outras bactérias para fixar nitrogênio. As bactérias que fixam nitrogênio e as bactérias que aumentam a habilidade de outras bactérias para fixar nitrogênio podem ser as mesmas ou diferentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana diferente, ou em certos consórcios bacterianos, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em uma monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio incluem, sem limitação, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter e Bacillus.

[240] Bactérias que podem ser produzidas pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, as bactérias podem ser selecionadas do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Enterobacter ou Rahnella. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Frankia ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, sem limitação, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens e Clostridium tetani. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Paenibacillus, por exemplo, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polimyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amilolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae ou Paenibacillus polimyxa.

[241] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com métodos da revelação podem ser um membro de um ou mais dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 gêneros incertae sedis, Xanthomonas e Zimmermannella.

[242] Em alguns casos, uma espécie bacteriana selecionada de pelo menos um dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, uma combinação de espécies bacterianas dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, a espécie utilizada pode ser uma ou mais de: Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari e Rahnella aquatilis.

[243] Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de molibdênio-ferro nitrogenase que compreende: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, um micróbio Gram- positivo pode ter um sistema de vanádio nitrogenase que compreende: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de nitrogenase só de ferro que compreende: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de nitrogenase que compreende glnB e glnK (proteínas de sinalização de nitrogênio). Alguns exemplos de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem glnA (glutamina sintetase), gdh (glutamato desidrogenase), bdh (3-hidroxibutirato desidrogenase), glutaminase, gltAB/gltB/gltS (glutamato sintase), asnA/asnB (aspartato-amônia ligase/asparagina sintetase) e ansA/ansZ (asparaginase). Alguns exemplos de proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem amtB (transportador de amônio), glnK (regulador do transporte de amônio), glnPHQ/ glnQHMP (transportadores de glutamina/glutamato ATP-dependentes), glnT/alsT/yrbD/yflA (transportadores de simporte de próton glutamina-like) e gltP/gltT/yhcl/nqt (transportadores de simporte de próton glutamato-like).

[244] Exemplos de micróbios Gram-positivos que podem ser de interesse particular incluem Paenibacillus polimixa, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus sp., Frankia sp., Heliobacterium sp., Heliobacterium chlorum, Heliobacillus sp., Heliophilum sp., Heliorestis sp., Clostridium acetobutilicum, Clostridium sp., Mycobacterium flaum, Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Agromyces sp., Corynebacterium autitrophicum, Corynebacterium sp., Micromonspora sp., Propionibacteria sp., Streptomyces sp. e Microbacterium sp.

[245] Alguns exemplos de alterações genéticas que podem ser feitas em micróbios Gram-positivos incluem: deleção de glnR para remover a regulação negativa de BNF na presença de nitrogênio ambiental, inserção de promotores diferentes diretamente upstream do cluster nif para eliminar a regulação por GlnR em resposta ao nitrogênio ambiental, mutação de glnA para reduzir a taxa de assimilação de amônio pela via de GS-GOGAT, deleção de amtB para reduzir a captação de amônio dos meios, mutação de glnA de modo que seja constitutivamente no estado de inibido por feedback (FBI- GS), para reduzir a assimilação de amônio pela via de GS- GOGAT.

[246] Em alguns casos, glnR é o regulador principal do metabolismo e fixação de N na espécie Paenibacillus. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnR. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnE ou glnD. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um gene para produzir glnB ou glnK. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para glnB, ou seus homólogos encontrados na arquéia Methanococcus maripaludis, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, os genomas de espécies de Paenibacillus podem ser variáveis. Por exemplo, Paenibacillus polimixa E681 não possui glnK e gdh, possui vários transportadores de composto de nitrogênio, mas somente amtB parece ser controlado por GlnR. Em outro exemplo, Paenibacillus sp. JDR2 possui glnK, gdh e a maioria dos outros genes centrais do metabolismo de nitrogênio, possui muito poucos transportadores de composto de nitrogênio, mas possui glnPHQ controlado por GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 contém um óperon-padrão de glnRA, um gene fdx, um óperon principal de nif, um óperon de nif secundário, e um óperon de anf (que codifica nitrogenase só de ferro). Supostos sítios glnR/tnrA foram encontrados upstream de cada um desses óperons. GlnR pode regular todos os óperons acima, exceto o óperon de anf. GlnR pode se ligar a cada uma dessas sequências regulatórias como um dímero.

[247] Cepas de Paenibacillus fixadoras de N podem se enquadrar em dois subgrupos: Subgrupo I, que contém somente um agrupamento mínimo do gene nif e subgrupo II, que contém um agrupamento mínimo, mais um gene não caracterizado entre nifX e hesA, e frequentemente outros agrupamentos que duplicam alguns dos genes nif, por exemplo, nifH, nifHDK, nifBEN, ou agrupamentos que codificam genes de vanádio nitrogenase (vnf) ou nitrogenase só de ferro (anf).

[248] Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um cluster nif mínimo com 9 genes transcritos por um promotor Sigma-70. Em alguns casos, um cluster nif de Paenibacillus pode ser regulado negativamente por nitrogênio ou oxigênio. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir Sigma-54. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para Sigma-54. Em alguns casos, um cluster nif pode ser regulado por glnR e/ou TnrA. Em alguns casos, a atividade de um cluster nif pode ser alterada por alteração da atividade de glnR e/ou TnrA.

[249] Em bacilos, glutamina sintetase (GS) é inibida por feedback por concentrações elevadas de glutamina intracelular, causando uma mudança na confirmação (referida como FBI-GS). Clusters Nif contêm sítios de ligação distintos para os reguladores GlnR e TnrA em várias espécies de bacilos. GlnR se liga e reprime a expressão gênica na presença de excesso de glutamina intracelular e AMP. Um papel de GlnR pode ser evitar o influxo e produção intracelular de glutamina e amônio sob condições de alta disponibilidade de nitrogênio. TnrA pode se ligar e/ou ativar (ou reprimir) a expressão gênica na presença de glutamina intracelular limitante, e/ou na presença de FBI-GS. Em alguns casos, a atividade de um cluster nif de bacilo pode ser alterada por alteração da atividade de GlnR.

[250] A glutamina sintetase inibida por Feedback (FBI- GS) pode se ligar a GlnR e estabilizar a ligação de GlnR às sequências de reconhecimento. Várias espécies bacterianas possuem um sítio de ligação GlnR/TnrA upstream do cluster nif. A alteração da ligação de FBI-GS e GlnR pode alterar a atividade da via de nif.

Fontes de micróbios

[251] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) podem ser obtidas de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, sua biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); da geosfera terrestre e marinha (regolito e pedra, por exemplo, pedras subterrâneas trituradas, areia e argilas); da criosfera e suas águas de degelo; da atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, gotículas de nuvens e chuva); de ambientes urbanos, industriais e outros ambientes feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada no concreto, canais da beira de estradas, superfícies de telhados e superfícies de estradas).

[252] As plantas das quais as bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) são obtidas podem ser uma planta que possui um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que naturalmente cresce em um ambiente particular ou sob certas condições de interesse. Apenas como exemplo, certa planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de salinidade elevada, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou ela pode ser resistente a certas pragas ou doenças presentes no ambiente, e pode ser desejável que um plantio comercial cresça nessas condições, particularmente caso sejam, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica particular. Como exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de plantios comerciais desenvolvidos nesses ambientes ou, mais especificamente, de plantas de plantio individuais que melhor exibem um traço de interesse dentro de um plantio desenvolvido em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas que crescem mais rápido dentro de um plantio desenvolvido em solos com limitação salina, ou as plantas manos danificadas em plantios expostos a danos severos por insetos ou doença epidêmica, ou plantas que possuem quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibras, teor de óleo e semelhantes, ou plantas que exibem cores, sabor ou aroma desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outra biota animal e de plantas, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, como citado previamente.

[253] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) podem ser isoladas de tecido de planta. Esse isolamento pode ocorrer de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo por exemplo, raiz, caule e folhas, e tecidos reprodutivos da planta. Apenas como exemplo, métodos convencionais para o isolamento de plantas tipicamente incluem a excisão estéril do material de planta de interesse (por exemplo, comprimentos da raiz ou caule, folhas), esterilização de superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio 2%), e depois o material de planta é colocado em meio nutriente para crescimento microbiano. Alternativamente, o material de planta com a superfície esterilizada pode ser triturado em um líquido estéril (normalmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material de planta triturado, espalhada sobre a superfície de um meio ágar sólido adequado, ou meios, que pode ou não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser retiradas individualmente para separar as placas de meio nutriente, e adicionalmente purificadas até uma única espécie por métodos bem conhecidos. Alternativamente, a raiz da planta ou amostras de folhagem podem não ser esterilizadas na superfície, mas apenas lavadas gentilmente incluindo, dessa forma, microorganismos epifíticos que habitam a superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, por impressão e retirada de pedaços de raízes, caule ou folhas da planta sobre a superfície de um meio ágar e depois o isolamento de colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem a retirada por lavagem de pequenas quantidades de solo anexado às raízes incluindo, dessa forma, micróbios que colonizam a rizosfera da planta. De outro modo, o solo aderido às raízes pode ser removido, diluído e espalhado sobre ágar de meios seletivos e não seletivos adequados para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas. TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA A FINALIDADE DE PROCEDIMENTOS DE PATENTE

[254] Os depósitos microbianos da presente revelação foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o “Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos Para a Finalidade de Procedimentos De Patente” (Tratado de Budapeste).

[255] Os requerentes declaram que de acordo com 37 C.F.R. § 1.808(a)(2) “todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão da patente”. Essa declaração está submetida ao parágrafo (b) dessa seção (ou seja, 37 C.F.R. § 1.808(b)).

[256] Culturas biologicamente puras de Rahnella aquatilis e Enterobacter sacchari foram depositadas em 14 de julho de 2015 com a “American Type Culture Collection” (ATCC; uma Autoridade Depositária Internacional), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente na ATCC PTA-122293 e PTA- 122294, respectivamente. Essa aplicável informação de depósito é encontrada abaixo na Tabela A.

[257] A Enterobacter sacchari foi agora reclassificada como Kosakonia sacchari, o nome para o organismo pode ser usado de forma intercambiável ao longo do manuscrito.

[258] Muitos micróbios da presente revelação são derivados de duas cepas do tipo selvagem, como retratado na Figura 18 e na Figura 19. A Cepa CI006 é uma espécie bacteriana classificada previamente no gênero Enterobacter (veja a reclassificação mencionada anteriormente em Kosakonia), e a Figura 19 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI006. A cepa CI019 é uma espécie bacteriana classificada no gênero Rahnella, e a Figura 19 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI019. Com relação à Figura 18 e à Figura 19, observa-se que cepas que compreendem CM no nome são mutantes das cepas retratadas imediatamente à esquerda da referida cepa de CM. As informações de depósito para a Kosakonia tipo selvagem (WT) CI006 e Rahnella WT CI019 não encontradas na Tabela A abaixo.

[259] Alguns microorganismos descritos nesse pedido foram depositados em 06 de janeiro de 2017 ou em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA. Como mencionado anteriormente, todos os depósitos foram feitos sob os termos do “Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para as Finalidades de Procedimento de Patente”. Os números de acesso e datas de depósito no “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” para os depósitos de acordo com o Tratado de Budapeste mencionados anteriormente são fornecidos na Tabela A.

[260] Culturas biologicamente puras de Kosakonia sacchari (WT), Rahnella aquatilis (WT) e uma cepa variante de Kosakonia sacchari foram depositadas em 06 de janeiro de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201701001, 201701003 e 201701002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela A.

[261] Culturas biologicamente puras de cepas variantes de Kosakonia sacchari foram depositadas em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201708004, 201708003 e 201708002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela A.

[262] Uma cultura biologicamente pura de Klebsiella variicola (WT) foi depositada em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e recebeu o número de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201708001. Culturas biologicamente puras de duas variantes de Klebsiella variicola foram depositadas em 20 de dezembro de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201712001 e 201712002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela A. Tabela A: Microorganismos depositados sob o Tratado de Budapeste.

Microorganismos isolados e biologicamente puros

[263] A presente revelação, em certas modalidades, fornece microorganismos isolados e biologicamente puros que possuem aplicações, inter alia, em agricultura. Os microorganismos revelados podem ser utilizados em seus estados isolados e biologicamente puros, bem como serem formulados em composições (veja a seção abaixo para descrições de composições exemplares). Além disso, a revelação fornece composições microbianas que contêm pelo menos dois membros dos microorganismos revelados isolados e biologicamente puros, bem como métodos de utilização das referidas composições microbianas. Além disso, a revelação fornece métodos de modulação da fixação de nitrogênio em plantas por meio da utilização dos micróbios isolados e biologicamente puros revelados.

[264] Em alguns aspectos, os microorganismos isolados e biologicamente puros da revelação são aqueles da Tabela A. Em outros aspectos, os microorganismos isolados e biologicamente puros da revelação são derivados de um microorganismo da Tabela A. Por exemplo, uma cepa, jovem, mutante ou derivado de um microorganismo da Tabela A são fornecidos neste relatório descritivo. A revelação contempla todas as combinações possíveis de micróbios listados na Tabela A, as referidas combinações algumas vezes formando um consórcio microbiano. Os micróbios da Tabela A, individualmente ou em qualquer combinação, podem ser combinados com qualquer planta, ativo (sintético, orgânico etc.), adjuvante, carreador, suplemento ou produto biológico, mencionado na revelação.

Composições

[265] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem estar na forma de um líquido, uma espuma ou um produto seco. Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas para aprimorar traços de plantas. Em alguns exemplos, uma composição que compreende populações bacterianas pode estar na forma de um pó seco, uma lama de pó e água, ou um tratamento fluido de semente. As composições que compreendem populações bacterianas podem ser revestidas em uma superfície de uma semente, e podem estar em forma líquida.

[266] A composição pode ser fabricada em biorreatores como, por exemplo, reatores de tanque agitado contínuo, reatores de batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas em um recipiente, por exemplo, um jarro ou em pequenos volumes. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em uma garrafa, jarro, ampola, pacote, vaso, bolsa, caixa, lata, envelope, caixa de papelão, recipiente, silo, recipiente de envio, caçamba de caminhão, e/ou caixote.

[267] As composições também podem ser usadas para aprimorar traços de plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma plântula. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas como uma camada acima de uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma composição que é revestida sobre uma semente pode estar em forma líquida, em forma de produto seco, em forma de espuma, em forma de uma lama de pó e água, ou em um tratamento fluido de semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser aplicadas a uma semente e/ou plântula por pulverização, imersão, revestimento, encapsulação e/ou espanamento da semente e/ou plântula com as (uma ou mais) composições. Em alguns exemplos, várias bactérias ou populações bacterianas podem ser revestidas sobre uma semente e/ou uma plântula da planta. Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais do que dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionadas de um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Metilobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[268] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais do que dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae e Pleosporaceae.

[269] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais do que dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae Pleosporaceae.

[270] Exemplos de composições podem incluir revestimentos de semente para cultivos agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, milho e trigo. Exemplos de composições também podem incluir revestimentos de semente para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais e sementes oleaginosas. Sementes como fornecidas neste relatório descritivo podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não-GMO, orgânicas ou convencionais. Em alguns exemplos, as composições podem ser pulverizadas nas partes aéreas da planta, ou aplicadas às raízes por inserção em sulcos nos quais as sementes de planta são plantadas, irrigação do solo, ou imersão das raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidratadas em uma forma adequada que mantém a viabilidade celular e a habilidade para inocular e colonizar artificialmente as plantas hospedeiras. A espécie bacteriana pode estar presente nas composições em uma concentração entre 108 a 1010 UFC/ml. Em alguns exemplos, as composições podem ser suplementadas com íons de metal-traço, por exemplo, íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês, ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições como descritos nesse relatório descritivo pode estar entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM. Alguns exemplos de composições também podem ser formulados com um carreador, por exemplo, beta-glucano, carboxilmetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açúcar, leite animal, ou outros carreadores adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantio podem ser usados como um carreador, ou biopolímeros nos quais a composição é capturada no biopolímero, podem ser usados como um carreador. As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem aprimorar traços de plantas, por exemplo, a promoção do crescimento de plantas, a manutenção de um teor elevado de clorofila nas folhas, o aumento dos números de frutos ou sementes, e o aumento do peso unitário de frutos ou sementes.

[271] As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser revestidas na superfície de uma semente. Dessa forma, as composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias descritas nesse relatório descritivo também são contempladas. O revestimento de semente pode ser formado por misturação da população bacteriana com um carreador granular poroso, quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos de arados nos quais a semente é plantada ou pulverizada sobre as folhas da planta ou aplicadas por imersão das raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para popular a região abaixo do solo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável, ou popular as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com traços aprimorados (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).

[272] As composições bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser formuladas usando um carreador agronomicamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anti-complexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida, um nutriente, ou qualquer combinação destes. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis no armazenamento. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas nesse relatório descritivo pode incluir um carreador agronomicamente aceitável (por exemplo, um ou mais de um fertilizante como, por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão como, por exemplo, um agente de adesão de ocorrência não natural, e um pesticida como, por exemplo, um pesticida de ocorrência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes, plântulas ou plantas revestidas descritas nesse relatório descritivo pode conter um carreador agronomicamente aceitável desse tipo no revestimento de semente. Em qualquer uma das composições ou métodos descritos nesse relatório descritivo, um carreador agronomicamente aceitável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural como, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética, ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitantes de carreadores agronomicamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agronomicamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de carreadores agronomicamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agronomicamente aceitáveis são conhecidos na técnica.

[273] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador agronomicamente aceitável. O carreador pode ser um carreador sólido ou um carreador líquido, e em várias formas incluindo microesferas, pós, emulsões e semelhantes. O carreador pode ser qualquer um ou mais de diversos carreadores que conferem diversas propriedades, tais como estabilidade aumentada, umectabilidade ou dispersibilidade. Agentes umidificantes como, por exemplo, tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação destes, podem ser incluídos na composição. Emulsões água-em-óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.485.451). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, fitas ou péletes de ágar, espessantes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, líquidos como, por exemplo, compósitos aquosos de baixa viscosidade, suspensões aquosas, emulsões água-em-óleo etc. A formulação pode incluir grão ou produtos de legumes, por exemplo, grão ou feijões triturados, caldo ou farinha derivada de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[274] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de plantas. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes, ou combinações destes. Alternativamente, o carreador agrícola pode ser um sólido, por exemplo, terra diatomácea, greda, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, cascas de sementes, outros produtos de plantas e animais, ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes mencionados anteriormente também são contempladas como carreadores como, por exemplo, sem limitação, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou péletes à base de farinha em greda, areia ou argila etc. As formulações podem incluir fontes de alimentos para as bactérias, por exemplo, cevada, arroz, ou outros materiais biológicos como, por exemplo, sementes, partes de plantas, bagaço de cana de açúcar, cascas ou talos do processamento de grãos, material de planta moído ou madeira de restos de locais de construção, serragem ou pequenas fibras da reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[275] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes a uma semente, plântula ou planta. Exemplos não limitantes de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal destes). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido lático, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartrato de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente de pegajosidade ou aderente (denominado um agente adesivo) para ajudar a ligar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, uma superfície de uma semente). Esses agentes são úteis para combinação das bactérias com carreadores que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para gerar uma composição de revestimento. Essas composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte de planta. Em uma modalidade, adesivos são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, carragenana, PGA, outros biopolímeros, óleo mineral, polietileno glicol (PEG), polivinil pirrolidona (PVP), arabinogalactana, metil celulose, PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilonitrila, glicerol, trietileno glicol, acetato de vinila, goma gelana, poliestireno, polivinil, carboximetil celulose, goma Gatti e copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno.

