BR112012030522A2

BR112012030522A2 - Método para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada, método para preparo de uma célula transformada, ácido nucleico, recombinase configurada codificada pelo ácido nucleico, célula transformada ecomposição farmacêutica"

Info

Publication number: BR112012030522A2
Application number: BR112012030522-0A
Authority: BR
Inventors: Joachim Hauber; Jan Chemnitz; Frank Buchholz; Janet Chusainow
Original assignee: Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut Fur Experimentelle Virologie - Stiftung Burgerlichen Rechts; Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V.
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2020-10-13
Also published as: CN103154256A; EP2576798A2; ZA201208908B; RU2012157303A; US20170130212A1; US20150104433A1; US20130164271A1; SG186695A1; CA2801913A1; WO2011147590A3; AU2011257555B2; US10316301B2; CN106065405B; ES2577929T3; CN106065405A; AU2011257555A1; WO2011147590A2; CA2801913C; AU2011257555A8; HK1179302A1

Abstract

MÉTODO PARA PREPARO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA UMA RECOMBINASE CONFIGURADA MÉTODO PARA PREPARO DE UMA CÉLULA TRANSFORMADA, ÁCIDO NUCLEICO, RECOMBINASE CONFIGURADA CODIFICADA PELO ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA TRANSFORMADA E COMPOSIÇÃO FARMACÉUTICA. A presente invenção refere-se a um método para preparo de uma vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo assimétricas dentro da repetição terminal longa (LRT) do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais inseridas no genoma de uma célula hospedeira, bem como ao vetor de expressão obtido, células transfectadas com este, recombinase expressa e composições farmacêuticas que compreendem o vetor de expressão, células e/ou recombinase. As composições farmacêuticas são úteis, por exemplo, no tratamento e/ou prevenção de infecção retroviral. Em particular, sequências alvo assimétricas presentes em uma pluralidade de cepas de HIV são descritas, bem como recombinases configuradas capazes de combinação destas sequências (Tre 3.0 e 4.0) e vetores de expressão que codificam as mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO . PARA PREPARO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA UMA RECOMBINASE CONFIGURADA, MÉTODO PARA PREPARO DE UMA CÉLULA TRANSFORMADA, ÁCIDO NUCLEICO, RECOMBINASE CON- —FIGURADA CODIFICADA PELO ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA TRANS- FORMADA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", A presente invenção refere-se a um método para preparo de um vetor de expressão que codifica para uma recombinase configurada, recom- binase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo as- simétricas dentro da repetição terminal longa (Long Terminal Repeat - LTR) de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais a qual pode ser inserida no genoma de um célula hospedeira, bem como ao vetor de expres- ' são obtido, células transfectadas com os mesmos, recombinase expressa e " composições farmacêuticas que compreendem o vetor de expressão, células e/ou recombinase. Composições farmacêuticas são úteis, por exemplo, no tratamento e/ou prevenção de infecção retroviral. Em particular, sequências alvo assimétricas presentes em uma pluralidade de cepas de HIY-1 são di- vulgadas, bem como recombinases configuradas capazes de combinação destas sequências (Tre 3.0 e 4.0) e vetores de expressão que codificam as mesmas.

ANTECEDENTE TÉCNICO Infecções retrovirais tal como, por exemplo, infecções pelo vírus da imunodeficiência humana (Human Immuno Deficiency - HIV), ainda são uma das doenças humanas mais importantes e mais disseminadas.

Uma abordagem para o tratamento de retrovírus, por exemplo, HIV, é objetivar o pró-virus inserido no genoma da célula hospedeira. Exci- são do DNA pró-viral do genoma do hospedeiro, por exemplo, impediria ain- da mais a replicação do HIV e difere das metodologias atuais pelo fato de que ela tem o potencial de erradicar mesmo o vírus dormente no genoma do hospedeiro.

Uma classe de proteínas que foram consideradas para uso nes- ta abordagem alternativa são recombinases sítio específicas (FLORES et al.,

i 1997). Recombinases sítio específicas mediam um grande número de fun- - ções na natureza, de rearranjo gênico à segregação de genoma tal como, por exemplo, excisão, inversão ou integração das unidades de DNA defini- das (revisto em Stark et a/., 1992). Uma das recombinases mais simples e melhor compreendida é a recombinase Cre do bacteriófago Pl que decompõe em dímeros no geno- ma em monômeros por meio de recombinação entre dois sítios de DNA fita dupla idênticos de uma sequência particular (HOESS & ABREMSKI, 1985). A recombinase Cre tem encontrado ampla utilização em genética de rato (NAGY, 2000). Cre é uma proteína de 38 kDa que foi nomeada em virtude de sua função, uma vez que ela causa recombinação (STERNBERG & HA- MILTON, 1981). Pré-requisito para esta recombinação é o alinhamento dos ' dois sítios de recombinação reconhecidas pela Cre na orientação antiparale- . la os quais são, então, ligados por quatro subunidades Cre idênticas que se juntam para formar um anel no qual cada subunidade contata duas subuni- dades adjacentes e meio-sítios de um sítio de recombinação (HOESS & ABREMSKI, 1985). O sítio de recombinação reconhecido pela Cre é uma sequência de DNA fita dupla de 34 bp conhecida como /oxP (de locus of crossing over (x) -, P1; STERNBERG & HAMILTON, 1981), a qual é palin- drômica, com exceção de seus oito pares de bases mais internos (referidos como o espaçador), os quais conferem capacidade de direcionamento ao sítio.

Alguns sistemas de recombinação sítio específicos, incluindo o sistema Cre/loxP, funcionam sem proteínas acessórias ou co-fatores e fun- cionam sob uma grande variedade de condições celulares.

No entanto, uma vez que recombinases sítio específicas funcionam através de interações es- pecíficas das subunidades enzimáticas de recombinase com suas sequên- cias de DNA alvo cognatas, a utilização destas enzimas é limitada pelo re- quisito de que as regiões de DNA alvo devam conter sítios alvo apropriada- mente posicionados (LEWANDOSKI, 2001). Até o momento, não foi identifi- cada nenhuma recombinase do tipo silvestre que reconhece sequências re- trovirais nativas como suas sequências de DNA alvo.

i Extensas análises mutacionais e estruturais de recombinases sí- - tio específicas foram realizadas em anos recentes para alterar suas proprie- dades e obter uma melhor compreensão dos mecanismos complicados des- tas enzimas (para uma revisão vide VAN DUYNE, 2001; e COATES et al, 2005). Uma série de estudos se focalizaram na recombinase Cre para explo- rar sua capacidade de evolução. Vários estudos demonstraram que a espe- cificidade alvo da Cre poderia ser alterada quando alguns nucleotídeos em seu sítio de reconhecimento /oxP eram alterados (BUCHHOLZ & STEWART, 2001; SANTORO & SCHULTZ, 2002; RUFER & SAUER, 2002). Outros es- tudos abordam à engenharia de sítios alvo loxP com mutação que contêm sequências da LTR do HIV-1 para desenvolver possíveis sítios alvo para a utilização de Cre como estratégia antiviral (LEE & PARK, 1998; LEE et al., 2000).

+ O método de evolução dirigida é um método poderoso para se- lecionar enzimas com especificidades alteradas (revisto em YUAN et al, 2005; e JOHANNES & ZHAO, 2006). No início, este método foi utilizado para isolar enzimas aprimoradas com base no RNA mediante seleção de molécu- las de RNA com sítios de substrato alterados. O uso de métodos baseados em PCR permite a triagem de bibliotecas muito grandes e a recuperação de regiões de codificação com sucesso a partir de um grupo de candidatos. Na evolução dirigida de proteínas, ao contrário, a triagem e recuperação de mu- tantes aprimorados, os quais são identificados por alterações nas proprieda- des da proteina, requerem um método para recuperação da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. O elo entre a proteina e sua sequên- cia de codificação tem sido, muitas vezes, mantido por meio de comparti- mentalização. Consequentemente, triagem de biblioteca em evolução dirigi- da de proteina tem estado limitada a abordagens "um-por-um" que mantêm os compartimentos e as vantagens associadas à triagem de grupos de can- didatos não têm estado disponíveis. Esta limitação foi superada pelo desenvolvimento de métodos que permitem o cruzamento de proteínas com seus respectivos RNAs men- sageiros (mMRNA) utilizando fusões de MRNA-proteína e visualização ribos-

] sômica. Triagens funcionais para propriedades aprimoradas de proteina fo- z ram, assim, acopladas à recuperação direta de moléculas de codificação correspondentes e grandes grupos sofreram triagem in vitro (vide, por e- xemplo, BUCHHOLZ et a/., 1998). Um aprimoramento adicional de evolução dirigidade proteína foi obtido através da assim denominada evolução de pro- teina subsirato-ligada (SLIPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001), em que o substrato da recombinase foi colocado na mesma molécula de DNA que a região de codificação da proteína. Desta maneira, quando a recombinase foi expressa dentro de um compartimento, sua ação alterou o substrato de DNA próximo de sua própria região de codificação. Consequentemente, uma bi- blioteca pôde sofrer triagem como um grupo por meio de PCR para amplifi- car apenas regiões de codificação candidatas que estavam próximas de um ' substrato alterado. Isto permite a triagem de grandes bibliotecas convenien- « temente para recuperação rápida com sucesso de regiões de codificação. Este método foi aplicado para alteração da especificidade de DNA da re- combinase Cre e adaptação da mesma a um novo sítio de reconhecimento alvo (BUCHHOLZ & STEWART, 2001).

Tendo em vista o potencial de recombinases sítio específicas e a necessidade de descobrir uma terapia para AIDS que erradica o pró-virus de HIV do genoma da célula hospedeira, o documento WO 2008/083931 di- vulgou a geração de uma recombinase configurada (TRE), que é capaz de recombinação de sítios alvo assimétricos dentro da LTR do DNA pró-viral de um retrovírus inserido no genoma de uma célula hospedeira, assim, exci- sando o pró-vírus do genoma da célula hospedeira. A recombinase manipu- lada divulgada nos exemplos, Tre, reconhece um sítios semelhante ao loxP específico presente em uma cepa de HIV-1 em particular. O documento WO 2008/083931 considerou que, em devido da alta variabilidade de sequência de retrovírus, em particular HIV, para o tratamento de um paciente com uma cepa de HIV diferente, uma recombinase configurada diferente teria de ser adaptada ou uma coleção de recombinases preparada contendo recombina- ses configuradas específicas para uma variedade ou sequências alvo. Em vista disso, os inventores agora abordaram o problema de proporcionar uma recombinase configurada capaz de excisão de uma plura- í lidade de retrovírus, por exemplo, cepas de HIV. Assim, a recombinase ge- rada pode ser empregada para uma pluralidade de infecções pelo HIV, sem a geração de uma nova recombinase para cada cepa. Este problema é re- —solvido pela presente invenção.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Os presentes inventores proporcionam, pela primeira vez, um método para geração de um vetor de expressão que codífica uma recombi- nase configurada capaz de recombinação de sequências alvo assimétricas dentrodaLTR do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais de uma espécie inserida no genoma de uma célula hospedeira. Recombinases foram configuradas para reconhecer sítios alvo assimétricos diferentes de ' seus sítios alvo simétricos nativos dividindo-se o substrato em uma série de « novos subconjuntos com diferenças mínimas do alvo original e configurando, passo a passo, recombinases para reconhecer esses subconjuntos (docu- mento WO 2008/083931). Uma abordagem combinatorial permite a seleção de moléculas funcionais que reconhecem o sítio alvo assimétrico dentro de uma determinada sequência. Assim, utilizando a abordagem de percorrer através de intermediários de substrato durante evolução molecular dirigida, é possível produzir enzimas com novas especificidades por alvos assimétricos remotos. A presente invenção emprega esta abordagem ao problema de proporcionar recombinases configuradas capazes de recombinar uma plura- lidade de cepas retrovirais, de preferência cepas de uma espécie. Eles des- cobriram que, apesar da alta variabilidade de sequência de retrovírus, é pos- sível identificar sequências alvo assimétricas presentes em uma alta propor- ção dos virus de um subtipo em particular.

A invenção proporciona um método para preparo de um vetor de expressão que codifica para uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo assimétri- cas dentrodaLTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais a qual pode ser inserida no genoma de uma célula hospedeira compreen- dendo as etapas de identificação, na sequência da LTR de DNA pró-viral, de uma pluralidade de sequências de cepas retrovirais com uma homologia de - pelo menos 30% pela sequência do meio-sítio à esquerda e a sequência do meio-sítio à direita de pelo menos um sítio alvo conhecido da recombinase, em que as sequências homólogas são separadas por um espaçador de 5-12 nucleotídeos e em que a sequência alvo assimétrica é encontrada em uma pluralidade de cepas retrovirais; e geração, repetindo as etapas de: i) evolução molecular dirigida sobre pelo menos uma recombina- se que reconhece o sítio alvo homólogo conhecido utilizando, como substra- to, sequências alvo modificadas com base na sequência da sequência alvo assimétrica, mas modificadas para conter apenas um número limitado de variantes da sequência alvo conhecida; em que, em cada ciclo, a sequência alvo pode variar, com relação à sequência alvo sobre a qual se sabe que a ' recombinase atua, quanto a um, dois ou três nucleotídeos; e « ii) embaralhamento das bibliotecas de recombinase para obter bibliotecas de recombinase capazes de recombinar sequências alvo mais homólogas à sequência alvo assimétrica, até que seja obtida pelo menos uma recombinase que é ativa na sequência alvo assimétrica dentro da LTR do DNA retroviral; iii) isolamento do ácido nucleico da pelo menos uma recombina- seobtida;e iv) clonagem do ácido nucleico que codifica a recombinase em um vetor de expressão adequado.

O método de geração de uma recombinase configurada divulga- do no documento WO 2008/083931 pode ser utilizado para a geração de uma recombinase configurada capaz de recombinação de uma sequência alvo assimétrica.

