BR102021014148A2 - UNILAMELLAR ANIONIC NANOLIPOSOME AND ITS SINGLE-STEP PRODUCTION PROCESS - Google Patents
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Abstract
A presente descrição se refere a um nanolipossoma aniônico (AL) e um nanolipossoma aniônico stealth (AL), ambos unilamelares, com dimensões entre 52 e 58 nm e índice de polidispersão entre 0,05 e 0,09. Também é descrito seu processo de produção contínuo, em etapa única, utilizando um dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica (1), que consiste na injeção de uma mistura de fosfolipídios dispersa em solvente orgânico com baixa toxicidade numa entrada de fluido principal (2) do dispositivo microfluídico (1), concomitantemente com a injeção de uma solução salina (PBS) em pelo menos uma entrada de fluido radial (3) do dispositivo microfluídico (1), sendo recolhida uma solução com nanolipossomas aniônicos unilamelares em pelo menos uma saída de fluido (4) do dispositivo microfluídico (1).
Description
[0001] A presente descrição é do campo de preparação de dispersões de lipossomas, com ênfase em processos utilizando dispositivos microfluídicos.[0001] The present description is from the field of preparation of liposome dispersions, with emphasis on processes using microfluidic devices.
[0002] Sistema de entrega de fármacos é uma área promissora da nanomedicina, de caráter multidisciplinar, e que vem revolucionando o sistema convencional de administração de fármacos. A eficiência na atuação desses sistemas depende do sistema utilizado e de suas características.[0002] Drug delivery system is a promising area of nanomedicine, with a multidisciplinary nature, and which has been revolutionizing the conventional drug delivery system. The efficiency in the operation of these systems depends on the system used and its characteristics.
[0003] Nesse sentido os lipossomas ou vesículas fosfolipídicas que são agregados de fosfolipídios que formam uma bicamada ou mais com interior aquoso são estratégicas, visto que podem atuar como carreadores de substâncias ativas no organismo, e favorecer melhor biodistribuição de medicamentos e aumentar os resultados terapêuticos associados.[0003] In this sense, liposomes or phospholipid vesicles that are aggregates of phospholipids that form one or more bilayers with an aqueous interior are strategic, since they can act as carriers of active substances in the body, and favor better biodistribution of drugs and increase therapeutic results associates.
[0004] Dentre os tipos de lipossomas, os lipossomas aniônicos (AL) foram examinados como alternativas aos lipossomas catiônicos em aplicações na nanomedicina, por exemplo, em sistemas de entregas de DNA de plasmídeo, devido à sua baixa toxicidade. Em particular, destacamos as formulações lipossomais aniônicas compostas por dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG) que foram lançadas para desenvolvimento clínico, evidenciando o grande potencial dos AL com essa formulação para atuar como nanocarreadores de fármacos para aplicações em liberação de fármacos.[0004] Among the types of liposomes, anionic liposomes (AL) have been examined as alternatives to cationic liposomes in nanomedicine applications, for example, in plasmid DNA delivery systems, due to their low toxicity. In particular, we highlight the anionic liposomal formulations composed of dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) and dimyristoyl phosphatidylglycerol (DMPG) that were launched for clinical development, evidencing the great potential of LA with this formulation to act as drug nanocarriers for drug delivery applications.
[0005] Entretanto, apesar do grande potencial de aplicação dessas nanoestruturas na nanomedicina alguns desafios subsistem: a alta taxa de eliminação dos lipossomas pelo sistema imune e processo de produção laborioso.[0005] However, despite the great potential for applying these nanostructures in nanomedicine, some challenges remain: the high rate of elimination of liposomes by the immune system and the laborious production process.
[0006] A utilização de lipídios quimicamente modificados contendo uma cadeia de polímero como polietilenoglicol (PEG), tem sido amplamente estudada, porquanto, viabiliza uma camada protetora na superfície da lamela os tornando furtivo (stealth) com intuito de estender a permanência dos lipossomas aniônicos no sistema circulatório.[0006] The use of chemically modified lipids containing a polymer chain such as polyethylene glycol (PEG) has been widely studied, as it enables a protective layer on the surface of the lamella making them stealthy in order to extend the permanence of anionic liposomes in the circulatory system.
[0007] Sobre os processos laboriosos de produção, a microfluídica, que é a ciência do escoamento de fluidos em canais de escala micrométrica, vem sendo frequentemente aplicada na produção de nanoagregados, como os lipossomas.[0007] Regarding laborious production processes, microfluidics, which is the science of fluid flow in micrometer-scale channels, has been frequently applied in the production of nanoaggregates, such as liposomes.
[0008] Os métodos de produção já descritos na literatura para os lipossomas aniônicos com a formulação DMPC:DMPG:DSPE-PEG são relativamente complexos, pouco reprodutíveis, utilizam solventes orgânicos tóxicos e necessitam de etapas de pós-processamento. Ainda, esses métodos não garantem a homogeneidade dos sistemas e produzem nanoagregados com mais de 100 nm. O tamanho dos sistemas e a homogeneidade são parâmetros fundamentais para o controle da dose do fármaco, permanência no organismo e absorção celular. É conhecido que lipossomas menores e menor polidispersidade são estratégicos no ganho de biodisponibilidade.[0008] The production methods already described in the literature for anionic liposomes with the DMPC:DMPG:DSPE-PEG formulation are relatively complex, not very reproducible, use toxic organic solvents and require post-processing steps. Still, these methods do not guarantee the homogeneity of the systems and produce nanoaggregates with more than 100 nm. The size of the systems and the homogeneity are fundamental parameters for the control of the drug dose, permanence in the organism and cellular absorption. It is known that smaller liposomes and lower polydispersity are strategic in gaining bioavailability.