[276] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera como, por exemplo, cera de carnaúba, cera de abelhas, cera chinesa, cera de goma-laca, cera de espermaceti, cera de coroa, cera de mamona, cera de ouricuri e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), uma gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeínas), gomas arábicas e goma-lacas. Agentes adesivos podem ser compostos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitantes de polímeros que podem ser usados como um agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, copolímeros de etileno-acetato de vinila (EVA), álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, celuloses (por exemplo, etilceluloses, metilceluloses, hidróxi-metilceluloses, hidroxipropilceluloses, e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolímeros de cloreto vinilideno, lignossulfonatos de cálcio, copolímeros acrílicos, polivinil-acrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, poliidroxietil acrilato, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[277] Em alguns exemplos, um ou mais dos agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de carreadores agronomicamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S- 630), tensoativos, aglutinantes e agentes de enchimento.

[278] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem mesclas de nitrogênio-tensoativo como, por exemplo, Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v até 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v até 1% v/v.

[279] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiano. Um agente desse tipo pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que possa ser classificado como um dessecante, independentemente se o composto ou compostos são usados em concentrações tais que, na verdade, possuam um efeito dessecante sobre o inoculante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada, e devem promover a habilidade da população microbiana para sobreviver à aplicação nas sementes e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trehalose, sacarose, glicerol e metileno glicol. Outros dessecantes adequados incluem, sem limitação, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% até cerca de 50% por peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% até cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35%, ou entre cerca de 20% e cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como, por exemplo, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um rodenticida, bactericida ou um nutriente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que fornecem proteção contra patógenos originários da superfície da semente. Em alguns exemplos, protetores podem fornecer algum nível de controle de patógenos originários do solo. Em alguns exemplos, protetores podem ser eficazes predominantemente na superfície de uma semente.

[280] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, seja químico ou biológico, que pode inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um protetor, ou agentes que são eficazes predominantemente na superfície da semente, que fornecem proteção contra patógenos originários da superfície da semente e que fornecem algum nível de controle de patógenos originários do solo. Exemplos não limitantes de fungicidas protetores include captan, maneb, Tiram ou fludioxonil.

[281] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido na plântula emergente e inibir ou matar o fungo dentro de tecidos da planta hospedeira. Fungicidas sistêmicos usados para tratamento de semente incluem, sem limitação, os seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina, e vários fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados primariamente para visar os fungos de bolor de água Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferidos em relação a outros, dependendo da espécie de planta, por causa das diferenças sutis na sensibilidade da espécie fúngica patogênica, ou por causa das diferenças na distribuição ou sensibilidade das plantas ao fungicida. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente controle biológico, por exemplo, uma bactéria ou um fungo. Esses organismos podem ser parasíticos para os fungos patogênicos, ou secretam toxinas ou outras substâncias que podem matar ou de algum outro modo evitar o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser usado como um agente de controle em uma composição de semente.

[282] Em alguns exemplos, a composição do revestimento de semente compreende um agente de controle que possui propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado dos compostos descritos nesse relatório descritivo em outra seção. Em outra modalidade, o composto é estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser usados como parte de uma composição do revestimento de semente incluem aqueles baseados em diclorofeno e álcool benzílico hemi formal (Proxel® de ICI ou Acticide® RS de Thor Chemie e Kathon® MK 25 de Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona como, por exemplo, alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie).

[283] Em alguns exemplos, o regulador do crescimento é selecionado do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolida, butralina, clormequat (cloreto de clormequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, Dikegulac, dimetipin, 2,6- dimetilpuridina, Etefon, flumetralin, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfida, ácido indol-3-acético, hidrazida maléica, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, N- 6-benziladenina, paclobutrazol, prohexadiona fosforotritioato, ácido 2,3,5-tri-iodobenzóico, trinexapac- etil e uniconazol. Exemplos não limitantes adicionais de reguladores do crescimento incluem brassinosteróides, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxinas (por exemplo, ácido indolilacético e indolilacetil aspartato), flavonóides e isoflavonóides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoalexinas (por exemplo, gliceolina) e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (por exemplo, pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacurônico e ácido oligogalacturônico) e giberelinas. Esses agentes são idealmente compatíveis com a semente ou plântula agrícola sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, ele não deve ser deletério para o crescimento ou para a saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente um que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, nenhuma questão de segurança, ou o composto é suficientemente lábil que o produto de planta comercial derivado da planta contém quantidades desprezíveis do composto).

[284] Alguns exemplos de agentes de biocontrole antagonísticos de nematódeos incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; fungos microrrízicos vesiculares- arbusculares, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e rizobactérias. Agentes de biocontrole antagonísticos de nematódeos particularmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrothecium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, fungos microrrízicos vesiculares-arbusculares, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, Brevibacillus laterosporus cepa G4, Pseudomonas fluorescens e rizobactérias.

[285] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, sem limitação, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções de nitrogênio sem pressão, amônia Aqua, amônia anidra, tiossulfato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia-formaldeídos, IBDU, ureia revestida com polímero, nitrato de cálcio, Ureaform e metileno-ureia, fertilizantes de fósforo como, por exemplo, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e superfosfato Triplo, e fertilizantes de potássio como, por exemplo, cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio-magnésio, nitrato de potássio. Essas composições podem existir como sais ou íons livres dentro da composição de revestimento de semente. Alternativamente, nutrientes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação sustentada ao longo do tempo.

[286] Alguns exemplos de rodenticidas podem ser selecionados do grupo de substâncias que consiste em 2- isovalerilindan- 1,3-diona, 4-(quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloroidrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido arsenioso, carbonato de bário, Nisthiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumaclor, coumafuril, coumatetralil, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocoumafen, fluoracetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfino, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinuron, Scilliroside, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoracetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio, warfarin e fosfeto de zinco.

[287] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo, ou outros carreadores líquidos.

[288] Composições sólidas podem ser preparadas por dispersão das populações bacterianas em e sobre um carreador sólido adequadamente dividido, por exemplo, turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e semelhantes. Quando essas formulações são usadas como pós molháveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis como, por exemplo, agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos, podem ser usados.

[289] Os carreadores sólidos usados mediante formulação incluem, por exemplo, carreadores minerais como, por exemplo, argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita e perlita, e sais inorgânicos como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, pós orgânicos finos como, por exemplo, farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz, podem ser usados. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais como, por exemplo, óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, polipropileno glicol etc.

Aplicação de populações bacterianas em plantios

[290] A composição da bactéria ou população bacteriana descrita nesse relatório descritivo pode ser aplicada nos sulcos de arados, em talco ou como tratamento de semente. A composição pode ser aplicada a um pacote de sementes a granel, mini-carga, em uma bolsa ou em talco.

[291] O plantador pode plantar a semente tratada e crescer o plantio de acordo com formas convencionais, fileiras gêmeas, ou formas que não exijam trabalhar o solo. As sementes podem ser distribuídas usando um reservatório de sementes de controle ou um reservatório de sementes individual. As sementes também podem ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. A colocação da semente pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Adicionalmente, a aplicação da bactéria ou população bacteriana descrita nesse relatório descritivo pode ser feita usando tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, as bactérias podem ser aplicadas às sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveias, grama de Palmer, centeio, painço-pérola, sorgo, trigo-vermelho, teff, triticale e trigo. Exemplos de pseudocereais podem incluir árvore-do-pão, trigo sarraceno, tifa, chia, linhaça, amaranto, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não-GMO, orgânicas ou convencionais.

[292] Aditivos como, por exemplo, microfertilizante, PGR, herbicidas, inseticidas e fungicidas, podem ser usados adicionalmente para tratar os plantios. Exemplos de aditivos incluem protetores de plantio como, por exemplo, inseticidas, nematicidas, fungicida, agentes de intensificação como, por exemplo, corantes, polímeros, agentes de peletização, preparação e desinfetantes, e outros agentes como, por exemplo, inoculantes, PGR, amaciantes e micronutrientes. PGRs podem ser hormônios de planta naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, florescência ou alongamento do caule. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[293] A composição pode ser aplicada nos sulcos em combinação com um fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

[294] A composição pode aprimorar traços de plantas, por exemplo, promoção do crescimento de plantas, manutenção de um teor de clorofila elevado em folhas, aumento dos números de frutos ou sementes e aumento do peso unitário de frutos ou sementes. Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou aprimorar um ou mais de diversos traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância térmica, tolerância ao sal, tolerância ao estresse por nitrogênio baixo, eficiência no uso de nitrogênio, resistência ao estresse por nematódeo, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito, modulação no nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da plântula, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou aprimorados) desenvolvidas sob condições idênticas. Em alguns exemplos, os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da plântula, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou aprimorados) desenvolvidas sob condições similares.

[295] Um traço agronômico para uma planta hospedeira pode incluir, sem limitação, os seguintes: teor de óleo alterado, teor de proteína alterado, composição de carboidratos da semente alterada, composição de óleo de sementes alterada, e composição de proteína da semente alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, aumento do crescimento, aumento da saúde, tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aumentada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura da raiz aprimorada, eficiência no uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento da raiz aumentado, peso da semente aumentado, comprimento do broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições de água limitada, massa do caroço, teor de umidade do caroço, tolerância a metais, número de espigas, número de caroços por espiga, número de vagens, aumento da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, aumento da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, efeito verde, aumento do vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número aumentado de vagens por planta, comprimento aumentado de vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrito e uma modulação detectável no proteoma, comparada com uma planta da mesma linhagem desenvolvida a partir de uma semente sem a referida formulação de tratamento de semente.

[296] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações bacterianas que são isoladas da mesma espécie de planta que o elemento de planta da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente em encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) está associada com um elemento de planta de uma planta de outra variedade de Zea mays que, em seu estado natural, não possui as referidas bactérias e populações bacterianas. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de uma planta de uma espécie de planta relacionada que o elemento de planta da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria e população bacteriana que é normalmente encontrada em Zea diploperennis Iltis e cols. (diploperennial teosinte) é aplicada a uma Zea mays (milho), ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações bacterianas que são heterólogas ao elemento de planta da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e população bacteriana que é normalmente encontrada em dicotiledôneas é aplicada a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculação de milho com uma bactéria e população bacteriana derivada de soja), ou vice-versa. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana a ser inoculada sobre uma planta é derivada de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são parte de uma composição projetada inoculada em qualquer elemento da planta hospedeira.

[297] Em alguns exemplos, a bactéria ou população bacteriana é exógena, em que as bactérias e população bacteriana são isoladas de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[298] Em alguns exemplos, as bactérias e populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo são capazes de se mover de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e o isolamento de bactérias e populações bacterianas da presente invenção dentro dos tecidos de plantas maduros após revestimento no exterior de uma semente demonstram sua habilidade para se mover do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta em amadurecimento. Portanto, em uma modalidade, a população de bactéria e população bacteriana são capazes de se mover do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta. Em uma modalidade, a bactéria e população bacteriana que são revestidas sobre a semente de uma planta são capazes, após germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido da planta diferente. Por exemplo, bactérias e populações bacterianas podem ser capazes de se localizar em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: na raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo da raiz, broto, folha, flor, botão, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estólons, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, colmo, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz e/ou no pelo da raiz da planta. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Ainda em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto) da planta. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Ainda em outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas colonizam um tecido do fruto ou da semente da planta. Ainda em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de colonizar a planta de modo a estar presente na superfície da planta (ou seja, sua presença está presente de forma detectável no exterior da planta, ou na episfera da planta). Ainda em outras modalidades, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[299] A eficácia das composições também pode ser avaliada por medição da maturidade relativa do plantio ou da unidade térmica do plantio (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho, e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa do caroço de milho ou com o tempo no qual o caroço de milho está em peso máximo. A unidade térmica do plantio (CHU) também pode ser usada para prever o amadurecimento do plantio de milho. A CHU determina a quantidade de acúmulo de calor por medição das temperaturas máximas diárias no crescimento do plantio.

[300] Em exemplos, bactérias podem se localizar em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: na raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo da raiz, broto, folha, flor, pendão do botão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estólons, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, colmo, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar em tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame ou fruto) da planta. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana coloniza o tecido de um fruto ou semente da planta. Ainda em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de colonizar a planta de modo a estar presente na superfície da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bactéria ou população bacteriana não está localizada na raiz de uma planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[301] A eficácia das composições bacterianas aplicadas aos plantios pode ser avaliada por medição de várias características do crescimento do plantio incluindo, sem limitação, taxa de plantio, vigor da semeadura, força da raiz, tolerância à seca, altura da planta, taxa de secagem e peso do hectolitro.

Espécies de plantas

[302] Os métodos e bactérias descritos nesse relatório descritivo são adequados para qualquer uma de diversas plantas, por exemplo, plantas nos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitantes de plantas adequadas incluem musgos, liquens e algas. Em alguns casos, as plantas possuem valor econômico, social e/ou ambiental, por exemplo, plantios de alimentos, plantios de fibras, plantios de óleos, plantas na floresta ou indústrias de polpa e papel, matéria-prima para a produção de biocombustível e/ou plantas ornamentais. Em alguns exemplos, as plantas podem ser usadas para produzir produtos economicamente valiosos como, por exemplo, um grão, uma farinha, um amido, um xarope, um farelo, um óleo, uma película, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração animal, uma forragem de peixe, um material a granel para produtos químicos industriais, um produto de cereal, um produto alimentar processado para humanos, um açúcar, um álcool e/ou uma proteína. Exemplos não limitantes de plantas de cultivo incluem milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveias, centeio, triticale, trigo sarraceno, milho-verde, cana de açúcar, cebolas, tomates, morangos e aspargo.

[303] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou aprimoradas com o uso dos métodos e composição revelados nesse relatório descritivo podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou florestais. Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio e grama; e plantas dicotiledôneas como, por exemplo, ervilha, alfafa, tomate de cáscara, melão, grão- de-bico, chicória, cravo-da-índia, couve crespa, lentilhas, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieiras, uvas, algodão, girassol, agrião, canola, cítricos (incluindo laranja, tangerina, kumquat, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão, alface, Panicum virgatum (switch), sorgo bicolor (sorgo, Sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana-energia), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba), Pennisetum glaucum (painço-pérola), Panicum spp. Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (cânhamo), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (trigo - 25 trigo X centeio), bambu, Carthamus tinctorius (açafroa), Jatropha curcas (pinhão-manso), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira- real), Syagrus romanzoffiana (palma-rainha), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimentas e pimentões), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (squash), Cucurbita moschata (squash), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea 5 spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada), e Lolium spp. (centeio).

[304] Em alguns exemplos, uma planta monocotiledônea pode ser usada. Plantas monocotiledôneas pertencem às ordens das Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. Plantas que pertencem à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, cevada e cana de açúcar.

[305] Em alguns exemplos, uma planta dicotiledônea pode ser usada, incluindo aquelas que pertencem às ordens das Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Violates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em algodão, soja, pimentão e tomate.

[306] Em alguns casos, a planta a ser aprimorada não é facilmente receptiva às condições experimentais. Por exemplo, uma planta de plantio pode demorar muito para crescer o bastante para avaliar de forma prática um traço aprimorado serialmente ao longo de várias repetições. Consequentemente, uma primeira planta da qual as bactérias são inicialmente isoladas, e/ou as várias plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas podem ser uma planta-modelo, por exemplo, uma planta mais passível à avaliação sob condições desejadas. Exemplos não limitantes de plantas-modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A habilidade de bactérias isoladas de acordo com um método da revelação usando uma planta-modelo pode então ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de plantio) para confirmar a conferência do traço aprimorado.

[307] Traços que podem ser aprimorados pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem qualquer característica observável da planta incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, cheiro, alterações na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos, e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base em informação genotípica também é prevista (por exemplo, incluindo o padrão de expressão gênica da planta em resposta às bactérias, ou identificação da presença de marcadores genéticos, por exemplo, aqueles associados com fixação de nitrogênio aumentada). As plantas também podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço indesejável), ao contrário da presença de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço desejável).

Concentrações e taxas de aplicação de composições agrícolas

[308] Como mencionado anteriormente, as composições agrícolas da presente revelação, que compreendem um micróbio ensinado, podem ser aplicadas às plantas de várias formas. Em dois aspectos particulares, a revelação contempla um tratamento nos sulcos de arado ou um tratamento de semente.

[309] Para as modalidades de tratamento de semente, os micróbios da revelação podem estar presentes na semente em diversas concentrações. Por exemplo, os micróbios podem ser encontrados em um tratamento de semente em uma concentração de ufc, por semente de: 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, ou mais. Em aspectos particulares, as composições de tratamento de semente compreendem cerca de 1 x 104até cerca de 1 x 108 ufc por semente. Em outros aspectos particulares, as composições de tratamento de semente compreendem cerca de 1 x 105até cerca de 1 x 107 ufc por semente. Em outros aspectos, as composições de tratamento de semente compreendem cerca de 1 x 106 ufc por semente.

[310] Nos Estados Unidos, cerca de 10% dos acres de milho são plantados em uma densidade de sementes acima de cerca de 36.000 sementes por acre; 1/3 dos acres de milho é plantado em uma densidade de sementes entre cerca de 33.000 até 36.000 sementes por acre; 1/3 dos acres de milho é plantado em uma densidade de sementes entre cerca de 30.000 até 33.000 sementes por acre, e o restante dos acres é variável. Veja, “Corn Seeding Rate Considerations”, escrito por Steve Butzen, disponível em: https://www.pioneer.com/home/ site/us/agronomy/library/corn-seeding-rate-considerations/.

[311] A Tabela B abaixo utiliza várias concentrações de ufc por semente em uma modalidade contemplada de tratamento de semente (fileiras) e várias densidades de plantio de acres de sementes (1st coluna: 15K-41K) para calcular a quantidade total de ufc por acre, que seria utilizada em vários cenários agrícolas (ou seja, concentração de tratamento de semente por semente x densidade de sementes plantadas por acre). Dessa forma, se fossemos utilizar um tratamento de semente com 1 x 106 ufc por semente e plantar 30.000 sementes por acre, então o teor de ufc total por acre seria 3 x 1010 (ou seja, 30K * 1 x 106). Tabela B: Cálculo de UFC total por acre para modalidades de tratamento de semente.

[312] Para modalidades no sulco, os micróbios da revelação podem ser aplicados em uma concentração de ufc por acre de: 1 x 106, 3,20 x 1010, 1,60 x 1011, 3,20 x 1011, 8,0 x 1011, 1,6 x 1012, 3,20 x 1012, ou mais. Portanto, em alguns aspectos, as composições líquidas no sulco podem ser aplicadas em uma concentração entre cerca de 1 x 106até cerca de 3 x 1012 ufc por acre.

[313] Em alguns aspectos, as composições no sulco estão contidas em uma formulação líquida. Nas modalidades no sulco líquidas, os micróbios podem estar presentes em uma concentração de ufc por mililitro de: 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, ou mais. Em certos aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 106até cerca de 1 x 1011 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 108até cerca de 1 x 109 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de até cerca de 1 x 1013 ufc por mililitro.