A invenção também proporciona um método para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo assimétri- cas dentrodaLTR do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais que pode ser inserida no genoma de uma célula hospedeira, compreenden- do as etapa de:

(a) identificação, na sequência de LTR do DNA pró-viral, de uma - pluralidade de sequências de cepas retrovirais com uma homologia de pelo menos 30% com a sequência do meio-sítio à esquerda e a sequência do meio-sítio à direita de pelo menos um sítio alvo conhecido da recombinase, emqueas sequências homólogas são separadas por um espaçador de 5-12 nucleotídeos e em que a sequência alvo assimétrica é encontrada em uma pluralidade de cepas retrovirais; (b) identificação de duas sequências, em que a primeira sequên- cia corresponde à sequência alvo assimétrica da etapa (a) homóloga à se- quênciado meio-sítio à esquerda do referido sítio alvo conhecido e é referida como "sequência de meio-sitio 1" e em que a segunda sequência corres- ponde à sequência alvo assimétrica da etapa (a) homóloga à sequência do ' meio-sítio à direita e é referida como "sequência de meio-sítio 2"; . (c) determinação de nucleotídeos, dentro das sequências da e- tapa(b), que divergem das sequências de meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita do sítio alvo homólogo conhecido da etapa (a); (d) geração de um primeiro subconjunto de dois ácidos nucleicos alvo compreendendo sequências alvo, em que a primeira sequência alvo é designada subsítio 1 e compreende, adjacentes uns aos outros e na ordem 5 'para3',a sequência de meio-sítio 1 da etapa (b), a sequência espaçadora da sequência alvo assimétrica e uma repetição invertida de sequência de meio-sítio 1 e em que a segunda sequência alvo é designada subsítio 2 e compreende, adjacentes uns dos outros e na ordem 5 'para 3', uma repeti- ção invertida de sequência de meio-sítio 2, a sequência espaçadora da se- —quência alvo assimétrica e a sequência de meio-síitio 2 da etapa (b);

(e) geração de um segundo subconjunto de ácidos nucleicos alvo que compreende as sequências alvo modificadas com base nas se- quências alvo no primeiro subconjunto da etapa (d),

em que, nas sequências baseadas no subsítio 1, na sequência de meio-sítio à esquerda, uma porção dos nucleotídeos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspondente do pelo menos um sítio alvo conhecido da etapa (a) é substituída pelos nucleotídeos nativos encon-

trados no referido sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de mei- - o-sítio contenha um, dois ou três nucleotídeos que divergem do referido sítio alvo conhecido, em que o meio-síitio à direita da referida sequência alvo mo- dificada é formado por uma repetição invertida da referida sequência de meio-sítio à esquerda modificada, a qual é separada da referida sequência de meio-sítio à esquerda pela sequência espaçadora da sequência alvo as- simétrica, e em que, em sequências baseadas no subsítio 2, na sequência de meio-sitio à direita, uma porção dos nucleotídeos que divergem da se- quênciade meio-sítio homóloga correspondente do pelo menos um sítio alvo conhecido da etapa (a) é substituída pelos nucleotídeos nativos encontrados no referido sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de meio-sítio contenha um, dois ou três nucleotídeos que divergem do referido sítio alvo . conhecido, em que o meio-sitio à esquerda da referida sequência alvo modi- ficadaé formado por uma repetição invertida da referida sequência de meio- sitio à direita modificada, a qual é separada da referida sequência de meio- sítio à direita pela sequência espaçadora da sequência alvo assimétrica, de modo que, em todas as sequências de meio-sítio modificadas que se originam de uma sequência alvo do primeiro subconjunto da etapa (d)tomadas juntas, todos os nucleotídeos divergentes podem ser encontra- dos, enquanto que nenhuma das referidas sequências de meio-sítio modifi- cadas isoladamente compreende todos os nucleotídeos divergentes; (f) aplicação, separadamente, de evolução molecular dirigida so- bre pelo menos uma recombinase que reconhece um sítio alvo conhecido homólogo de acordo com a etapa (a) utilizando cada ácido nucleico do se- gundo subconjunto obtido na etapa (e) como um substrato; (g) embaralhamento das bibliotecas de recombinase evoluídas na etapa (f), em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram so- bre sequências com base no subsítio 1 são combinadas e embaralhadas e em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram sobre sequên- cias com base no subsítio 2 são combinadas e embaralhadas; (h) aplicação de evolução molecular dirigida sobre as bibliotecas i embaralhadas obtidas na etapa (g) utilizando cada ácido nucleico do sub- . conjunto de acordo com a etapa (d) como um substrato; (i) embaralhamento das bibliotecas de recombinase evoluídas na etapa (h); ()) aplicação de evolução molecular dirigida sobre a biblioteca embaralhada obtida na etapa (g) utilizando um ácido nucleico que compre- ende a sequência alvo assimétrica da etapa (a) como um substrato, até que seja obtida pelo menos uma recombinase que é ativa sobre a sequência alvo assimétrica dentro da LTR do DNA retroviral da etapa (a); (k) isolamento do ácido nucleico da pelo menos uma recombina- se obtida na etapa (j) da biblioteca; e (1) clonagem do ácido nucleico obtido na etapa (k) em um vetor de expressão adequado.

. Na etapa (a) do método da presente invenção, a sequência da LTRdo DNA pró-viral pode ser determinada tal como, por exemplo, por meio de sequenciamento de DNA utilizando inibidores de término de cadeia (SANGER et al., 1977). No entanto, se a sequência da LTR do DNA retrovi- ral inserida no genoma do hospedeiro já foi determinada, a sequência pode ser determinada por meio de referência a um banco de dados. Com base em informação da sequência computadorizada, análise de informação de se- quência é realizada para identificar, na mesma, sequências com homologia de pelo menos 30% com as sequências de meio-sítio à esquerda e meio- sítio à direita de sítios alvo conhecidos, respectivamente, de recombinases conhecidas que são separadas por um espaçador adequado de 5-12 nucleo- tídeos, em que a sequência alvo assimétrica é encontrada em uma plurali- dade de cepas retrovirais. De preferência, a homologia com as sequências de sequência de meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita de sítios alvo conhecidos é de pelo menos 40% ou pelo menos 50%. De preferência, estas cepas retrovirais são de uma espécie ou um subtipo da mesma. De prefe- rência, uma pluralidade de cepas compreende mais de 10 cepas, mais prefe- rivelmente mais de 100 cepas, mais de 130 cepas, mais de 200 cepas ou mais de 300 cepas, por exemplo, cepas de HIV, As cepas podem ser de um i subtipo do vírus, por exemplo, HIV-1, HIV-1 subtipo A e B ou HIV-1 subtipo é B. Assim, a recombinase obtida ou vetor de expressão que codifica a mesma pode ser utilizado para o tratamento da infecção com uma pluralidade de cepas, por exemplo, mais de 50%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90% outodasas cepas conhecidas de um retrovírus ou subtipo do mesmo. O termo "recombinase", conforme aqui utilizado, refere-se a uma proteína envolvida em recombinação. Como tal, recombinases reconhecem e ligam duas sequências de DNA específicas denominadas "sítios de re- combinação” ou "sítios alvo" e mediam a recombinação entre estes dois sí- tios alvo. Assim sendo, o termo "recombinase" se destina a referir-se a qual- quer componente de proteína de qualquer sistema recombinante que media rearranjos de DNA em um locus de DNA específico. Recombinases que o- Ú correm naturalmente reconhecem sítios alvo simétricos que consistem em . duas sequências idênticas denominadas "meio-sítio" de aproximadamente 9- pb que formam uma repetição invertida, em que as sequências de meio- sítio são separadas por uma sequência espaçadora de 5-12 pb. Recombina- ses da família integrase de tirosina são caracterizadas por terem uma tirosi- na como o nucleófilo no sítio ativo que é utilizado para clivagem de DNA, enquanto que recombinases da família integrase de serina utilizam uma se- 20 rinaem vez de uma tirosina.

Em uma modalidade da presente invenção, a pelo menos uma recombinase conhecida cuja sequência alvo é usada na etapa (a) e sobre a qual evolução molecular dirigida é aplicada nas etapas (h) e ()) pertence à família de integrases de serina. Recombinases preferidas que pertencem à família de integrases de serina são selecionadas do grupo que consiste em integrase phicC31 (COMBES et a/., 2002), qualquer componente de sistemas de recombinação Gin ou Hin, resolvase TN3 (KRASNOW & COZZARELLI, 1983) ou qualquer outro membro das grandes recombinases de serina, Rag1, RAG2 ou qualquer outro componente do sistema de recombinação VDJ ou variantesdosmesmos. Em outra modalidade, a referida recombinase pertence à família de integrases de tirosina. Recombinases preferidas que pertencem à família | i de integrases de tirosina são selecionadas do grupo que consiste em Cre do . Fago P1 (ABREMSKI et a/., 1983, 1984), recombinase FLP de levedura (VOLKERT & BROACH, 1986), Dre de fago D6 (SAUER & MCDERMOTT, 2004), recombinase R do plasmídeo pSR1 de Zygosaccharomyces rouxii, recombinase A do plasmídeo pKD1 de Kluveromyces drosophilarium, uma recombinase do plasmídeo pKW1 de Kluveromyces waltii, Thnp1 do transpo- son Tn4430 de Bacilo, qualquer componente do sistema de recombinação Int ou variantes das mesmas. De preferência, a referida recombinase é re- combinase Cre ou uma variante da mesma. Por exemplo, uma recombinase configurada divulgada no documento WO 2008/083931 (Tre) pode ser usa- da.

O termo variante, neste contexto, refere-se à proteínas as quais Ú são derivadas das proteínas acima por meio de substituição, deleção e/ou - adição de aminoácidos e as quais retêm uma parte ou toda a função ineren- tena proteina da qual elas são derivadas.

Em uma modalidade preferida, a recombinase conhecida é uma recombinase quimérica obtida, por exemplo, por meio de "embaralhamento de família", conforme descrito por CRAMERI et al. (1998). Pré-requisito para o emprego de embaralhamento de família é uma homologia significativa en- treasrecombinases utilizadas para geração das recombinases quiméricas, Um exemplo de uma recombinase quimérica que pode ser utilizada na pre- sente invenção é uma recombinase quimérica que consiste em sequências de recombinase Cre e de recombinase Dre, respectivamente.

Em uma modalidade mais preferida, a recombinase é a recom- —binase Cre que reconhece um sítio alvo simétrico de 34 bp conhecido como loxP (SEQ ID NO: 3). O sítio /oxP (e também outros sítios de recombinação de recombinases do tipo silvestre) é palindrômico, com duas repetições de 13 bp separadas por oito pares de bases mais internos, os quais represen- tam o assim denominado espaçador, o qual confere capacidade de direcio- namento ao sítio. Recombinação ocorre por meio de clivagem dentro da se- quência espaçadora. Dependendo da localização relativa e orientação dos dois sítios loxP participantes, a Cre catalisa a integração, excisão ou rearran- nn | jo de DNA (HOESS & ABREMSKI, 1985).

. Uma recombinase é útil Zre (SEQ ID NO: 26) isolada de Salmo- nella enterica ou variantes, fragmentos e homólogos da mesma, por exem- plo, tendo uma homologia de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de&80%, pelomenos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% com a se- quência do tipo selvagem e tendo função de recombinase.Recombinases Zre recombinam DNA em sítios zox (figura 1). Elas podem ser utilizadas pa- ra iniciar o método da invenção, quer isoladamente ou no contexto de uma biblioteca.

Em uma modalidade, uma biblioteca de recombinase é utilizada como um ponto de partida para evolução molecular, por exemplo, uma bi- blioteca de recombinase que compreende diferentes recombinases do tipo ' silvestre e/ou adaptadas/embaralhadas, por exemplo, conforme descrito a- - baixo ou no Exemplo 2. Tal biblioteca é, de preferência, usada como um ponto de partida utilizado para a geração das recombinases configuradas capazes de reconhecer SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

A recombinase configurada é capaz de recombinação de se- quências alvo assimétricas dentro da LTR do DNA pró-viral de uma plurali- dade de cepas retrovirais. O DNA pró-viral objetivado pela recombinase po- de ser inserido no genoma de uma célula hospedeira. Alternativamente, a recombinase configurada da invenção pode recombinar sequências alvo as- simétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas re- trovirais as quais (ainda) não foram integradas no genoma de uma célula hospedeira, isto é, as quais estão presentes como um complexo pré- integração (Pre-Integration Complex - PIC) não integrado. Assim, HIV o qual ainda não foi integrado no genoma da célula hospedeira, bem como HIV o qual já foi integrado, podem ser inativados pela recombinase configurada da invenção.

Deverá ser notado que, na presente invenção e também na téc- nica, os termos "sequência alvo", "sítio alvo" e "sítio de recombinação" são utilizados como sinônimos.

Contrário às recombinases que ocorrem naturalmente que reco-

nhecem um sítio alvo simétrico, o método da presente invenção proporciona - recombinases configuradas que reconhecem sítios alvo os quais não consis- tem em sequências palindrômicas separadas por um espaçador. Antes, nos sítios alvo assimétricos, as sequências não formam uma repetição simétrica invertida. Assim sendo, uma recombinase configurada capaz de reconhecer um sítio alvo assimétrico deve reconhecer e recombinar sítios alvo que con- sistem em meio-sítios de diferentes sequências. Dentro de um sítio alvo assimétrico, as sequências referidas co- mo "meio-sítio à esquerda" e "meio-sítio à direita", respectivamente, são de- finidaspor sua homologia com o meio-síitio à esquerda e à direita de um sítio alvo conhecido. A sequência localizada entre as sequências homólogas ao meio-sítio à esquerda e à direita de um sítio alvo conhecido é referida como i espaçadora.

. No entanto, se as sequências são encontradas na LTR que têm —homologia apenas pela sequência de meio-sítio à esquerda ou à direita de um sítio alvo conhecido, estas sequências poderiam, contudo, ser utilizadas na prática da presente invenção. O tamanho do sítio alvo que pertence à recombinase, cuja sequência alvo nativa mostra homologia com sequências dentro da LTR, é conhecido por aqueles versados. Por exemplo, se for en- contrada homologia na sequência de LTR com uma sequência alvo reco- nhecida pela recombinase Cre, um sítio alvo assimétrico a ser reconhecido pela recombinase Cre deverá consistir em 34 nucleotídeos com duas se- quências de meio-sitio de 13 nucleotídeos cada separadas por um espaça- dor de 8 nucleotídeos. Consequentemente, a sequência homóloga dentro da LTRé definida como o meio-sítio à esquerda ou à direita ou o espaçador do sítio alvo assimétrico, dependendo da homologia com a sequência do sítio alvo conhecido. Assim, sequências com homologia ao meio-sitio à esquerda de uma sequência alvo conhecida são definidos como meio-sítio à esquerda, sequências com homologia ao meio-sítio à direita de uma sequência alvo conhecida são definidos como meio-sítio à direita. A partir desta definição, as outras partes dos sítios alvo assimétricos são definidas considerando-se a estrutura do sítio alvo conhecido. Assim, tendo definido, por exemplo, uma sequência de meio-sitio à direita dentro da LTR sobre a homologia por um - sítio /oxP (reconhecido pela recombinase Cre), as outras sequências que correspondem ao espaçador e ao meio-sítio à esquerda da sequência alvo assimétrica podem ser facilmente definidas. A sequência espaçadora é, por exemplo, definida contando-se 8 nucleotídeos a montante da extremidade 5' da sequência definida como a sequência de meio-sítio à direita, enquanto que a sequência de meio-sítio à esquerda é similarmente definida contando- se 13 nucleotídeos a montante da extremidade 5' da sequência espaçadora previamente definida.

Homologia, neste contexto, bem como em todo o pedido, signifi- ca identidade de sequência. Uma comparação preferida para fins de homo- logia é comparar pelo menos duas sequências utilizando técnicas padrões conhecidas no campo incluindo, porém sem limitações, o algoritmo de homo- . logia local de SMITH & WATERMAN (1981), o algoritmo de alinhamento por homologia de NEEDLEMAN & WUNSCH (1970) ou o método de busca por similaridade de PEARSON & LIPMAN (1988). Para fins do presente pedido, homologia de sequência é, de preferência, determinada usando o programa de computador ClustalW disponível do European Bioinformatics Institute (E- BI), a menos que indicado de outra forma.

Tendo em vista o requisito de dois sítios alvo idênticos que de- vem estar presentes no genoma do pró-virus para permitir que a recombina- se venha a excisar a sequência entre estes dois sítios alvo, as sequências de DNA pró-viral sofrem varredura na etapa (a) do método da presente in- venção que estão presentes pelo menos duas vezes no genoma. Estas se- —quências são, por exemplo, as sequências de LTR do DNA pró-viral. Conse- quentemente, a sequência da LTR, de preferência, sofre varredura, uma vez que a 5-LTR e a 3-LTR do DNA pró-viral são idênticas. Um sítios alvo assi- métrico presente na 5-LTR também está presente na 3-LTR e, portanto, permite a excisão do DNA pró-viral localizado entre as LTRs.

Fora das sequências identificadas dentro da sequência de LTR tendo homologia suficiente com sítios alvo conhecidos, de preferência, são escolhidas sequências que têm a maior homologia com a sequência do sítio alvo de recombinases conhecidas. No entanto, também é possível selecio- - nar outras sequências que não aquelas tendo maior homologia, por exem- plo, aquelas que estão presentes no maior número de cepas retrovirais ou nas cepas retrovirais de interesse, por exemplo, se um paciente está infec- tadocom uma cepa em particular.