[0009] Nesse sentido, estudos voltados para o melhoramento das propriedades dos nanolipossomas e seus métodos de produção são necessários e pertinentes, visto que essa formulação chama bastante atenção pelas vantagens no encapsulamento de fármacos constituídos por pequenas moléculas com baixa solubilidade em água.[0009] In this sense, studies aimed at improving the properties of nanoliposomes and their production methods are necessary and relevant, since this formulation draws a lot of attention for its advantages in the encapsulation of drugs consisting of small molecules with low solubility in water.
[0010] O estado da técnica compreende alguns métodos de produção de lipossomas com aplicações biológicas.[0010] The state of the art comprises some methods of producing liposomes with biological applications.
[0011] O documento de patente CN112108193A revela o método de produção de lipossomas através de um sistema microfluídico SHM (acrônimo inglês para Staggered Herringbone Micromixer) ou Tesla. A seguinte produção é caracterizada pela inserção de moléculas de colesterol na formulação lipídica, assim como, utilização de solventes orgânicos, sendo alguns solventes tóxicos, como o metanol e isopropanol. As amostras de lipossomas obtidos apresentaram dimensões principais entre 110 nm e 600 nm e PDI (acrônimo inglês para Polydispersity Index) próximo de 0,4.[0011] The patent document CN112108193A discloses the method of producing liposomes through a microfluidic system SHM (English acronym for Staggered Herringbone Micromixer) or Tesla. The following production is characterized by the insertion of cholesterol molecules in the lipid formulation, as well as the use of organic solvents, some of which are toxic solvents, such as methanol and isopropanol. The obtained liposome samples showed principal dimensions between 110 nm and 600 nm and PDI (English acronym for Polydispersity Index) close to 0.4.
[0012] No documento de patente BRPI0720733 consta a preparação de lipossomas de tamanhos entre 30 e 80 nm, compreendendo, ou não, moléculas de colesterol inseridas na membrana, a fim de regular a sua fluidez. Ainda, foram utilizados álcool t-butílico ou ciclo-hexano na preparação da fase orgânica, que são solventes orgânicos de alta toxicidade, produzindo sistemas multilamelares heterogêneos. O método de obtenção dos lipossomas consiste na hidratação do filme seco, o que não garante a homogeneidade e reprodutibilidade dos sistemas, além disso, foram necessárias múltiplas etapas de pós processamento.[0012] The patent document BRPI0720733 contains the preparation of liposomes of sizes between 30 and 80 nm, comprising, or not, cholesterol molecules inserted into the membrane, in order to regulate its fluidity. Still, t-butyl alcohol or cyclohexane were used in the preparation of the organic phase, which are highly toxic organic solvents, producing heterogeneous multilamellar systems. The method of obtaining liposomes consists of hydration of the dry film, which does not guarantee the homogeneity and reproducibility of the systems, in addition, multiple post-processing steps were required.
[0013] O documento CA2928387 expõe a obtenção de lipossomas contendo sais de amônio e poliânions no seu interior por seus métodos clássicos de produção, os quais utilizam solventes tóxicos, que são realizados em diversas etapas e não conferem a homogeneidade do sistema.[0013] Document CA2928387 exposes the obtainment of liposomes containing ammonium salts and polyanions inside them by their classic production methods, which use toxic solvents, which are carried out in several steps and do not confer the homogeneity of the system.
[0014] Forbes e colaboradores (2019, International journal of pharmaceutics, 556, 68-81), tal qual, Khadke e colaboradores (2019, Journal of Controlled Release, 307, 211-220) revelam a obtenção de lipossomas multilamelares por mecanismos já descritos na literatura, demonstrando processo laborioso com diversas etapas de pós processamento e utilização de solventes com alta toxicidade.[0014] Forbes et al. (2019, International journal of pharmaceutics, 556, 68-81), just like Khadke et al. (2019, Journal of Controlled Release, 307, 211-220) reveal obtaining multilamellar liposomes by mechanisms already described in the literature, demonstrating a laborious process with several post-processing steps and the use of solvents with high toxicity.
[0015] É descrito no documento de patente BR 102017025862-9 a produção de lipossomas stealth catiônicos, obtidos através do processo microfluídico de focalização hidrodinâmica, possuindo composição lipídica de EPC:DOPE:DOTAP:DSPE-PEG. As amostras apresentaram diâmetro médio de 112,32 nm e PDI 0,14, tendo aplicação preferencial em terapia gênica, no processo de transfecção, que é facilitado pelo caráter catiônico dos lipossomas de interesse.[0015] It is described in the patent document BR 102017025862-9 the production of cationic stealth liposomes, obtained through the microfluidic process of hydrodynamic focusing, having a lipid composition of EPC:DOPE:DOTAP:DSPE-PEG. The samples had an average diameter of 112.32 nm and PDI 0.14, with preferential application in gene therapy, in the transfection process, which is facilitated by the cationic character of the liposomes of interest.
[0016] Nas anterioridades apresentadas são propostos métodos de obtenção de lipossomas aniônicos utilizando solventes com alta toxicidade, produzindo lipossomas multilamelares, dependendo de pós processamento e múltiplas etapas de produção.[0016] In the presented prior art methods are proposed for obtaining anionic liposomes using solvents with high toxicity, producing multilamellar liposomes, depending on post-processing and multiple production steps.
[0017] Portanto, não é revelado no estado da técnica a produção em etapa única de lipossomas aniônicos (do acrônimo inglês AL) e lipossomas aniônicos stealth (do acrônimo inglês SAL) unilamelares, uniformes, com elevada estabilidade coloidal e térmica, sendo de dimensões pequenas (e.g., inferior a 53,7 nm), com PDI inferior a 0,1, utilizando uma composição lipídica comercial (e.g., DMPC:DMPG) e um solvente de baixa toxicidade.[0017] Therefore, the state of the art does not reveal the single-step production of anionic liposomes (from the English acronym AL) and stealth anionic liposomes (from the English acronym SAL) unilamellar, uniform, with high colloidal and thermal stability, with dimensions small (e.g., less than 53.7 nm), with PDI less than 0.1, using a commercial lipid composition (e.g., DMPC:DMPG) and a low toxicity solvent.