EXEMPLOS

[314] Os exemplos fornecidos nesse relatório descritivo descrevem métodos de isolamento bacteriano, análise bacteriana e de planta e aprimoramento de traço de planta. Os exemplos são apenas para fins ilustrativos, e não devem ser de modo algum considerados como limitantes.

Exemplo 1: Isolamento de micróbios de tecido de planta

[315] A camada superficial do solo foi obtida de várias áreas agrícolas da região central da Califórnia. 20 solos com características de textura diversas foram coletados, incluindo argila pesada, greda de argila de turfa, argila lodosa e greda arenosa. Sementes de vários milhos de campo, milho-verde, milho crioulo e tomate foram plantadas em cada solo, como mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Tipo e variedades de plantio plantados em solo com características diversas.

[316] As plantas foram arrancadas pela raiz após 2-4 semanas de crescimento e solo em excesso nas superfícies da raiz foi removido com água deionizada. Após remoção de solo, as plantas foram esterilizadas na superfície com água sanitária e enxaguadas vigorosamente em água estéril. Um corte de 1 cm de raiz, limpo, foi retirado da planta e colocado em uma solução salina tamponada com fosfato contendo microesferas de aço de 3 mm. Uma lama foi gerada por agitação vigorosa da solução com um TissueLyser II de Qiagen. A raiz e a lama salina foram diluídas e inoculadas em vários tipos de meios de crescimento para isolar micróbios rizosféricos, endofíticos, epifítico e outros micróbios associados às plantas. Meios de ágar R2A e Nfb foram usados para obter colônias únicas, e rampas de meios Nfb semi- sólidos foram usadas para obter populações de bactérias fixadoras de nitrogênio. Após incubação de 2-4 semanas em rampas de meios Nfb semi-sólidos, as populações microbianas foram coletadas e semeadas para obter colônias únicas em ágar R2A, como mostrado na Figura 1A-B. colônias únicas foram ressuspensas em uma mistura de R2A e glicerol, submetidas à análise por PCR, e congeladas a -80°C para análise posterior. Aproximadamente 1.000 colônias únicas foram obtidas e designadas “micróbios isolados”. Os isolados foram então submetidos a uma avaliação por PCR da colônia para detectar a presença do gene nifH a fim de identificar diazotróficos. O conjunto de iniciadores descrito previamente Ueda 19F/388R, que demonstrou que detecta mais de 90% de diazotróficos em avaliações, foi usado para sondar a presença do agrupamento nif em cada isolado (Ueda e cols. 1995; J. Bacteriol. 177: 1.414-1.417) . Colônias únicas de isolados purificados foram selecionadas, ressuspensas em PBS e usadas como um modelo para PCR da colônia, como mostrado na Figura 2. Colônias de isolados que geraram bandas de PCR positivas foram semeadas novamente, e o processo de PCR da colônia e nova semeadura foi repetido duas vezes para evitar a identificação falso-positiva de diazotróficos. Isolados purificados foram então designados “micróbios candidatos”.

Exemplo 2: Caracterização de micróbios isolados Sequenciamento, análise e caracterização filogenética

[317] Sequenciamento de rDNA 16S com o conjunto de iniciadores 515f-806r foi usado para gerar identidades filogenéticas preliminares para micróbios isolados e candidatos (veja, por exemplo, Vernon e cols.; BMC Microbiol., 23 de dezembro de 2002; 2: 39). Os micróbios compreendem diversos gêneros incluindo: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pantoea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium e Paenibacillus, como mostrado na Tabela 2. Tabela 2: Diversidade de micróbios isolados de plantas de tomate como determinada por sequenciamento profundo de rDNA 16S.

[318] Subsequentemente, os genomas de 39 micróbios candidatos foram sequenciados usando a plataforma Illumina Miseq. DNA genômico de culturas puras foi extraído usando o mini kit de DNA QIAmp (QIAGEN), e bibliotecas de DNA total para sequenciamento foram preparadas por meio de um vendedor terceirizado (SeqMatic, Hayward). A montagem do genoma foi então realizada por meio do pacote A5 (Tritt e cols. 2012; PLoS One 7 (9): e42304). Os genes foram identificados e anotados, e aqueles relacionados à regulação e expressão de fixação de nitrogênio foram observados como alvos para mutagênese.

Definição do perfil transcriptômico de micróbios candidatos

[319] A definição do perfil transcriptômico da cepa CI010 foi realizada para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A Cepa CI010 foi cultivada em meios definidos livres de nitrogênio suplementados com 10 mM de glutamina. RNA total foi extraído dessas culturas (kit RNeasy de QIAGEN) e submetido ao sequenciamento RNAseq por meio de HiSeq de Illumina (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de sequenciamento foram mapeadas para os dados de genoma de CI010 usando Geneious, e os genes altamente expressos sob o controle de promotores da transcrição proximais foram identificados.

[320] As Tabelas 3A-C list am genes e seu nível de expressão relativo, como medido por meio de sequenciamento RNASeq de RNA total. Sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese de vias de nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio, ou outros genes com um nível de expressão desejado. Tabela 3A Tabela 3B Tabela 3C

Avaliação da tratabilidade genética

[321] Micróbios candidatos foram caracterizados com base na capacidade de transformação e tratabilidade genética. Primeiro, a utilização ótima da fonte de carbono foi determinada por crescimento em um pequeno painel de meios relevantes, bem como em uma curva de crescimento tanto em meios livres de nitrogênio quanto em meios ricos em nitrogênio. Segundo, a resistência antibiótica natural de cada cepa foi determinada por meio de plaqueamento de spot e crescimento em cultura líquida contendo um painel de antibióticos usados como marcadores seletivos para mutagênese. Terceiro, cada cepa foi testada quanto à sua capacidade de transformação por meio de eletroporação de uma coleção de plasmídeos. A coleção de plasmídeos compreende a expansão combinatória de sete origens de replicação, ou seja, p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 e pRO1600 e quatro marcadores de resistência antibiótica, ou seja, CmR, KmR, SpecR e TetR. Essa avaliação sistemática de compatibilidade de origem e marcador de resistência foi usada para identificar vetores para mutagênese à base de plasmídeo em micróbios candidatos.

Exemplo 3: Mutagênese de micróbios candidatos Knockouts mediados por Lambda-Red

[322] Vários mutantes de micróbios candidatos foram gerados usando o plasmídeo pKD46 ou um derivado contendo um marcador de resistência à canamicina (Datsenko e cols. 2000; PNAS 97 (12): 6.640-6.645). Foram projetados cassetes de knockout com homologia de 250 bp flanqueando o gene-alvo e gerados por meio de PCR de extensão superposta. Micróbios candidatos foram transformados com pKD46, cultivados na presença de arabinose para induzir a expressão do maquinário Lambda-Red, preparados para eletroporação, e transformados com os cassetes de knockout para produzir cepas candidatas mutantes. Quatro micróbios candidatos e uma cepa de laboratório, Klebsiella oxytoca M5A1, foram usados para gerar treze mutantes candidatos dos genes reguladores da fixação de nitrogênio nifL, glnB e amtB, como mostrado na Tabela 4. Tabela 4: Lista de mutantes por knockout únicos criados por meio de mutagênese Lambda-Red.

Mutagênese óligo-dirigida com seleção de Cas9

[323] Mutagênese óligo-dirigida foi usada para direcionar alterações genômicas ao gene rpoB em E. coli DH10B e mutantes foram selecionados com um sistema CRISPR-Cas. Um óligo mutagênico (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACC GTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC” (ID. DE SEQ. N°: 2), em que * representa ligação fosforotioato) foi projetado para conferir resistência à rifampicina por meio de uma mutação de 4 bp ao gene rpoB. Células contendo um plasmídeo que codifica Cas9 foram induzidas para expressão de Cas9, preparadas para eletroporação, e depois eletroporadas tanto com o óligo mutagênico quanto com um plasmídeo que codifica a expressão constitutiva de um RNA-guia (gRNA) que visa a clivagem de Cas9 da sequência de rpoB WT. As células eletroporadas foram recuperadas em meios não seletivos de um dia para o outro para permitir segregação suficiente dos cromossomos mutantes resultantes. Após plaqueamento na seleção para o plasmídeo que codifica gRNA, duas de dez colônias avaliadas demonstraram que contêm a mutação desejada, enquanto o resto demonstrou ser composto por mutantes de escape gerados por meio de mutação do protoespaçador no plasmídeo de gRNA ou perda do plasmídeo de Cas9.

Mutagênese Lambda-Red com seleção de Cas9

[324] Mutantes de micróbios candidatos CI006 e CI010 foram gerados por meio de mutagênese Lambda-Red com seleção por CRISPR-Cas. Os cassetes de knockout continham um promotor endógeno identificado por meio da definição do perfil de transcrição (como descrito no Exemplo 2 e retratado nas Tabelas 3A-C) e regiões de homologia de aproximadamente 250 bp que flanqueiam o alvo da deleção. CI006 e CI010 foram transformadas com plasmídeos que codificam o sistema de recombinação Lambda-Red (genes exo, beta, gam) sob o controle de um promotor induzível por arabinose e Cas9 sob o controle um promotor induzível por IPTG. Os sistemas de recombinação Red e Cas9 foram induzidos em transformantes resultantes, e as cepas foram preparadas para eletroporação. Os cassetes de knockout e um gRNA de seleção codificado por plasmídeo foram subsequentemente transformados nas células competentes. Após plaqueamento em antibióticos seletivos tanto para o plasmídeo de Cas9 quanto par ao plasmídeo de gRNA, 7 das 10 colônias avaliadas exibiam a mutação por knockout desejada, como mostrado na Figura 3.

Exemplo 4: Fenotipagem in vitro de moléculas candidatas

[325] O impacto do nitrogênio exógeno sobre a biossíntese e atividade de nitrogenase em vários mutantes foi avaliado. O Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) (Temme e cols. 2012; 109 (18) : 7.085-7.090) foi usado para medir a atividade de nitrogenase em condições de cultura pura. As cepas foram desenvolvidas em tubos de ensaio hermeticamente fechados, e a redução de acetileno em etileno foi quantificada com um cromatógrafo a gás Agilent 6890. As atividades de ARA de micróbios candidatos e mutantes candidatos correspondentes desenvolvidos nos meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina são mostradas nas Figuras 4A-B e Figuras 10A-C.

[326] Sob condições de cultura anaeróbicas, uma gama de concentrações de glutamina e amônia foi testada para quantificar o impacto sobre a atividade de fixação de nitrogênio. Em células do tipo selvagem, a atividade diminuiu rapidamente à medida que as concentrações de glutamina aumentavam. No entanto, em uma série inicial de mutações por knock-out, foi validada uma classe de mutação que permite a expressão de genes de fixação de nitrogênio sob concentrações de glutamina que, de outro modo, cessariam a atividade no tipo selvagem. Esse perfil foi gerado em quatro espécies diferentes de diazotróficos, como observado na Figura 4C. Além disso, por reconstrução da rede regulatória usando partes genéticas que foram identificadas, o nível de atividade de fixação de nitrogênio foi ajustado previsivelmente. Isso é observado na Figura 4B, que ilustra cepas CM023, CM021, CM015 e CI006. A Cepa CM023 é uma cepa pouco evoluída; a cepa CM021 é uma cepa bem evoluída; a cepa CM015 é uma cepa com evolução média; a cepa CI006 é do tipo selvagem (cepa 2). A amônia excretada nos sobrenadantes da cultura foi testada usando um ensaio de base enzimática (MEGAZYME). O ensaio mede a quantidade de NADPH consumido na absorbância de 340 nm. O ensaio foi realizado em culturas bacterianas desenvolvidas em um ambiente anaeróbico livre de nitrogênio, com uma densidade de partida de 1E9 UFC/ml. Através de um painel de seis cepas evoluídas, uma cepa excretou até 100 μM de amônia ao longo de um período de 48 horas, como observado na Figura 4D. Além disso, um mutante duplo exibiu excreção de amônia maior do que o mutante simples do qual foi derivado, como observado na Figura 11. Isso demonstra uma capacidade microbiana para produzir amônia além de suas necessidades fisiológicas.

Definição do perfil de transcrição de culturas puras

[327] A atividade transcricional de CI006 foi medida usando a plataforma Nanostring Elements. As células foram desenvolvidas em meios livres de nitrogênio e 10E8 células foram coletadas após incubação de 4 horas. RNA total foi extraído usando o kit RNeasy de Qiagen. RNA purificado foi submetido a Core Diagnostics em Palo Alto, CA, para hibridização de sonda e análise por “Digital Analyzer”, como mostrado na Figura 5.

Exemplo 5: Fenotipagem em plantas de micróbios candidatos Colonização de plantas por micróbios candidatos

[328] A colonização de plantas hospedeiras desejadas por um micróbio candidato foi quantificada por meio de experimentos de crescimento de plantas de curto prazo. Plantas de milho foram inoculadas com cepas que expressam RFP por um plasmídeo ou por um cassete de expressão de RFP Tn5-integrado. As plantas foram desenvolvidas tanto em areia esterilizada quanto em meio de turfa não estéril, e a inoculação foi realizada por pipetagem de 1 ml de cultura de células diretamente sobre o coleóptilo da planta emergente três dias pós-germinação. Os plasmídeos foram mantidos por irrigação das plantas com uma solução contendo o antibiótico apropriado. Após três semanas, as raízes da planta foram coletadas, enxaguadas três vezes em água estéril para remover solo visível, e divididas em duas amostras. Uma amostra de raiz foi analisada por meio de microscopia de fluorescência para identificar os padrões de localização de micróbios candidatos. A microscopia foi realizada em comprimentos de 10 mm das raízes da planta intactas mais finas, como mostrado na Figura 6.

[329] Um segundo método quantitativo para avaliação de colonização foi desenvolvido. Um ensaio de PCR quantitativo foi realizado em preparações de DNA inteiro das raízes de plantas inoculadas com os endófitos. As sementes de milho (Dekalb DKC-66-40) foram germinadas em areia previamente autoclavada em um pote de 2,5 pol (6,35 centímetros) por 2,5 pol (6,35 centímetros) por 10 pol (25,4 centímetros). Um dia após o plantio, 1 ml de cultura de endófito de um dia para o outro (meios SOB) foi banhado exatamente no local onde a semente estava localizada. 1 ml dessa cultura de um dia para o outro equivale aproximadamente a cerca de 10-9 ufc, variando dentro de 3 vezes um do outro, dependendo de qual cepa está sendo usada. Cada plântula foi fertilizada 3x por semana com 50 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 2,5 mM ou 0,25 mM de nitrato de amônio. Em quatro semanas após o plantio, amostras de raiz foram coletadas para extração de DNA. Os restos de solo foram removidos por lavagem usando spray pressurizado de água. Essas amostras de tecido foram então homogeneizadas usando Tissuelyzer de QIAGEN e o DNA foi então extraído usando o Mini Kit de DNA QIAmp (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi realizado usando RT-PCR Mx3005P de Stratagene nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram projetados (usando “NCBI’s Primer BLAST”) para serem específicos para loci no genoma de cada um dos endófitos. A presença das cópias do genoma dos endófitos foi quantificada. Para confirmar adicionalmente a identidade dos endófitos, os produtos de amplificação por PCR foram sequenciados e foram confirmados como tendo a sequência correta. Os resumos do perfil de colonização da cepa CI006 e CI008 de micróbios candidatos são apresentados na Tabela 5. Uma taxa de colonização de até 10-7 x ufc/g de peso fresco de raiz foi demonstrada na cepa CI008. Tabela 5: Colonização de milho como medida por q-PCR.

Definição do perfil de RNA em plantas

[330] A biossíntese de componentes da via nif em plantas foi estimada por medição da transcrição de genes nif. RNA total foi obtido de tecido da raiz de planta de plantas inoculadas com CI006 (métodos de plantio como descritos previamente). A extração de RNA foi realizada usando o Mini Kit RNEasy de acordo com o protocolo recomendado (QIAGEN). RNA total desses tecidos de planta foi então testado usando os kits Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) usando sondas que eram específicas para os genes nif no genoma da cepa CI006. Os dados da expressão do gene nif em plantas estão resumidos na Tabela 6. A expressão de genes nifH foi detectada em plantas inoculadas por cepas CM013, enquanto a expressão de nifH não era detectável em plantas inoculadas com CI006. A cepa CM013 é um derivado da cepa CI006 no qual o gene nifL foi submetido a knockout.

[331] Os genes de CM011 altamente expressos, classificados por transcritos por milhão de quilobases (TPM), foram medidos em plantas sob condição fertilizada. Os promotores que controlam a expressão de alguns desses genes altamente expressos foram usados como modelos para recombinação homóloga em loci de fixação e assimilação de nitrogênio visados. Amostras de RNA da planta desenvolvida em estufa inoculada com CM011 foram extraídas, o rRNA removido usando o kit Ribo-Zero, sequenciado usando a plataforma Truseq de Illumina e mapeado de volta ao genoma de CM011. Os genes altamente expressos de CM011 estão listados na Tabela 7. Tabela 6: Expressão de nifH em plantas. Tabela 7

Ensaio de 15N

[332] O método primário para demonstração de fixação usa o isótopo de nitrogênio 15N, que é encontrado na atmosfera em uma taxa definida em relação ao 14N. Por suplementação de fertilizante ou atmosfera com níveis enriquecidos de 15N, pode-se observar a fixação diretamente, em quantidades de 15N acentuadas fixadas de uma atmosfera suplementada com gás 15N2 (Yoshida 1980) ou, inversamente, por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás N2 atmosférico em tecidos de planta (Iniguez 2004). O método de diluição permite a observação de nitrogênio fixado cumulativo ao longo do período de crescimento de plantas, enquanto o método de gás 15N2 se restringe à medição da fixação que ocorre ao longo do intervalo curto no qual uma planta pode ser desenvolvida em uma atmosfera contida (medição de taxa). Portanto, o método de gás é superior em termos de especificidade (na medida em que quaisquer níveis de 15N2 elevados na planta acima da taxa atmosférica podem ser atribuídos inequivocamente à fixação), mas não pode exibir atividade cumulativa.