Deve ser notado que o potencial do método da presente inven- ção permite ainda configuração de recombinases que reconhecem sítios al- vo assimétricos com menos de 30% de homologia a sítios alvo conhecidos, por exemplo, pelo menos 11% ou pelo menos 20% de homologia. No entan- to, para assegurar a presença de atividade residual de recombinação para o respectivo sítio alvo assimétrico, de preferência, ele sofre varredura com re- lação a sequências tendo uma homologia de pelo menos 30% por sequên- Ú cias de meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita de sítios alvo conhecidos - de recombinases conhecidas. Em outras modalidades preferidas, sequên- cias alvo assimétricas tendo uma homologia de pelo menos 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73,74, 75,76, 77, 78, 79, 80%, mais preferivelmente 85%, particularmente de prefe- rência 90% e, ainda mais preferivelmente, 95% pelas sequências de meio- sítio à esquerda e meio-sítio à direita de sítios alvo conhecidos de recombi- nases conhecidas são selecionadas.

Em uma modalidade da presente invenção, a sequência selecio- nada dentro da LTR tem homologia pelos sítios alvo loxP simétricos reco- nhecidos pela recombinase Cre sítio específica.

Em uma modalidade, uma biblioteca de recombinase é utilizada como um ponto de partida para evolução molecular, por exemplo, uma bi- blioteca de recombinase que compreende diferentes recombinases do tipo silvestre e/ou adaptadas/embaralhadas, tal como a biblioteca descrita no Exemplo 2. Uma biblioteca exemplificativa compreende recombinases Cre e recombinases derivadas da mesma. Ela pode também compreender recom- binases Tre, Dre, recombinases de Salmonella e Shewanella e/ou recombi- nases derivadas das mesmas. A biblioteca pode incluir, por exemplo, re- | i combinase Cre, Dre, Dre "Cre-ed" (SEQ ID NO: 24), recombinase de She- - wanella (Shew), Shew "Cre-ed" (SEQ ID NO: 25) e/ou Zre (SEQ ID NO: 26). Uma biblioteca é descrita na figura 3A. Tre é uma recombinase configurada, conforme divulgado pelo documento WO 2008/083931, a qual é também aindareferida como Tre1.0.

Em uma modalidade, todas as recombinases na biblioteca reco- nhecem uma sequência alvo com o mesmo comprimento do espaçador. O comprimento total das sequências de meio-sítio 1 e 2, incluindo espaçador é, de preferência, de 34 nucleotídeos.

Se a pelo menos uma recombinase é uma biblioteca de recom- binase, a homologia é homologia com o grupo de sítios alvo de recombina- se conhecidos (isto é, homologia em uma dada posição de pelo menos uma das sequências alvo é definida como homologia). Consequentemente, na ” etapa (c), apenas aqueles nucleotídeos os quais não correspondem a um —nucleotídeo em pelo menos uma das sequências alvo conhecidas são defi- nidos como nucleotídeos divergentes. No caso de uma biblioteca de recom- binase, um "nucleotídeo nativo" na etapa (e) pode ser um nucleotídeo pre- sente naquela posição em qualquer uma das sequências alvo conhecidas, de preferência, é um nucleotídeo presente naquela posição em várias ou na —maioriadas sequências alvo conhecidas.

Para identificar sequências alvo presentes em uma pluralidade de cepas retrovirais, os sítios de reconhecimento conhecidos de recombina- ses, os quais foram descritos na literatura, podem ser usados como uma consulta para uma pesquisa por sequências alvo assimétricas conservadas contra um trecho genômico. Dada a natureza repetitiva de regiões, a utiliza- ção de ferramentas de pesquisa por similaridade de sequência padrões, con- tudo, é impedida. SARKAR et a/., 2007, usaram o BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) para encontrar um sítio de ligação semelhante a lox através de cepas de HIV. A pesquisa pelo BLAST pelo sítio semelhante a lox, quando realizada através de sequências de LTR de HIV-1, resultou na descoberta de apenas um sítio presente em uma única cepa. Se recombinases, no entanto, têm de ser utilizadas como agentes terapêuticos contra genomas retrovirais,

é crítico manipular as recombinases para objetivar sítios de reconhecimento - presentes através de tantas cepas do retrovírus quanto possível.

Como BLAST não funciona bem com tais sequências curtas re- dundantes, foi considerada a utilização do HMMER (EDDY et al., 1998), Re- peatMasker ou o programa Palindrome do conjunto de pacotes Emboss. O HMMER foi desenvolvido para encontrar homólogos remotos com base em um modelo probabilístico de um padrão de sequência que está sendo procu- rado, o qual não é a natureza da pesquisa que se pretende realizar. O HM- MER poderia ser forçado a se dirigir a esta questão, mas a quantidade de pré- e pós-processamento de dados e parâmetros o tornaria altamente pro- penso a erros e ineficiente. O RepeatMasker pesquisa apenas repetições e regiões de baixa complexidade que já são bem caracterizadas o que, mais uma vez, não é a natureza desta pesquisa. O programa Palindrome no Em- - boss se aproxima mais ao abordar o problema de pesquisa, mas não permi- te quea busca seja definida porém, antes, resulta em uma lista de possibili- dades de sítios semelhantes ao lox. Estes, então, teriam de ser correspondi- dos à assinatura do sítio lox de interesse. Evidentemente, tal estratégia ape- nas tornaria a busca complicada e problemática, Para lidar com a falta de um programa e um método para encontrar sítios semelhantes ao lox, um programa capaz de pesquisar sítios semelhantes ao lox degenerados em sequências genômicas teve de ser desenvolvido.

Uma sequência alvo assimétrica encontrada em uma pluralidade de cepas retrovirais pode ser identificada de acordo com este programa, uti- lizando um algoritmo com base em uma matriz de posição ponderada para asregiões de flanqueamento com base em um sítio de reconhecimento co- nhecido de uma recombinase. De preferência, para tornar a busca computa- cionalmente eficiente, operações binárias são utilizadas sobre as sequências após elas terem sido transformadas em trechos de bits.

Em uma modalidade preferida da invenção, o retrovirus é HIV, em particular HIV1. Para HIV-1, sequências alvo assimétricas adequadas foram determinadas, tendo a sequência apresentada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, a seguir.

O — |

As sequências de meio-siítio à esquerda e meio-sitio à direita es- . tão sublinhadas e o espaçador está impresso em negrito: SEQ ID NO: 1º AARCCCACTGCTTAAGCCTCAATAAMAGCTTGCCT SEQIDNO:2 CTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGAT SEQ ID NO: 1 é idêntica em 92% das cepas de subtipo B de HIV-1 pesquisadas (348/379) e em 80% das cepas de subtipo A de HIV-1 pesquisadas (32/40). SEQ ID NO: 2 é idêntica em 76% das cepas de subtipo B pesquisadas (288/379). 82% das cepas de subtipo C também compreen- dem esta sequência.

SEQ ID NO: 2 não está presente em nenhuma das ce- pasdo subtipo A pesquisadas, Conforme mostrado na figura 1, SEQ ID NO: 1 tem uma homo- logia de 54% com um grupo de sítios alvo de recombinase conhecidos e SEQ ID NO: 2 tem uma homologia de 42% com o grupo destas sequências . (com relação aos meio-sítios à esquerda e à direita, respectivamente). Ho- mologia a sitios alvo individuais conhecidos é mais baixa, por exemplo, pelo menos 30% para a SEQ ID NO: 1 e pelo menos 11% para SEQ ID NO: 2. Em particular, no caso de baixa homologia individual por sítios alvo conheci- dos, pode ser vantajoso utilizar uma biblioteca de recombinases como mate- rial de iniciação, por exemplo, para geração de uma recombinase configura- da capaz de recombinação de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, uma biblio- teca compreendendo Cre, Fre, Dre, Zre e Tre.

Na etapa (b) do método da invenção, a sequência do sítio alvo assimétrico dentro da LTR dos pró-vírus, a qual é homóloga ao meio-sítio à esquerda do sítio alvo conhecido, é definida como "sequência de meio-sítio 1" A sequência do sítio alvo assimétrico dentro da LTR dos pró-vírus, a qual é homóloga ao meio-sitio à direita do sítio alvo conhecido, é definida como "sequência de meio-sítio 2". A sequência entre as sequências que represen- tam os meio-sítios à esquerda e à direita é conhecida como espaçador.

Na etapa (c), os nucleotídeos dentro da "sequência de meio-sítio 1" e"sequência de meio-sitio 2", respectivamente, das sequências da etapa (b) divergem das sequências do meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita homólogos correspondentes do alvo conhecido são determinados por meio de alinhamento de sequência e comparação de sequência. Neste contexto, a . sequência da "sequência de meio-sítio 1" é comparada com o meio-sítio nativo correspondente o qual é, de preferência, a sequência de meio-sítio à esquerda, enquanto que a sequência da "sequência de meio-sítio 2" é com- paradacom outro meio-sítio que forma o sítio alvo nativo palindrômico o qual é, de preferência, a sequência de meio-sítio à direita.

A figura 1 mostra o resultado desta comparação para SEQ ID NO: 1 e 2 comparado com uma biblioteca de recombinases. Nucleotídeos divergentes são mostrados antes de um fundo escuro.

Esta comparação não deve necessariamente ser realizada após a etapa (b) e antes da etapa (d) do método da invenção, mas pode também ser realizada em uma fase diferente do método após a etapa (a) e antes da i etapa (e). . Na etapa (d), um primeiro subconjunto de dois ácidos nucleicos alvo que compreende as sequências alvo é gerado, em que a primeira se- quência alvo é designada primeiro subsítio 1 e compreende, adjacentes uns aos outros e na ordem 5' para 3', a sequência de meio-sítio 1 da etapa (b), a sequência espaçadora da sequência alvo assimétrica e uma repetição inver- tida da sequência de meio-sítio 1 e em que a segunda sequência alvo é de- signada subsítio 2 e compreende, adjacentes uns aos outros e na ordem 5 para 3', uma repetição invertida da sequência de meio-sítio 2, a sequência espaçadora da sequência alvo assimétrico e a sequência de meio-sítio 2 da etapa (b). As sequências alvo do primeiro subconjunto são sequências de oligonucleotideo palindrômicas tendo a estrutura de um sítio alvo simétrico.

Estessítios alvo simétricos artificiais são sintetizados com base nas sequên- cias de meio-sítio da etapa (b) complementando-se a falta da sequência de meio-sítio em cada sequência de oligonucleotídeo como repetição invertida, em que a sequência da "sequência de meijo-sítio 1" e "sequência de meio- sítio 2", respectivamente, são usadas para complementar a segunda se- quência de meio-sítio na extremidade oposta da sequência espaçadora. Consequentemente, a primeira sequência alvo no primeiro subconjunto (re- ferida como "subsítio 1") compreende uma repetição invertida que consiste na "sequência de meio-sítio 1" e na "sequência de meio-sítio 1" inversamen- - te repetida separadas pela sequência espaçadora, enquanto que a segunda sequência alvo no primeiro subconjunto (referida como "subsítio 2") compre- ende uma repetição invertida que consiste na "sequência de meio-sítio 2" inversamente repetida e "sequência de meio-sítio 2" separadas pela se- quência espaçadora. No "subsítio 1, as sequências estão dispostas como se segue: 5' - "sequência de meio-sítio 1" - espaçador- "repetição invertida de sequência de meio-sítio 1" - 3'; no "subsítio 2", as sequências estão dispos- tas como segue: 5' - "repetição invertida de sequência de meio-sítio 2" - es- paçador-"sequência de meio-sítio 2" - 3', As sequências separadoras dentro de cada uma das duas se- quências alvo sintéticas do primeiro subconjunto são, de preferência, idênti- cas e correspondem à sequência de LTR que representa ou definida como a - sequência espaçadora do sítio alvo assimétrico. No entanto, em uma outra modalidade, as sequências espaçadoras podem compreender um ou dois desvios de sequência provenientes de substituições de nucleotídeo.

Em geral, está etapa representa uma primeira divisão das se- quências do sítio alvo assimétrico selecionado para configuração a uma re- combinase específica (vide Figura 1 do documento WO 2008/083931, o qual é totalmente incorporado aqui por referência e figura 2. do presente pedido). As sequências são geradas nesta etapa abrigando sítios alvo simétricos de- rivados dos meio-sítios do sítio alvo assimétrico selecionado para configura- ção a uma recombinase específica. Como consequência, cada mutação (isto é, diferença com relação ao sítio alvo reconhecido pela recombinase do tipo silvestre) presente em um meio-sítio do referido sítio alvo assimétrico agora está distribuída entre as sequências alvo simétricas no primeiro subconjunto Na etapa (e) do método da invenção, um segundo subconjunto de ácidos nucleicos alvo que compreende sequências alvo modificadas é gerado com base nas sequências alvo no primeiro subconjunto da etapa (d).

Em sequências baseadas no subsítio 1, na sequência de meio-sítio à es- querda, uma parte dos nucleotídeos que divergem da sequência de meio- sítio homóloga correspondente do pelo menos um sítio alvo conhecido da | etapa (a) é substituida pelos nucleotideos nativos encontrados no referido - sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de meio-sítio contenha um, dois ou três (de preferência, dois) nucleotídeos que divergem do referido sitio alvo conhecido, em que o meio-sítio à direita da referida sequência alvo modificada é formado por uma repetição invertida da referida sequência de meio-sítio modificada à esquerda, a qual é separada da referida sequência de meio-sítio à esquerda modificada pela sequência espaçadora da sequên- cia alvo assimétrica.

Em sequências baseadas no subsítio 2, na sequência de meio- sítio à direita, uma parte dos nucleotídeos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspondente do pelo menos um sítio alvo conhecido da etapa (a) é substituída pelos nucleotídeos nativos encontrados no referido sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de meio-sítio contenha - um, dois ou três (de preferência, dois) nucleotídeos que divergem do referido sítio alvo conhecido, em que o meio-sítio à esquerda da referida sequência alvo modificada é formado por uma repetição invertida da referida sequência de meio-sitio à direita modificada, a qual é separada da referida sequência de meio-sítio à direita modificada pela sequência espaçadora da sequência alvo assimétrica Por exemplo, se um subsítio compreende seis nucleotídeos di- vergentes, tal como ambos os subsítios baseados em SEQ ID NO: 1 ou sub- sítio 2 de SEQ ID NO: 2 com relação à biblioteca de recombinases mostrada na figura 1, três sequências alvo modificadas podem ser geradas com base no subsítio, as quais contêm, cada uma, dois nucleotídeos divergentes (dife- rentes) no meio-sítio à esquerda (se baseado no subsítio 1) ou meio-sítio à direita (se baseado no subsítio 2). Consequentemente, em cada sequência alvo modificada, a sequência do respectivo subsítio é modificada para cor- responder à sequência da sequência alvo conhecida (ou pelo menos uma sequência alvo conhecida) em quatro nucleotídeos (figura 2). Naturalmente, também é possível gerar seis sequências alvo modificadas, cada uma con- tendo um dos nucleotídeos divergentes ou duas sequências alvo contendo, cada uma, três dos nucleotídeos divergentes. |

Em outro exemplo, se um subsítio compreende nove nucleotí- - deos divergentes, tal como o subsítio 1 de SEQ ID NO: 2 com relação à bi- blioteca de recombinases mostrada na figura 1, três sequências alvo modifi- cadas podem ser geradas com base no subsítio, as quais contêm, cada u- ma, trêsnucleotídeos divergentes (diferentes) no meio-sítio.

Como uma consequência, em todas as sequências de meio-sítio modificadas provenientes de uma sequência alvo do primeiro subconjunto da etapa (d), tomadas juntas, todos os nucleotídeos divergentes podem ser en- contrados, enquanto que nenhuma das referidas sequências de meio-sítio modificadas isoladamente compreende todos os nucleotídeos divergentes.

Mais uma vez, uma repetição invertida é gerada com base na sequência de meio-sítio modificada, de modo que a sequência espaçadora separa ambas as sequências que formam a repetição invertida (vide figura . 2). As sequências espaçadoras dentro de cada sequência alvo modificada deum novo subconjunto derivado de uma sequência alvo de um subconjun- to maior são, de preferência, idênticas e correspondem à sequência da LTR que representa ou definida como a sequência espaçadora do sítio alvo as- simétrico. No entanto, em uma outra modalidade, as sequências espaçado- ras podem compreender uma ou duas divergências de sequência provenien- tes de substituições de nucleotídeo. Usando esta abordagem, o número de mutações (isto é, diferenças com relação ao sítio alvo reconhecido pela re- combinase do tipo silvestre) nas sequências alvo que representam cada subconjunto é menor do que na sequência alvo assimétrica inicial, mas to- das as mutações ainda estão representadas em uma das sequências alvo (vide Figura 1 do documento WO 2008/083931, figura 2 do presente pedido de patente).