[0018] É um dos objetivos da presente descrição revelar um processo de produção contínuo de AL e SAL unilamelares, em etapa única, resultando em nanolipossomas com elevada estabilidade coloidal e térmica, de dimensões inferiores a 58 nm e PDI inferior a 0,1, utilizando como insumos uma composição lipídica comercial e um solvente orgânico de baixa toxicidade.[0018] It is one of the objectives of this description to reveal a continuous production process of unilamellar AL and SAL, in a single step, resulting in nanoliposomes with high colloidal and thermal stability, with dimensions smaller than 58 nm and PDI lower than 0.1, using a commercial lipid composition and a low toxicity organic solvent as inputs.
[0019] Os objetivos da presente descrição são alcançados por um processo de produção de lipossomas aniônicos (AL) unilamelares, conduzido em um dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica. Tais dispositivos encontram-se prontamente disponíveis no estado da técnica, compreendendo pelo menos duas entradas de fluido e pelo menos uma saída de fluido, com canais tendo dimensões internas entre 135 e 145 μm, preferencialmente 140 μm. O processo compreende as etapas de:[0019] The objectives of this description are achieved by a production process of unilamellar anionic liposomes (AL), conducted in a hydrodynamic focusing microfluidic device. Such devices are readily available in the state of the art, comprising at least two fluid inlets and at least one fluid outlet, with channels having internal dimensions between 135 and 145 μm, preferably 140 μm. The process comprises the steps of:
[0020] injetar em pelo menos uma entrada de fluido principal do dispositivo microfluídico uma mistura de fosfolipídios dispersos em solvente orgânico compreendendo pelo menos os fosfolipídios dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG) em proporções entre 95:5 e 85:15 %molar de DMPC:DMPG, preferencialmente em proporções de 90:10 %molar, a mistura de fosfolipídios tendo concentrações entre 20 e 30 mM em solvente orgânico, preferencialmente tendo concentração de 25 mM em solvente orgânico; e, simultaneamente,[0020] inject into at least one main fluid inlet of the microfluidic device a mixture of phospholipids dispersed in organic solvent comprising at least the phospholipids dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) and dimyristoylphosphatidyl glycerol (DMPG) in proportions between 95:5 and 85:15 mol % of DMPC:DMPG, preferably in proportions of 90:10 mol %, the mixture of phospholipids having concentrations between 20 and 30 mM in organic solvent, preferably having concentration of 25 mM in organic solvent; and, simultaneously,
[0021] injetar uma solução tampão em pelo menos uma entrada de fluido radial do dispositivo microfluídico, em que a taxa entre a velocidade de escoamento da solução tampão e a velocidade de escoamento da mistura de fosfolipídios é de 5 a 40, preferencialmente 10; e,[0021] injecting a buffer solution into at least one radial fluid inlet of the microfluidic device, wherein the ratio between the flow velocity of the buffer solution and the flow velocity of the phospholipid mixture is from 5 to 40, preferably 10; It is,
[0022] recolher uma solução com lipossomas aniônicos (AL) unilamelares em pelo menos uma saída de fluido do dispositivo microfluídico.[0022] Collect a solution with unilamellar anionic liposomes (AL) in at least one fluid outlet of the microfluidic device.
[0023] Os objetivos da presente descrição também são alcançados por um processo de produção de lipossomas aniônicos stealth (SAL) unilamelares, conduzido nos mesmos dispositivos e condições do processo de produção de lipossomas aniônicos (AL) unilamelares, diferindo apenas pelo fato da mistura de fosfolipídios injetada compreender ainda o estabilizador estérico 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000 (mDSPE-PEG2000) em proporções entre 94,5:5:0,5 e 85:13:2 %molar de DMPC:DMPG:mDSPE-PEG2000, preferencialmente em proporções de 89:10:1 %molar, a mistura de fosfolipídios tendo concentrações entre 20 e 30 mM em solvente orgânico, preferencialmente tendo concentração de 25 mM em solvente orgânico.[0023] The objectives of the present description are also achieved by a production process of unilamellar anionic liposomes (SAL), conducted in the same devices and conditions of the production process of unilamellar anionic liposomes (AL), differing only by the fact that the mixture of Injected phospholipids further comprise the steric stabilizer 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 (mDSPE-PEG2000) in ratios between 94.5:5:0.5 and 85: 13:2 mole % DMPC:DMPG:mDSPE-PEG2000, preferably in proportions of 89:10:1 mole %, the phospholipid mixture having concentrations between 20 and 30 mM in organic solvent, preferably having a concentration of 25 mM in organic solvent .
[0024] A presente invenção encontra-se ilustrada nas modalidades representadas em figuras, conforme brevemente descritas a seguir.[0024] The present invention is illustrated in the embodiments represented in figures, as briefly described below.
[0025] A figura 1 é uma representação esquemática de uma modalidade do processo de produção e dos nanolipossomas aniônicos stealth unilamelares da presente descrição.[0025] Figure 1 is a schematic representation of one embodiment of the production process and unilamellar stealth anionic nanoliposomes of the present description.