[333] Ambos os tipos de ensaio foram realizados para medir a atividade de fixação de cepas aprimoradas em relação às plantas de milho do tipo selvagem e não inoculadas, e taxas de fixação elevadas foram observadas in planta para várias das cepas aprimoradas (Figura 12, Figura 14A e Figura 14B). Esses ensaios são instrumentais na demonstração de que a atividade das cepas observada in vitro se traduz nos resultados in vivo. Além disso, esses ensaios permitem a medição do impacto do fertilizante sobre a atividade da cepa, sugerindo funcionalidade adequada em um ambiente agrícola. Resultados similares foram observados quando plantas setárias foram inoculadas com cepas do tipo selvagem e aprimoradas (Figura 13). A atividade de fixação in planta mostrada nas Figuras 14A-14C é ainda apoiada por dados transcriptômicos. Cepas evoluídas exibiram nível de transcrito de nifH aumentado em relação às contrapartes do tipo selvagem. Além disso, o nível de nitrogênio derivado de micróbio em plantas também está correlacionado com o nível de colonização em uma planta. Esses resultados (Figura 12, Figura 13, Figuras 14A-14C, Figura 15A e Figura 15B) apoiam a hipótese de que o micróbio, por meio da regulação aprimorada do agrupamento do gene nif, é a razão provável para o aumento no nitrogênio derivado da atmosfera observado no tecido de planta. Além de medir a fixação diretamente, o impacto da inoculação de plantas com as cepas aprimoradas em um ensaio de biomassa de planta com estresse por nitrogênio foi medido. Embora a biomassa de planta possa estar relacionada com muitas interações de micróbios possíveis com a planta, seria de se esperar que a adição de nitrogênio fixado impactasse no fenótipo da planta quando o nitrogênio é limitado. Plantas inoculadas foram desenvolvidas na ausência completa de nitrogênio, e foram observados aumentos significantes na área da folha, peso fresco e seco do broto, e peso fresco e seco da raiz em plantas inoculadas em relação aos controles não tratados (Figura 14C). Embora essas diferenças não possam ser atribuídas à fixação de nitrogênio exclusivamente, elas apoiam a conclusão de que as cepas aprimoradas fornecem ativamente nitrogênio à planta. Plantas de milho e setárias foram desenvolvidas e inoculadas como descrito acima. Fertilizante que compreende 1,2% de 15N foi regularmente fornecido às plantas por meio de irrigação. A fixação de nitrogênio por micróbios foi quantificada por medição do nível de 15N no tecido de planta. Tecido da quarta folha foi coletado e seco em 4 semanas após o plantio. Amostras de folha seca foram homogeneizadas usando microesferas (QIAGEN Tissuelyzer) e divididas em alíquotas em cápsulas de estanho para IRMS (“MBL Stable Isotope Laboratory at The Ecosystems Center”, Woods Hole, MA). O nitrogênio derivado da atmosfera (NDFA) foi calculado, e as produções de nitrogênio por CI050 e CM002 são mostradas na Figura 7.

Ensaio de produção de fitormônio

[334] O cultivar de tomate-anão (Solanum lycopersicum) ‘Micro-Tom’ foi usado previamente para estudar a influência do ácido indol-3-acético sobre a maturação do fruto por meio de um ensaio in vitro (Cohen 1996; J. Am. Soc. Hortic. Sci. 121: 520-524) . Para avaliar a produção e secreção de fitormônio por micróbios candidatos, um ensaio de avaliação baseada em placa usando fruto de Micro-Tom imaturo foi desenvolvido. Placas de teste de cultura de tecido de doze poços foram preparadas por enchimento dos poços com meio ágar, permitindo que ele solidifique, e semeando 10 μl de culturas microbianas de um dia para o outro sobre a superfície de ágar, como mostrado na Figura 8. Os poços com ágar contendo quantidades crescentes de ácido giberélico (GA), mas sem cultura bacteriana, foram usados como um controle positivo e padrões. Flores um dia pós-antese removidas de plantas Micro-Tom em crescimento foram inseridas, com o caule primeiro, no ágar no ponto da cultura da semeadura bacteriana. Essas flores foram monitoradas por 2-3 semanas, e depois os frutos foram colhidos e pesados. Um aumento na massa de frutos de planta através de várias réplicas indica produção de hormônio de planta pelo micróbio inoculante, como mostrado na Figura 9.

Exemplo 6: Evolução cíclica de micróbio-hospedeiro

[335] Plantas de milho foram inoculadas com CM013 e desenvolvidas por 4 semanas até aproximadamente o estágio de crescimento V5. Aquelas que demonstram acúmulo de nitrogênio aumentado de fontes microbianas por meio da análise de 15N foram arrancadas pela raiz, e as raízes foram lavadas usando água pressurizada para remover solo grosseiro. Um corte de 0,25 g de raiz foi feito e enxaguado em solução de PBS para remover partículas finas de solo e micróbios não aderentes. As amostras de tecido foram homogeneizadas usando microesferas de aço de 3 mm no TissueLyser II de QIAGEN. O homogeneizado foi diluído e plaqueado em meio ágar SOB. Colônias únicas foram ressuspensas em meios líquidos e submetidas à análise por PCR de rDNA 16S e mutações únicas à cepa inoculante. O processo de isolamento de micróbio, mutagênese, inoculação e novo isolamento pode ser repetido várias vezes para aprimorar os traços microbianos, traços de plantas e a capacidade de colonização do micróbio.

Exemplo 7: Compatibilidade através da geografia

[336] A habilidade dos micróbios aprimorados para colonizar uma planta inoculada é crucial para o sucesso da planta sob condições de campo. Embora os métodos de isolamento descritos sejam projetados para selecionar micróbios do solo que possam ter relacionamento próximo com plantas de plantio como, por exemplo, milho, muitas cepas podem não colonizar eficazmente através de uma gama de genótipos de plantas, ambientes, tipos de solo ou condições de inoculação. Na medida em que a colonização é um processo complexo que exige uma gama de interações entre uma cepa microbiana e a planta hospedeira, a avaliação da competência colonização se tornou um método central para a seleção de cepas prioritárias para desenvolvimento posterior. Os esforços iniciais para avaliar a colonização usavam a marcação fluorescente de cepas, que era eficaz, mas era demorada e não escalonável em termos de cepas. Como a atividade de colonização não é passível de aprimoramento direto, é imperativo que os candidatos a produto potenciais sejam selecionados de cepas que sejam colonizadoras naturais.

[337] Foi projetado um ensaio para testar a colonização robusta das cepas do tipo selvagem em certa planta hospedeira usando qPCR e iniciadores projetados para serem cepa- específicos em uma amostra da comunidade. Esse ensaio visa medir rapidamente a taxa de colonização dos micróbios de amostras de tecido de milho. Os testes iniciais usando cepas avaliadas quanto às colonizadoras prováveis usando microscopia de fluorescência e técnicas baseadas em placas indicaram que uma abordagem de qPCR seria tanto quantitativa quanto escalonável.

[338] Um ensaio típico é realizado da seguinte forma: plantas, principalmente de variedades de milho e trigo, são desenvolvidas em uma mistura de envasamento de turfa na estufa em réplicas de seis por cepa. Em quatro ou cinco dias após o plantio, um banho de 1 ml de culturas de bactérias em fase estacionária inicial diluída até uma OD590 de 0,6-1,0 (aproximadamente 5E+08 UFC/ml) é pipetado sobre o coleóptilo emergente. As plantas são irrigadas apenas com água corrente e é permitido o crescimento por quatro semanas antes da coleta de amostras, quando então as plantas são arrancadas pela raiz e as raízes lavadas cuidadosamente para remover a maioria dos resíduos de turfa. Amostras de raiz limpa são retiradas e homogeneizadas para criar uma lama de restos de células de planta e células bacterianas associadas. Desenvolvemos um protocolo de extração de DNA de alto rendimento que efetivamente produzia uma mistura de DNA de planta e bacteriano para usar como modelo para qPCR. Com base em experimentos de semeadura de célula bacteriana, esse processo de extração de DNA fornece uma amostra quantitativa de DNA bacteriano em relação ao peso fresco das raízes. Cada cepa é avaliada usando iniciadores cepa-específicos projetados usando Primer BLAST (Ye 2012) e comparada com a amplificação de fundo de plantas uninoculadas. Como alguns iniciadores exibem amplificação foram do alvo em plantas uninoculadas, a colonização é determinada pela presença de amplificação ou de amplificação elevada do produto correto comparado com o nível de fundo.

[339] Esse ensaio foi usado para medir a compatibilidade do produto microbiano através de diferentes geografias do solo. As qualidades do solo de campo e as condições de campo podem ter grande influência sobre o efeito de um produto microbiano. O pH, a capacidade retenção de água e micróbios competitivos do solo são apenas alguns exemplos de fatores no solo que podem afetar a habilidade de sobrevida e colonização do inóculo. Um ensaio de colonização foi realizado usando amostras retiradas de três tipos diversos de solos de campos agrícolas na Califórnia como o meio de crescimento de plantas (Figura 16A). Uma densidade de inoculação intermediária foi usada para se aproximar das condições agrícolas realísticas. Dentro de 3 semanas, a Cepa 5 colonizou todas as plantas a 1E+06 a 1E+07 UFC/g de peso fresco. Após 7 semanas de crescimento de plantas, uma versão evoluída da Cepa 1 exibiu taxas de colonização elevadas (1E+06 UFC/g FW) em todos os tipos de solo. (Figura 16B).

[340] Adicionalmente, a avaliação da colonização na complexidade de condições de campo, um experimento de campo de 1 acre em San Luis Obispo em junho de 2015 foi iniciado para avaliar os impactos e a colonização de sete das cepas do tipo selvagem nas duas variedades de milho de campo. O design agronômico e a execução do experimento foram realizados por contrato com uma organização de pesquisa de campo, Pacific Ag Research. Para inoculação, a mesma técnica de revestimento de sementes de cultura de turfa testada no experimento dos métodos de inoculação foi empregada. Durante o período da estação de crescimento, amostras de planta foram coletadas para avaliar a colonização na raiz e no interior do caule. Amostras foram coletadas de três lotes replicados de cada tratamento de quatro e oito semanas após o plantio, e de todas as seis réplicas de cada tratamento imediatamente antes da colheita em 16 semanas. Amostras adicionais foram coletadas de todos os seis lotes replicados de tratamentos inoculados com a Cepa 1 e Cepa 2, bem como controles não tratados, em 12 semanas. Os números de células por grama de peso fresco de raízes lavadas foram avaliados como com outros ensaios de colonização com qPCR e iniciadores cepa- específicos. Duas cepas, Cepa 1 e Cepa 2, mostraram colonização da raiz consistente e disseminada que alcançou um pico em 12 semanas e depois declinou abruptamente (Figura 16C). Embora a Cepa 2 pareceu estar presente em números em uma ordem de magnitude menor do que a Cepa 1, ela foi encontrada em números mais consistentes de planta para planta. Nenhuma cepa pareceu colonizar eficazmente o interior do caule. Em apoio aos dados de colonização por qPCR, ambas as cepas foram isoladas novamente com sucesso das amostras de raiz usando plaqueamento e sequenciamento de 16S para identificar isolados de sequência compatível.

Exemplo 8: Melhoramento de micróbios

[341] Exemplos de melhoramento de micróbios podem ser resumidos na representação esquemática da Figura 17A. A Figura 17A retrata o melhoramento de micróbios, em que a composição do microbioma primeiro pode ser medida e uma espécie de interesse é identificada. O metabolismo do microbioma pode ser mapeado e ligado à genética. A seguir, uma variação genética direcionada pode ser introduzida usando métodos que incluem, sem limitação, conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptiva e edição gênica. Micróbios derivados são usados para inocular plantios. Em alguns exemplos, os plantios com os melhores fenótipos são selecionados.

[342] Como fornecido na Figura 17A, a composição do microbioma primeiro pode ser medida e uma espécie de interesse é identificada. A Figura 17B retrata uma visão expandida da medição da etapa do microbioma. O metabolismo do microbioma pode ser mapeado e ligado à genética. O metabolismo de nitrogênio pode envolver a entrada de amônia (NH4+) da rizosfera para dentro do citosol das bactérias por meio do Transportador de AmtB. Amônia e L-glutamato (L-Glu) são catalisados por glutamina sintetase e ATP em glutamina. Glutamina pode levar à formação de biomassa (crescimento da planta), e ela também pode inibir a expressão do óperon de nif. A seguir, uma variação genética direcionada pode ser introduzida usando métodos que incluem, sem limitação, conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptiva e edição gênica. Micróbios derivados são usados para inocular plantios. Os plantios com os melhores fenótipos são selecionados.

Exemplo 9: Experimentos de campo com micróbios da revelação - Verão de 2016

[343] A fim de avaliar a eficácia de cepas da presente revelação sobre o crescimento e produtividade do milho sob regimes de nitrogênio variáveis, foram feitos experimentos de campo.

[344] Foram realizados experimentos com (1) sete tratamentos de subparcela de seis cepas mais o controle - quatro lotes principais compreendiam 0, 15, 85 e 100% de retorno máximo para nitrogênio (MRTN) com verificação local. O controle (somente UTC) foi realizado com 10 100% de MRTN mais 5, 10, ou 15 lb (2,26, 4,53 ou 6,80 kg). Os tratamentos tiveram quatro réplicas.

[345] Os lotes de milho (mínimo) eram 4 fileiras de 30 pés (9,14 metros) de comprimento, com 124 lotes por localização. Todas as observações foram feitas das duas fileiras centrais dos lotes, e toda a amostragem destrutiva foi retirada das fileiras externas. As amostras de sementes foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[346] Prática agrícola local: A semente era um milho comercial sem tratamento convencional com fungicida e inseticida. Todos os tratamentos de semente foram aplicados por um único especialista em tratamento de semente para assegurar uniformidade. A data do plantio, taxa de semeadura, manejo de ervas daninhas/insetos etc. foram deixados para as práticas agrícolas locais. Com a exceção de aplicações de fungicida, foram seguidas práticas de manejo padronizadas.

[347] Caracterização do solo: A textura do solo e a fertilidade do solo foram avaliadas. Amostras do solo foram pré-plantadas para cada réplica para assegurar níveis de nitrato residuais menores do que 50 lb/Ac. Monólitos foram retirados de 0 cm a 30 cm. O solo foi ainda caracterizado quanto ao pH, CEC, K e P totais.

[348] Avaliações: A população de plantas inicial foi avaliada 14 dias após o plantio (DAP)/acre, e foi ainda avaliada para: (1) vigor (escala de 1 a 10, com 10 = excelente) 14 DAP & V10; (2) registro de classificações de doença em qualquer momento quando sintomas foram evidentes nos lotes; (3) registrar quaisquer diferenças em acamamento caso ocorra acamamento nos lotes; (4) rendimento (Bu/acre), ajustado à percentagem de umidade-padrão; (5) peso do hectolitro; e (6) percentagem de umidade do grão.

[349] Requisitos da amostragem: O solo teve amostras coletadas em três pontos do tempo (antes do início do experimento, V10-VT, 1 semana pós-colheita). Todas as seis localizações e todos os lotes tiveram amostras coletadas a 10 gramas por amostra (124 lotes X 3 pontos do tempo X 6 localizações).

[350] Amostragem de colonização: Amostras de colonização foram coletadas em dois pontos do tempo (V10 e VT) para cinco localizações e seis pontos do tempo (V4, V8, V10, VT, R5 e Pós-colheita). As amostras foram coletadas da seguinte forma: (1) de 0% e 100% de MRTN, 60 lotes por localização; (2) 4 plantas por lote selecionados aleatoriamente das fileiras externas; (3) 5 gramas de raiz, 20,32 centímetros de talo, e três folhas superiores - colocadas em bolsas e identificadas cada uma separadamente - 12/bags por lote; (4) cinco localizações (60 lotes X 2 pontos do tempo X 12 bolsas/lote); e uma localização (60 lotes X 6 pontos do tempo X 12 bolsas/lote. Veja a Figura 17C, que ilustra a amostragem de colonização.

[351] A determinação do índice de vegetação de diferença normalizada (NDVI) foi feita usando um instrumento Greenseeker em dois pontos do tempo (V4 - V6 e VT). Cada lote foi avaliado em todas as seis localizações (124 lotes X 2 pontos do tempo X 6 localizações).

[352] A análise da raiz foi realizada com Win Rhizo de uma localização que melhor ilustrava a diferenciação de tratamento. Dez plantas por lote foram coletadas aleatoriamente (5 adjacentes de cada fileira externa; plantas em estágio V3-V4 foram preferidas) e gentilmente lavadas para remover o máximo de poeira considerado razoável. Dez raízes foram colocadas em uma bolsa plástica e rotuladas. Analisadas com “WinRhizo Root Analysis”.

[353] As características do talo foram medidas em todas as seis localizações entre R2 e R5. O diâmetro do talo de dez plantas por lote na altura de 6” (15,24 centímetros) foi registrado, bem como o foi o comprimento do primeiro internódio acima da marca de 6” (15,24 centímetros). Dez plantas foram monitoradas; cinco plantas consecutivas do centro das duas fileiras interiores. Seis localizações foram avaliadas (124 lotes X 2 medições X 6 localizações).

[354] Os nitratos do tecido foram analisados em todos os lotes e todas as localizações. Um segmento de talo de 8” (20,32 centímetros) começando 6” (15,24 centímetros) acima do solo quando o milho está entre um e três semanas após formação da camada preta; as bainhas das folhas foram removidas. Todas as localizações e lotes foram avaliados (6 localizações X 124 lotes).

[355] Os seguintes dados climáticos foram registrados para todas as localizações do plantio à colheita: temperaturas máximas e mínimas diárias, temperatura do solo na semeadura, precipitação pluviométrica diária mais irrigação (se aplicada), e quaisquer eventos climáticos incomuns como, por exemplo, chuva, vento, frio ou calor excessivos.

[356] Os dados de rendimento através de todas as seis localizações são apresentados na Tabela 8. A taxa de nitrogênio teve um impacto significante sobre o rendimento, mas cepas através de taxas de nitrogênio não tiveram. No entanto, na menor taxa de nitrogênio, as cepas CI006, CM029 e CI019 numericamente ultrapassaram o rendimento do UTC por 4 a 6 bu/acre. O rendimento também foi numericamente aumentado 2 a 4 bu/acre pelas cepas CM029, CI019 e CM081 a 15% de MRTN. Tabela 8: Dados de rendimento através de todas as seis localizações.

[357] Outra abordagem de análise é apresentada na Tabela 9. A tabela compreende as quatro localizações onde a resposta ao nitrogênio foi a maior, o que sugere que nitrogênio residual disponível era o menor. Essa abordagem não altera a avaliação de que a taxa de nitrogênio impactava significantemente o rendimento, cujas cepas não o fizeram quando ponderadas através de todas as taxas de nitrogênio. No entanto, a vantagem numérica de rendimento na menor taxa de N é mais pronunciada para todas as cepas, particularmente CI006, CM029 e CM029/CM081, nas quais os rendimentos foram aumentados de 8 para 10 bu/acre. A 15% de MRTN, o rendimento da cepa CM081 ultrapassou o de UTC por 5 bu. Tabela 9: Dados de rendimento através de quatro localizações Média de 4 localizações - SGS, AgIdea, Bennett, RFR

[358] Os resultados do experimento de campo também estão ilustrados nas Figuras 21-27. Os resultados indicam que os micróbios da revelação são capazes de aumentar o rendimento de planta, o que aponta para a habilidade dos micróbios ensinados para aumentar a fixação de nitrogênio em um cultivo agrícola importante, ou seja, milho.

[359] Os resultados baseados no campo validam ainda mais os métodos revelados de modificação de forma não intergenérica do genoma de cepas microbianas selecionadas, a fim de produzir resultados agronomicamente relevantes em um ambiente de campo quando se aplicam as referidas cepas modificadas geneticamente a um plantio.

[360] A Figura 18 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006 (Kosakonia sacchari WT). Os dados de campo demonstram que um derivado modificado geneticamente da cepa CI006 WT, ou seja, CM029, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um ambiente de campo. Por exemplo, a Tabela 8 ilustra que a 0% de MRTN, CM029 gerou 147,0 bu/acre, comparada com controle não tratado a 141,2 bu/acre (um aumento de 5,8 bu/acre). A Tabela 8 também ilustra que a 15% de MRTN, CM029 gerou 167,3 bu/acre, comparada com controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 2,2 bu/acre). A Tabela 9 suporta essas conclusões e ilustra que a 0% de MRTN, CM029 gerou 140,7 bu/acre, comparada com controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 8,8 bu/acre). A Tabela 9 também ilustra que a 15% de MRTN CM029 gerou 164,1 bu/acre, comparada com controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 2,8 bu/acre).