O termo "divergência de nucleotídeo", conforme aqui utilizado, refere-se a um nucleotídeo dentro da sequência alvo assimétrica identificada ou definida dentro da LTR ou dentro de uma sequência alvo de um subcon- junto gerado de acordo com a presente invenção que diverge (isto é, é dife- rente) do nucleotídeo presente na mesma posição na sequência homóloga correspondente da sequência alvo simétrica homóloga conhecida de uma | recombinase conhecida escolhida na etapa (a) do método da presente in- - venção. Neste contexto, os termos " nucleotídeos divergentes" e "mutações" são utilizados como sinônimos.

O documento WO 2008/083931 ensina que recombinases po- dem ser configuradas utilizando evolução molecular dirigida usando sequên- cias alvo como substrato, se a sequência alvo utilizada como substrato difere em não mais do que 3 nucleotídeos com relação à sequência alvo nativa. Assim, a geração de subconjuntos de diferentes ordens descritos acima ser- ve para reduzir o número de nucleotídeos divergentes por sequência alvo para3oumenos (vide Figura 1 do documento WO 2008/083931). A redução gradual da quantidade de nucleotídeos divergentes finalmente produz um número de subconjuntos de sequências alvo de diferentes ordens com redu- Ú ção do número de nucleotídeos divergentes até ser criado um subconjunto - final que pode ser utilizado como um substrato para evolução molecular diri- gida. Embora criando diferentes subconjuntos e, desse modo, reduzindo o número de nucleotídeos divergentes, as diferenças com relação ao sítio alvo reconhecido pela recombinase do tipo silvestre estão distribuídas entre vá- rias sequências alvo que não compreendem mais do que 3 destes nucleoti- deos divergentes cada, enquanto que as sequências alvo da ordem final, como um todo, ainda representam todos os nucleotídeos divergentes. Opcionalmente, no método da presente invenção, os subconjun- tos adicionais de sequências alvo podem ser gerados começando a partir das sequências alvo do segundo subconjunto repetindo-se gradualmente o processo da etapa (e), isto é, dividindo-se as sequências alvo nas respecti- —vassequênciasde meio-sítio e gerando novas estruturas palindrômicas com base nestas sequências de meio-sítio após alteração da sequência do meio- sítio derivada de uma sequência alvo do segundo subconjunto, cada vez gerando um novo subgrupo de sequências alvo, em que as sequências de meio-sítio usadas para geração das repetições invertidas contêm menos nu- — cleotídeos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspon- dente do pelo menos um sítio alvo conhecido. Estas sequências alvo adício- nais podem ser usadas para etapas adicionais de evolução molecular dirigi- | da e embaralhamento de bibliotecas de recombinase.

Naturalmente, tal eta- - pa adicional pode também ser realizada apenas para algumas das sequên- cias, por exemplo, para sequências em que recombinases com uma baixa eficiência de recombinação são obtidas.

Se subconjuntos adicionais são ge- rados e recombinases evoluídas sobre estes, a biblioteca de recombinases evoluída é utilizada na etapa (f) do processo da presente invenção.

Começando a partir do segundo subconjunto de sequências alvo obtido na etapa (e), um terceiro subconjunto pode ser gerado, seguido por um quarto, quinto, sexto subconjunto etc., se necessário.

No entanto, a ge- ração do terceiro subconjunto em geral! é necessária apenas se as sequên- cias alvo do segundo subconjunto ainda contêm mais de três nucleotídeos divergentes.

O mesmo se aplica à geração dos subconjuntos seguintes, os quais são necessários apenas se as sequências alvo do subconjunto anteri- - or ainda contêm mais de três nucleotídeos divergentes.

Deverá ser notado que, em uma modalidade, subconjuntos de sequências alvo serão gerados até que as sequências alvo do subconjunto final compreendam apenas um nucleotídeo divergente.

Consequentemente, dependendo do número de nu- cleotideos em cada sequência de meio-sítio, o número de subconjuntos ge- rados para cada sequência de meio-sítio do local alvo assimétrico pode ser diferente.

Por exemplo, pode ser necessário gerar apenas dois subconjuntos para a sequência de meio-sítio à esquerda, enquanto que três ou quatro subconjuntos têm de ser gerados para a metade de meio-síitio à direita de forma a distribuir os nucleotídeos divergentes entre várias sequências alvo, de modo que uma única sequência alvo não compreenda mais de três des- tes nucleotídeos divergentes.

O princípio de geração de subconjuntos adicionais das sequên- cias alvo para redução do número de nucleotídeos divergentes para núme- ros abaixo de três é ilustrado na figura 1 do documento WO 2008/083931 e a figura 2 do presente pedido fornece exemplos específicos de sequências —alvomodificadas.

Na etapa (f), um método de evolução molecular dirigida é aplica- do sobre a pelo menos uma recombinase que reconhece um local alvo co- | nhecido homólogo da etapa (a) utilizando uma sequência alvo do segundo " ou subconjunto final obtido na etapa (e) contendo um, dois ou três nucleotí- deos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspondente do referido sítio alvo homólogo conhecido como um substrato.

O termo "subconjunto final", conforme aqui utilizado, refere-se ao último subconjunto gerado na etapa (e), isto é, se nenhum subconjunto adi- cional é gerado, sobre o segundo subconjunto. Dependendo do número de nucleotídeos divergentes no sítio alvo assimétrico e do número de subcon- juntos que tinham de ser gerados para reduzir o número de nucleotídeos divergentes por sequência alvo para abaixo de 3, o "subconjunto final" pode corresponder a qualquer subconjunto, por exemplo, o segundo, terceiro, quarto ou um subconjunto posterior e pode ser diferente para as sequências de meio-sitio da sequência alvo assimétrica dentro da LTR. Se recombina- " ses foram previamente evoluídas sobre subconjuntos adicionais de sequên- cias alvo modificadas tendo menos nucleotídeos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspondente do referido sítio alvo homólogo co- nhecido, a recombinase obtida nesta etapa é usada.

Naturalmente, é possível iniciar o processo da presente inven- ção com uma recombinase específica para uma sequência alvo modificada específica e com outra recombinase (ou uma biblioteca) para outra sequên- cia alvo modificada específica.

Métodos de evolução molecular dirigida, também referidos como evolução de laboratório ou evolução in vitro, são conhecidos na técnica (para uma revisão vide YUAN et al., 2005 e referências no mesmo; JOHANNES & ZHAO, 2006).

Em uma primeira etapa de evolução molecular dirigida, bibliote- cas de sequências de recombinase com mutação aleatória são geradas por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando PCR pro- pensa a erro e embaralhamento de DNA (revisto, por exemplo, em YUAN et al, 2005) ou os métodos descritos no pedido de Patente Internacional WO 2002/44409. Os plasmídeos de cada biblioteca que compreendem a recom- binase com mutação também contêm uma das sequências alvo do subcon-

i junto final obtido na etapa (f). Após transfecção da biblioteca de plasmídeo - gerada em células adequadas, expressão da recombinase é permitida e evo- lução molecular dirigida é realizada, conforme conhecido por aqueles versa- dos no campo.

Em uma modalidade preferida, evolução molecular dirigida em- pregada na etapa (f) do método da presente invenção é evolução de proteí- na substrato-ligada (SLIPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001; Patente Inter nacional WO 02/44409). A evolução de proteina substrato-ligada pode ser realizada conforme descrito em detalhes nos exemplos do documento WO 2008/083931. Resumidamente, as sequências alvo obtidas na etapa (e) são clonadas em um plasmídeo (o assim denominado vetor de evolução) junta- mente com uma sequência de codificação com mutação aleatória para a re- combinase. A mutação aleatória é realizada por meio de PCR propensa a : erros (vide BUCHHOLZ & STEWART, 2001). A biblioteca de plasmídeo ge- radaé, então, transfectada em células de E. coli para permitir expressão da recombinase. Ao utilizar um promotor induzível para dirigir a expressão da recombinase, é possível ajustar os níveis de expressão. Após incubação durante a noite, o DNA de plasmídeo é isolado das células e é digerido com Ndel para cortar os plasmídeos que não foram recombinados e apenas —plasmídeosrecombinados são subsequentemente amplificados com primers. O produto de PCR de forma recombinada do plasmídeo produz uma banda de 1,7 Kb. O produto de PCR é digerido com BsrGl e Xbal e subclonado no vetor de evolução similarmente digerido para o ciclo de evolução seguinte.

Na etapa (g), as bibliotecas de recombinase evoluídas na etapa (f) são combinadas e embaralhadas. A tecnologia de embaralhamento de DNA é conhecida no campo (para uma revisão vide MINSHULL & STEMMER, 1999: STEMMER, 1994). As bibliotecas de recombinase evoluídas sobre se- quências alvo modificadas baseado no subsítio 1 são combinadas e embara- lhadas e, separadamente, as bibliotecas de recombinase evoluídas sobre sequências alvo modificadas baseado no subsítio 2 são combinadas e em- baralhadas.

As bibliotecas combinadas e embaralhadas são, então, clonadas | em uma nova geração de vetores que compreendem as sequências alvo do - próximo subconjunto maior, isto é, se dois subconjuntos são gerados, o sub- conjunto gerado na etapa (d). Por exemplo, o vetor para a biblioteca evoluí- da sobre as sequências baseadas no subsítio 1 compreende a sequência de — subsítio 1 como uma sequência alvo e o vetor para a biblioteca evoluída so- bre as sequências baseadas no subsítio 2 compreende a sequência de sub- sítio 2 como uma sequência alvo.

Na etapa (h), o método de evolução molecular dirigida é aplicado sobre as bibliotecas embaralhadas obtidas na etapa (g) usando a sequência alvo do próximo subconjunto maior o qual, conforme discutido, pode ser o subconjunto de acordo com a etapa (d). Nesta etapa, o mesmo método de evolução molecular dirigida conforme aquele aplicado antes na etapa (f) po- de ser usado, mas também é possível usar um método diferente de evolução - molecular dirigida nesta etapa do método da presente invenção.

Exemplos de diferentes métodos de evolução molecular dirigida foram descritos, por exemplo, por YUAN et al. (2005). De preferência, o método de evolução de proteína substrato-ligada também é aplicado sobre as bibliotecas combina- das e embaralhadas.

Esta etapa proporciona recombinases que reconhecem e re- combinam sequências alvo trazendo a combinação (e, assim, números cres- centes) de mutações das diferentes sequências alvo do subconjunto menor.

A combinação de mutações das diferentes bibliotecas de um subconjunto menor de sequências alvo resulta em efeitos sinérgicos e leva à geração de recombinases as quais, agora, recombinam sequências alvo de um subcon- junto maior, demonstrando que uma estratégia de evolução que percorre através de intermediários pode ser utilizada para alcançar uma atividade de- sejada.

Na etapa (1), as etapas (g), isto é, combinação e embaralhamen- to de bibliotecas de recombinase, e (j), isto é, a aplicação de evolução mole- cular dirigida às bibliotecas combinadas e embaralhadas, são repetidas até que seja obtida pelo menos uma recombinase que é ativa sobre a sequência alvo assimétrica presente na LTR do DNA pró-viral.

Por exemplo, em um método em que a geração de dois subcon- . juntos de sequências alvo foi necessária para gerar sequências alvo com apenas um, dois ou três nucleotídeo divergentes, as bibliotecas de recombi- nase evoluídas, por exemplo, para o segundo subconjunto de sequências alvo, são combinadas e embaralhadas e evolução molecular dirigida é apli- cada sobre esta biblioteca embaralhada usando as sequências alvo do pri- meiro subconjunto. Na próxima etapa (e final), a sequência alvo assimétrica da etapa (a) dentro da LTR do DNA pró-viral é utilizada para evoluir a biblio- teca de recombinase que compreende recombinases que reconhecem as sequências alvo do primeiro subconjunto por meio de evolução molecular dirigida para se obter pelo menos uma recombinase que é ativa na sequên- cia alvo assimétrica dentro da LTR do DNA retroviral. Nesta etapa, o método de evolução molecular dirigida é, de preferência, o método de evolução de . proteína substrato-ligada.

Na etapa (k), o ácido nucleico de uma recombinase tendo ativi- dade na sequência alvo assimétrica da etapa (a) dentro da LTR do DNA re- troviral é isolado da biblioteca. O ácido nucleico é isolado do respectivo plasmídeo dentro da biblioteca utilizando enzimas de restrição apropriadas. Método de digestão com endonucleases de restrição são conhecidos por aqueles versados. O ácido nucleico que codifica a recombinase pode, então, ser recuperado por meio de métodos conhecidos tal como, por exemplo, ele- troforese em gel.

O ácido nucleico pode ser armazenado (de preferência em tem- peraturas abaixo de -80 ºC) ou, opcionalmente, pode ser clonado na etapa (1) em um vetor de expressão para uso em análises posteriores, em méto- dos de expressão de proteína ou para a administração a um indivíduo para o tratamento e/ou prevenção de infecção retroviral, em particular, infecção pe- lo HIV e/ou AIDS. Vetores de expressão adequados são conhecidos no es- tado da técnica ou divulgados abaixo.

De preferência, a sequência alvo assimétrica identificada na eta- pa (a) está localizada na 5-LTR e 3-LTR do pró-virus para permitir excisão do DNA pró-viral do genoma da célula hospedeira,

Usando evolução dirigida substrato-ligada e as sequências iden- , tificadas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 como um substrato, os presen- tes inventores estão produzindo uma recombinase configurada que recombi- na esta sequência de DNA alvo assimétrica presente nas repetições termi- —naislongasdo HIV-1de uma pluralidade de cepas de HIV-1. O desenvolvi- mento de tais recombinases configuradas que objetivam especificamente sequências assimétricas dentro de uma pluralidade de LTRs de HIV-1 permi- te a excisão do respectivo pró-virus a partir de sua integração cromossômica para a maioria dos indivíduos infectados com HIV-1. Assim, em uma modali- dade,arecombinase configurada é derivada de uma biblioteca de recombi- nases que compreende recombinase Cre, por exemplo, uma biblioteca con- forme descrito na figura 3 e ela objetiva uma pluralidade de cepas de HIV-1, reconhecendo as sequências alvo que têm a sequência apresentada como , SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. De preferência, a evolução molecular diri- gidaé evolução de proteína substrato-ligada (SLIPE). O vetor de expressão que codifica para a recombinase configurada é, de preferência, derivado de um vetor lentiviral. Este vetor de expressão, células transfectadas com o mesmo e/ou proteína recombinase derivada do mesmo têm utilizações mé- dicas, por exemplo, no tratamento e/ou prevenção de uma infecção pelo HIVA.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configura- da, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequên- cias alvo assimétricas dentro da LTR do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas de HIV-1, a qual pode ser inserida no genoma de uma célula hospe- deira, compreendendo as etapas de: (a) identificação de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que tem homologia com a sequência de meio-sítio à esquerda e a sequência de mei- o-sítio à direita dos locais alvo de uma biblioteca de recombinase que com- preendeasrecombinases especificadas na figura 1; (b) identificação de duas sequências, em que a primeira sequên- cia corresponde à sequência da sequência alvo assimétrica da etapa (a)

homóloga ao meio-sítio à esquerda do referido sítio alvo conhecido e é refe- - rida como "sequência de meio-sítio 1" e em que a segunda sequência cor- responde à sequência da sequência alvo assimétrica da etapa (a) homóloga ao meio-sítio à direita e é referida como "sequência de meio-sítio 2"; (c) determinação dos nucleotídeos dentro das sequências da e- tapa (b) que divergem das sequências de meio-sítio à esquerda homólogo e meio-sítio à direita correspondentes do sítio alvo conhecido homólogo da etapa (a), conforme mostrado na figura 1; (d) geração de um primeiro subconjunto de dois ácidos nucleicos alvocompreendendo sequências alvo, em que a sequência alvo é designada primeiro subsítio 1 e compreende SEQ ID NO: 8 (para SEQ ID NO: 1) ou SEQ ID NO: 16 (para SEQ ID NO: 2) e em que a sequência alvo é designa- : da segundo subsítio 2 e compreende SEQ ID NO: 12 (para SEQ ID NO: 1) . ou SEQ ID NO: 20 (para SEQ ID NO: 2); (e) geração de um segundo subconjunto de ácidos nucleicos al- vo que compreende as sequências alvo modificadas com base nas sequên- cias alvo no primeiro subconjunto da etapa (d) que compreende SEQ ID NOs: 9-11 e 13-15 (para SEQ ID NO: 1) ou SEQ ID NOs: 17-19 e 21-23 (pa- ra SEQ ID NO: 2), respectivamente, (f) aplicação, separadamente, de evolução molecular dirigida so- . bre a referida biblioteca de recombinase usando cada ácido nucleico do se- gundo subconjunto obtido na etapa (e) como um substrato; (g) embaralhamento das bibliotecas recombinase evoluídas na etapa (f), em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram sobre sequências com base no subsítio 1 são combinadas e embaralhadas e em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram sobre sequências com base no subsítio 2 são combinadas e embaralhadas; (h) aplicação de evolução molecular dirigida sobre as bibliotecas embaralhadas obtidas na etapa (g) utilizando cada ácido nucleico do sub- — conjuntode acordo com a etapa (d) como um substrato; (i) embaralhamento das bibliotecas de recombinase evoluídas na etapa (h);