[0026] As figuras 2a, 2b e 2c são gráficos resultantes de ensaios de caracterização dos nanolipossomas aniônicos (AL) unilamelares obtidos pelo presente método, sendo, respectivamente, caracterização de distribuição de tamanho por espalhamento dinâmico de luz (da sigla inglesa, DLS), caracterização de potencial zeta por anemometria de laser-doppler (com acrônimo inglês LDA), em diversos tempos, e caracterização por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (conhecido pelo acrônimo SAXS, do inglês), em diversas temperaturas.[0026] Figures 2a, 2b and 2c are graphs resulting from characterization tests of unilamellar anionic nanoliposomes (AL) obtained by the present method, being, respectively, characterization of size distribution by dynamic light scattering (DLS) , characterization of zeta potential by laser-doppler anemometry (with the English acronym LDA), at different times, and characterization by low-angle X-ray scattering (known by the acronym SAXS), at different temperatures.
[0027] As figuras 3a, 3b e 3c são gráficos resultantes de ensaios de caracterização dos nanolipossomas aniônicos stealth (SAL) unilamelares obtidos pelo presente método, sendo, respectivamente, caracterização de distribuição de tamanho por espalhamento dinâmico de luz (DLS), caracterização de potencial zeta por anemometria de laser-doppler (LDA), em diversos tempos, e caracterização por espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS), em diversas temperaturas.[0027] Figures 3a, 3b and 3c are graphs resulting from characterization tests of unilamellar stealth anionic nanoliposomes (SAL) obtained by the present method, being, respectively, characterization of size distribution by dynamic light scattering (DLS), characterization of zeta potential by laser-doppler anemometry (LDA), at different times, and characterization by small angle X-ray scattering (SAXS), at different temperatures.
[0028] A figura 3d é uma imagem de criomicroscopia eletrônica de transmissão dos nanolipossomas aniônicos stealth obtidos pelo presente método.[0028] Figure 3d is a transmission electron cryomicroscopy image of the stealth anionic nanoliposomes obtained by the present method.
[0029] A presente descrição se refere a um nanolipossoma aniônico (AL) e um nanolipossoma aniônico stealth (SAL), ambos unilamelares, com dimensões entre 52 e 55 nm e índice de polidispersão entre 0,09 e 0,07. Também é descrito seu processo de produção contínuo, em etapa única, utilizando um dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica.[0029] This description refers to an anionic nanoliposome (AL) and a stealth anionic nanoliposome (SAL), both unilamellar, with dimensions between 52 and 55 nm and polydispersion index between 0.09 and 0.07. Its continuous production process, in a single step, using a hydrodynamic focusing microfluidic device is also described.
[0030] A figura 1 é uma representação esquemática de uma modalidade do processo de produção e dos nanolipossomas aniônicos unilamelares da presente descrição. São representados nesta figura os principais elementos de uma modalidade do dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica (1), com detalhe para o encontro das correntes de fluxos (5) internos. Também é representado o mecanismo de formação dos nanolipossomas unilamelares, favorecido pela diminuição da concentração de solvente orgânico após a focalização hidrodinâmica.[0030] Figure 1 is a schematic representation of one embodiment of the production process and unilamellar anionic nanoliposomes of the present description. This figure represents the main elements of a modality of the hydrodynamic focusing microfluidic device (1), with details for the meeting of the internal flow currents (5). The formation mechanism of unilamellar nanoliposomes is also represented, favored by the decrease in the concentration of organic solvent after hydrodynamic focusing.
[0031] Em uma modalidade do processo de produção de nanolipossomas aniônicos unilamelares, o dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica (1) compreende: pelo menos duas entradas de fluido (2,3); e pelo menos uma saída de fluido (4), em que as entradas de fluido (2,3) são conectadas fluidamente por microcanais (5) que se unem em um microcanal (5) conectado fluidamente a saída de fluido (4), os microcanais (5) tendo dimensões internas entre 135 e 145 μm, preferencialmente 140 μm.[0031] In one embodiment of the unilamellar anionic nanoliposomes production process, the hydrodynamic focusing microfluidic device (1) comprises: at least two fluid inlets (2,3); and at least one fluid outlet (4), in which the fluid inlets (2,3) are fluidly connected by microchannels (5) that join in a microchannel (5) fluidly connected to the fluid outlet (4), the microchannels (5) having internal dimensions between 135 and 145 μm, preferably 140 μm.
[0032] Em uma modalidade deste processo, o dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica possui uma única entrada de fluido principal (2) e duas entradas de fluido radiais (3), em que as entradas de fluido radiais (3) são perpendiculares à entrada de fluido principal (2). Essa modalidade resulta em um dispositivo microfluídico (1) com microcanais (5) em formato de "T", conforme representado na figura 1.[0032] In one embodiment of this process, the hydrodynamic focusing microfluidic device has a single main fluid inlet (2) and two radial fluid inlets (3), wherein the radial fluid inlets (3) are perpendicular to the inlet of main fluid (2). This modality results in a microfluidic device (1) with microchannels (5) in a "T" shape, as shown in figure 1.
[0033] Em outras modalidades, o dispositivo microfluídico de focalização possui uma pluralidade de entradas de fluido radiais, sendo perpendiculares ou não a entrada de fluido principal, em que essas modalidades de dispositivo se encontram prontamente disponíveis no estado da técnica, conforme revisão apresentada por Lu e colaboradores, 2016 (Nano Today, 11(6); 778-792). Em outras modalidades, o dispositivo microfluídico de focalização possui uma pluralidade de entradas de fluido radiais, sendo coaxiais a entrada de fluido principal.[0033] In other embodiments, the microfluidic focusing device has a plurality of radial fluid inlets, whether perpendicular or not to the main fluid inlet, in which these device modalities are readily available in the state of the art, as per a review presented by Lu et al., 2016 (Nano Today, 11(6); 778-792). In other embodiments, the microfluidic focusing device has a plurality of radial fluid inlets, with the main fluid inlet being coaxial.