[361] A Figura 19 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019 (Rahnella aquatilis WT). Os dados de campo demonstram que um derivado modificado geneticamente da cepa CI019 WT, ou seja, CM081, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um ambiente de campo. Por exemplo, a Tabela 8 ilustra que a 15% de MRTN CM081 gerou 169,3 bu/acre, comparada com controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 4,2 bu/acre). A Tabela 9 suporta essas conclusões e ilustra que a 0% de MRTN, CM081 gerou 136,3 bu/acre, comparada com controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 4,4 bu/acre). A Tabela 9 também ilustra que a 15% de MRTN CM081 gerou 166,8 bu/acre, comparada com controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 5,5 bu/acre).

[362] Além disso, pode ser observado na Tabela 9 que a combinação de CM029/CM081 a 0% de MRTN gerou 141,4 bu/acre, comparada com controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 9,5 bu/acre).

Exemplo 10: Experimentos de campo com micróbios da revelação

[363] A diversidade de bactérias de fixação de nitrogênio pode ser encontrada na natureza, incluindo em solos agrícolas. No entanto, o potencial de um micróbio para fornecer nitrogênio suficiente aos plantios para permitir uso diminuído de fertilizantes pode ser limitado por repressão de genes de nitrogenase em solos fertilizados, bem como pela baixa abundância em associação íntima com raízes de plantio. A identificação, isolamento e melhoramento de micróbios que se associam intimamente com plantios comerciais cruciais podem romper e aprimorar as redes reguladoras que ligam a percepção de nitrogênio e fixação de nitrogênio e desbloquear contribuições de nitrogênio significantes por micróbios associados a plantios. Para essa finalidade, foram identificados micróbios fixadores de nitrogênio que se associam com e colonizam o sistema de raiz de milho.

[364] Amostras de raiz de plantas de milho desenvolvidas em solos agronomicamente relevantes foram coletadas, e populações microbianas extraídas da rizosfera e endosfera. DNA genômico dessas amostras foi extraído, seguido por sequenciamento do amplicon 16S para definir o perfil de composição da comunidade. Um micróbio Kosakonia sacchari (cepa PBC6.1) foi isolado e classificado por meio de sequenciamento de rRNA 16S e do genoma inteiro. Esse é um fixador de nitrogênio particularmente interessante capaz de colonizar até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz (Figura 30). Para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, as taxas de fixação de nitrogênio em cultura pura foram medidas com um ensaio de redução de acetileno (ARA) clássico e níveis variáveis de suplementação de glutamina. A espécie exibiu um nível elevado de atividade de fixação de nitrogênio em meios livres de nitrogênio, embora nitrogênio exógeno fixado reprimisse a expressão do gene nif e a atividade de nitrogenase (Cepa PBC6.1, Figura 28C e 28D). Adicionalmente, quando a amônia liberada foi medida no sobrenadante de PBC6.1 desenvolvida em condições de fixação de nitrogênio, muito pouca liberação de nitrogênio fixado podia ser detectada (Figura 28E).

[365] Formulamos a hipótese de que PBC6.1 poderia ser um contribuinte significante de nitrogênio fixado em campos fertilizados se as redes reguladoras que controlam o metabolismo de nitrogênio fossem remontadas para permitir expressão ótima de nitrogenase e liberação de amônia na presença de nitrogênio fixado. Deve existir diversidade genética suficiente dentro do genoma de PBC6.1 para permitir a remodelagem fenotípica ampla sem a inserção de transgenes ou elementos reguladores sintéticos. A cepa isolada possui um genoma de pelo menos 5,4 Mbp e um grupamento canônico do gene de fixação de nitrogênio. As vias relacionadas do metabolismo de nitrogênio em PBC6.1 são similares àquelas do organismo-modelo para fixação de nitrogênio, Klebsiella oxytoca m5al.

[366] Foram identificados vários nós da rede reguladora de genes que podem aumentar a fixação de nitrogênio e a transferência subsequente para uma planta hospedeira, particularmente em concentrações exógenas elevadas de nitrogênio fixado (Figura 28A). O óperon de nifLA regula diretamente o resto do cluster nif por meio da ativação transcricional por NifA e repressão nitrogênio- e oxigênio- dependente de NifA por NifL. A ruptura do nifL pode abolir a inibição de NifA e aumentar a expressão de nif na presença tanto de oxigênio quanto de nitrogênio exógeno fixado. Além disso, a expressão de nifA sob o controle de um promotor nitrogênio-independente pode desacoplar a biossíntese de nitrogenase da regulação pelo complexo NtrB/NtrC-percepção de nitrogênio. A assimilação de nitrogênio fixado pelo micróbio em glutamina por glutamina sintetase (GS) é regulada reversivelmente pela enzima adenililtransferase (ATase) de dois domínios GlnE por meio da adenililação e desadenililação de GS para atenuar e restaurar a atividade, respectivamente. O truncamento da proteína GlnE para deletar seu domínio de remoção de adenilil (AR) pode levar à glutamina sintetase constitutivamente adenililada, limitando a assimilação de amônia pelo micróbio e aumentando a amônia intra- e extracelular. Finalmente, a redução da expressão de AmtB, o transportador responsável pela captação de amônia, poderia levar a uma amônia extracelular maior. Para gerar fenótipos microbianos racionalmente projetados sem o uso de transgenes, duas abordagens foram empregadas: a criação de deleções sem marcador de sequências genômicas que codificam domínios de proteína ou genes inteiros, e reconstrução de redes reguladoras por rearranjo de promotor intragenômico. Por meio de um processo de mutagênese iterativo, várias cepas não transgênicas derivadas de PBC6.1 foram geradas (Tabela 10). Tabela 10. Lista de cepas de K. sacchari isoladas e derivadas usadas nesse trabalho. Prm, sequência promotora derivada do genoma de PBC6.1; ΔglnEAR1 e ΔglnEAR2, versões truncadas diferentes do gene glnE que removem a sequência do domínio de remoção de adenilil.

[367] Vários ensaios in vitro foram realizados para caracterizar fenótipos específicos das cepas derivadas. O ARA foi usado para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, no qual PBC6.1 exibiu repressão da atividade de nitrogenase em concentrações elevadas de glutamina (Figura 28D). Em contraste, a maioria das cepas derivadas mostrou um fenótipo não reprimido com níveis variáveis de redução de acetileno observados em concentrações elevadas de glutamina. As taxas transcricionais de nifA em amostras analisadas por qPCR se correlacionavam bem com a redução de taxas de acetileno (Figura 31), suportando a hipótese de que a ruptura de nifL e a inserção de um promotor nitrogênio-independente para dirigir nifA podem levar à desrepressão do cluster nif. Cepas com atividade alterada de GlnE ou AmtB mostraram taxas de excreção de amônio acentuadamente aumentadas, comparadas com cepas do tipo selvagem ou derivadas sem essas mutações (Figura 28E), ilustrando o efeito desses genótipos sobre a assimilação e recaptação de amônia.

[368] Foram feitos dois experimentos para estudar a interação de derivados de PBC6.1 com plantas de milho e quantificar a incorporação de nitrogênio fixado em tecidos de plantas. Primeiro, as taxas de fixação microbiana de nitrogênio foram quantificadas em um estudo em estufa usando traçadores isotópicos. Resumidamente, plantas são desenvolvidas com fertilizante marcado com 15N, e as concentrações diluídas de 15N em tecidos de plantas indicam as contribuições do nitrogênio fixado por micróbios. Plântulas de milho foram inoculadas com cepas microbianas selecionadas, e as plantas foram desenvolvidas até o estágio de crescimento V6. As plantas foram subsequentemente desconstruídas para permitir a medição da colonização microbiana e expressão gênica, bem como a medição das proporções 15N/14N em tecidos de plantas por espectrometria de massa de proporção de isótopo (IRMS). A análise do tecido aéreo mostrou uma contribuição pequena, não significante, por PBC6.38 para os níveis de nitrogênio da planta, e uma contribuição significante por PBC6.94 (p=0,011). Aproximadamente 20% do nitrogênio encontrado em folhas de milho acima do solo foram produzidos por PBC6.94, com o restante vindo da semente, substrato de produção de mudas, ou fixação “de fundo” por outros micróbios originários do solo (Figura 29C). Isso ilustra que nosso canal de melhoramento microbiano pode gerar cepas capazes de produção de contribuições de nitrogênio significantes para as plantas na presença de fertilizante de nitrogênio. A transcrição microbiana dentro de tecidos de plantas foi medida, e a expressão do grupamento do gene nif foi observada em cepas derivadas, mas não na cepa do tipo selvagem (Figura 29B), mostrando a importância da desrepressão de nif para contribuição por BNF aos plantios em condições fertilizadas. A colonização da raiz medida por qPCR demonstrou que a densidade de colonização é diferente para cada uma das cepas testadas (Figura 29A). Uma diferença de 50 vezes na colonização foi observada entre PBC6.38 e PBC6.94. Essa diferença poderia ser uma indicação de que PBC6.94 possui adequação reduzida na rizosfera em relação a PBC6.38 como um resultado de níveis elevados de fixação e excreção.

Métodos Meios

[369] Meio mínimo contém (por litro) 25 g de Na2HPO4, 0,1 g de CaCl2-2H2O, 3 g de KH2PO4, 0,25 g de MgSO4^7H2O, 1 g de NaCl, 2,9 mg de FeCla, 0,25 mg de Na2MoO4^2H2O e 20 g de sacarose. O meio de crescimento é definido como meio mínimo suplementado com 50 ml de 200 mM de glutamina por litro. Isolamento de diazotróficos

[370] Plântulas de milho foram desenvolvidas a partir de semente (DKC 66-40, DeKalb, IL) por duas semanas em um ambiente de estufa controlado de 22°C (noite) até 26°C (dia) e expostas a ciclos de luz de 16 horas em solo coletado de San Joaquin County, CA. As raízes foram colhidas e lavadas com água deionizada estéril para remover solo grosseiro. Os tecidos de raiz foram homogeneizados com glóbulos de aço inoxidável de 2 mm em um lisador de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) por três minutos na configuração 30, e as amostras foram centrifugadas por 1 minuto a 13.000 rpm para separar tecido de bactérias associadas à raiz. Os sobrenadantes foram divididos em frações, e uma foi usada para caracterizar o microbioma por meio de sequenciamento do amplicon de rRNA 16S e a fração restante foi diluída e plaqueada em meios de Caldo livre de Nitrogênio (NfB) suplementados com ágar 1,5%. As placas foram incubadas a 30°C por 5-7 dias. As colônias que emergiram foram testadas quanto à presença do gene nifH por PCR de colônia com iniciadores Ueda19f e Ueda406r. DNA genômico de cepas com uma PCR de colônia de nifH positiva foi isolado (Kit QIAamp DNA Mini, N° de Catálogo 51306, QIAGEN, Alemanha) e sequenciado (Illumina MiSeq v3, SeqMatic, Fremont, CA). Após montagem e anotação de sequência, os isolados contendo grupamentos gênicos de fixação de nitrogênio foram utilizados em pesquisas posteriores.

Definição do perfil do microbioma do isolamento de plântulas

[371] DNA genômico foi isolado de bactérias associadas à raiz usando o Kit ZR-96 Genomic DNA I (Zymo Research P/N D3011), e amplicons de rRNA 16S foram gerados usando iniciadores com código de barras Nextera que visam 799f e 1114r. As bibliotecas de amplicons foram purificadas e sequenciadas com a plataforma Illumina MiSeq v3 (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram taxonomicamente classificadas usando Kraken usando a base de dados Minikraken (Figura 30).

Ensaio de redução de acetileno (ARA)

[372] Uma versão modificada do Ensaio de Redução de Acetileno foi usada para medir a atividade de nitrogenase em condições de cultura puras. As cepas foram propagadas a partir de colônia única em SOB (RPI, P/N S25040-1000) a 30°C com agitação a 200 RPM por 24 horas e depois subcultivadas 1:25 em meio de crescimento e desenvolvidas aerobicamente por 24 horas (30°C, 200 RPM). 1 ml da cultura em meios mínimos foi então adicionado a 4 ml de meios mínimos suplementados com 0 a 10 mM de glutamina em tubos Hungate hermeticamente fechados e desenvolvido anaerobicamente por 4 horas (30°C, 200 RPM). Um espaço vazio de 10% foi removido e depois substituído por um volume igual de acetileno por injeção, e a incubação continuou por 1 hora. Subsequentemente, 2 ml de espaço vazio foram removidos por meio de uma seringa hermética a gás para quantificação da produção de etileno usando um cromatógrafo a gás Agilent 6850 equipado com um detector de ionização de chama (FID). Ensaio de excreção de amônio

[373] A excreção de nitrogênio fixado na forma de amônia foi medida usando fermentação de batelada em biorreatores anaeróbicos. As cepas foram propagadas a partir de colônia única em 1 ml/poço de SOB em uma placa de DeepWell de 96 poços. A placa foi incubada a 30°C com agitação a 200 RPM por 24 horas e depois diluída 1:25 em uma placa fresca contendo 1 ml/poço de meio de crescimento. As células foram incubadas por 24 horas (30°C, 200 RPM) e depois diluídas 1:10 em uma placa fresca contendo meio mínimo. A placa foi transferida para uma câmara anaeróbica com uma mistura de gás de >98,5% de nitrogênio, 1,2-1,5% de hidrogênio e <30 ppm de oxigênio e incubada a 1.350 RPM, em temperatura ambiente por 66-70 horas. A biomassa da cultura inicial foi comparada com a biomassa final por medição da densidade óptica a 590 nm. As células foram então separadas por centrifugação, e o sobrenadante do caldo do reator foi testado para amônia livre usando o kit de Ensaio de Amônia Megazyme (P/N K-AMIAR) normalizado para biomassa em cada ponto do tempo.

Extração de microbioma associado a raiz

[374] As raízes foram agitadas gentilmente para remover partículas livres, e os sistemas de raiz foram separados e embebidos em uma solução de estabilização de RNA (Thermo Fisher P/N AM7021) por 30 minutos. As raízes foram então brevemente enxaguadas com água deionizada estéril. As amostras foram homogeneizadas usando pulsação com glóbulos com rolamentos de bolas de aço inoxidável de 0,5 lb (1,27 centímetro) em um lisador de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) em 2 ml de tampão de lise (Qiagen P/N 79216). A extração de DNA genômico foi realizada com o kit ZR-96 Quick- gDNA (Zymo Research P/N D3010), e extração de RNA usando o kit RNeasy (Qiagen P/N 74104).

Ensaio de colonização da raiz

[375] Quatro dias após o plantio, 1 ml de uma cultura bacteriana de um dia para o outro (aproximadamente 109 ufc) foi aplicado ao solo acima da semente plantada. As plântulas foram fertilizadas três vezes por semana com 25 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 0,5 mM de nitrato de amônio. Quatro semanas após o plantio, amostras de raiz foram coletadas e o DNA genômico total (gDNA) foi extraído. A colonização da raiz foi quantificada usando qPCR com iniciadores projetados para amplificar regiões únicas do genoma da cepa tipo selvagem ou derivada. A eficiência da reação de QPCR foi medida usando uma curva-padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma-alvo. Os dados foram normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso e volume de extração de tecido. Para cada experimento, os números de colonização foram comparados com plântulas de controle não tratadas. Transcriptômica in planta

[376] A definição de perfil transcricional de micróbios associados à raiz foi medida em plântulas desenvolvidas e processadas como descrito no Ensaio de Colonização de Raiz. RNA purificado foi sequenciado usando a plataforma Illumina NextSeq (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram mapeadas para o genoma da cepa inoculada usando Bowtie2 usando parâmetros ‘--muito-sensíveis-local’ e uma pontuação de alinhamento mínima de 30. A cobertura através do genoma foi calculada usando Samtools. A cobertura diferencial foi normalizada para expressão gênica de manutenção e visualizada através do genoma usando Circos e através do grupamento do gene nif usando DNAplotlib. Adicionalmente, o perfil transcricional in planta foi quantificado por meio de análise direcionada por Nanostring. RNA purificado foi processado em um nCounter Sprint (Core Diagnostics, Hayward, CA).

Estudo em estufa de diluição de 15N

[377] Um experimento de diluição de fertilizante de 15N foi realizado para avaliar a atividade da cepa optimizada in planta. Um meio de plantio contendo N de fundo mínimo foi preparado usando uma mistura de vermiculita e areia lavada (5 enxágues em H2O DI). A mistura de areia foi autoclavada por 1 hora a 122°C e aproximadamente 600 g de colocados em potes de 0,656 litro (656 ml), que foram saturados com H2O DI estéril e foi permitido que drenassem por 24 horas antes do plantio. Sementes de milho (DKC 66-40) foram esterilizadas na superfície em hipoclorito de sódio 0,625% por 10 minutos, e depois enxaguadas cinco vezes em água destilada estéril e plantadas a 1 cm de profundidade. As plantas foram mantidas sob lâmpadas fluorescentes por quatro semanas com duração do dia de 16 horas em temperaturas ambientes variando de 22°C (noite) até 26°C (dia).

[378] Cinco dias após o plantio, as plântulas foram inoculadas com uma suspensão de 1 ml de células embebidas diretamente sobre o coleóptilo emergente. O inóculo foi preparado a partir de 5 ml de culturas de um dia para o outro em SOB, que foram centrifugadas e ressuspensas duas vezes em 5 ml de PBS para remover SOB residual antes da diluição final até o OD de 1,0 (aproximadamente 109 UFC/ml). Plantas de controle foram tratadas com PBS estéril e cada tratamento foi aplicado a dez réplicas de plantas.

[379] As plantas foram fertilizadas com 25 ml de solução de fertilizante contendo 2% de 2 mM de KNO3 enriquecido em 15N em 5, 9, 14 e 19 dias após o plantio, e a mesma solução sem KNO3 em 7, 12, 16 e 18 dias após o plantio. A solução de fertilizante continha (por litro) 3 mmol de CaCl2, 0,5 mmol de KH2PO4, 2 mmol de MgSO4, 17,9 μmol de FeSO4, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2^4H2O, 0,22 mg de ZnSO4^7H2O, 51 μg de CuSO4^5H2O, 0,12 mg de Na2MoO4^2H2O e 0,14 nmol de NÍCI2. Todos os potes foram irrigados com H2O DI estéril, como necessário para manter a umidade do solo consistente sem escoamento.

[380] Em quatro semanas, as plantas foram colhidas e separadas no nó mais baixo em amostras para extração de gDNA e RNA da raiz e tecido aéreo para IRMS. Os tecidos aéreos foram limpos como necessário para remover areia, colocados inteiros em bolsas de papel e secos por pelo menos 72 horas a 60°C. Após completamente seco, tecido aéreo total foi homogeneizado por vibração com glóbulos e 5-7 mg de amostras foram analisados por espectrometria de massa de proporção de isótopo (IRMS) para δ15N pelo “MBL Stable Isotope Laboratory” (The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). O percentual de NDFA foi calculado usando a seguinte fórmula: %NDFA = (δ15N de média de UTC - δ15N de amostra)/(δ15N de média de UTC) x 100.

Exemplo 11: Experimentos de campo com micróbios da revelação - Verão de 2017

[381] A fim de avaliar a eficácia de cepas da presente revelação sobre o crescimento e produtividade do milho sob regimes de nitrogênio variáveis, foram feitos experimentos de campo. Os dados de campo abaixo demonstram que os micróbios não intergenéricos da revelação são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e liberar o referido nitrogênio a uma planta - resultando em rendimentos aumentados - tanto em um ambiente limitante de nitrogênio, quanto em um ambiente não limitante de nitrogênio.