' ()) aplicação de evolução molecular dirigida sobre a biblioteca - embaralhada obtida na etapa (g) utilizando um ácido nucleico que compre- ende a sequência alvo assimétrica da etapa (a) como um substrato, até que seja obtida pelo menos uma recombinase que é ativa na sequência alvo as- simétrica dentro da LTR do DNA retroviral da etapa (a); (1) isolamento do ácido nucleico da pelo menos uma recombina- se obtida na etapa (j) a partir da biblioteca; e (1) clonagem do ácido nucleico obtido na etapa (k) em um vetor de expressão adequado, em que o método de evolução molecular dirigida é, de preferência, evolução de proteína substrato-ligada.

A recombinase TRE configurada para reconhecer SEQ ID NO: 1 é designada TRE 3.0. A recombinase TRE configurada para reconhecer SEOQ ID NO: 2 é designada TRE 4.0. . No entanto, é óbvio para aqueles versados no campo que outras recombinases configuradas sítio específicas podem ser geradas, as quais recombinam sítios alvo divergentes encontrados no genoma de uma plurali- dade de pró-vírus retrovirais inseridos no genoma da célula hospedeira.

Ou- tras sequências alvo candidatas podem ser determinadas, por exemplo, as quais estão presentes no genoma de uma pluralidade de cepas retrovirais.

O DNA pró-viral, o qual pode ser inserido no genoma de uma cé- luta hospedeira ou o qual pode ainda não ter sido inserido é, de preferência, o DNA de um retrovírus.

Retrovírus compreendem uma família grande e di- versa de vírus de RNA com invólucro.

O aspecto característico da família é sua estratégia de replicação que inclui, como etapas essenciais, a transcri- —çãoreversa do RNA viral em DNA fita dupla linear e a subsequente integra- ção do DNA (DNA pró-viral) no genoma da célula hospedeira.

Retrovírus são subdivididos em sete grupos, definidos por classe evolucionária.

Cinco des- tes grupos (alfa-, beta-, delta-, epsilon- e gama-retrovírus) representam re- trovírus com potencial oncogênico e os outros dois grupos são os lentivírus e os spumavírus.

Os vírus de leucemia de células T humana patogênica do tipo | e tipo Il (HTLV e HTLV-II) pertencem ao grupo de delta retrovírus, enquanto que os vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 e tipo 2 (HIV-1 | e HIV-2) pertencem ao grupo dos lentivírus (para uma revisão vide o livro 2 texto padrão "Retrovirus" de COFFIN JM, SH HUGHES, VARMUS HE (Eds.) 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York). Em uma modalidade, o DNA pró-viral o qual pode ser inserido no genoma de uma célula hospedeira é o DNA de um retrovírus selecionado do grupo que consiste em vírus do tumor mamário do rato (Mouse Mammary Tumour Virus - MMTV), vírus de Mason Pfizer de macaco (Mason Pfizer Monkey Virus - MPMV), vírus da leucemia de células T humana do tipo | (Human T Cell! Leukemia Virus Type 1 - HTLVH), vírus de leucemia de células Tdotipoll (Human T Cell Leukemia Virus Type Il - HTLV-II), virus da leuce- mia de células T de símios do tipo | (Simian T Cell Leukemia Virus Type | - STLV-I), vírus da leucemia de células T de símios do tipo 1! (Simian T Cell i Leukemia Virus - Type Il STLV-II), vírus da leucemia bovina (Bovine Leuke- . mia Virus - BLV), vírus da leucemia felina (Feline Leukemia Virus - FelV) e vírusdaleucemia de Moloney de murinos (Moloney murine Leukemia Virus - MoMLV).

Em uma modalidade, o retrovirus é um lentivírus selecionado do grupo que consiste em vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1- HIV-1), virus da imunodeficiência humana dotipo2(HumanImmunodeficiency Virus Type 2 - HIV-2), vírus da imunode- ficiência de símios (Simian Immunodeficiency Virus - SIV), vírus da imunode- ficiência felina (Feline Immunodeficiency Virus - FIV), vírus da imunodefíci- ência bovina (Bovine Immunodeficiency Virus - BIV), vírus Maedi-visna (Ma- edi-Visna Virus - MVV), vírus da anemia infecciosa de equinos (Equine In- fectious Anemia Virus - EIAV) e vírus da encefalite artrítica de caprinos (Ca- prine Arthritis Encephalitis Virus - CAEV). Conforme indicado acima, HIV, em particular HIV-1, é preferido.

Em uma modalidade mais preferida, a sequência alvo assimétri- ca identificada na etapa (a) do método da presente invenção está localizada emambas as extremidades 5-LTR e 3-LTR de um pró-virus de HIV. De pre- ferência, a referida sequência alvo assimétrica localizada nas 5-LTR e 3'- LTR de um pró-virus de HIV tem a sequência apresentada como SEQ ID

NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

- Em uma modalidade preferida, o método de evolução molecular dirigida aplicado no método da presente invenção é o método de evolução de proteina substrato-ligada (SLiIPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001, vide também documento WO 02/44409).

Ao realizar o método da invenção tal como aqui descrito, os in- ventores geraram vários ácidos nucleicos que codificam uma recombinase configurada e as recombinases configuradas em si. A invenção proporciona, assim, uma recombinase adaptada compreendendo uma sequência de a- cordo com qualquer uma de SEQ ID NOs: 40-64 ou que consiste nas mes- mas ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas.

Surpreendentemente, descobriu-se que estas recombinases configuradas compreendem, de preferência, determinadas sequências de . consenso, conforme mostrado na figura 5. Em particular, todas as recombi- nases configuradas analisadas capazes de recombinação de uma sequência alvo assimétrica compreendem uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 37 (sequência de consenso "Tre em comum"). Descobriu-se ainda que todas as recombinases configuradas analisadas capazes de recombinação da se- quência alvo de acordo com SEQ ID NO: 1 compreendem uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 38. 95% de todas as recombinases configuradas analisadas capazes de recombinação da sequência alvo de acordo com SEQ ID NO: 1 compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 39, Em SEQ ID NO: 37, 38 e 39, aminoácidos variáveis são representados por um X (cf. figura 5).

A invenção fornece, assim, uma recombinase adaptada capaz de recombinar sequências alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma cepa retroviral que pode ser inserida no genoma de uma célula hos- pedeira (isto é, uma recombinase configurada funcional) a qual, de preferên- cia, compreende SEQ ID NO: 37. De preferência, a referida recombinase — configurada é capaz de recombinação de sequências alvo assimétricas den- tro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais as quais podem ser inseridas no genoma de uma célula hospedeira. Tal recombinase configurada é, por exemplo, obtenível de acordo com o método da invenção. z De preferência, a referida recombinase configurada compreende SEQ ID NO: 37 e compreende pelo menos uma, de preferência 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 das seguintes trocas de aminoácido definidas quando comparado com a se- quênciade Cre(SEQ ID NO: 36): P12S, P15L, M44V, K86N, G93A, A175S, P307A.

Estas trocas tornam a enzima particularmente adequada para re- combinação em uma sequência alvo de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência alvo que tem uma identidade de sequência elevada com SEQ ID NO: 1 (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95 % de identi- dadede sequência com SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade, a sequência da recombinase configurada da invenção, em particular a recombinase configurada que compreende SEQ ] ID NO: 37, não é divulgada no documento WO 2008/083931. De preferência, . a sequência não inclui SEQ ID NO: 65 do presente pedido (a qual é idêntica àSEQIDNO: 3 do documento WO 2008/083931) ou posições 11-351 de SEQ ID NO: 65 e a sequência de ácido nucleico que codifica uma recombi- nase configurada da invenção não codifica uma proteína compreendendo as posições 11-351 de SEQ ID NO: 65. A sequência da recombinase configura- da da invenção que compreende SEQ ID NO: 37 também varia com relação àrecombinases que ocorrem naturalmente, tais como Cre, Dre, Fre ou Zre, o qual é evidente a partir da característica de que ela é capaz de recombina- ção de sequências alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma cepa retroviral que pode ser inserida no genoma de uma célula hospedeira e, de preferência, que é capaz de recombinação de sequências alvo assimé- tricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovi- rais que podem ser inseridas dentro do genoma de uma célula hospedeira.

Se a recombinase configurada capaz de recombinar sequências alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de ce- pas retrovirais inseridas no genoma de uma célula hospedeira tem de re- combinar a sequência alvo de SEQ ID NO: 1, de preferência, ela compreen- de SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39. Recombinases funcionais adequadas capazes de recombinar sequências alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma plura- - lidade de cepas retrovirais as quais podem ser inseridas no genoma de uma célula hospedeira a qual pode, por exemplo, ser obtida por meio do método da invenção podem variar a partir das referidas sequências, mas as sequên- cias fornecem orientações valiosas para que aqueles versados no campo produzam uma recombinase configurada capaz de recombinar os sítios alvo assimétricos, tal como SEQ ID NO: 1, mesmo sem realizar o método da in- venção. A invenção também proporciona sequências que compreendem re- combinases configuradas com pelo menos 97% de identidade de sequência comSEQID NO: 38 e/ou tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 e/ou tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38. De preferência, uma recombinase configurada tem pelo Ú menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39 e/ou pelo me- . nos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39 e/ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39, Tendo um determina- do percentual de identidade de sequência com uma sequência de SEQ ID NO: 37, 38 ou 39, no contexto da presente invenção, significa que a identi- dade de sequência nas posições definidas na respectiva sequência, por e- xemplo, com identidade de sequência de 97%, 3% das posições de aminoá- cido definidas das referidas sequências podem variar. De preferência, trocas de aminoácidos com relação às sequências de referência são substituições conservativas, as quais são bem conhecidas por aqueles versados no cam- po (por exemplo, Creighton (1984), Proteins. WH Freeman and Company (Ed.)). Por exemplo, substituições conservativas substituem um aminoácido dogrupode aminoácidos negativamente carregados por um outro.

As recombinases configuradas capazes de recombinar sequên- cias alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais as quais podem ser inseridas no genoma de uma célula hospedeira podem também compreender uma combinação de 2, 3, 4 ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 40- 64, por exemplo, uma parte C-terminal de qualquer uma destas sequências, por exemplo, SEQ ID NO: 40 e uma parte N-terminal de qualquer outra des-

] tas sequências, por exemplo, SEQ ID NO: 64. A parte C-terminal pode ter - um comprimento de 1-342 aminoácidos. Em uma combinação de duas se- quências, a parte N-terminal pode ter um comprimento de 1-342 aminoáci- dos, A combinação, em qualquer caso, compreende um motivo TRE de con- senso, por exemplo, SEQ ID NO: 37 ou, de preferência, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39.

A invenção proporciona ainda uma composição que compreende duas ou mais recombinases configuradas compreendendo sequências dife- rentes de acordo com SEQ ID NO: 37 ,de preferência SEQ ID NO: 38 ou SEQIDNO: 389 ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas. Em uma mo- dalidade, a composição compreende duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, 20 ou mais ou 25 recombinases compre- : endendo sequências de acordo com qualquer uma de SEQ ID NOs: 40-64 . ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas. Tais composições podem ser composições farmacêuticas, conforme descrito abaixo.

A invenção proporciona também um ácido nucleico que codifica uma recombinase configurada capaz de recombinação de sequências alvo assimétricas dentro da LTR de DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas : retrovirais que podem ser inseridas no genoma de uma célula hospedeira, a recombinase configurada que compreende uma sequência de aminoácido, conforme definido acima. Em modalidades preferidas, a referida sequência de aminoácido tem pelo menos 97% de identidade de sequência com uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 38, pelo menos 98% de identidade de sequência com uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 38 ou pelo me- nos 99% de identidade de sequência com SEQ ID N: 38 ou compreende SEQ ID NO: 38. A invenção proporciona também um ácido nucleico que co- difica uma recombinase configurada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 39, pelo menos 98% de identidade de sequência com uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 39 ou pelo me- nos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 ou uma sequên- cia de aminoácidos que compreende SEQ ID NO: 39. A invenção proporcio- | na também um ácido nucleico que codifica uma recombinase configurada - compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 40-64 ou uma combinação das referidas sequên- cias. No contexto da invenção, um ácido nucleico ou uma proteína compreendendo uma sequência pode também consistir desta sequência.

Ela pode também compreender sequências adicionais, por e- xemplo, uma sequência sinalizadora que confere expressão/localização em um compartimento celular específico, tal como um sinal de localização nu- clear(por exemplo, o sinal nas posições 2-9 de SEQ ID NO: 65). Se a prote- Ina tem de ser utilizada em uma composição farmacêutica, é especialmente preferido expressá-la como uma proteina de fusão com um domínio de : transdução de proteína, tal como o domínio de transdução de proteina tat, o . qual permite transdução de proteína das células alvo. De preferência, uma recombinase configurada da invenção, a qual tem de ser utilizada em uma composição farmacêutica, é preparada como uma proteina de fusão com uma sequência de localização nuclear e com um domínio de transdução de proteina, por exemplo, de tal, e um ácido nucleico que codifica uma recom- binase configurada da invenção pode codificar tal proteina de fusão. Por e- xemplo, os domínios de transdução de proteina a seguir podem ser usados em uma proteina de fusão com uma recombinase configurada da invenção o qual, de preferência, ainda inclui um sinal de localização nuclear: - Domínio básico do transativador Tat de HIV-1 (Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, Barsoum J., "Tat-mediated deli- very of heterologous proteins into cells”, Proc Natl Acad Sci USA. 18 de Ja- neiro de 1994; 91(2): 664-8).

- Homeodomínio de Antennapedia Drosohila (Antp) (Derossi D, Joliot AH, Chassaing G, Pro-chiantz A., "The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes", J Biol Chem. 8 de Abrilde 1994; 269(14): 10444-50).

- Fator de transcrição VP22 de HSV (Elliott G, O'Hare P., "Inter cellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein",

' Cell. 24 de Janeiro de 1997; 88(2): 223-33).

. - Motivo de translocação célula-permeável (TLM) de antígeno na superfície PreS2 do vírus da hepatite B (HBV) (Oess S, Hildt E., "Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepa-titis-B virus surface antigens”, Gene Ther. Maio de 2000; 7(9): 750-88).