[0034] Em quaisquer modalidades deste processo, a produção de nanolipossomas aniônicos unilamelares é realizada de forma contínua, em etapa única, que consiste na injeção de uma mistura de fosfolipídios dispersa em solvente orgânico na entrada de fluido principal (2) do dispositivo microfluídico (1), concomitantemente com a injeção de uma solução salina em pelo menos uma entrada de fluido radial (3) do dispositivo microfluídico (1), sendo recolhida uma solução com nanolipossomas aniônicos unilamelares em pelo menos uma saída de fluido (4) do dispositivo microfluídico (1).[0034] In any modalities of this process, the production of unilamellar anionic nanoliposomes is carried out continuously, in a single step, which consists of injecting a mixture of phospholipids dispersed in organic solvent into the main fluid inlet (2) of the microfluidic device ( 1), concomitantly with the injection of a saline solution into at least one radial fluid inlet (3) of the microfluidic device (1), a solution with unilamellar anionic nanoliposomes being collected in at least one fluid outlet (4) of the microfluidic device (1).
[0035] Em uma modalidade, a mistura de fosfolipídios dispersa em solvente orgânico compreende pelo menos os fosfolipídios DMPC e DMPG em proporções entre 95:5 e 85:15 %molar de DMPC:DMPG, preferencialmente em proporções de 90:10 %molar. A mistura de fosfolipídios é provida em concentrações entre 20 e 30 mM em solvente orgânico, preferencialmente tendo concentração de 25 mM em solvente orgânico.[0035] In one embodiment, the mixture of phospholipids dispersed in organic solvent comprises at least DMPC and DMPG phospholipids in proportions between 95:5 and 85:15 mol % DMPC:DMPG, preferably in proportions of 90:10 mol %. The phospholipid mixture is provided in concentrations between 20 and 30 mM in organic solvent, preferably having a concentration of 25 mM in organic solvent.
[0036] Em uma modalidade, a mistura de fosfolipídios compreende ainda ο estabilizador estérico mDSPE-PEG2ooo em proporções entre 94,5:5:0,5 e 85:13:2 %molar de DMPC:DMPG:mDSPE-PEG2000, preferencialmente em proporções de 89:10:1 %molar, a mistura de fosfolipídios tendo concentrações entre 20 e 30 mM em solvente orgânico, preferencialmente tendo concentração de 25 mM em solvente orgânico.[0036] In one embodiment, the mixture of phospholipids further comprises the steric stabilizer mDSPE-PEG2ooo in proportions between 94.5:5:0.5 and 85:13:2 mol % of DMPC:DMPG:mDSPE-PEG2000, preferably in proportions of 89:10:1 mol %, the mixture of phospholipids having concentrations between 20 and 30 mM in organic solvent, preferably having concentration of 25 mM in organic solvent.
[0037] Em uma modalidade, a taxa entre a velocidade de escoamento da solução salina e a velocidade de escoamento da mistura de fosfolipídios é de 5 a 40, preferencialmente 10. Uma vez que o tamanho do canal dificulta a formação de escoamento turbulento, a difusão passa a ser o único mecanismo de transferência de massa envolvido no fenômeno. Por isso, a taxa entre a velocidade da solução salina e da mistura de fosfolipídios torna-se um parâmetro muito importante para a formação dos nanolipossomas, pois aumenta o mecanismo de interdifusão entre os fluidos pela compressão do veio fluido de fosfolipídios, diminuindo o conteúdo do solvente orgânico, e, assim, reduzindo o tempo de mistura e produção dos produtos. Ademais, essa compressão também atua na qualidade, tamanho médio e distribuição de tamanhos das estruturas formadas. Outrossim, o aumento indiscriminado das velocidades de escoamento pode causar deformações na parede dos microcanais, promovendo não-uniformidades na formação dos lipossomos. Portanto, o controle das faixas de velocidade dos escoamentos é essencial para alcançar as vantagens reveladas no presente processo.[0037] In one embodiment, the ratio between the flow velocity of the saline solution and the flow velocity of the phospholipid mixture is from 5 to 40, preferably 10. Since the size of the channel makes it difficult to form turbulent flow, the diffusion becomes the only mass transfer mechanism involved in the phenomenon. Therefore, the rate between the velocity of the saline solution and the phospholipid mixture becomes a very important parameter for the formation of nanoliposomes, as it increases the interdiffusion mechanism between the fluids by compressing the fluid vein of phospholipids, decreasing the content of the organic solvent, and thus reducing the mixing and production time of the products. Furthermore, this compression also acts on the quality, average size and size distribution of the formed structures. Furthermore, the indiscriminate increase in flow velocities can cause deformations in the microchannel wall, promoting non-uniformities in the formation of liposomes. Therefore, the control of the flow speed ranges is essential to achieve the advantages revealed in the present process.
[0038] Em uma modalidade, o solvente orgânico é etanol anidro. Em outras modalidades, o solvente orgânico é selecionado do grupo que compreende metanol anidro e isopropanol anidro.[0038] In one embodiment, the organic solvent is anhydrous ethanol. In other embodiments, the organic solvent is selected from the group comprising anhydrous methanol and anhydrous isopropanol.
[0039] Em uma modalidade, a solução salina é PBS. Em outras modalidades, a solução salina é uma solução selecionada do grupo que compreende as soluções de LiCI, NaCI, KCI, Na2HPO4, NaH2PO4, CaCl2, MgCl2, AlCl3 e ZnCl2.[0039] In one embodiment, the saline solution is PBS. In other embodiments, the saline solution is a solution selected from the group comprising LiCl, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaH2PO4, CaCl2, MgCl2, AlCl3, and ZnCl2 solutions.