[382] Foram realizados experimentos em sete localizações através dos Estados Unidos com seis localizações do Meio- Oeste geograficamente diversas. Cinco regimes de nitrogênio foram usados para tratamentos com fertilizante: 100% de prática agrícola-padrão do local/região, 100% menos 25 libras, 100% menos 50 libras, 100% menos 75 libras, e 0%; tudo por acre. As libras de nitrogênio por acre para o regime de 100% dependeram das práticas agrícolas padronizadas do local/região. Os regimes de nitrogênio mencionados anteriormente variaram de cerca de 153 libras por acre até cerca de 180 libras por acre, com uma média de cerca de 164 libras de nitrogênio por acre.

[383] Dentro de cada regime de fertilizante houve 14 tratamentos. Cada regime teve seis réplicas, e foi utilizado um design de lote dividido. Os 14 tratamentos incluíram: 12 micróbios diferentes, 1 UTC com a mesma taxa de fertilizante do lote principal, e 1 UTC com 100% de nitrogênio. No regime de 100% de nitrogênio, o 2° UTC é de 100 mais 25 libras.

[384] Os lotes de milho tinham, no mínimo, 4 fileiras de 9,14 metros de comprimento 30 lb entre fileiras (76,2 centímetros) com 420 lotes por localização. Todas as observações, salvo indicação em contrário, foram feitas das duas fileiras centrais das plantas, e toda a amostragem destrutiva foi retirada das fileiras externas. As amostras de sementes foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[385] Prática agrícola local: A semente foi um milho comercial aplicado com um tratamento de semente comercial sem co-aplicação biológica. A taxa de semeadura, data do plantio, manejo de ervas daninhas/insetos, tempos de colheita e outras práticas de manejo padronizadas foram deixadas para as normas de práticas agrícolas locais para as regiões, com a exceção da aplicação de fungicida (se necessária).

[386] Aplicação de micróbios: Os micróbios foram aplicados à semente em um tratamento de semente sobre sementes que já haviam recebido um tratamento químico normal. As sementes foram revestidas com caldo de fermentação que compreende os micróbios.

[387] Caracterização do solo: A textura do solo e a fertilidade do solo foram avaliadas. Foram utilizados procedimentos padronizados de amostragem de solo, que incluíram monólitos de profundidades de 0-30 cm e 30-60 cm. A amostragem-padrão do solo incluiu a determinação de nitrogênio de nitrato, nitrogênio de amônio nitrogênio total, matéria orgânica e CEC. A amostragem-padrão do solo ainda incluiu a determinação do pH, potássio total e fósforo total. Para determinar os níveis de fertilizante de nitrogênio, amostras do solo pré-semeadura de cada localização foram retiradas para assegurar as regiões de solo de 0-12” (0-30,48 centímetros) e potencialmente as de 12” até 24“ (30,48 centímetros até 60,96 centímetros) para nitrogênio de nitrato.

[388] Antes do plantio e da fertilização, amostras de solo de 2 ml foram coletadas de 0 a 15,24-30,48 centímetros do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras de solo).

[389] Pós-plantio (V4-V6), amostras de solo de 2 ml foram coletadas de 0 a 16-12” (5,24-30,48 centímetros) do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras de solo).

[390] Pós-colheita (V4-V6), amostras de solo de 2 ml foram coletadas de 0 a 6-12” (15,24-30,48 centímetros) do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira. Uma amostra de solo pós- colheita adicional coletada a 0-12” (0-30,48 centímetros) do UTC e potencialmente 30,48-60,96 centímetros do UTC (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras de solo).

[391] Uma amostra de solo V6-V10 de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 25 libras [nos 100% de bloqueio] para todos os regimes de fertilizante a 0-12” (0-30,48 centímetros) e 12-24” (30,4860,96 centímetros) (5 regimes de fertilizante x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[392] Amostra de solo pós-colheita de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 25 libras [nos 100% de bloqueio] para todos os regimes de fertilizante a 0-12” e 12-24” (0-30,48 centímetros e 30,4860,96 centímetros) (5 regimes de fertilizante x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[393] Avaliações: A população de plantas inicial foi avaliada a aproximadamente 50% de UTC e a população de plantas final foi avaliada antes da colheita. A avaliação incluiu (1) temperatura potencial (sonda de temperatura); (2) vigor (escala de 1-10 com 10 = excelente) em V4 e V8- V10; (3) altura da planta em V8-V10 e V14; (4) rendimento (alqueires/acre) ajustado para a percentagem de umidade- padrão; (5) peso do hectolitro; (6) percentagem de umidade do grão; (7) testes de nitrato do talo na camada preta (420 lotes x 7 localizações); (8) colonização com 1 planta por lote em uma bolsa do tipo zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4-V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 réplicas x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (9) transcriptômica com 1 planta por lote em uma bolsa do tipo zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4-V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 réplicas x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (10) Índice vegetativo de diferença normalizada (NDVI) ou determinação da borda vermelha de diferença normalizada (NDRE) usando um instrumento Greenseeker em dois pontos do tempo (V4-V6 e VT) para avaliar cada lote em todas as 7 localizações (420 lotes x 2 pontos do tempo x 7 localizações = 5,880 pontos de dados); (11) características do talo medidas em todas as 7 localizações entre R2 e R5 por registro do diâmetro do talo de 10 plantas/lote a 15,24 centímetros de altura, registrar o comprimento do primeiro internódio acima da marca de 15,24 centímetros, 10 plantas monitoradas (5 plantas consecutivas do centro de duas fileiras interiores) (420 lotes x 10 plantas x 7 localizações = 29.400 pontos de dados).

[394] Esquema de monitoramento: Os profissionais visitaram todos os experimentos em estágio V3-V4 para avaliar a resposta no início da estação aos tratamentos e durante o estágio de crescimento reprodutivo para monitorar a maturidade. Cooperadores locais visitaram o experimento de pesquisa durante o estudo.

[395] Informações climáticas: Dados climáticos do plantio à colheita foram coletados e consistiram em temperaturas mínimas e máximas diárias, temperatura do solo na semeadura, precipitação pluviométrica diária mais irrigação (se aplicada), e eventos climáticos incomuns como, por exemplo, vento, chuva, frio e calor excessivos.

[396] Registro de dados: Incluindo os dados indicados acima, os experimentos de campo geraram pontos de dados que incluem texturas do solo; espaçamento de fileiras; tamanhos de lote; irrigação; terra lavrada; plantio prévio; taxa de semeadura; população de plantas; entradas sazonais de fertilizante, incluindo fonte, taxa, momento e colocação; dimensões da área de colheita, método de colheita, por exemplo, manual ou por máquina, e ferramentas de medição usadas (balanças, monitor de rendimento etc.)

[397] Resultados: Resultados selecionados do experimento de campo mencionado anteriormente estão registrados na Figura 32 e na Figura 33.

[398] Na Figura 32, pode ser observado que um micróbio da revelação (ou seja, 6-403) resultou em um rendimento maior do que a cepa do tipo selvagem (WT) e um rendimento maior do que o controle não tratado (UTC). O tratamento “-25 lbs N” utiliza 25 libras menos N por acre do que práticas agrícolas padronizadas da região. O tratamento UTC “100% N” visa retratar práticas agrícolas padronizadas da região, nas quais 100% da utilização-padrão de N são distribuídos pelo fazendeiro. O micróbio “6-403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela A. Esse é um Kosakonia sacchari mutante (também denominado CM037) e é uma cepa mutante da prole de CI006 WT.

[399] Na Figura 33, os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação têm um desempenho consistente através de localizações. Além disso, os resultados de rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm um bom desempenho tanto em um ambiente com estresse de nitrogênio (ou seja, um ambiente limitante de nitrogênio), quanto em um ambiente que possui abastecimentos suficientes de nitrogênio (ou seja, uma condição não limitante de nitrogênio). O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela A. O micróbio “6-404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela A.

Exemplo 12: Gênero de micróbios não intergenéricos benéficos para sistemas agrícolas

[400] Os micróbios da presente revelação foram avaliados e comparados uns com os outros quanto à produção de nitrogênio produzido em um acre através de uma estação. Veja a Figura 20, Figura 40 e Figura 41.

[401] Os inventores formularam a hipótese de que, a fim de que uma população de micróbios não intergenéricos modificados geneticamente seja benéfica em um sistema agrícola moderno de plantio em fileiras, a população de micróbios precisa produzir pelo menos uma libra ou mais de nitrogênio por acre por estação.

[402] Para essa finalidade, os inventores descobriram surpreendentemente um gênero funcional de micróbios que são capazes de contribuir, inter alia, para: o aumento de rendimentos em plantios de não leguminosas; e/ou redução da dependência do fazendeiro da aplicação de nitrogênio exógeno; e/ou a habilidade para produzir pelo menos uma libra de nitrogênio por acre por estação, até mesmo em ambientes não limitantes de nitrogênio, o referido gênero sendo definido pelo produto da habilidade de colonização x mmol de N produzido por micróbio por hora (ou seja, a linha de divisão, Figuras 20, 40 e 41).

[403] Com relação às Figuras 20, 40, e 41, certos dados que utilizam micróbios da revelação foram agregados, a fim de retratar um mapa de calor das libras de nitrogênio liberadas por acre-estação por micróbios da revelação, que são registradas em função de micróbios por g de peso fresco por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta as imagens maiores estão os micróbios que liberam menos do que uma libra de nitrogênio por acre-estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que uma libra de nitrogênio por acre-estação.

[404] Dados de campo e mapa de calor da colonização do tipo selvagem: Os micróbios utilizados no mapa de calor da Figura 20 foram testados quanto à produção de N em milho. Para as cepas WT CI006 e CI019, dados da colonização da raiz de milho foram obtidos de um único local do campo. Para as cepas restantes, presumiu-se que a colonização é a mesma que o nível de campo WT. A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio ARA in vitro a 5 mM de glutamina. A tabela abaixo do mapa de calor na Figura 20 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora), juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

[405] Mapa de calor de dados de campo: Os dados utilizados no mapa de calor da Figura 40 são derivados de cepas microbianas testadas quanto à produção de N em milho em condições de campo. Cada ponto representa libras de N/acre produzidas por um micróbio usando dados da colonização da raiz de milho de um único local do campo. A atividade de fixação de N foi determinada usando ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio. A Tabela C abaixo dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora) juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da Figura 40.

[406] Mapa de calor de dados laboratoriais e de estufa: Os dados utilizados no mapa de calor da Figura 41 são derivados de cepas microbianas testadas quanto à produção de N em milho em condições de laboratório e de estufa. Cada ponto representa libras de N/acre produzidas por uma única cepa. Pontos brancos representam cepas nas quais os dados da colonização da raiz de milho foram reunidos em condições de estufa. Pontos pretos representam cepas mutantes para as quais níveis de colonização da raiz de milho são derivados de níveis de campo médios de colonização da raiz de milho da cepa progenitora do tipo selvagem. Pontos hachurados representam as cepas progenitoras do tipo selvagem em seus níveis de campo médios de colonização da raiz de milho. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada pelo ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio. A Tabela D abaixo dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio-hora) juntamente com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g/fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da Figura 41. Tabela C: Figura 40 - Mapa de calor de dados de campo. Tabela D: Figura 41 - Mapa de calor de dados laboratoriais e de estufa.

[407] Conclusões: Os dados nas Figuras 20, 40 e 41 e nas Tabelas C e D ilustram mais de uma dúzia de membros representativos do gênero descrito (ou seja, micróbios à direita da linha nas figuras). Além disso, esses numerosos membros representativos vêem de um arranjo diverso de gêneros taxonômicos, que podem ser encontrados nas Tabelas C e D acima. Além disso, os inventores descobriram numerosos atributos genéticos que retratam um relacionamento estrutura/função que é encontrado em muitos dos micróbios. Esses relacionamentos genéticos podem ser encontrados nas diversas tabelas da revelação que descrevem as modificações genéticas introduzidas pelos inventores, que incluem a introdução de pelo menos uma variação genética em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[408] Consequentemente, o gênero recém descoberto é apoiado por: (1) um conjunto de dados robusto, (2) mais de uma dúzia de membros representativos, (3) membros de gêneros taxonômicos diversos, e (4) classes de modificações genéticas que definem um relacionamento estrutura/função, na arquitetura genética subjacente dos membros do gênero. Exemplo 13: Métodos e ensaios para detecção de micróbios não intergenéricos modificados geneticamente

[409] A presente revelação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detecção dos micróbios utilizados nos vários Exemplos mencionados anteriormente. Os ensaios são capazes de detectar as sequências de nucleotídeos de “junção” não naturais nos micróbios não intergenéricos derivados/mutantes. Essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética particular em um micróbio.

[410] As presentes técnicas também são capazes de detectar essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos especializados de PCR quantitativa, incluindo iniciadores e sondas singularmente projetados. As sondas podem se ligar às sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural. Ou seja, sondas de DNA sequência-específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcadas com um repórter fluorescente, o que permite a detecção somente após hibridização da sonda com sua sequência complementar podem ser usadas. Os métodos quantitativos podem assegurar que somente a junção de nucleotídeo de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico, ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Outro aspecto do método é a escolha de iniciadores de tal modo que os iniciadores flaqueiem um dos lados de uma sequência de junção, de modo que se uma reação de amplificação ocorre, então a referida sequência de junção está presente.

[411] Consequentemente, DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação por utilização de qPCR. Os iniciadores utilizados na reação de qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou regiões únicas das cepas mutantes não intergenéricas modificadas geneticamente. A reação de qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando somente iniciadores de amplificação diretos e reversos; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan que contém um marcador de corante FAM na extremidade 5’, um extintor interno ZEN, e um ligante do sulco menor e extintor fluorescente na extremidade 3’ (Integrated DNA Technologies). Certos iniciadores, sondas e sequências de junção não nativas que podem ser usados nos métodos de qPCR estão listados na Tabela E abaixo. Especificamente, as sequências de junção não nativas podem ser encontradas nos IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

[412] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “uma” e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser considerado como englobando tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário nesse relatório descritivo ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “que compreendem”, “que possuem”, “que incluem” e “que contêm” devem ser considerados como termos em aberto (ou seja, significando “que incluem, sem limitação”), salvo indicação em contrário. A citação de faixas de valores nesse relatório descritivo visa simplesmente servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, salvo indicação em contrário nesse relatório descritivo, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente nesse relatório descritivo. Por exemplo, se a faixa 10-15 é revelada, então 11, 12, 13 e 14 também são revelados. Todos os métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser realizados em qualquer ordem adequada, salvo indicação em contrário nesse relatório descritivo ou de algum outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tais como”) fornecidos nesse relatório descritivo, visa simplesmente melhor iluminar a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da invenção, a menos que reivindicado de forma diferente. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[413] Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática da invenção. Deseja-se que as reivindicações seguintes definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam por elas englobados.

CLÁUSULAS

[414] 1. Um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, que compreende: i. aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, a referida pluralidade compreendendo bactérias não-intergenéricas que: ii. possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou iii. produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta, e em que cada membro das diversas bactérias não- intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não- intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[415] 2. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[416] 3. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias que: produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[417] 4. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[418] 5. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[419] 6. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[420] 7. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor induzível ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[421] 8. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas do não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[422] 9. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no grupamento do gene nif.

[423] 10. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[424] 11. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas aplicadas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio não- atmosférico exógeno.

[425] 12. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso.

[426] 13. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende amônio ou uma molécula que contém amônio.

[427] 14. O método de acordo com a cláusula 1, em que o nitrogênio exógeno é selecionado de um fertilizante que compreende um ou mais de: glutamina, amônia, amônio, ureia, nitrato, nitrito, moléculas que contêm amônio, moléculas que contêm nitrato e moléculas que contêm nitrito.

[428] 15. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[429] 16. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[430] 17. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, fixam nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[431] 18. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[432] 19. O método de acordo com a cláusula 1, em que o nitrogênio fixado produzido pelas diversas bactérias não- intergenéricas é medido por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás de N2 atmosférico em tecido de plantas.

[433] 20. O método de acordo com a cláusula 0, em que o (pelo menos um) gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio é selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[434] 21. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[435] 22. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: (A) uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[436] 23. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[437] 24. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[438] 25. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[439] 26. O método de acordo com a cláusula 0, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[440] 27. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[441] 28. O método de acordo com a cláusula 1, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[442] 29. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[443] 30. O método de acordo com a cláusula 0, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição.

[444] 31. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[445] 32. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são aplicadas em sulcos nos quais sementes da referida planta são plantadas.

[446] 33. O método de acordo com a cláusula 0, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[447] 34. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[448] 35. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[449] 36. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta, em uma concentração de cerca de 1 x 105até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[450] 37. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é uma cultura de cereais.

[451] 38. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[452] 39. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é milho.

[453] 40. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é uma planta de cultivo agrícola.

[454] 41. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta é um organismo geneticamente modificado.

[455] 42. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado.

[456] 43. O método de acordo com a cláusula 1, em que a planta geneticamente modificada ou cruzada para uso eficiente de nitrogênio.

[457] 44. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

[458] 45. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[459] 46. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[460] 47. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[461] 48. O método de acordo com a cláusula 1, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como PTA-122293, uma bactéria depositada como PTA-122294, uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

[462] 49. Uma composição bacteriana, que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola que foi fertilizado com mais do que 20 lbs (9,07 kg) de nitrogênio por acre.

[463] 50. Uma composição bacteriana, que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana que foi criada para fixar nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola que foi fertilizado com mais do que 20 lbs (9,07 kg) de nitrogênio por acre.

[464] 51. A composição bacteriana da cláusula 49 ou cláusula 50, em que o referido fertilizante é um fertilizante químico selecionado do grupo que consiste em amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, UAN (ureia-nitrato de amônio), fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, e nitrato de sódio.

[465] 52. Uma composição bacteriana, que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico, a (pelo menos um) cepa bacteriana modificada geneticamente compreendendo DNA adicionado exogenamente, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 80% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[466] 53. A composição bacteriana da cláusula 52, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 85% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[467] 54. A composição bacteriana da cláusula 52, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 90% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[468] 55. A composição bacteriana da cláusula 52, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 95% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[469] 56. A composição bacteriana da cláusula 52, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 99% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[470] 57. A composição bacteriana da cláusula 52, em que o referido DNA adicionado exogenamente é derivada de uma mesma cepa bacteriana que a referida cepa bacteriana nativa correspondente.

[471] 58. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a referida composição bacteriana é uma composição de fertilização.

[472] 59. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a referida (pelo menos uma) cepa bacteriana modificada geneticamente compreende pelo menos uma variação em um gene ou região intergênica dentro de 10.000 bp de um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[473] 60. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes, compreendendo ainda pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em um colante, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anti-complexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida e um nutriente.

[474] 61. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes, compreendendo ainda pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em um corante, iniciador, pélete, desinfetante, regulador do crescimento de plantas, protetor e um nematicida.

[475] 62. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a referida composição bacteriana é formulada para ser aplicada a um campo.

[476] 63. A composição bacteriana da cláusula 62, em que a referida composição bacteriana é formulada para ser aplicada em sulcos de arados.

[477] 64. A composição bacteriana da cláusula 62, em que a referida composição bacteriana é formulada para ser aplicada como um revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente.