No caso em que a proteína tem de ser purificada, uma "tag" que facilita a purificação de uma proteína, tal como uma "tag" His, também pode ser adicionada.

O uso de códon do ácido nucleico da invenção que codifica uma recombinase Tre, conforme definido acima, pode ser escolhido por aqueles versados no campo. Por exemplo, um uso de códon apropriado para expres- são em uma célula humana pode ser escolhido, em particular se expressão Ú em uma célula humana é pretendida, por exemplo, para fins terapêuticos.

. Uso de códon pode também ser baseado em uso de códon, por exemplo, de recombinase Cre.

A recombinase configurada ou ácido nucleico que codifica a re- ferida recombinase configurada pode ser obtido por meio do método da in- venção conforme aqui descrito ou pode ser obtida através deste método. Ela também pode ser obtida com base nas sequências aqui descritas, opcional- mente por meio de combinação e/ou ainda variação destas sequências, op- cionalmente testando a atividade em recombinação de sítios alvo assimétri- cos, tais como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A invenção proporciona ainda uma composição, por exemplo, uma biblioteca, que compreende dois ou mais dos ácidos nucleicos que co- dificam uma recombinase configurada conforme definido acima, por exem- plo, que codifica duas ou mais recombinases configuradas compreendendo diferentes sequências de acordo com SEQ ID NO: 37, de preferência dife- rentes sequências de acordo com SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, a composição compreende ácidos nucleicos que codificam recombinases configuradas compreendendo duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, 20 ou mais ou 25 ou mais re- combinases compreendendo sequências de acordo com qualquer uma de

: SEOQ ID NOs: 40-64 ou combinações destas sequências. Tais composições, - em particular composições específicas em que o ácido nucleico é um vetor de expressão, podem ser particularmente adequadas como composições farmacêuticas, conforme descrito abaixo.

No método da presente invenção, o ácido nucleico que codifica a pelo menos uma recombinase configurada que é ativa sobre a sequência alvo assimétrica dentro da LTR do DNA retroviral é clonado em um vetor de expressão. Vetores de expressão são construtos genéticos para expressão das proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos dentro do vetor. Tais veto- res de expressão podem ser vetores de autorreplicação extra-cromossô- micos ou vetores que se integram no genoma de um hospedeiro. Geralmen- te, estes vetores de expressão incluem ácido nucleico regulador de transcri- ção e tradução operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica a NR recombinase configurada da presente invenção.

O termo "sequências de controle" refere-se à sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação opera- tivamente ligada em organismo hospedeiro em particular. As sequências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um sítio de ligação ribossômica. Células eucariotas são conhecidas por utilizar promotores, si- nais de poliadenilação e intensificadores.

Um ácido nucleico é "operacionalmente ligado" quando ele está colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ribossômica está operativamente ligado a uma sequên- cia de codificação se ele está posicionado de modo a facilitar a tradução. À ligação é realizada por meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sinté- ticos são utilizados de acordo com a prática convencional. O ácido nucleico regulador de transcrição e tradução geralmente será apropriado à célula hospedeira utilizada para expressar a recombinase configurada. Numerosos i tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras ade- - quadas são conhecidos na técnica para uma variedade de células hospedei- ras.

O vetor de expressão utilizado na presente invenção pode ser um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor de spumavírus ou um vetor adenoviral. No entanto, em uma modalidade preferida, o vetor de expressão é um vetor lentiviral selecionado do grupo que consiste em vetores lentivirais derivados de HIV-1, SIV, FIV ou EIAV. Vetores lentivirais são, por exemplo, descritos por SCHAMBACH et al. (2006) ou no Pedido de Patente Européia No. 11000751.5.

Em modalidades preferidas da presente invenção, o vetor de ex- pressão compreende um promotor celular, bacteriano, viral ou híbrido.

: Em geral, para os fins da presente invenção, o promotor pode . ser um promotor constitutivo ou induzível. Além disso, os promotores podem serum promotor que ocorre naturalmente, tal como um promotor bacteriano, celular ou viral, ou um promotor híbrido. Promotores híbridos, os quais com- binam elementos de mais de um promotor, são conhecidos na técnica e são úteis na presente invenção. Além disso, o promotor utilizado na presente invenção pode também ser um derivado de um promotor que ocorre natu- ralmente. Um "derivado" de um promotor que ocorre naturalmente, conforme aqui utilizado, pode ser uma combinação de elementos cis-ativos obtidos a partir de promotores ou sequências de origem diferente ou, alternativamente, pode ser obtido por meio de deleção ou mutação de elementos cis-ativos dentro de um promotor que ocorre naturalmente específico (EDELMAN et al,2000;ALPER et al. 2006; HARTENBACH & FUSSENEGGER, 2006).

Em uma modalidade da presente invenção, o promotor constitu- tivo ou derivado do mesmo é selecionado ou obtido do grupo que consiste em promotores de citomegalovíirus, vírus do sarcoma de Rous, retrovírus relacionados ao vírus da leucemia de murino, gene de fosfogliceroquinase, virusde formação de foco em baço de murino ou fator 1 alfa de alongamento humano.

Em uma outra modalidade da presente invenção, o promotor in-

duzível ou derivado do mesmo é selecionado ou obtido do grupo que consis- - te na LTR ou derivados da mesma, derivados de lentivírus, spumavírus e delta retrovírus.

Neste contexto, o termo "LTR" refere-se a repetições terminais longas5' e3' de pró-vírus tendo função de promotor (para uma revisão vide o livro texto padrão "Retroviruses" (COFFIN JM, HUGHES SH, VARMUS HE (Eds.) 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)). De preferência, o promotor induzível ou derivado do mesmo é selecionado da LTR ou derivados da mesma derivados de HIV-1, HIV-2, MWV, EIAV, CAEV, SIV, FIV, BIV, HTLV-l e HTLV-IL.

A presente invenção proporciona ainda um método para preparo de uma recombinase configurada, em que o referido método compreende o Ú método antes mencionado para preparo de um vetor de expressão que codi- . fica uma recombinase configurada e a etapa adicional de expressão da re- combinase configurada ou um polipeptídeo de fusão compreendendo a se- quência de aminoácido da referida recombinase configurada a partir do áci- do nucleico que codifica a recombinase inserido no vetor de expressão obti- do no método antes mencionado para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada em uma célula hospedeira ade- quada De preferência, as recombinases finalmente obtidas são testa- das em células de mamífero para assegurar que elas funcionam em um am- biente de células de mamífero.

Além disso, para se obter boa expressão em células de mamífero, as recombinases podem ser otimizadas para expres- são nestas células (por exemplo, otimização de uso de códon usando méto- dos bem conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo SHIMSHEK et al., 2002) ou sequências sinalizadoras necessárias para dirigir a proteina ao núcleo da célula de mamífero, tal como a sequência NLS (MACARA, 2001) podem ser adicionadas ao ácido nucleico da recombinase configurada.

Expressão do ácido nucleico que codifica a recombinase confi- gurada clonado em um vetor de expressão, por exemplo, de acordo com a etapa (1) do método para preparo de um vetor de expressão que codifica

' uma recombinase configurada, pode ser realizada utilizando, por exemplo, . sistemas de expressão de bactérias, inseto ou mamífero.

Contudo, outros sistemas de expressão conhecidos na técnica podem também ser emprega- dos.

Métodos de introdução de ácido nucleico exógeno em hospedeiros mamíferos, insetos ou bacterianos, bem como outros hospedeiros, são tam- bém bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeira utiliza- da.

Técnicas incluem transfecção mediada por dextrana, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, infecção viral, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em li- possomas e microinjecção direta do DNA em núcleos.

Proteínas de fusão são preparadas por meio de métodos bem conhecidos no campo.

Por exemplo, o vetor de expressão de ácido nucleico Ú que codifica a recombinase configurada é clonado em uma sequência de . ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo ou proteína.

Ao clonar oácido nucleico que codifica a recombinase configurada ao mesmo tempo em que a sequência do segundo polipeptídeo ou proteina, ambas as se- quências serão expressas como proteína de fusão.

As células hospedeiras utilizadas para expressão da recombina- se configurada a partir do vetor de expressão são, de preferência, células hospedeiras, incluindo células procariotas tais como, por exemplo, células bacterianas ou células de levedura, ou células eucariotas tais como, por e- xemplo, células de inseto ou células de mamíferos.

A célula hospedeira pode ser uma célula hematopoiética, por exemplo, uma célula-tronco hematopoié- tica adulta ou uma célula T, por exemplo, uma célula CD4*. A célula pode ser derivada de um indivíduo infectado com o retrovírus e a célula pode ser administrada novamente ao indivíduo após transformação e, opcionalmente, cultura e/ou propagação.

A presente invenção proporciona ainda um método para preparo de uma célula-tronco adulta transformada, em que o referido método com- preende o método antes mencionado para preparo de um vetor de expres- são que codifica uma recombinase configurada e a etapa adicional de intro- dução do vetor de expressão obtido no método antes mencionado para pre-

paro de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada in - vitro em uma célula-tronco adulta adequada.

Em um aspecto adicional, a presente invenção é dirigida ao áci- do nucleico, conforme obtenível a partir do método antes mencionado da presente invenção. Ácidos nucleicos que codificam uma recombinase confi- gurada definida por uma sequência são também aqui proporcionados.

Um "ácido nucleico", conforme aqui utilizado, é um composto po- limérico compreendido de subunidades covalentemente ligadas denomina- das nucleotídeos. Ácido nucleico inclui ácido polirribonucleico (RNA) e ácido polidesoxirribonucleico (DNA), ambos os quais podem ser fita simples ou fita dupla. DNA inclui cONA, DNA genômico, DNA sintético e DNA semi- sintético.

' Em seu aspecto mais amplo, o ácido nucleico obtido por meio do . método da presente invenção ou definido aqui é um ácido nucleico que codi- fica uma recombinase configurada, em que as recombinase configurada re- combina sequência alvo assimétricas dentro do DNA um pró-virus de uma pluralidade de cepas de vírus a qual pode ser inserida no genoma de uma célula hospedeira, levando à excisão do pró-vírus do genoma da célula hos- pedeira, em que os sítios alvo assimétricos são diferentes dos sítios alvo da recombinase do tipo silvestre.

Em um aspecto adicional, a presente invenção é também dirigi- da ao vetor de expressão, conforme obtenível a partir do método antes men- cionado da presente invenção e a um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico que codifica uma recombinase configurada, tal como definido aqu.

O termo "proteína", conforme aqui utilizado, inclui proteínas, po- lipeptídeos e peptídeos. Conforme será apreciado por aqueles versados no campo, as sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser utilizadas para gerar sequências de proteína. Um aspecto adicional da pre- sente invenção é a proteina recombinase configurada conforme obtenível, por exemplo, a partir do método antes mencionado da presente invenção, recombinase a qual pode ser opcionalmente uma proteína de fusão compre-

' endendo uma recombinase funcional.

Em uma modalidade, a proteina re- - combinase configurada pode ser preparada como um polipeptídeo de fusão usando técnicas bem conhecidas no campo.

Em uma modalidade preferida, a proteina recombinase configurada está ligada a um segundo polipeptídeo.

De preferência, o polipeptíideo de fusão é obtido a partir do método acima mencionado da presente invenção, em que a recombinase configurada está ligada a um segundo polipeptídeo.

Em uma modalidade, a proteina recombinase configurada é pre- parada como um polipeptídeo de fusão para aumentar a expressão.

Em uma outramodalidade, a proteína recombinase configurada é feita como um poli- peptídeo de fusão para permitir introdução do polipeptideo em células vivas.

Tipicamente, proteinas purificadas não podem entrar em células, uma vez ' que elas não são capazes de atravessar a membrana celular em virtude de . seu tamanho.

No entanto, a fusão de sequências peptídicas específicos à proteínas pode resultar na captação destas proteínas de fusão nas células.

Na célula, a proteina pode, então, exercer sua função.

Recombinases sítio específicas, incluindo recombinase Cre, foram distribuídas com sucesso em células com esta abordagem (PEITZ et al., 2002). Recombinase célula- permeante foram ainda descritas por NOLDEN et a/. (2006) e LIN et al. (2004). Consequentemente, esta estratégia pode ser usada para distribuir as recombinases configuradas em células para remover o pró-virus de células infectadas.

Assim, o segundo polipeptídeo de fusão no polipeptídeo de fusão pode compreender um peptídeo sinalizador.

O peptídeo sinallizador pode ser um domínio de transdução de proteína, tal como o peptídeo TAT ou um peptí- deoda terceira hélice do homeodomínio de Antennapedia (DEROSS! et al, 1994, 1996; VIVES et al., 1997; VIVES, 2003; RICHARD et al., 2005) ou a NLS (Nucleus Localization Sequence - Sequência de Localização em Nú- cleo) para distribuição do polipeptídeo de fusão ao núcleo de uma célula eu-

cariota (MACARA, 2001). Um aspecto adicional da presente invenção é dirigido à célula- tronco adulta conforme obtenível a partir do método acima mencionado para o preparo de uma célula-tronco adulta transformada da presente invenção. |

: As células-tronco são, de preferência, infectadas ou transfectadas com o - vetor de expressão de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferi- da, a célula-tronco adulta é uma célula-tronco de linhagem hematopoiética que expressa a recombinase configurada, o polipeptídeo de fusão acima mencionado ou que compreende o vetor de expressão acima mencionado. Células-tronco hematopoiéticas (Hematopoietic Stem Cell - HSC) são deri- vadas células CD34* derivadas da medula óssea as quais podem, por e- xemplo, ser purificadas a partir de sangue periférico mobilizado em G-CSF de doadores (por exemplo, pacientes infectados com HIV) por meio de leu- caferese de rotina (SCHERR & EDER, 2002), As células geneticamente mo- dificadas in vitro podem, então, ser formuladas para reinfusão nos pacientes.

No estado da técnica, o termo "células-tronco" designa as célu- ' las as quais (a) têm a capacidade de autorrenovação e (b) a capacidade de . formar pelo menos um e muitas vezes um certo número de tipos de células especializadas em virtude de sua capacidade de divisão assimétrica (DO- NOVAN & GEARHART, 2001). Células-tronco adultas podem ser isoladas de diferentes tecidos de adulto, isto é, de indivíduos diferenciados. Tais célu- las-tronco são referidas no estado da técnica como "células-tronco multipo- tentes adultas”. A diferença essencial entre células-tronco pluripotentes em- brionárias e células-tronco multipotentes adultas reside no número de teci- dos diferenciados os quais podem ser obtidos a partir das respectivas célu- las.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão da presente in- venção é utilizado para a transformação de células T, por exemplo, células CD4+ primárias (células sanguíneas) de pacientes infectados por retrovírus (por exemplo, HIV) Em uma etapa adicional do método da presente invenção, o ve- tor de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica uma recombinase configurada da invenção, a proteína recombinase, a prote- ínade fusão ou a célula-tronco adulta obtidas por meio dos métodos da pre- sente invenção são formulados como uma composição farmacêutica para utilização na prevenção e/ou tratamento de uma infecção retroviral e/ou para

' redução da carga viral em um indivíduo infectado por um retrovírus, por e- . xemplo, HIV, em particular HIV-1.

Um objetivo adicional da invenção é a composição farmacêutica obtida por meio do método acima mencionado. A composição farmacêutica está, de preferência, presente na forma de uma solução apropriada para a- plicação intravenosa (perfusão).

O preparado farmacêutico pode ainda compreender um ou mais veículos, excipientes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Veícu- los, excipientes e adjuvantes apropriados para utilização em uma composi- ção farmacêutica são conhecidos na técnica.