[0040] No que segue, são apresentadas realizações exemplares do objeto aqui descrito, de modo não restritivo, ilustrando resultados e vantagens alcançadas pelo mesmo.[0040] In what follows, exemplary realizations of the object described here are presented, in a non-restrictive way, illustrating results and advantages achieved by it.
[0041] As figuras 2a, 2b e 2c são gráficos resultantes de ensaios de caracterização dos nanolipossomas aniônicos (AL) unilamelares obtidos pelo presente método, utilizando como insumo a mistura de fosfolipídios DMPC:DMPG em proporções de 90:10 %molar em etanol 25 mM, usando solução tampão nas entradas radiais, com taxa entre as velocidades dos escoamentos de 10, e o dispositivo microfluídico com microcanais em formato de "T".[0041] Figures 2a, 2b and 2c are graphs resulting from characterization tests of unilamellar anionic nanoliposomes (AL) obtained by the present method, using as input the mixture of phospholipids DMPC:DMPG in proportions of 90:10 mol % in ethanol 25 mM, using a buffer solution in the radial inlets, with a rate between the flow velocities of 10, and the microfluidic device with microchannels in the shape of a "T".
[0042] A técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi usada para medir a distribuição de tamanho, a polidispersidade e o diâmetro hidrodinâmico médio dos lipossomas. Para tanto, utilizou-se um equipamento Zetasizer Nano ZS (da empresa Malvern Panalytical, Reino Unido) com ângulo de detecção de retroespalhamento de 173°, laser He/Ne que emite a 633 nm e fonte de alimentação de 4,0 mW. O diâmetro hidrodinâmico médio - ou média Z - foi ponderado pela intensidade de espalhamento DLS. O tamanho médio das partículas foi obtido a partir dos resultados de três medições. A distribuição do tamanho foi avaliada pelo índice de polidispersidade (PDI). Esse índice é calculado a partir da análise cumulativa da função de autocorrelação de intensidade DLS. O índice varia de 0 a 1; valores mais baixos indicam uma distribuição mais homogênea para tamanhos de partículas. Todas as amostras foram diluídas para 0,3 mM antes da análise.[0042] Dynamic light scattering (DLS) technique was used to measure the size distribution, polydispersity and mean hydrodynamic diameter of liposomes. For that, a Zetasizer Nano ZS equipment (from Malvern Panalytical, United Kingdom) with a backscatter detection angle of 173°, He/Ne laser emitting at 633 nm and a 4.0 mW power supply was used. The mean hydrodynamic diameter - or Z mean - was weighted by the DLS scattering intensity. The average particle size was obtained from the results of three measurements. The size distribution was evaluated by the polydispersity index (PDI). This index is calculated from the cumulative analysis of the DLS intensity autocorrelation function. The index ranges from 0 to 1; lower values indicate a more homogeneous distribution for particle sizes. All samples were diluted to 0.3 mM before analysis.
[0043] O potencial zeta foi obtido medindo-se a mobilidade eletroforética das partículas pela técnica de anemometria laser-doppler (DLS). As medições para cada amostra foram realizadas em triplicata a 25 °C usando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, Reino Unido).[0043] The zeta potential was obtained by measuring the electrophoretic mobility of the particles using the laser-doppler anemometry (DLS) technique. Measurements for each sample were performed in triplicate at 25 °C using the Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Panalytical, UK).
[0044] Os experimentos espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizados na linha de luz SAXS1 do Laboratório Brasileiro de Luz Síncrotron (LNLS/CNPEM, Brasil) usando uma energia de feixe de 8,3 keV (λ = 1,47 Å) e distância amostra-detector de 880 mm. A intensidade medida é exibida como uma função do módulo de transferência de momento espacial recíproco q = 4π sin (Θ) / λ, onde 2Θ é o ângulo de espalhamento e λ é ο comprimento de onda da radiação. A faixa típica de valores de q foi de 0,015 Å-1 a 0,50 Å-1, e os experimentos foram feitos na faixa de temperatura de 15 a 40 °C.[0044] The low angle X-ray scattering (SAXS) experiments were carried out on the SAXS1 beamline of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS/CNPEM, Brazil) using a beam energy of 8.3 keV (λ = 1 .47 Å) and sample-detector distance of 880 mm. The measured intensity is displayed as a function of the modulus of reciprocal spatial momentum transfer q = 4π sin(Θ) / λ, where 2Θ is the scattering angle and λ is the wavelength of the radiation. The typical range of q values was 0.015 Å-1 to 0.50 Å-1, and the experiments were done in the temperature range of 15 to 40 °C.
[0045] A análise dos resultados foi baseada no modelo de lipídio bicamada. A intensidade de espalhamento pode ser escrita como uma função do módulo de vetor de espalhamento / (q) da seguinte forma:
[0046] em que F (q) é o fator de forma, que descreve a forma como cada bicamada espalha os raios-X; e S (q) é fator de estrutura, que está relacionado á organização de empilhamento das bicamadas no sistema. Para modelagem de F (Q), usamos o modelo de deconvolução gaussiana, para simular o perfil de densidade eletrônica (EDP) através da bicamada lipídica. Para o fator de estrutura, foi utilizado um modelo baseado na Teoria de Caillé Modificada (MCT), que permite uma descrição adequada do fator de estrutura para sistemas lamelares.[0046] where F(q) is the shape factor, which describes how each bilayer scatters X-rays; and S(q) is the structure factor, which is related to the stacking organization of the bilayers in the system. For F(Q) modeling, we used the Gaussian deconvolution model to simulate the electron density profile (EDP) across the lipid bilayer. For the structure factor, a model based on the Modified Caillé Theory (MCT) was used, which allows an adequate description of the structure factor for lamellar systems.