[478] 65. A composição bacteriana da cláusula 61 ou cláusula 62, em que a referida composição bacteriana é formulada para ser aplicada no plantio, antes do plantio ou pós-plantio da semente.

[479] 66. Uma composição de semente que compreende uma semente de uma planta que é inoculada com uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[480] 67. Um método de crescimento de um plantio usando diversas sementes que possuem uma composição de semente da cláusula [479].

[481] 68. O método da cláusula 67, compreendendo ainda a colheita do referido plantio.

[482] 69. Um método de aplicação de uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes a um campo.

[483] 70. O método da cláusula 69, em que a referida composição bacteriana é aplicada ao referido campo em uma forma selecionada do grupo que consiste em uma forma líquida, uma forma em pó, um grânulo, um pó e um pélete.

[484] 71. O método da cláusula 69, em que a referida composição bacteriana é aplicada ao referido campo como um revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente.

[485] 72. O método da cláusula 69, em que a referida composição bacteriana é aplicada ao referido campo como um tratamento nos sulcos de arado.

[486] 73. O método da cláusula 69, em que a referida composição bacteriana é aplicada ao referido campo no plantio, antes do plantio ou pós-plantio da semente.

[487] 74. Uma composição de fertilizante que compreende uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[488] 75. A composição de fertilizante da cláusula 74, em que a referida composição de fertilizante é um revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou composição de tratamento de semente.

[489] 76. A composição de fertilizante da cláusula 74, em que a referida composição de fertilizante é uma composição in sulco.

[490] 77. A composição de fertilizante da cláusula 74, em que a referida composição de fertilizante é fornecida a um plantio no plantio, antes do plantio ou pós-plantio.

[491] 78. A composição de fertilizante da cláusula 74, compreendendo ainda um carreador poroso.

[492] 79. A composição de fertilizante da cláusula 74, compreendendo ainda um componente sinérgico adicional que, quando combinado com a referida composição bacteriana, aumenta um benefício fertilizante da referida composição de fertilizante a um plantio que é além de um benefício cumulativo de seus componentes individuais.

[493] 80. Um método de manutenção dos níveis de nitrogênio do solo, que compreende: plantio, no solo de um campo, de um plantio inoculado por uma bactéria modificada geneticamente que fixa nitrogênio atmosférico; e colheita do referido plantio, em que no máximo 90% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[494] 81. O método da cláusula 80, em que no máximo 80% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[495] 82. O método da cláusula 80, em que no máximo 70% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[496] 83. O método da cláusula 80, em que no máximo 60% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[497] 84. O método da cláusula 80, em que no máximo 50% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[498] 85. O método da cláusula 80, em que no máximo 40% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[499] 86. O método da cláusula 80, em que a referida bactéria modificada geneticamente compreende uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[500] 87. O método da cláusula 80, em que a referida bactéria modificada geneticamente consiste em uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[501] 88. Um método de liberação de um suplemento probiótico a uma planta de plantio, que compreende: revestimento de uma semente de plantio com um revestimento de semente, tratamento de semente ou tratamento químico de sementes, em que o referido revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente compreende representantes vivos do referido probiótico; e aplicação, no solo de um campo, das referidas sementes de plantio.

[502] 89. O método da cláusula 88, em que o referido revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente é aplicado em uma camada única à referida semente de plantio.

[503] 90. O método da cláusula 88, em que o referido revestimento de semente é aplicado em múltiplas camadas à referida semente de plantio.

[504] 91. O método da cláusula 88, em que o referido revestimento de semente é aplicado em uma mistura à referida semente de plantio.

[505] 92. O método da cláusula 88, em que a referida semente de plantio é não nodulante.

[506] 93. O método da cláusula 88, em que o referido revestimento de semente compreende uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[507] 94. O método de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a cepa bacteriana modificada geneticamente é uma cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente.

[508] 95. O método da cláusula 94, em que a cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente possui um nível de expressão alterado de um regulador de um cluster Nif.

[509] 96. O método da cláusula 94, em que a cepa bacteriana Gram-positiva modificada geneticamente expressa uma quantidade diminuída de um regulador negativo de um cluster Nif.

[510] 97. O método da cláusula 94, em que a cepa bacteriana modificada geneticamente expressa uma quantidade diminuída de GlnR.

[511] 98. O método de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”.

[512] 99. O método de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”.

[513] 100. O método de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”.

[514] 101. O método de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que o genoma da cepa bacteriana modificada geneticamente codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”.

[515] 102. Um método de melhoramento de cepas microbianas para aprimorar traços específicos de relevância agronômica, que compreende: o fornecimento de diversas cepas microbianas que possuem a habilidade para colonizar um plantio desejado; o aprimoramento de redes reguladoras que influenciam o traço por meio de rearranjo intragenômico; a avaliação das cepas microbianas dentro da pluralidade de cepas microbianas para determinar uma medição do traço; e a seleção de uma ou mais cepas microbianas da pluralidade de cepas microbianas que geram um aprimoramento no traço na presença do plantio desejado.

[516] 103. O método da cláusula 102, em que o traço específico que é aprimorado é a habilidade da cepa microbiana para fixar nitrogênio.

[517] 104. O método da cláusula 103, em que o traço específico que é aprimorado é a habilidade da cepa microbiana para fixar nitrogênio atmosférico na presença de condições de crescimento fertilizado com N.

[518] 105. Um método de melhoramento de cepas microbianas para aprimorar traços específicos de relevância agronômica, que compreende: o fornecimento de diversas cepas microbianas que possuem a habilidade para colonizar um plantio desejado; a introdução de diversidade genética na pluralidade de cepas microbianas; a avaliação das cepas microbianas dentro da pluralidade de cepas microbianas para determinar uma medição do traço; e a seleção de uma ou mais cepas microbianas da pluralidade de cepas microbianas que geram um aprimoramento no traço na presença do plantio desejado.

[519] 106. O método da cláusula 105, em que o traço específico que é aprimorado é a habilidade da cepa microbiana para fixar nitrogênio.

[520] 107. O método da cláusula 106, em que o traço específico que é aprimorado é a habilidade da cepa microbiana para fixar nitrogênio atmosférico na presença de condições de crescimento fertilizado com N.

[521] 108. Um método de aumento da quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta não- leguminosa, que compreende: a exposição da referida planta não-leguminosa a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio ou pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[522] 109. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de fixação de nitrogênio.

[523] 110. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[524] 111. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[525] 112. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente são aplicados em sulcos nos quais sementes da referida planta não-leguminosa são plantadas.

[526] 113. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente são revestidos sobre uma semente da referida planta não- leguminosa.

[527] 114. O método da cláusula 108, em que a referida planta não-leguminosa é uma planta não leguminosa de cultivo agrícola selecionada do grupo que consiste em sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, milho, trigo, batata, painço, cereais, grãos e milho.

[528] 115. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente colonizam pelo menos uma raiz da referida planta não- leguminosa de modo que os micróbios não intergenéricos modificados geneticamente estejam presentes na referida planta não-leguminosa em uma quantidade de pelo menos 105 unidades formadoras de colônia por grama de peso fresco de tecido.

[529] 116. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[530] 117. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[531] 118. O método da cláusula 108, em que a referida (pelo menos uma) variação genética é introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[532] 119. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, produzem pelo menos 1% de nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa.

[533] 120. O método da cláusula 119, em que o referido nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa produzido pelos referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente é medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[534] 121. O método da cláusula 119, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa.

[535] 122. O método da cláusula 108, em que os referidos micróbios não intergenéricos são modificados geneticamente usando pelo menos um tipo de modificação genética selecionada do grupo que consiste em mutagênese dirigida, mutagênese aleatória e evolução dirigida.

[536] 123. Um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho, que compreende: a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente que compreendem variações genéticas criadas geneticamente dentro de pelo menos dois genes selecionados do grupo que consiste em nifL, glnB, glnE e amtB.

[537] 124. O método da cláusula 123, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[538] 125. O método da cláusula 123, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente são aplicados em sulcos nos quais sementes da referida planta de milho são plantadas.

[539] 126. O método da cláusula 123, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente são revestidos sobre uma semente da referida planta de milho.

[540] 127. Um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho, que compreende: a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos modificados geneticamente que compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente, in planta, produzem pelo menos 5% de nitrogênio fixado na referida planta de milho, como medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[541] 128. Um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, que compreende: i. aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, a referida pluralidade compreendendo bactérias não-intergenéricas que: ii. possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e iii. produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora, e em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta, e em que cada membro das diversas bactérias não- intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não- intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[542] 129. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[543] 130. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[544] 131. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor induzível ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[545] 132. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas do não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[546] 133. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no grupamento do gene nif.

[547] 134. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, excretam os produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[548] 135. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas aplicadas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio não- atmosférico exógeno.

[549] 136. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso.

[550] 137. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende amônio ou uma molécula que contém amônio.

[551] 138. O método de acordo com a cláusula 128, em que o nitrogênio exógeno é selecionado de um fertilizante que compreende um ou mais de: glutamina, amônia, amônio, ureia, nitrato, nitrito, moléculas que contêm amônio, moléculas que contêm nitrato e moléculas que contêm nitrito.

[552] 139. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[553] 140. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[554] 141. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, fixam nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[555] 142. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[556] 143. O método de acordo com a cláusula 128, em que o nitrogênio fixado produzido pelas diversas bactérias não- intergenéricas é medido por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás de N2 atmosférico em tecido de plantas.

[557] 144. O método de acordo com a cláusula 128, em que o (pelo menos um) gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio é selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[558] 145. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[559] 146. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: (A) uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[560] 147. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[561] 148. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[562] 149. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[563] 150. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[564] 151. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[565] 152. O método de acordo com a cláusula 128, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[566] 153. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[567] 154. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição.

[568] 155. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[569] 156. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são aplicadas em sulcos nos quais sementes da referida planta são plantadas.

[570] 157. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[571] 158. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[572] 159. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[573] 160. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta, em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[574] 161. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é uma cultura de cereais.

[575] 162. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[576] 163. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é milho.

[577] 164. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é uma planta de cultivo agrícola.

[578] 165. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta é um organismo geneticamente modificado.

[579] 166. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado.

[580] 167. O método de acordo com a cláusula 128, em que a planta geneticamente modificada ou cruzada para uso eficiente de nitrogênio.

[581] 168. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

[582] 169. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[583] 170. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[584] 171. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[585] 172. O método de acordo com a cláusula 128, em que as diversas bactérias não-intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como PTA- 122293, uma bactéria depositada como PTA-122294, uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

[586] 173. Um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, que compreende: a. aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias, a referida pluralidade compreendendo bactérias que: i. possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou ii. produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 1017 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que as diversas bactérias, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[587] 174. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[588] 175. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: produzem N fixado de pelo menos cerca de [586] x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[589] 176. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[590] 177. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[591] 178. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias, in planta, excretam os produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[592] 179. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias aplicadas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio não-atmosférico exógeno.

[593] 180. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[594] 181. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição.

[595] 182. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[596] 183. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são aplicadas em sulcos nos quais sementes da referida planta são plantadas.

[597] 184. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[598] 185. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[599] 186. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[600] 187. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta, em uma concentração de cerca de 1 x 105até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[601] 188. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta é uma cultura de cereais.

[602] 189. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[603] 190. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta é milho.

[604] 191. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta é uma planta de cultivo agrícola.

[605] 192. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta é um organismo geneticamente modificado.

[606] 193. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado.

[607] 194. O método de acordo com a cláusula 173, em que a planta geneticamente modificada ou cruzada para uso eficiente de nitrogênio.

[608] 195. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

[609] 196. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[610] 197. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[611] 198. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[612] 199. O método de acordo com a cláusula 173, em que as diversas bactérias são selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701003, uma bactéria depositada como NCMA 201701001 e uma bactéria depositada como NCMA 201708001.

[613] 200. Uma população bacteriana não intergenérica capaz de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não- leguminosa, que compreende: a. uma pluralidade de bactérias não-intergenéricas, que: i. possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou ii. produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta desenvolvida na presença das diversas bactérias não- intergenéricas, e em que cada membro das diversas bactérias não- intergenéricas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que as bactérias não- intergenéricas sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[614] 201. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[615] 202. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem bactérias que: produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[616] 203. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[617] 204. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[618] 205. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[619] 206. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor induzível ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[620] 207. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas do não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[621] 208. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas do não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no grupamento do gene nif.

[622] 209. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[623] 210. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas aplicadas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio não-atmosférico exógeno.

[624] 211. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso.

[625] 212. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é desenvolvida em solo de um campo no qual foram administrados pelo menos cerca de 50 lbs (22,68 kg) de fertilizante que contém nitrogênio por acre, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende pelo menos cerca de 5% de nitrogênio por peso, e em que o fertilizante que contém nitrogênio compreende amônio ou uma molécula que contém amônio.

[626] 213. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que o nitrogênio exógeno é selecionado de um fertilizante que compreende um ou mais de: glutamina, amônia, amônio, ureia, nitrato, nitrito, moléculas que contêm amônio, moléculas que contêm nitrato e moléculas que contêm nitrito.

[627] 214. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[628] 215. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[629] 216. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, fixam nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[630] 217. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[631] 218. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que o nitrogênio fixado produzido pelas diversas bactérias não-intergenéricas é medido por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás de N2 atmosférico em tecido de plantas.

[632] 219. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que o (pelo menos um) gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio é selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[633] 220. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[634] 221. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: (A) uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[635] 222. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[636] 223. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[637] 224. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[638] 225. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[639] 226. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[640] 227. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[641] 228. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[642] 229. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas são formuladas em uma composição.

[643] 230. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas são formuladas em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[644] 231. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas são formuladas em uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[645] 232. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas são formuladas em um revestimento de semente.

[646] 233. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é uma cultura de cereais.

[647] 234. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[648] 235. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é milho.

[649] 236. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é uma planta de cultivo agrícola.

[650] 237. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta é um organismo geneticamente modificado.

[651] 238. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado.

[652] 239. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que a planta geneticamente modificada ou cruzada para uso eficiente de nitrogênio.

[653] 240. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

[654] 241. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[655] 242. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[656] 243. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[657] 244. A população bacteriana não intergenérica de acordo com a cláusula 200, em que as diversas bactérias não- intergenéricas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como PTA-122293, uma bactéria depositada como PTA-122294, uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

[658] 245. Uma população bacteriana capaz de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, que compreende: a. uma pluralidade de bactérias, que: i. possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou ii. produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que as diversas bactérias, in planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[659] 246. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[660] 247. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: produzem N fixado de pelo menos cerca de [658] x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[661] 248. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[662] 249. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem bactérias que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[663] 250. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias, in planta, excretam os produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[664] 251. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias aplicadas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio não- atmosférico exógeno.

[665] 252. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[666] 253. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição.

[667] 254. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[668] 255. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são aplicadas em sulcos nos quais sementes da referida planta são plantadas.

[669] 256. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são formuladas em uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[670] 257. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[671] 258. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta.

[672] 259. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são formuladas em um revestimento de semente e são aplicadas sobre uma semente da referida planta, em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[673] 260. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta é uma cultura de cereais.

[674] 261. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[675] 262. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta é milho.

[676] 263. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta é uma planta de cultivo agrícola.

[677] 264. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta é um organismo geneticamente modificado.

[678] 265. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado.

[679] 266. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que a planta geneticamente modificada ou cruzada para uso eficiente de nitrogênio.

[680] 267. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

[681] 268. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[682] 269. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[683] 270. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[684] 271. A população bacteriana de acordo com a cláusula 245, em que as diversas bactérias são selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701003, uma bactéria depositada como NCMA 201701001 e uma bactéria depositada como NCMA 201708001.

[685] 272. Uma bactéria que: i. possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou ii. produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[686] 273. Uma bactéria não intergenérica, que compreende: pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio, de modo que a bactéria não intergenérica seja capaz de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno, e em que a referida bactéria: i. possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas; e/ou ii. produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[687] 274. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[688] 275. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[689] 276. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora.

[690] 277. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria possui uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas de pelo menos cerca de 1,0 x 104células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas e produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[691] 278. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[692] 279. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[693] 280. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética compreende um promotor induzível ligado operacionalmente ao (pelo menos um) gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[694] 281. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria não compreende um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[695] 282. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria não compreende um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no grupamento do gene nif.

[696] 283. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a bactéria, in planta, excreta os produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[697] 284. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que o (pelo menos um) gene, ou polinucleotídeo não-codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio é selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[698] 285. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[699] 286. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: (A) uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[700] 287. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[701] 288. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[702] 289. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[703] 290. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é selecionada de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[704] 291. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[705] 292. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a (pelo menos uma) variação genética é um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[706] 293. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, formulada em uma composição.

[707] 294. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, formulada em uma composição que compreende um carreador agronomicamente aceitável.

[708] 295. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, formulada em uma composição líquida dentro do sulco.

[709] 296. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, formulada em um revestimento de semente.

[710] 297. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a referida bactéria é selecionada de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[711] 298. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a referida bactéria é endofítica, epifítica ou rizosférica.

[712] 299. A bactéria não intergenérica de acordo com a cláusula 273, em que a referida bactéria é selecionada de: uma bactéria depositada como PTA-122293, uma bactéria depositada como PTA-122294, uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

[713] 300. Um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta, que compreende a administração à planta de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende: i. uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; ii. uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284295; e/ou iii. uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303; e em que a planta administrada com a quantidade eficaz da composição exibe um aumento na fixação de nitrogênio, como comparada com uma planta que não recebeu a administração da composição.

[714] 301. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[715] 302. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[716] 303. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos 16S selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[717] 304. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[718] 305. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[719] 306. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[720] 307. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270274, 275, 276, e 284-295.

[721] 308. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296-303.

[722] 309. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296-303.

[723] 310. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296-303.

[724] 311. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreende bactérias com uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296-303.

[725] 312. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com pelo menos uma variação genética introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[726] 313. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com pelo menos uma variação genética introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase, em que a variação genética (A) é uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[727] 314. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com pelo menos uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT ou AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[728] 315. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[729] 316. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[730] 317. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[731] 318. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com pelo menos uma das seguintes alterações genéticas: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[732] 319. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[733] 320. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[734] 321. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL.

[735] 322. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, em que uma modificação é uma ruptura, knockout ou truncamento.

[736] 323. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, e em que as bactérias ainda compreendem um promotor ligado operacionalmente a uma sequência de nifA.

[737] 324. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, e em que as bactérias não possuem um homólogo de nifL.

[738] 325. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE.

[739] 326. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, em que uma modificação é uma ruptura, knockout ou um truncamento.

[740] 327. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, e em que a sequência de proteína de GlnE não possui um domínio de remoção de adenilil (AR).

[741] 328. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: uma população purificada de bactérias que compreendem bactérias com uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, e em que a sequência da proteína de GlnE não possui atividade de remoção de adenilil (AR).

[742] 329. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias, in planta, fornece pelo menos 1% de nitrogênio fixado à planta.

[743] 330. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias, in planta, fornece pelo menos 5% de nitrogênio fixado à planta.

[744] 331. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias, in planta, fornece pelo menos 10% de nitrogênio fixado à planta.

[745] 332. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias é capaz de fixação de nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[746] 333. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias, in planta, excreta produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[747] 334. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias, in planta, fornece pelo menos 1% de nitrogênio fixado à planta, e em que o referido nitrogênio fixado é medido por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás de N2 atmosférico em tecido de plantas.