A composição farmacêutica da presente invenção, de preferên- cia, reduz a carga viral em um indivíduo infectado por um retrovírus para a- ' baixo de 5.000 equivalentes genômicos/ml de plasma, de preferência abaixo . de 500 equivalentes genômicos/ml de plasma e, mais preferivelmente, abai- xode 50 equivalentes genômicos/ml de plasma, quando administrados ao indivíduo. Assim, a composição farmacêutica da presente invenção que compreende um vetor de expressão que codifica uma recombinase configu- rada (ou a recombinase configurada como uma proteína ou um polipeptídeo de fusão ou uma célula-tronco que compreende o vetor de expressão) é ca- paz de reduzir a carga viral em um indivíduo infectado com um retrovirus, erradicando o reservatório genético de retrovírus dentro de células hospedei- ras evitando, assim, os ciclos de vida do vírus.

A "carga viral", conforme utilizado aqui refere-se, por exemplo, aos equivalentes de RNA do HIV (isto é, genomas) que estão associados com1mlde plasma do paciente (DYBUL et al., 2002). Assim, a carga viral é determinada medindo-se o teor de DNA viral em amostras obtidas do paci- ente. Atualmente, existem três tipos principais de ensaios de carga viral dis- poníveis: 1) Reação em cadeia de polimerase-transcrição reversa de RNA deHIV(RT-PCR): Amplicor'"" HIV-1 Monitor Test; Roche Diagnostics 2) DNA de cadeia ramíificada (DDNA): Versant'"” HIV RNA As- say; Bayer Diagnostics; e |

: 3) amplificação baseada em sequência de ácido (Nucleic Acid - Sequence-Based Amplification - NASBA): Nuclisens"“ Assay; BioMerieux. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica da presente invenção é capaz de reduzir a carga viral em um indivíduo infecta- do por um retrovírus para abaixo de 5.000 equivalentes genômicos/ml de plasma, de preferência abaixo de 500 equivalentes genômicos/ml de plasma e, mais preferivelmente, abaixo de 50 equivalentes genômicos/ml de plasma. Pacientes com uma carga viral abaixo de 5000 equivalentes genômicos/ml de plasma são considerados como sendo relativamente bem adaptados para otratamento medicinal. No entanto, o objetivo em terapia de AIDS atual é uma redução da carga viral para abaixo do limite de detecção dos ensaios de carga viral o qual é, atualmente, abaixo de cerca de 50 equivalentes ge- ' nômicos/ml de plasma.

. A composição farmacêutica, de preferência, reduz a carga viral de retrovírus selecionados do grupo que consiste em vírus do tumor mamá- rio do rato (Mouse Mammary Tumour Virus - MMTV), virus de Mason Pfizer de macaco (Mason Pfizer Monkey Virus - MPMV), virus da leucemia de célu- las T humana do tipo | (Human T Cell Leukemia Virus Type | - HTLV-I), vírus de leucemia de células T do tipo Il (Human T Cell Leukemia Virus Type |l - HTLWV-I), vírus da leucemia de células T de simios do tipo | (Simian T Cell Leukemia Virus Type | - STLV-I), vírus da leucemia de células T de símios do tipo |l (Simian T Cell Leukemia Virus - Type Il STLV-II), vírus da leucemia bovina (Bovine Leukemia Virus - BLV), vírus da leucemia felina (Feline Leu- kemia Virus - FeLV) e virus da leucemia de Moloney de murinos (Moloney murine Leukemia Virus - MoMLV). Em ainda uma outra modalidade preferi- da, o retrovírus a ser tratado com o fármaco da presente invenção é um len- tivírus. O referido lentivirus é, de preferência, selecionado do grupo que con- siste em vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (Human Immunodefici- ency Virus Type 1 - HIV-1), vírus da imunodeficiência humana do tipo 2 (Human Immunodeficiency Virus Type 2 - HIV-2), virus da imunodeficiência de símios (Simian Immunodeficiency Virus - SIV), vírus da imunodeficiência felina (Feline Immunodeficiency Virus - FIV), vírus da imunodeficiência bovi-

' na (Bovine Immunodeficiency Virus - BIV), vírus Maedi-visna (Maedi-Visna . Virus - MVV), vírus da anemia infecciosa de equinos (Equine Infectious A- nemia Virus - EIAV) e vírus da encefalite artrítica de caprinos (Caprine Arthri- tis Encephalitis Virus - CAEV). Mais preferivelmente, o retrovírus é HIV, em particular HIV-1. No entanto, é óbvio para aqueles versados no campo que a presente invenção é também aplicável a infecções retrovirais por outros re- trovírus que não aqueles mencionados acima.

O indivíduo infectado por um retrovírus ao qual a composição farmacêutica deve ser administrada é selecionado do grupo que consiste em seres humanos, primatas, macacos, vacas, cavalos, cabras, ovelhas e gatos domésticos.

No entanto, o indivíduo é, de preferência, um ser humano.

Em geral, uma quantidade eficaz do vetor de expressão, da re- : combinase configurada ou da célula transformada da presente invenção é . administrada ao indivíduo.

A administração pode ser administração, por e- xemplo, administração intravenosa ou intramuscular.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica é formulada para concomitante administração com outros agentes ativos da terapia antir- retroviral altamente ativa (Highly Active Antiretroviral Therapy - HAART). À terapia antirretroviral altamente ativa HAART é uma terapia combinada que objetiva a transcriptase reversa viral, protease e fusão (GULICK ef al., 1997; LALEZARI et al., 2003). Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é formu- lada para administração concomitante ou subsequente à terapia de ativação imune global ou ativação específica de expressão gênica de pró-virus.

À premissa de terapia de ativação imune se baseia na hipótese de que ativa- ção deliberada de células latentemente infectadas pelo HIV pode acelerar a erradicação de reservatórios virais persistentes.

Erradicação ocorreria via eliminação imune por meio de morte programada daquelas células que ex- pressam ativamente produtos de HIV-1 (pró-apoptóticas) (KULKOSKY & —BRAY, 2006). Ativação imune global (ativação de células imunes, incluindo células em repouso) é normalmente obtida, por exemplo, mediante adminis- tração de imunotoxinas, citocinas (por exemplo, IL-2) ou anticorpos ativado- |

' res de células T (por exemplo, OKT3).

, Tendo em vista o fato de que a ativação imune conduzida para ativar deliberadamente reservatórios latentes HAART-resistentes infelizmen- te não conseguiu eliminar permanentemente o HIV-1 e retorno da carga viral (para revisões vide KULKOSKY & BRAY, 2006: MARCELLO, 2006; Shehu- XHILAGA et al., 2005) em virtude do fato de que a ativação global de células T aparentemente também induz à replicação viral e aumenta o número de potenciais células alvo de HIV-1 além do nível que pode ser contido pela HAART (FRASER et al., 2000), tratamentos mais específicos são necessá- rios para o tratamento do HIV. Uma abordagem é a ativação de transcrição de genomas virais de outro modo quiescente. Ativação específica de ex- pressão gênica de pró-virus latente pode ser obtida mediante administração ' do forbol éster Prostratina ou citocina humana IL-7, os quais parecem ambos . reativar o HIV-1 latente na ausência de proliferação celular (MARCELLO, 2006). Além disso, a ativação transcricional seletiva de HIV-1 pode também ser obtida por inibidores de desacetilase de histona (HDAC1) tal como, por exemplo, ácido valpróico que, eventualmente, induz ao crescimento de HIV- 1 a partir de células em repouso na ausência de ativação celular (MARCEL- LO, 2006; LEHRMAN et a/., 2005).

No entanto, a terapia de ativação imune global ou ativação es- pecífica de expressão gênica do pró-vírus ou estratégias terapêuticas simila- res se beneficiam enormemente da concorrente remoção de DNA pró-viral, deste modo, reduzindo o grupo de células infectadas no paciente.

A presente invenção também proporciona um método de trata- mento e/ou prevenção de uma infecção retroviral, em particular uma infec- ção por HIV, em um indivíduo. Em uma modalidade, a sequência do retroví- rus que infecta o indivíduo é analisada em uma amostra obtida de um indiví- duo e pelo menos um vetor de expressão que codifica para uma recombina- se configurada, pelo menos uma recombinase configurada ou pelo menos uma célula transformada com o referido vetor de expressão, por exemplo, uma célula-tronco adulta é administrada ao indivíduo se o DNA pró-viral do indivíduo compreende a sequência alvo assimétrica identificada na etapa (a)

' na qual a recombinase foi selecionada, A amostra obtida do indivíduo pode - ser uma amostra de sangue, por exemplo, compreendendo células CD4 * infectadas. Breve Descrição das Figuras Figura 1: A figura 1 apresenta os sítios alvo de recombinases específicas, loxP (reconhecido por Cre), loxH (reconhecido por Fre), rox (re- conhecido por Dre), Zox (reconhecido por Zre) e loxLTR (reconhecido por Tre) (SEQ ID NOs: 3 -7), bem como os sítios alvo assimétricos presentes em uma pluralidade de cepas de HIV-1 (SEQ ID NOs: 1 e 2). A sequência espa- çcadora é apresentada em negrito. Posições de nucleotídeos no meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que não são homólogas à um dos sítios alvo conhecidos encontram-se sublinhadas. ' SEQ ID NO: 1 tem uma homologia de 54% com um grupo de sítios alvo co- . nhecidos de recombinase; SEQ ID NO: 2 tem uma homologia de 42% com um grupo de sítios alvo conhecidos de recombinase.

Figura 2: A figura 2 apresenta as sequências dos subsítios usa- dos para geração de recombinases configuradas TRE 3.0 e TRE 4.0. Posi- ções de nucleotídeos no meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita de SEQ ID NO: 1 ou 2 que não são homólogas a um dos sítios alvo conhecidos en- contram-se sublinhadas. Os subsítios 1 e 2 são gerados na etapa (d) do mé- todo da invenção e os subsítios 1A-C e subsítios 2A-C são gerados na etapa (e) do método da invenção. Subsítios 1a/b e subsítios 1b-2a/b, bem como subsítios intermédios 1b + 1, 1b + 2, 2a + 1 e 2a + 2 são gerados em fases adicionais do método da presente invenção.

Figura 3: A figura 3 fornece um esquema da estratégia de evo- lução e mostra os resultados das primeira etapa de evolução para a SEQ ID NO: 1. A biblioteca de recombinases inicial foi gerada por meio de agrupa- mento e embaralhamento de várias recombinases Cre e semelhantes à Cre conhecidas (A). Recombinases bem sucedidas foram enriquecidas realizan- do vários ciclos de evolução de proteina substrato-ligada sobre os subsítios do 2º subconjunto. Em (B), a atividade de recombinação após o 1º ciclo de evolução é ensaiada, em (E) após o 6º ciclo de evolução. O produto recom-

' binado é mais curto, uma vez que a sequência entre os sítios alvo foi exci- - sada, a qual está marcada com um triângulo. Produto não recombinado está marcado com dois triângulos. Recombinases bem sucedidas foram amplifi- cadas por PCR, resultando em um produto de 1,7 kb (C e D). Uma das com- binações errôneas nos subsítios 1C e 2C, respectivamente, foi abordada separadamente (via um sítio alvo loxP com mutação, denominado AloxP, a fim de obter uma maior atividade de recombinação residual nos subsítios 1C e2C(D). Figura 4: A figura 4 fornece um esboço das etapas adicionais da estratégia de evolução e mostra os resultados das etapas finais de evolução para SEQ ID NO: 1. A parte (A) da Figura corresponde às etapas dos primei- ros ciclos de evolução descritos em detalhes na Figura 3. (B) Recombinases , bem sucedidos foram ainda enriquecidas realizando-se vários ciclos de evo- . lução de proteína substrato-ligada sobre os subsítios do 3º subconjunto, se- —guido por vários ciclos de evolução substrato-ligada sobre alguns substratos intermediários (C) e, finalmente, sobre os 1º subsítios (D), de forma a pro- porcionar recombinases específicas para o sítio alvo assimétrico SEQ ID NO: 1. Em (E), a atividade de recombinação após o 8º ciclo de evolução com quantidades relativamente elevadas de ativador de transcrição L-arabinose (L-Ara, 200 ug/ml) é ensaiada, em (F) a atividade de recombinação foi medi- da após o 16º ciclo de evolução com menor indução de transcrição a apenas 50 pg/ml de L-ara. Produto recombinado está marcado com um triângulo, não recombinado com dois triângulos. (G) e (H) mostram a respectiva ativi- dade de recombinação após os ciclos de evolução indicados, as concentra- ções indicadas de L-ara e sobre os subsítios indicados. Após o ciclo de evo- lução final (ciclo 43), a população de recombinase com a maior atividade foi isolada e enriquecida, resultando na biblioteca ativa. Os clones individuais de recombinases foram selecionados e foram submetidos a análises adicio- nais.

Figura 5: A figura 5 fornece um alinhamento das sequências de proteina de (a) recombinase Cre SEQ ID NO: 36; (b) sequência de consenso em comum SEQ ID NO: 37 de recombinases Tre (específica para sítios alvo

: assimétricos dentro da LTR de HIV-1); (c) sequência de consenso obrigató- . ria/estringente SEQ ID NO: 38 de recombinases Tre específicas para SEQ ID NO: 1; e (d) sequência de consenso relaxada SEQ ID NO: 39 (com uma obrigação de 95%) de recombinases Tre específicas para SEQ ID NO: 1. Trechosem negrito indicam aminoácidos conservados; posições não especi- ficadas são indicadas com um X. Exemplos Exemplo 1: Identificação de sequências alvo assimétricas presentes em uma pluralidade de cepas As sequências alvo assimétricas foram identificadas por meio de um método dividido em três etapas: formação de uma matriz de posição ponderada com base em sítios de reconhecimento de uma recombinase ' conhecidos, fornecimento de sequências genômicas que têm de ser pesqui- ' sadas com relação a sítios de reconhecimento e uma pesquisa binária por sítios alvo potenciais nas sequências proporcionadas e classificação do hits resultantes com base na matriz de posição ponderada inicial, em que os nu- cleotídeos são transformados em espaço binário.

Descobriu-se que SEQ ID NO: 1 estava presente em 348 de 379 de isolados de HIV-1 de subtipo B. Além disso, descobriu-se que SEQ ID NO:1 estava presente em 32 das 40 cepas de HIV-1 do subtipo A. Ela está localizada na a região R da LTR.

Descobriu-se que SEQ ID NO: 2 estava presente em 288 de 379 cepas de HIV-1 do subtipo B. Descobriu-se que SEQ ID NO: 2 não estava presente em qualquer um dos 40 isolados de HIV-1 de subtipo A pesquisa- dos.Ela está localizada na região U3 da LTR. Exemplo 2: Geração de uma recombinase configurada que reconhece e re- combina uma sequência alvo assimétrica dentro da LTR de HIV-1 Para iniciar o processo de evolução, foram selecionadas se- quências de LTR de HIV-1 que são altamente conservadas entre cepas de HIV1. Descobriu-se que SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 estavam em con- formidade com estes critérios e representam sequências alvo assimétricas para as quais uma recombinase configurada pode ser selecionada.

' A seguir, a geração de uma recombinase configurada que reco- . nhece SEQ ID NO: 1 é descrita em detalhes.

Um esboço simplificado da estratégia de evolução e os progres- sos feitos até o momento é descrito na Figura 2. De modo geral, a evolução deuma nova recombinase Tre que reconhece especificamente a sequência alvo desejada foi conduzida conforme descrito no documento WO 2008/083931 e descrito por Sarkar et al. (SARKAR et al., Science 2007). A biblioteca de recombinases inicial foi gerada por meio de a- grupamento e embaralhamento de recombinases Cre e várias recombinases semelhantes à Cre conhecidas, isto é, uma biblioteca de mutantes de Cre (Cre/Fre) (Buchholz & Stewart, Nature, 2001), uma biblioteca de Tre previ- amente gerada (Sarkar ef al., Science 2007), Dre (Sauer ef al., Nucl Acids : Res., 2004), Zre (isolada de Salmonella enterica, número de acesso ao . Genbank NZ ABEWO1000015) e Shew (Shewanella sp. cepa ANA-3, núme- rode acesso ao Genbank CPO000470) (2A). A fim de promover a eficiência de embaralhamento de família, Dre e Shew foram modificadas ("Cre-ed") alterando-se a sequência de nucleotídeos de forma que ela fosse tão similar à Cre quanto possível, sem resultar em uma sequência de proteína alterada.