[0047] Na figura 2a é possível observar, através dos resultados do DLS para 7 dias, uma alta estabilidade dos lipossomas, que apresentaram perfil monomodal, com baixa polidispersão (0,080 ± 0,009), e com tamanho médio de em torno de 53,7 ±1,4 nm. Estudos anteriores relataram a produção dessas estruturas aniônicas com a mesma composição por métodos convencionais utilizando solventes orgânicos tóxicos, como o terc-butanol, exigindo etapas trabalhosas para a obtenção de estruturas monodispersas e com tamanho superior a 100 nm. Além disso, são bem conhecidas as vantagens apresentadas por lipossomas de dimensões menores, que têm taxas de depuração sanguínea mais lentas e, portanto, biodisponibilidade melhorada.[0047] In figure 2a, it is possible to observe, through the results of the DLS for 7 days, a high stability of the liposomes, which presented a monomodal profile, with low polydispersion (0.080 ± 0.009), and with an average size of around 53.7 ±1.4 nm. Previous studies have reported the production of these anionic structures with the same composition by conventional methods using toxic organic solvents, such as tert-butanol, requiring laborious steps to obtain monodisperse structures with a size greater than 100 nm. Furthermore, the advantages presented by liposomes of smaller dimensions, which have slower blood clearance rates and therefore improved bioavailability, are well known.
[0048] Com vistas ao gráfico do potencial Zeta, apresentado na figura 2b, obtido por LDA, a estabilidade dos lipossomas é reforçada pelos valores negativos constantes ao longo do período em que foi monitorado, ao contrário do comportamento das nanoestruturas formadas por espécies isoelétricas. Devido aos lipídios carregados (DMPG) em sua formulação, os grupos principais adquirem uma orientação preferencial na membrana. Os valores do potencial Zeta obtidos estão, neste caso, diretamente associados a espécies carregadas na estrutura lipossomal.[0048] With a view to the graph of the Zeta potential, shown in figure 2b, obtained by LDA, the stability of liposomes is reinforced by constant negative values over the period in which it was monitored, contrary to the behavior of nanostructures formed by isoelectric species. Due to the charged lipids (DMPG) in its formulation, the main groups acquire a preferential orientation on the membrane. The Zeta potential values obtained are, in this case, directly associated with species charged in the liposomal structure.
[0049] O tamanho e a distribuição do tamanho dos lipossomas são parâmetros cruciais para garantir a aplicação eficiente dessas estruturas como nanocarreadores, e diretamente ligada a esses parâmetros está a lamelaridade, uma vez que sistemas compostos por estruturas unilamelares podem garantir uma dosagem mais controlada do fármaco. Os dados do gráfico da figura 3c, obtido por SAXS, permitiram determinar a forma e organização das membranas lipídicas. Ajustando as curvas com modelagem adequada, conhecida do estado da técnica, foi possível confirmar que os lipossomas possuem organização unilamelar (fração unilamelar maior que 97%) e, com o aumento da temperatura, foi possível observar seu efeito na fluidez das bicamadas, evidenciado pelo perfil de densidade eletrônica obtido a partir dos ajustes.[0049] The size and size distribution of liposomes are crucial parameters to ensure the efficient application of these structures as nanocarriers, and directly linked to these parameters is lamellarity, since systems composed of unilamellar structures can guarantee a more controlled dosage of the drug. The data from the graph in Figure 3c, obtained by SAXS, allowed the determination of the shape and organization of the lipid membranes. Adjusting the curves with adequate modeling, known from the state of the art, it was possible to confirm that the liposomes have a unilamellar organization (unilamellar fraction greater than 97%) and, with the increase in temperature, it was possible to observe its effect on the fluidity of the bilayers, evidenced by the electronic density profile obtained from the adjustments.
[0050] As figuras 3a, 3b e 3c são gráficos resultantes de ensaios de caracterização dos lipossomas aniônicos stealth (SAL) unilamelares obtidos pelo presente método, utilizando como insumo a mistura de fosfolipídios DMPC:DMPG:DSPE-PEG2000 em proporções de 89:10:1 %molar em etanol 25 nM, usando solução tampão nas entradas radiais, com taxa entre as velocidades dos escoamentos de 10, e o dispositivo microfluídico com microcanais em formato de "T".[0050] Figures 3a, 3b and 3c are graphs resulting from characterization tests of unilamellar anionic stealth liposomes (SAL) obtained by the present method, using as input the mixture of phospholipids DMPC:DMPG:DSPE-PEG2000 in proportions of 89:10 :1 mol % in 25 nM ethanol, using a buffer solution in the radial inlets, with a rate between the flow velocities of 10, and the microfluidic device with microchannels in a "T" format.
[0051] A Figura 3 (a) mostra que a inserção do estabilizador estérico DSPE-PEG2000 na composição da formulação alterou ligeiramente o tamanho dos lipossomas, manteve o perfil monomodal e permaneceu estável durante o tempo de monitoramento. O diâmetro hidrodinâmico foi em torno de 56,9 ± 0,4 nm e índice de polidispersão de 0,060 ± 0,004. Em comparação, a literatura relata a produção desta plataforma utilizando solvente orgânico tóxico (clorofórmio e álcool isopropílico) pelo método convencional, necessitando da etapa de ultrassonicação para otimizar o tamanho dos lipossomas, que diminui de 242 nm para 87 nm, com um alto índice de polidispersidade (= 0,309). Conforme relatado na literatura, a plataforma de tamanho 242 nm exibiu uma taxa de liberação mais lenta (24,2%) do que a plataforma otimizada (81,6%) nas primeiras 12 horas de diálise, sugerindo uma circulação sanguínea mais longa para a plataforma não otimizada, demonstrando a importância da obtenção de lipossomas menores para atingir sua eficiência máxima, quando aplicados como nanocarreadores.[0051] Figure 3 (a) shows that the insertion of the steric stabilizer DSPE-PEG2000 in the composition of the formulation slightly changed the size of the liposomes, maintained the monomodal profile and remained stable during the monitoring time. The hydrodynamic diameter was around 56.9 ± 0.4 nm and the polydispersity index was 0.060 ± 0.004. In comparison, the literature reports the production of this platform using toxic organic solvent (chloroform and isopropyl alcohol) by the conventional method, requiring the ultrasonication step to optimize the size of the liposomes, which decreases from 242 nm to 87 nm, with a high index of polydispersity (= 0.309). As reported in the literature, the 242 nm size platform exhibited a slower release rate (24.2%) than the optimized platform (81.6%) in the first 12 hours of dialysis, suggesting longer blood circulation to the unoptimized platform, demonstrating the importance of obtaining smaller liposomes to reach their maximum efficiency, when applied as nanocarriers.