[748] 335. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias coloniza a raiz da referida planta e estão presentes em uma quantidade de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[749] 336. O método da cláusula 300, em que a planta compreende a semente, caule, flor, fruta, folhas ou rizoma.

[750] 337. O método da cláusula 300, em que a composição compreende: um carreador agronomicamente aceitável.

[751] 338. O método da cláusula 300, em que a composição que compreende a população purificada de bactérias é administrada em sulcos nos quais sementes da referida planta são plantadas.

[752] 339. O método da cláusula 300, em que a composição que compreende a população purificada de bactérias é formulada como uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107 até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[753] 340. O método da cláusula 300, em que a composição que compreende a população purificada de bactérias é administrada sobre uma semente da referida planta.

[754] 341. O método da cláusula 300, em que a composição que compreende a população purificada de bactérias é formulada como um revestimento de semente e é administrada sobre uma semente da referida planta.

[755] 342. O método da cláusula 300, em que a composição que compreende a população purificada de bactérias é formulada como um revestimento de semente e é administrada sobre uma semente da referida planta, em uma concentração de cerca de 1 x 105até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[756] 343. O método da cláusula 300, em que a planta é não leguminosa.

[757] 344. O método da cláusula 300, em que a planta é uma cultura de cereais.

[758] 345. O método da cláusula 300, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[759] 346. O método da cláusula 300, em que a planta é milho.

[760] 347. O método da cláusula 300, em que a planta é um legume.

[761] 348. O método da cláusula 300, em que a planta é um plantio de grãos.

[762] 349. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[763] 350. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias do gênero Rahnella.

[764] 351. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias da espécie Rahnella aquatilis.

[765] 352. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como PTA-122293.

[766] 353. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201701003.

[767] 354. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias do gênero Kosakonia.

[768] 355. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias da espécie Kosakonia sacchari.

[769] 356. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como PTA-122294.

[770] 357. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201701001.

[771] 358. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201701002.

[772] 359. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201708004.

[773] 360. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201708003.

[774] 361. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201708002.

[775] 362. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias do gênero Klebsiella.

[776] 363. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende bactérias da espécie Klebsiella variicola.

[777] 364. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201708001.

[778] 365. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201712001.

[779] 366. O método da cláusula 300, em que a população purificada de bactérias compreende uma bactéria depositada como NCMA 201712002.

[780] 367. Uma bactéria isolada, que compreende: i. uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; ii. uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295; e/ou iii. uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

[781] 368. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[782] 369. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos 16S que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[783] 370. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos 16S selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, e 277-283.

[784] 371. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263- 268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[785] 372. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[786] 373. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[787] 374. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, e 284-295.

[788] 375. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296303.

[789] 376. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296303.

[790] 377. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296303.

[791] 378. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260 e 296-303.

[792] 379. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase.

[793] 380. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, e um gene associado com a biossíntese de uma enzima nitrogenase, em que a variação genética (A) é uma mutação knockout; (B) altera ou elimina uma sequência regulatória de um gene-alvo; (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga; ou (D) uma deleção de domínio.

[794] 381. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: pelo menos uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT ou AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

[795] 382. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

[796] 383. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[797] 384. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[798] 385. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: pelo menos uma das seguintes alterações genéticas: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

[799] 386. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR).

[800] 387. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada desprovida de um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[801] 388. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL.

[802] 389. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, em que uma modificação é uma ruptura, knockout ou truncamento.

[803] 390. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, e em que as bactérias ainda compreendem um promotor ligado operacionalmente a uma sequência de nifA.

[804] 391. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de nifL que expressa uma proteína NifL a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de nifL, e em que as bactérias não possuem um homólogo de nifL.

[805] 392. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE.

[806] 393. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, em que uma modificação é uma ruptura, knockout ou um truncamento.

[807] 394. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, e em que a sequência de proteína de GlnE não possui um domínio de remoção de adenilil (AR).

[808] 395. As bactérias isoladas da cláusula 367, que compreendem: uma modificação de glnE que expressa uma proteína GlnE a menos do que cerca de 50% das bactérias desprovidas da modificação de glnE, e em que a sequência da proteína de GlnE não possui atividade de remoção de adenilil (AR).

[809] 396. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias, in planta, fornecem pelo menos 1% de nitrogênio fixado a uma planta exposta às referidas bactérias.

[810] 397. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias, in planta, fornecem pelo menos 5% de nitrogênio fixado a uma planta exposta às referidas bactérias.

[811] 398. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias, in planta, fornecem pelo menos 10% de nitrogênio fixado a uma planta exposta às referidas bactérias.

[812] 399. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[813] 400. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[814] 401. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias, in planta, fornecem pelo menos 1% de nitrogênio fixado a uma planta exposta às referidas bactérias, e em que o referido nitrogênio fixado é medido por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás de N2 atmosférico em tecido de plantas.

[815] 402. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias colonizam uma raiz de uma planta exposta às referidas bactérias a uma concentração de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas.

[816] 403. As bactérias isoladas da cláusula 367, formuladas em uma composição agrícola.

[817] 404. As bactérias isoladas da cláusula 367, formuladas em uma composição dentro do sulco.

[818] 405. As bactérias isoladas da cláusula 367, formuladas como uma composição líquida dentro do sulco que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 107 até cerca de 1 x 1010 ufc por mililitro.

[819] 406. As bactérias isoladas da cláusula 367, formuladas como um tratamento de semente ou revestimento de semente.

[820] 407. As bactérias isoladas da cláusula 367, formuladas como um tratamento de semente ou revestimento de semente que compreende bactérias em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 ufc por semente.

[821] 408. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias estão em contato com a planta e aumentam a fixação de nitrogênio na planta.

[822] 409. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em uma planta não-leguminosa.

[823] 410. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em uma cultura de cereais.

[824] 411. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em uma planta selecionada do grupo que consiste em: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio e triticale.

[825] 412. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em milho.

[826] 413. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em um legume.

[827] 414. As bactérias isoladas da cláusula 367, dispostas em um plantio de grãos.

[828] 415. As bactérias isoladas da cláusula 367, selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[829] 416. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são do gênero Rahnella.

[830] 417. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são da espécie Rahnella aquatilis.

[831] 418. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como PTA-122293.

[832] 419. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201701003.

[833] 420. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são do gênero Kosakonia.

[834] 421. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são da espécie Kosakonia sacchari.

[835] 422. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como PTA-122294.

[836] 423. As bactérias isoladas da cláusula 367,depositadas como NCMA 201701001.

[837] 424. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201701002.

[838] 425. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201708004.

[839] 426. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201708003.

[840] 427. As bactérias isoladas da cláusula 367,depositadas como NCMA 201708002.

[841] 428. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são do gênero Klebsiella.

[842] 429. As bactérias isoladas da cláusula 367, em que as bactérias são da espécie Klebsiella variicola.

[843] 430. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201708001.

[844] 431. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201712001.

[845] 432. As bactérias isoladas da cláusula 367, depositadas como NCMA 201712002.

[846] 433. Uma composição que compreende qualquer uma ou mais bactérias das cláusulas 415 a 432.

[847] 434. Um método de detecção de uma sequência de junção não nativa, que compreende: a amplificação de uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

[848] 435. O método de acordo com a cláusula 434, em que a referida amplificação é por realização de uma reação em cadeia de polimerase.

[849] 436. O método de acordo com a cláusula 434, em que a referida amplificação é por realização de uma reação em cadeia de polimerase quantitativa.

[850] 437. Um método de detecção de uma sequência de junção não nativa, que compreende: a amplificação de uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para pelo menos um fragmento de 10 pares de bases contíguas contido nos IDS. DE SEQ. Nos: 372-405, o referido fragmento de pares de bases contíguas sendo composto por nucleotídeos na interseção de: uma sequência upstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 304-337 e sequência downstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 338-371.

[851] 438. O método de acordo com a cláusula [850], em que a referida amplificação é por realização de uma reação em cadeia de polimerase.

[852] 439. O método de acordo com a cláusula [850], em que a referida amplificação é por realização de uma reação em cadeia de polimerase quantitativa.

[853] 440. Uma sequência de junção não nativa, que compreende: uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

[854] 441. Uma sequência de junção não nativa, que compreende: uma sequência de nucleotídeos que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para pelo menos um fragmento de 10 pares de bases contíguas contido nos IDS. DE SEQ. Nos: 372405, o referido fragmento de pares de bases contíguas sendo composto por nucleotídeos na interseção de: uma sequência upstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 304-337 e sequência downstream que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 338371.

[855] 442. Uma composição bacteriana, que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana remodelada que fixa nitrogênio atmosférico, a (pelo menos uma) cepa bacteriana remodelada compreendendo DNA adicionado exogenamente, em que o referido DNA adicionado exogenamente compartilha pelo menos 80% de identidade para uma cepa bacteriana nativa correspondente.

[856] 443. Um método de manutenção dos níveis de nitrogênio do solo, que compreende: o plantio, no solo de um campo, de um plantio inoculado por uma bactéria remodelada que fixa nitrogênio atmosférico; e a colheita do referido plantio, em que no máximo 90% de uma dose de nitrogênio necessária para a produção do referido plantio são administrados ao referido solo do referido campo entre o plantio e a colheita.

[857] 444. Um método de liberação de um suplemento probiótico a uma planta de plantio, que compreende: o revestimento de uma semente de plantio com um revestimento de semente, tratamento de semente ou tratamento químico de sementes, em que o referido revestimento de semente, tratamento químico de sementes ou tratamento de semente compreende representantes vivos do referido probiótico; e a aplicação no solo de um campo das referidas sementes de plantio.

[858] 445. Um método de aumento da quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta não- leguminosa, que compreende: a exposição da referida planta não-leguminosa a micróbios não intergenéricos remodelados, os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio ou pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[859] 446. Um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho, que compreende: a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos remodelados que compreendem variações genéticas remodeladas dentro de pelo menos dois genes selecionados do grupo que consiste em nifL, glnB, glnE e amtB.

[860] 447. Um método de aumento de uma quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta de milho, que compreende: a exposição da referida planta de milho a micróbios não intergenéricos remodelados que compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, produzem pelo menos 5% de nitrogênio fixado na referida planta de milho, como medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[861] 448. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[862] 449. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[863] 450. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[864] 451. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[865] 452. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[866] 453. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, quando na presença de nitrogênio exógeno.

[867] 454. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[868] 455. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[869] 456. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[870] 457. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[871] 458. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[872] 459. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[873] 460. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[874] 461. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[875] 462. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[876] 463. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[877] 464. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[878] 465. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[879] 466. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[880] 467. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[881] 468. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[882] 469. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[883] 470. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[884] 471. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[885] 472. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[886] 473. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[887] 474. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[888] 475. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[889] 476. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[890] 477. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[891] 478. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[892] 479. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[893] 480. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não-intergenéricas, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[894] 481. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as diversas bactérias não- intergenéricas, in planta, produzem 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

[895] 482. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[896] 483. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[897] 484. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[898] 485. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[899] 486. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[900] 487. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[901] 488. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[902] 489. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[903] 490. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[904] 491. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[905] 492. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[906] 493. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de plantas e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de plantas por hora.

[907] 494. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a planta foi remodelada ou aprimorada para uso eficiente de nitrogênio.

[908] 495. A composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a referida (pelo menos uma) cepa bacteriana remodelada compreende pelo menos uma variação em um gene ou região intergênica dentro de 10.000 bp de um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[909] 496. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a referida bactéria remodelada compreende uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[910] 497. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a referida bactéria remodelada consiste em uma composição bacteriana de qualquer uma das cláusulas precedentes.

[911] 498. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a cepa bacteriana remodelada é uma cepa bacteriana remodelada Gram-positiva.

[912] 499. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a cepa bacteriana remodelada Gram-positiva possui um nível de expressão alterado de um regulador de um cluster Nif.

[913] 500. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a cepa bacteriana remodelada Gram-positiva expressa uma quantidade diminuída de um regulador negativo de um cluster Nif.

[914] 501. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a cepa bacteriana remodelada expressa uma quantidade diminuída de GlnR.

[915] 502. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o genoma da cepa bacteriana remodelada codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”.

[916] 503. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o genoma da cepa bacteriana remodelada codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”.

[917] 504. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o genoma da cepa bacteriana remodelada codifica um polipeptídeo com pelo menos 75% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”.

[918] 505. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o genoma da cepa bacteriana remodelada codifica um polipeptídeo com pelo menos 85% de identidade para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”.

[919] 506. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de fixação de nitrogênio.

[920] 507. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[921] 508. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendem pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida na referida rede genética regulatória de assimilação de nitrogênio.

[922] 509. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados são aplicados em sulcos nos quais sementes da referida planta não-leguminosa são plantadas.

[923] 510. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados são revestidos sobre uma semente da referida planta não-leguminosa.

[924] 511. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados colonizam pelo menos uma raiz da referida planta não-leguminosa de modo que os micróbios não intergenéricos remodelados estejam presentes na referida planta não- leguminosa em uma quantidade de pelo menos 105 unidades formadoras de colônia por grama de peso fresco de tecido.

[925] 512. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico em condições não limitantes de nitrogênio.

[926] 513. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[927] 514. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, produzem pelo menos 1% de nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa.

[928] 515. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que o referido nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa produzido pelos referidos micróbios não intergenéricos remodelados é medido por diluição de 15N em plantios desenvolvidos em campos tratados com fertilizante que contem 1,2% de 15N.

[929] 516. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na referida planta não-leguminosa.

[930] 517. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos são remodelados usando pelo menos um tipo de modificação genética selecionada do grupo que consiste em mutagênese dirigida, mutagênese aleatória, e evolução dirigida.

[931] 518. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados, in planta, excretam produtos que contêm nitrogênio da fixação de nitrogênio.

[932] 519. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados são aplicados em sulcos nos quais sementes da referida planta de milho são plantadas.

[933] 520. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados são revestidos sobre uma semente da referida planta de milho.

[934] 521. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos remodelados compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[935] 522. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[936] 523. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que os referidos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[937] 524. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as referidas bactérias remodeladas não- intergenéricas compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[938] 525. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as referidas bactérias não-intergenéricas compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[939] 526. O método de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as referidas bactérias modificadas geneticamente não-intergenéricas compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[940] 527. A bactéria de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a referida bactéria compreende pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[941] 528. A população bacteriana de qualquer uma das cláusulas prévias, em que bactérias dentro da referida população bacteriana compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[942] 529. As bactérias isoladas de qualquer uma das cláusulas prévias, em que as referidas bactérias isoladas compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[943] 530. A população bacteriana não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que bactérias não- intergenéricas dentro da referida população bacteriana não intergenérica compreendem pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[944] 531. A bactéria não intergenérica de qualquer uma das cláusulas prévias, em que a referida bactéria não intergenérica compreende pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio e pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética reguladora da assimilação de nitrogênio.

[945] 532. Uma composição que compreende qualquer uma ou mais bactérias de qualquer uma das cláusulas prévias.

Claims (33)

1. Composição caracterizada por compreender: a) uma pluralidade de diazotróficos modificados compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede reguladora genética de fixação ou assimilação de nitrogênio que aumenta a expressão ou atividade de nifH, e que possuem um produto da (i) habilidade de colonização e (ii) N produzido por micróbio por hora, de pelo menos cerca de 2,5 x 10-8 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta por hora; e b) uma semente de planta não leguminosa, em que a referida pluralidade de diazotróficos modificados pode fornecer pelo menos uma libra de nitrogênio por acre por estação em um campo para uma planta não leguminosa produzida a partir da referida semente de planta.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade de NifA; ou diminui a expressão ou atividade de NtrB, GlnB, GlnD, GlnK ou DraT.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a pelo menos uma variação genética não é selecionada a partir de uma deleção completa ou parcial de nifL, uma deleção completa ou parcial de glnE e uma deleção completa ou parcial de amtB.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que pelo fato de que a pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade de NifA.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade de nitrogenase ou glutaminase; ou diminui a expressão ou atividade de glutamina sintetase.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que pelo fato de que as bactérias não intergenéricas compreendem uma sequência de ácido nucleico 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre SEQ ID NOs: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a pelo menos uma variação genética compreende material genético originário de pelo menos um organismo da mesma espécie.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a planta exposta aos diazotróficos modificados compreende uma quantidade aumentada de nitrogênio derivado da atmosfera em relação a uma planta exposta à mesma quantidade de diazotróficos não modificados da mesma espécie que os diazotróficos modificados.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapor compreender duas ou mais cepas microbianas.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que a referida pluralidade de cepas microbianas compreende pelo menos uma cepa microbiana selecionada do grupo que consiste em Kosakonia sacchari, Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola e Kosakonia pseudosacchari.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de que a referida cepa de Kosakonia sacchari compreende bactérias depositadas sob a Designação de Depósito de Patente No. 201701002, 201708004, 201708003 ou 201708002.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de que a referida cepa de Rahnella aquatilis compreende bactérias depositadas sob o N° de Acesso PTA-122293.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de que a referida cepa de Klebsiella variicola compreende bactérias depositadas sob a Designação de Depósito de Patente No. 201712001 ou 201712002.

14. Método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não-leguminosa, caracterizadopor compreender: aplicar à planta uma pluralidade de bactéria não- intergenérica que são diazotróficos modificados, a referida pluralidade compreendendo diazotróficos modificados que: possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta; e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora, e em que a pluralidade de diazotróficos modificados, in planta, produz 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta, e em que cada membro da pluralidade de diazotróficos modificados compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não- codificador, da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio que aumenta a expressão ou atividade de nifH, de modo que a bactéria não-intergenérica seja capaz de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica compreende pelo menos duas espécies diferentes de bactéria.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica compreende pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactéria.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica compreende bactéria selecionada de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica é endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica compreende bactéria selecionada de: uma bactéria depositada como PTA-122293, uma bactéria depositada como PTA-122294, uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

20. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a bactéria produz N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora quando na presença de nitrogênio exógeno.

21. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica, in planta, produz 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

22. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica, in planta, produz 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

23. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenérica, in planta, produz 15% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

24. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de bactéria não-intergenéricas, in planta, produz 20% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

25. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-7 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta por hora.

26. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o produto da (i) habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta e (ii) N fixado produzido por célula bacteriana por hora, é pelo menos cerca de 2,0 x 10-6 mmol de N por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta por hora.

27. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade de NifA; ou diminui a expressão ou atividade de NtrB, GlnB, GlnD, GlnK ou DraT.

28. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que pelo menos uma variação genética não é selecionada dentre uma deleção completa ou parcial de nifL, uma deleção completa ou parcial de glnE e uma deleção completa ou parcial de amtB.

29. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade de NifA.

30. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que pelo menos uma variação genética aumenta a expressão ou atividade da nitrogenase ou da glutaminase; ou diminui a expressão ou atividade da glutamina sintetase.

31. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que as bactérias não intergenéricas compreendem uma sequência de ácido nucleico 16S que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre SEQ ID NOs: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283.

32. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pelo menos uma variação genética introduzida compreende material genético originário de pelo menos um organismo da mesma espécie.

33. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a planta exposta aos diazotróficos modificados compreende uma quantidade aumentada de nitrogênio derivado da atmosfera em relação a uma planta exposta à mesma quantidade de diazotróficos não modificados da mesma espécie que os diazotróficos modificados.