Para realizar evolução de proteína substrato-ligada, a biblioteca de recombi- nases inicial foi clonada nos vetores de evolução (Sarkar et a/., Science 2007) contendo o respectivo subsítio alvo.

Um primeiro subconjunto de dois ácidos nucleicos alvo compre- endendo sequências alvo foi gerado, em que a primeira sequência alvo é designada subsítio 1 e compreende SEQ ID NO: 8 e em que a segunda se- —quência alvo é designada subsítio 2 e compreende SEQ ID NO: 12. Um segundo subconjunto de ácidos nucleicos alvo que compre- ende as sequências alvo modificadas foi, então, gerado com base nos subsíi- tios 1 e 2. Conforme mostrado na figura 2, ele compreende SEQ ID NOs: 9- 11 e 13-15, respectivamente.

Realçado em cinza estão combinações errô- neas das sequências em referência ao grupo das sequências alvo conheci- das reconhecidas pelas recombinases contidas na biblioteca inicial.

As bibli- otecas de subsítio foram independentemente crescidas em E. coli.

Nos pri-

' meiros poucos ciclos de evolução (1-4), expressão da recombinase foi indu- . zida com 200 pg/mL de L-arabinose; nos ciclos seguintes, com 100 ug/ml (ciclos 5-6). Culturas foram crescidas durante 13 horas a 37 ºC sob agitação. Para ensaiar a atividade de recombinação, o DNA de plasmídeo isolado das culturasfoidigerido com BsrG| e Xbal. A digestão do DNA de plasmídeo re- combinado resulta em um fragmento mais curto do aquele do plasmideo não recombinado (Sarkar et al., Science 2007). Após o primeiro ciclo de evolu- ção, nenhuma ou bandas muito fracas do produto recombinado podem ser monitoradas para todas as bibliotecas de subsítio 1A, IB, 1C, 2A, 28 e 2C (Figura3B). Para isolar recombinases com sucesso, o DNA de plasmídeo foi digerido com Ndel e amplificado por PCR antes da clonagem dos mes- mos novamente nos respectivos vetores de evolução para o próximo ciclo de ' evolução (Sarkar ef al., Science 2007). Após o primeiro ciclo de evolução, . atividade residual suficiente foi obtida para as bibliotecas de subsítio 1A, 1B, 2Ae2B,mas não para as bibliotecas de subsítio 1C e 2C (Figura 3C). Des- cobriu-se que a combinação errônea na posição 11 da sequência alvo de 34 bp era mais crítica para a atividade de recombinação. Consequentemente, um sítio loxP modificado foi gerado, com o nome AloxP, contendo apenas esta mutação única (T) e a respectiva repetição invertida na posição 24 (A). Quando de testagem da biblioteca de recombinases inicial no vetor de evo- lução contendo o sítio alvo AloxP, atividade residual suficiente foi obtida (Fi- gura 3D). A biblioteca de recombinases amplificada bem sucedida foi clona- da novamente nos vetores de evolução com os subsítios 1C e 2C, respecti- vamente, e testadas com relação à atividade de recombinação. Agora, ativi- daderesidual suficiente também foi obtida para as bibliotecas de subsítio 1C e 2C (Figura 3D), de modo que o processo de evolução sobre todos os sub- sítios pôde ser iniciado. 6 ciclos de evolução foram realizados em cada um dos subsítios 1A, 1B, 1C, 2A, 2B e 2C, enriquecendo significativamente as bibliotecas de recombinases bem sucedidas, conforme pode ser observado —nogelde teste mostrado na Figura 3E (comparar com a Figura 3B). As bibliotecas de subsítio enriquecidas são combinadas e emba- ralhadas para obter bibliotecas para a continuação do processo de ciclos de

NI

Ú evolução sobre o 2º subconjunto de sequências alvo, a saber, subsítio 1 e . subsítio 2. As bibliotecas de recombinases bem sucedidos são, então, enri- quecidas, conforme descrito acima, antes de combinação e embaralhamento das mesmas para o estágio final dos ciclos de evolução, que é a evolução nosítio alvo a ser especificamente reconhecido pela recombinase Tre. O ácido nucleico que codifica a recombinase pode ser obtido a partir da biblio- teca e clonado em um vetor de expressão. Materiais e métodos são utilizados conforme descrito no docu- mento WO 2008/083931 e BUCHHOLZ & STEWART, 2001, salvo indicação em contrário. As recombinases TRE obtidas adaptadas para reconhecer e re- combinar as sequências alvo assimétricas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ' são sequenciadas e a sua capacidade de recombinar DNA pró-viral de dife- . rentes cepas de HIV-1 alvo confirmada. Listade Referência Abremski K, Hoess RH, Sternberg N (1983) "Studies on the properties of PI site-specífic recombination: evidence for topologically un- linked products following recombination". Cell 32,1301-1311. Abremski K, Hoess R (1983) "Bacteriophage PI site-specífic re- combination. Purification and properties of the Cre recombinase protein". J. Biol. Chem. 259, 1509-1514. Adachi A, Gendelman HE, Koenig S, Folks T, Willey R, Rabson A, Martin MA (1986) "Production of acquired immunodeficiency syndrome- associated retrovirus in human and non human cells transfected with an in- fectious molecular clone". J. Virol. 59, 284-291. Alper H, Fischer C, Nevoigt E, Stephanopoulos G (2006) "Tuning genetic control through promoter engineering". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12678-12683. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miler, W.eLipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new ge- neration of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25, 3389-3402.

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Claims

] REIVINDICAÇÕES , 1. Método para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo assimétricas dentro da LTR do DNA pró- viral deuma pluralidade de cepas retrovirais, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) identificação das sequências com uma homologia de pelo menos 30% com a sequência do meio-sítio à esquerda e a sequência do meio-sítio à direita de pelo menos um sítio alvo conhecido da recombinase,

na sequência de LTR do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovi- rais, em que as sequências homólogas são separadas por um espaçador de 5-12 nucleotídeos e em que a sequência alvo assimétrica é encontrada em ? uma pluralidade de cepas retrovirais;

. (b) identificação de duas sequências, em que a primeira sequên- cia corresponde à sequência da sequência alvo assimétrica da etapa (a) homóloga aomeio-sítio à esquerda do referido sítio alvo conhecido e é refe- rida como "sequência de meio-sítio 1" e em que a segunda sequência cor- responde à sequência da sequência alvo assimétrica da etapa (a) homóloga ao meio-sitio à direita e é referida como "sequência de meio-sítio 2"; (c) determinação de nucleotídeos, dentro das sequências da e- tapa (b), que divergem das sequências de meio-sítio à esquerda e meio-sítio à direita homológas correspondentes do pelo menos sítio alvo homólogo co-

nhecido da etapa (a);

(d) geração de um primeiro subconjunto de dois ácidos nucleicos alvo compreendendo sequências alvo, em que a primeira sequência alvo é designada subsítio 1 e compreende, adjacentes uns aos outros e na ordem 5 'para 3', a sequência de meio-sítio 1 da etapa (b), a sequência espaçadora da sequência alvo assimétrica e uma repetição invertida de sequência de meio-sítio 1 e em que a segunda sequência alvo é designada subsitio 2 e compreende, adjacentes uns dos outros e na ordem 5 'para 3', uma repeti- ção invertida de sequência de meio-sítio 2, a sequência espaçadora da se-

quência alvo assimétrica e a sequência de meio-sítio 2 da etapa (b);

|

' (e) geração de um segundo subconjunto de ácidos nucleicos al- vo que compreende as sequências alvo modificadas com base nas sequên- cias alvo no primeiro subconjunto da etapa (d), em que, nas sequências ba- seadas no subsítio 1, na sequência de meio-sitio à esquerda, uma porção dos nucleotideos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga cor- respondente do pelo menos um sítio alvo conhecido da etapa (a) é substitui- da pelos nucleotídeos nativos encontrados no referido sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de meio-sítio contenha um, dois ou três nucleo- tídeos que divergem do referido sítio alvo conhecido, em que o meio-sítio à direita da referida sequência alvo modificada é formado por uma repetição invertida da referida sequência de meio-sítio à esquerda modificada, a qual é separada da referida sequência de meio-sítio à esquerda pela sequência 7 espaçadora da sequência alvo assimétrica, e em que, em sequências base- . adas no subsítio 2, na sequência de meio-sitio à direita, uma porção dos nu- cleotídeos que divergem da sequência de meio-sítio homóloga correspon- dente do pelo menos um sítio alvo conhecido da etapa (a) é substituída pe- los nucleotideos nativos encontrados no referido sítio alvo conhecido, até que a referida sequência de meio-sítio contenha um, dois ou três nucleotí- deos que divergem do referido sítio alvo conhecido, em que o meio-sítio à esquerda da referida sequência alvo modificada é formado por uma repeti- ção invertida da referida sequência de meio-sítio à direita modificada, a qual é separada da referida sequência de meio-sítio à direita pela sequência es- paçadora da sequência alvo assimétrica, de modo que, em todas as se- quências de meio-sítio modificadas que se originam de uma sequência alvo do primeiro subconjunto da etapa (d) tomadas juntas, todos os nucleotideos divergentes podem ser encontrados, enquanto que nenhuma das referidas sequências de meio-sítio modificadas isoladamente compreende todos os nucleotídeos divergentes;

(f) aplicação, separadamente, de evolução molecular dirigida so- bre pelomenos uma recombinase que reconhece um sítio alvo conhecido homólogo de acordo com a etapa (a) utilizando cada ácido nucleico do se-

gundo subconjunto obtido na etapa (e) como um substrato;

: (g) embaralhamento das bibliotecas de recombinase evoluídas . na etapa (f), em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram so- bre sequências com base no subsítio 1 são combinadas e embaralhadas e em que todas as bibliotecas de recombinase que evoluíram sobre sequên- ciascom base no subsítio 2 são combinadas e embaralhadas; (h) aplicação de evolução molecular dirigida sobre as bibliotecas embaralhadas obtidas na etapa (g) utilizando cada ácido nucleico do sub- conjunto de acordo com a etapa (d) como um substrato; (1) embaralhamento das bibliotecas de recombinase evoluídas na etapa(h); (]) aplicação de evolução molecular dirigida sobre a biblioteca embaralhada obtida na etapa (g) utilizando um ácido nucleico que compre- º ende a sequência alvo assimétrica da etapa (a) como um substrato, até que . seja obtida pelo menos uma recombinase que é ativa sobre a sequência alvo assimétrica dentro da LTR do DNA retroviral da etapa (a); (k) isolamento do ácido nucleico da pelo menos uma recombina- se obtida na etapa (j) da biblioteca; e (1) clonagem do ácido nucleico obtido na etapa (k) em um vetor de expressão adequado.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o retrovírus é HIV, de preferência HIV-1.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o retrovírus é HIV-1 e a sequência alvo assimétrica tem a se- quência apresentada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma recombinase conhecida cuja sequência alvo é usada na etapa (a) e sobre a qual evolução molecular dirigida é aplicada na etapa (f) é parte de uma biblioteca de recombinase.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a evolução molecular dirigida empregada é evolução de proteina substrato-ligada.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a | í 5, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão na etapa (|) é sele- . cionado do grupo que consiste em vetores retrovirais, vetores lentivirais, ve- tores adenovirais e vetores de spumavírus.
7. Método para preparo de uma recombinase configurada, carac- terizado pelo fato de que compreende o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e a etapa adicional de expressão da recombi- nase configurada a partir do ácido nucleico que codifica a recombinase inse- rida no vetor de expressão em uma célula hospedeira adequada, em que a recombinase é opcionalmente expressa como um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos da recombinase configurada.
8. Método para preparo de uma célula transformada, caracteri- zado pelo fato de que compreende o método de acordo com qualquer uma 9 das reivindicações 1 a 6 e a etapa adicional de introdução do vetor de ex- . pressão em uma célula in vitro, em que a célula é, de preferência, uma célu- latronco adulta.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de preparo do vetor de expressão, da recombinase ou célula como uma composição far- macêutica.
10. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que que codifica para uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é ca- paz de recombinação de sequências alvo assimétricas dentro da LTR do DNA pró-viral de uma pluralidade de cepas retrovirais, em que a sequência de aminoácidos da recombinase configurada tem pelo menos 97% de identi- dade de sequência com uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 38, em que o ácido nucleico é opcionalmente um vetor de expressão.
11. Ácido nucleico conforme obtenível a partir da etapa (k) do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou o vetor de expressão conforme obtenível a partir do método como definido em qual- queruma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequên- cia de aminoácidos da recombinase configurada tem opcionalmente pelo menos 97% de identidade de sequência com uma sequência de acordo com

? SEQ ID NO: 38 e/ou em que a recombinase configurada codificada pelo ácido nucleico compreende, opcionalmente, uma sequência de aminoácidos de a- cordo com SEQ ID NO: 37.
12. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a recombinase configurada compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 37, em que a referida recombinase configurada compreende pelo menos uma, de preferência, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 das trocas de aminoácido definidas quando comparado com à sequência Cre (SEQ ID NO: 36) selecionada do grupo que consisteem: P12S, P15L, M44V, K86N, G93A, A1758S e P307A.
13. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da º recombinase configurada compreende a sequência de acordo com SEQ ID . NO: 38, em que a sequência de aminoácidos da recombinase configurada compreende opcionalmente a sequência de acordo com SEQ ID NO: 39 e/ou em que a sequência de aminoácidos da recombinase configurada é opcio- nalmente selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 40-64 e uma combinação de sequências do grupo que consiste em SEQ ID NO: 40-64.
14. Recombinase configurada codificada pelo ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que é opcionalmente expressa como uma proteína de fusão.
15. Célula transformada compreendendo um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula-tronco da linhagem hematopoiética.
16. Célula transformada de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizada pelo fato de que é, de preferência, uma célula procariótica tal como células de bactérias ou leveduras.
17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindi- cações10a13,uma recombinase configurada como definida na reivindicação 14 e/ou uma célula transformada como definida nas reivindicações 15 e 16.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17,

': 6/6 . * caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é para o uso no í tratamento ou prevenção de infecção por retrovírus em um indivíduo, em que o retrovírus é, de preferência, HIV, em particular HIV-1, em que a composi- ção farmacêutica é opcionalmente formulada para administração a um indi- víduo, se DNA pró-viral encontrado em uma amostra obtida do indivíduo compreende a sequência alvo assimétrica identificada na etapa (a) na qual a recombinase foi selecionada.
19. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto —oude processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- lada ou ilustrada no pedido de patente. a

7 RESUMO + Patente de Invenção: "MÉTODO PARA PREPARO DE UM VETOR DE EX- PRESSÃO QUE CODIFICA UMA RECOMBINASE CONFIGURADA, MÉ- TODO PARA PREPARO DE UMA CÉLULA TRANSFORMADA, ÁCIDO —NUCLEICO, RECOMBINASE CONFIGURADA CODIFICADA PELO ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA TRANSFORMADA E COMPOSIÇÃO FARMACÊU- TICA". A presente invenção refere-se a um método para preparo de um vetor de expressão que codifica uma recombinase configurada, recombinase configurada a qual é capaz de recombinação de sequências alvo assimétri- cas dentro da repetição terminal longa (LTR) do DNA pró-viral de uma plura- lidade de cepas retrovirais inseridas no genoma de uma célula hospedeira, º bem como ao vetor de expressão obtido, células transfectadas com este, - recombinase expressa e composições farmacêuticas que compreendem o vetor de expressão, células e/ou recombinase.

As composições farmacêuti- cas são úteis, por exemplo, no tratamento e/ou prevenção de infecção retro- viral.

Em particular, sequências alvo assimétricas presentes em uma plurali- dade de cepas de HIV são descritas, bem como recombinases configuradas capazes de combinação destas sequências (Tre 3.0 e 4.0) e vetores de ex- pressão que codificam as mesmas.