[0052] A figura 3b mostra o potencial zeta, que se manteve estável ao longo de 7 dias, em torno de -14,3 mV, compatível com a composição do lipossoma e semelhante ao relatado na literatura de -10 a -13,4 mV, diminuindo a possibilidade de agregação destes sistemas.[0052] Figure 3b shows the zeta potential, which remained stable over 7 days, around -14.3 mV, compatible with the composition of the liposome and similar to that reported in the literature from -10 to -13.4 mV, reducing the possibility of aggregation of these systems.
[0053] Na figura 3c, são apresentados resultados dos perfis de intensidade SAXS e da imagem crio-TEM [21] , que são complementares e corroboram com o fato de que são obtidos nanolipossomas aniônicos stealth com organização unilamelar através do processo aqui descrito. Com o aumento da temperatura, as estruturas permaneceram com a mesma conformação e organização.[0053] Figure 3c shows the results of the SAXS intensity profiles and the cryo-TEM image [21] , which are complementary and corroborate the fact that stealth anionic nanoliposomes with unilamellar organization are obtained through the process described here. With increasing temperature, the structures remained with the same conformation and organization.
[0054] A figura 3d é uma imagem de criomicroscopia eletrônica de transmissão dos lipossomas aniônicos stealth obtidos pelo presente método. A imagem corrobora os resultados de SAXS, evidenciando a formação de nanolipossomos com organização unilamelar. As estruturas têm circunferência perfeita (destacadas com setas brancas) e tamanho em torno de 58 nm, conforme já apontado pela análise de DLS.[0054] Figure 3d is a transmission electron cryomicroscopy image of the stealth anionic liposomes obtained by the present method. The image corroborates the results of SAXS, showing the formation of nanoliposomes with unilamellar organization. The structures have perfect circumference (highlighted with white arrows) and size around 58 nm, as already pointed out by the DLS analysis.
[0055] Embora modalidades exemplares dos processos e produtos descritos tenham sido apresentadas neste relatório, não se pretende que o escopo de proteção seja limitado ã literalidade das mesmas. Portanto, a descrição deve ser interpretada não como limitativa, mas meramente como exemplificações de modalidades particulares que guardam o conceito inventivo aqui apresentado. Um técnico no assunto poderá prontamente aplicar ensinamentos aqui apresentados em soluções análogas, decorrentes dos mesmos, limitadas apenas pelo escopo das reivindicações deste pedido.[0055] Although exemplary modalities of the processes and products described have been presented in this report, it is not intended that the scope of protection be limited to their literality. Therefore, the description should not be interpreted as limiting, but merely as examples of particular modalities that keep the inventive concept presented here. A person skilled in the art can readily apply teachings presented here in analogous solutions, arising therefrom, limited only by the scope of the claims of this application.
Claims (10)
injetar em pelo menos uma entrada de fluido principal (2) do dispositivo microfluídico (1) uma mistura de fosfolipídios dispersa em solvente orgânico compreendendo pelo menos os fosfolipídios DMPC e DMPG em proporções entre 95:5 e 85:15 %molar de DMPC:DMPG, preferencialmente em proporções de 90:10 %molar, a mistura de fosfolipídios tendo concentrações entre 20 e 30 mM em solvente orgânico, preferencialmente tendo concentração de 25 mM em solvente orgânico; e, simultaneamente,
injetar uma solução salina em pelo menos uma entrada de fluido radial (3) do dispositivo microfluídico (1), em que a taxa entre a velocidade de escoamento da solução salina e a velocidade de escoamento da mistura de fosfolipídios é de 5 a 40, preferencialmente 10; e,
recolher uma solução com lipossomas aniônicos unilamelares em pelo menos uma saída de fluido (4) do dispositivo microfluídico (5).Process for the production of unilamellar anionic nanoliposomes, conducted in a hydrodynamic focusing microfluidic device (1) comprising: at least two fluid inlets (2,3); and at least one fluid outlet (4), in which the fluid inlets (2,3) are fluidly connected by microchannels (5) that join in a microchannel (5) fluidly connected to the fluid outlet (4), the microchannels (5) having internal dimensions between 135 and 145 μm, the process characterized by:
injecting into at least one main fluid inlet (2) of the microfluidic device (1) a mixture of phospholipids dispersed in organic solvent comprising at least the phospholipids DMPC and DMPG in proportions between 95:5 and 85:15 mole % DMPC:DMPG , preferably in proportions of 90:10 mol %, the mixture of phospholipids having concentrations between 20 and 30 mM in organic solvent, preferably having a concentration of 25 mM in organic solvent; and, simultaneously,
injecting a saline solution into at least one radial fluid inlet (3) of the microfluidic device (1), wherein the ratio between the saline solution flow velocity and the phospholipid mixture flow velocity is from 5 to 40, preferably 10; It is,
collecting a solution with unilamellar anionic liposomes in at least one fluid outlet (4) of the microfluidic device (5).
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